Коновалова Е.В. - Московский государственный медико
advertisement
1 На правах рукописи Коновалова Елена Владимировна Эндолимфатические инфузии цитостатиков в комплексном лечении папилломавирусной инфекции высокого онкогенного риска 14.01.01 – Акушерство и гинекология 14.01.17 - Хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2013 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздравсоцразвития России) Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Марченко Анна Ивановна Доктор медицинских наук, профессор Попов Юрий Павлович Официальные оппоненты: Минкина Галина Николаевна - доктор медицинских наук, профессор ( ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России) профессор кафедры акушерства и гинекологии, Мержвинский Иван Анатольевич - доктор медицинских наук (городская клиническая больница №6, г. Москвы, заместитель главного врача по хирургии). Ведущее учреждение: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России». Защита состоится “ ” ____ 2013 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.06, созданного на базе ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России по адресу: 127437 г. Москва, ул. Делегатская, 20/1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета имени А.И. Евдокимова (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а) Автореферат разослан “ ” _______ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Юлия Николаевна Пономарева 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы За последнее десятилетие накоплен большой фактический материал по вопросу гистофизиологии и патологии шейки матки (Кулаков В.И., 2000, Прилепская В.Н., Костава М.Н., 2009). Особой сложностью ранней диагностики характеризуются папилломавирусной онкопроцессы, инфекцией интраэпителиальные поражения, связанные с гениталий (плоскоклеточные цервикальная интраэпителиальная неоплазия) (Манухин И.Б. 1998, Минкина Г.Н. 2004; Касихина Е.И., 2011), в тоже время в течение последнего десятилетия отмечается неуклонный рост частоты генитальных заболеваний, вызванных вирусами папилломы человека. Установлена четкая связь между возникновением рака шейки маики и персистенцией у женщин папилломавирусов высокого канцерогенного риска (Munoz N. Et al. 2003, Кувда Д.А., Шипулина О.Ю. 2007). Доля рака репродуктивной шейки системы матки составила среди злокачественных 16,2%, а в опухолей России ежегодно регистрируется 12,3 тысячи новых случаев рака шейки матки (Аксель Е.М., Давыдов М.И. 2002). В 95 % случаев выявления рака шейки матки у женщин детородного возраста регистрируется наличие папилломавирусов высокого канцерогенного риска (Прилепская В.Н. 2004, Минкина Г.Н. 2005). Характерной особенностью папилломавирусной инфекции гениталий является поражение лиц молодого возраста (Адаскевич В.П., 2001). За последние 10 лет средний возраст заболевших раком шейки матки снизился с 58 до 55 лет, а у женщин до 29 лет заболеваемость возросла в 2 раза. Вирусы папилломы человека относятся к широко распространенной и гетерогенной группе вирусов. Эпидемиологическими исследованиями последних лет показано, что к группе высокого риска принадлежат типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82. Типы 26, 53 и 66 относятся к категории предположительно высокого риска. К группе низкого риска 4 принадлежат типы 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81. Остальные типы относятся к категории неустановленного риска и чаще всего не ассоциированы с развитием патологии (Munoz N. et al. 2003 Куевда Д.А., Шипулина О.Ю. 2006г.). Обращает на себя внимание также тот факт, что инфицированность ВПЧ в 10 раз выше, чем частота клинических проявлений инфекции (Куевда Д.А. 2006; Соловьев А.М., 2011). Развитие рака шейки матки не является молниеносным процессом. По данным ВОЗ переход тяжелой дисплазии в рак in situ длится в среднем 3 – 8 лет. Врач располагает достаточным временем для обнаружения начальных форм поражения. Вот почему проблема диагностики папилломавирусной инфекции остается одной из актуальных задач практической гинекологии. Поздняя диагностика, отсутствие скрининговых программ выявления этиологического фактора, приводит к неудовлетворительным результатам лечения патологических процессов шейки матки. Лечение ВПЧ высокого онкогенного риска сопряжено со значительными трудностями, обусловленными необходимостью комплексного воздействия на патологический процесс. Комплекс лечения включает в себя противовирусную терапию, удаление кондилом, папиллом, диспластических и других проявлений заболевания. Однако в нем не учитывается главное – необходимость остановить дальнейшее функционирование и деление оставшихся патологически измененных клеток, не вошедших в биопсионый материал и продолжающих существовать как базовый биологический материал, из которого в дальнейшем формируется злокачественный процесс. Большая часть патологически измененных клеток, наряду с другими метаболитами концентрируется в лимфатической системе (Пекарев О.Г., Любарский М.С., Поздняков И.М., 2006; Елисеева М. Ю., 2010; Савенко В.О., Савенко Н.Б., 2002; Ярема И.В., 2011). Таким образом, вопросы ранней диагностики и изучение возможностей эндолимфатической лекарственной терапии у больных с ВПЧ высокого риска представляют собой актуальную проблему. 5 Цель исследования: Улучшить результаты лечения папилломавирусной инфекции высокого онкогенного риска у женщин репродуктивного возраста, путем разработки алгоритма диагностических и лечебных мероприятий с включением эндолимфатической лекарственной терапии. Для реализации намеченной цели перед проведением исследований были поставлены следующие задачи: 1. Оценить диагностическую ценность метода полимеразной цепной реакции для раннего выявления папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста. 2. Определить чувствительность и специфичность метода ПЦР для выявления вируса папилломы человека высококанцерогенных типов, как основного этиопатогенетического фактора развития диспластических процессов и рака шейки матки. 3. Определить характер клинических и морфологических проявлений папиломавирусной инфекции гениталий у женщин. 4. Разработать методику эндолимфатической лекарственной терапии, определить ее эффективность, безопасность и уточнить алгоритм лечебных воздействий. 5. Изучить результаты лечения пациентов с использованием эндолимфатической лекарственной терапии цитостатиком (5-фторурацил). Научная новизна Использование метода ПЦР диагностики у женщин детородного возраста позволит выявить ВПЧ даже при отсутствии клинических признаков патологии шейки матки и существенно расширит показания к проведению дополнительных уточняющих методов обследования. При проведении таких дополнительных методов исследования как кольпоскопия, цитология, биопсия, поводом к которым была положительная реакция на ДНК ВПЧ с клиническими проявлениями, удается выявить предраковые процессы шейки матки на доклинических стадиях заболевания. 6 Возможность селективной диагностики различных типов вирусов позволит выявлять те из них, при которых вероятность возникновения тяжелых дисплазий и рака шейки матки наиболее высока. Впервые у пациенток репродуктивного возраста с выявленным ВПЧ высокого онкогенного риска будет использоваться эндолимфатическая лекарственная терапия, обладающая цитостатическим действием. Предполагается, что проведенное лечение существенно ускорит сроки регрессии основных клинико-морфологичских проявлений ВПЧ инфекции и будет являться важным фактором предупреждения злокачественного роста. Практическая значимость Проведенные исследования и полученные результаты позволят повысить эффективность лечения больных с папилломавирусной инфекцией высокого онкогенного риска. Включение в комплекс лечения папилломавирусной инфекции эндолимфатической терапии 5-фторурацилом приводит к уменьшению послеоперационного болевого синдрома и таких послеоперационных осложнений как повышенная кровоточивость, нагноение и длительное течение раневого процесса. Использование эндолимфатической лекарственной терапии в послеоперационном периоде дополняет хирургическое лечение с точки зрения более полного блокирования деления клеток, пораженных вирусом папилломы человека, и снижает риск вероятного возникновения рака шейки матки в будущем. Основные положения, выносимые на защиту 1. По данным обследования женщин детородного возраста, с применением ПЦР диагностики, у 40% из них выявляются различные типы папилломавирусной инфекции, а у 93% из всех инфицированных выявлены типы вирусов высокого канцерогенного риска. 2. При последующем использовании клинических и лабораторных цитологических методов исследования изменения эндоцервикса под 7 действием онкотропных вирусов удается обнаружить на стадиях вирусоносительства. 3. Комплексное лечение патологии шейки матки обусловленное папилломавирусной инфекцией на ранних стадиях заболевания позволяет предупредить переход легкой степени дисплазии шейки матки в тяжелую, и развитие рака шейки матки в дальнейшем. 4. Выявление у пациенток вируса папилломы человека высокого онкогенного риска должно стать поводом к проведению комплексного лечения, включающего в себя хирургическое удаление клинических проявлений этого заболевания (кондилом, эктопий, дисплазий тяжелой степени, папиллом и др.) с обязательным проведением эндолимфатической цитостатической терапии 5-фторурацилом, позволяющего устранить базовый клеточный фактор, на основе которого в дальнейшем формируется процесс озлокачествления. Внедрение результатов исследования в практику Основные результаты исследования внедрены в практику работы городской поликлиники №77 г. Москвы, хирургического и гинекологического отделения городской больницы №40. Положения и выводы диссертационной работы используются в программе обучения студентов 5 и 6 курсов лечебного факультета Московского государственного медико-стоматологического университета им.А.И. Евдокимова. Личный вклад автора Автором самостоятельно организовано планирование и выполнение всех этапов работы, включающих разработку протокола исследования, индивидуальной карты пациента и информированного согласия. В ходе сбора материала для диссертационной работы Коноваловой Е.В. определен алгоритм обследования больных с папилломавирусной инфекцией, разработаны скрининговые программы, позволяющие обследовать широкий контингент больных и выявлять группы риска по онкологическим заболеваниям. Автор самостоятельно провела лечение с использованием 8 эндолимфатической лекарственной терапии, так же осуществляла за пациентами динамическое наблюдение. Апробация работы Результаты исследований доложены и обсуждены на конференциях «IV Съезд лимфологов России », (Москва, 15-17 сентября 2011), «научнопрактическая конференция к 90-летию со дня рождения профессора Р.Т. Панченкова», (Москва,18-19 мая 2012), IX Всероссийском форуме «Образование, наука и практика в стоматологии», (Москва, 20-22 февраля 2012), на научно-практической конференции, посвященной 50 летнему юбилею ГКБ №54 (Москва, 7 сентября 2012). Публикации Основное содержание диссертационного исследования достаточно полно отражено в автореферате и в 3 научных работах соискателя, в том числе 1 рекомендованной в журналах ВАК Минобрнауки России. Структура и объем диссертации Диссертация выполнена на 128 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Указатель литературы включает отечественные и зарубежные публикации. Работа иллюстрирована 19 рисунками, 7 таблицами, 9 диаграммами. Примеры из историй болезни. В работе использовались молекулярно биологические, кольпоскопические, цитологические и морфологические методы исследования. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Диссертационная работа основана на анализе и лечении 130 женщин, обследовавшихся с подозрением на наличие заболеваний, передающихся половым путем и для планового диспансерного наблюдения, у которых выявлен вирус папилломы человека. Из них у 54 (41,5%) был выявлен ВПЧ, 76 (58,5%) не были инфицированы. Из 54, 50 (93%) были носителями вируса высоко онкогенного типа. Было оперировано 35 (65%) пациенток в связи с 9 наличием клинических проявлений заболевания. Им в комплексном лечении выполнялось дренирование лимфатического протока с введением 5фторурацила. Всем 130 обследуемым женщинам было проведено цитологическое исследование. Мазки классифицировали по системе «Bethesda system» (1988), которая используется цитологами большинства стран Америки и Европы. Она основана на разной степени плоскоклеточного интраэпителиального повреждения (squamous intraepithelium lesion — SIL), вызываемого различными патогенными агентами. Цитологически выделяли две степени указанного повреждения эпителия — низкую и высокую. Низкая степень SIL-L встречается при инфицировании любым серотипом HPV — инфекции и гистологически подтвержденной слабой степени дисплазии (CIN 1). Высокая степень SIL-H наблюдается при умеренной и тяжелой степенях дисплазии (CIN 2-3) и инфицировании HPV-cepoтипами 16, 18, 31, 33. Цитологическая классификация «Bethesda system» предполагает оценку качества мазка, его категории, диагностического описание. При определении в цитологическом мазке дискариотических клеток проводили кольпоскопическое исследование с целью подтверждения или исключения существования предракового поражения. Гистологическое субклинических исследование форм проводили папилломавирусной с целью инфекции, выявления для которых характерны акантоз, гиперплазия клеток базального и парабазального слоев клеток многослойного плоского эпителия, клеточные элементы с койлоцитотической атипией. Молекулярно-биологические методы позволяли устанавливать факт присутствия основного этиологического агента дисплазий и рака шейки матки - ВПЧ, а следовательно, эффективно подтверждать сомнительные результаты иных методов исследования. Кроме того, данные методы позволяли проводить определение генотипа вируса и его принадлежность к группе 10 высокого или низкого онкогенного риска, что существенным образом помогало формулировать прогноз течения заболевания. Для выявления и генотипирования вируса папилломы человека использовали три основные группы методов выявления ДНК: неамплификационные, методы с амплификацией мишени и методы с амплификацией сигнала. Неамплификационные методы, такие как dot-blot, Southern blot или in situ гибридизация (FISH) для выявления ДНК ВПЧ выполняли в единичных случаях. Онкогенный потенциал разных типов ВПЧ в пределах группы высокого риска не являлся одинаковым. Наибольшим онкогенным потенциалом обладали типы 16 и 18, прогноз их выявления наиболее тревожный. Обсуждается вопрос о влиянии инфицирования несколькими высокоонкогенными типами на риск развития рака. Поскольку прогностическим значением может обладать не только генотип ВПЧ, но и вирусная нагрузка, пациенты с установленными высокими концентрациями вирусных геномов в образцах на начальных этапах ВПЧ-инфекции имели более высокий риск развития CIN II/CINIII по сравнению с инфицированными пациентами, но с низкой вирусной нагрузкой в образцах. Расширенная кольпоскопия позволяла выявить и конкретизировать изменения эпителиального покрова шейки матки, трактовка которых при визуальном наблюдении затруднена, либо совсем невозможна. При проведении кольпоскопии нами были поставлены следующие задачи: оценить состояние эпителия шейки матки и влагалища; выявить очаг поражения; дифференцировать доброкачественные изменения от подозрительных в отношении злокачественности; осуществить прицельное взятие мазков и биопсии, что существенно повышает информативность последних. Исследование на ВПЧ проводилось всем 130 обратившимся женщинам. Нами использовалась тест система «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-EPh», состоящий из 3 комплектов реагентов. Для проведения анализа 11 использовался следующий клинический материал: Образцы эпителия от женщин забирали так же, как для цитологического исследования: Использовался комплект для взятия образцов, содержащий одну/две цервикальные цитощетки и пробирку на 2 мл с «Транспортной средой для клинического материала из урогенитального тракта женщин» в объеме 0,5мл. Соскоб эпителия цервикального канала (эндоцервикс), взятый одной цервикальной цитощеткой помещался в пробирку с транспортной средой. Рабочую часть цитощеток обламывали и оставляли в пробирке с транспортной средой. Для обработки забранного клинического материала, использовался входящий в состав набора реагентов комплект реагентов «ДНК-сорб-А». Учёт результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК (табл. 1). Таблица 1. Длина специфических полос амплифицированных фрагментов ДНК ПЦР-смесь 1 ВПЧ 16/35 ПЦР-смесь 1 ВПЧ 18/59 ПЦР-смесь 1 ВПЧ 52/66 Гено Длина Гено Гено Длина тип специфи ческого виру фрагмен са та Длина внутреннего контроля ВПЧ 16 325п.н. са 18 специфи- внутрен- ческого него фрагмента контроля 520п.н. 45 425 п.н. 39 35 475 п.н. фрагмен- са та него контроля 360 п.н. 56 325 п.н. 340 п.н. 58 240 п.н. 723 п.н. 59 внутрен- ВПЧ ВПЧ 280п.н. виру Длина ВПЧ 723 п.н. ВПЧ специфического 52 ВПЧ 227п.н. тип ВПЧ ВПЧ ВПЧ 33 виру Длина ВПЧ ВПЧ 31 тип Длина 723 п.н. ВПЧ 395 п.н. 66 304 п.н. 12 1. В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа ПНР (К), не должно быть никаких полос. 2. В дорожке, соответствующей положительному контролю амплификации ДНК человека (К ч), должна быть полоса на уровне 723 п.н. 3. Отрицательными считались образцы, которые содержат только полосу внутреннего контроля - 723 п.н. 4. В дорожках, соответствующих контролям этапа электрофоретического анализа (КФ) должно быть по четыре полосы амплифицированных ДНК, соответствующей длины. Кроме специфических полос в дорожках может присутствовать полоса внутреннего контроля -723п.н. и полоса внутреннего контроля - 723 п.н. - во всех пробирках независимо от цвета. 5. Для того чтобы точно определить тип ВПЧ, проводились линии, соединяющие на электрофореграмме соответствующие полосы амплифицированной ДНК в КФ+. Пациентки с нормальной цитологией (отрицательный результат Papтеста), у которых обнаруживаются высокоонкогенные ВПЧ имеют в 100 раз более высокую вероятность развития тяжелой дисплазии, чем пациентки с нормальной цитологией и отрицательным результатом ВПЧ-теста. Исследование, включающее в себя ВПЧ-тест, то есть способность выявлять наличие этиологического агента рака шейки матки еще до клинических проявлений, во-первых, позволяет более точно предсказать течение заболевания, во-вторых, позволяет более четко и адекватно спланировать программу дальнейших исследований, в-третьих, увеличить интервалы между исследованиями в случае отрицательного Рар – и ВПЧ - тестов от 3-5 до 6-8 лет. Чувствительность теста на ДНК-ВПЧ в среднем составляет 97%. При совмещении теста на ДНК-ВПЧ с Рар-тестом чувствительность при выявлении дисплазии средней, высокой тяжести и РШМ практически достигает 100%. Выявление этиологического агента рака шейки матки позволяет разрешить проблему с неопределенным цитологическим диагнозом 13 (ASCUS), а, следовательно, снизить количество повторных исследований женщин со спорной или положительной цитологией и отрицательным тестом на ВПЧ. Проведение теста на ДНК-ВПЧ при цитологическом диагнозе ASCUS обладает более высокой прогностической точностью, чем повторное проведение цитологического или кольпоскопического исследования. Экономическая целесообразность объясняется тем, что более высокая стоимость первичного скрининга окупается более малым количеством подтверждающих исследований и увеличением интервала между исследованиями. Таким образом, включение теста на ДНК-ВПЧ в программу скрининга является строго необходимым, спорным вопросом остается необходимость совместного применения Рар - и ВПЧ-тестов или полная замена первого вторым. В настоящее время мы продолжаем активное внедрение теста на ДНК ВПЧ в программы цервикального скрининга и, согласно первым результатам, использование теста на ДНК ВПЧ для первичного скрининга женщин старше 30 лет позволило увеличить чувствительность скрининга на 10%-20% по сравнению с одиночным цитологическим исследованием. Дополнительные методы исследования применяются при положительном результате ВПЧ-теста и выявлении любых изменений в цитологическом исследовании или при отрицательном результате ВПЧ-теста и выявлении в цитологическом исследовании H-SIL или карциномы. Положительный результат теста на ВПЧ в сочетании с нормальным цитологическим мазком требуют повтора исследования в среднем через 0,5 года. Отрицательный результат теста на ВПЧ даже в сочетании с цитологическими диагнозами ASCUS или L-SIL принимаются как отрицательный результат скрининга. Анализ сомнительных результатов цитологического исследования (ASCUS). При положительном результате теста на ВПЧ необходимо подтверждающее исследование (кольпоскопия, гистология), при отрицательном - переход к рутинному скринингу, повтор исследования через 3-5 лет. Результатом скрининга должно стать определение группы пациентов 14 нуждающихся в лечении с использованием эндолимфатической лекарственной терапии. Методика катетеризации лимфатического сосуда выполнялась следующим образом: под оптическим увеличением сосуд освобождали от окружающей его соединительной ткани на протяжении 1,0-1,5 см, чтобы облегчить вход в просвет лимфатического сосуда. Под сосуд подводили 2 лигатуры. Микрохирургическими ножницами поперечно на 1/2 диаметра надсекали выделенный лимфатический сосуд. После вытекания периферической лимфы сосуд спадался. С помощью лапчатого пинцета в просвет лимфатического сосуда вводили конец микрокатетера и продвигали его в антеградном направлении до ощутимого препятствия. Дальнейшему продвижению препятствует лимфатического сосуда. При клапанная система попытке насильственного коллекторного продвижения микрокатетера возможна перфорация стенки сосуда. Обычно нам удавалось ввести катетер на глубину 2-3 см, что вполне достаточно. Катетер фиксировали к сосуду двумя лигатурами, к коже — шелком. Чтобы удостовериться в правильности катетеризации, по катетеру вводили раствор индигокармина. В случае повреждения цельности стенки лимфатического сосуда окружающие ткани окрашиваются в синий цвет. В таком случае требовалась повторная катетеризация этого же лимфатического сосуда из нового разреза, производимого выше предыдущего, или же поиск нового коллекторного лимфатического сосуда на этой же или противоположной стопе. После этого кожу прошивали 2-3 узловыми швами. На стопу накладывали восьмиобразную давящую повязку. Морфофункциональные особенности лимфатической системы дают патогенетическое обоснование для использования ее в лечебных целях. При развитии патологических процессов в гениталиях основная нагрузка приходится на лимфатическую систему малого таза. Лимфоотток от задней поверхности шейки матки распространяется через широкую связку матки вниз к прямой кишке и вверх по матке до уровня маточных труб и яичников. 15 Отток лимфы от эндометрия происходит латерально к истмической части маточной трубы. Первичный ток лимфы между яичниками осуществляется субсерозно через дно матки и маточно-крестцовые связки. Таким образом, регионарными лимфатическими узлами шейки матки можно считать лимфатические узлы, расположенные около мочевого пузыря, околоматочные, аноректальные, околопрямокишечные, лимфоотток осуществляется паховые. Далее в лимфатические узлы, расположенные по ходу общей подвздошной артерии, продолжаясь в группу узлов, лежащих у левой полуокружности аорты и в окружности нижней полой вены. Наряду с удалением кондилом и других проявлении ВПЧ требуется провести противовирусную терапию, а главное остановить дальнейшее функционирование и деление патологически измененных клеток. Таким действием обладает 5-фторурацил, противоопухолевая активность которого обусловлена превращением этого препарата в тканях в активные метаболиты, действие которых в свою очередь приводит к дефициту тимидина, ингибированию синтеза ДНК и к нарушению процессинга РНК и синтеза белка. Однако при внутривенном ведении период полувыведения составляет около 16 минут. Усилить экспозиционное действие препарата в патологическом очаге возможно только путем изменения путей введения. Исследование на ДНК ВПЧ проводилось всем 130 обратившимся женщинам. После приготовления мазков-отпечатков, для проведения цитологических исследований, цитощетка помещалась в транспортную среду, обламывалась и отправлялась в лабораторию для проведения молекулярно-биологического тестирования. Обнаружение ДНК ВПЧ осуществлялось с использованием тест-системы, выявляющей 12 генотипов высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59), работающей по принципу ПЦР АмплиСенс ВПЧ ВКР. По итогам исследований женщины были распределены на две группы: у 54 (41,5%) женщин были обнаружены вирусы папилломы человека, 76 (58,5%) женщин не были инфицированы. 16 Диаграмма №1. "Результаты молекулярно-биологического тестирования на выявление ДНК ВПЧ высоко канцерогенного риска". 42% 58% HPV позитивные 42% HPV негативные 58% Из всей группы инфицированных женщин 50 (93%) были носителями типов высокого онкогенного риска, и только у 4 (7%) были выявлены типы низкого онкогенного риска. Диаграмма №2. Распределение типов вируса среди инфицированных 100% 80% 60% 93% 40% 7% 20% 0% Высокого онкогенного риска (93%) Низкого онкогенного риска (7%) Возрастное соотношение в группе инфицированных женщин: 39(72%) были в возрасте до 30 лет и 15 (28%) в возрасте 30 и более лет. Диаграмма №3. Распределение инфицированных по возрастам 80% 60% 79% 40% 20% 21% 0% Возрастная группа Возрастная группа до 30 лет 30 лет и более 17 Серотипы папилловирусов высокого онкогенного риска значительно преобладали в обеих возрастных группах. Среди женщин до 30 лет их было 34(87%), среди старшей возрастной группы. Результаты кольпоскопических исследований отражены в таблице №2. Таблица №2. Отклонения от нормальной кольпоскопической картины в общей группе обследуемых пациенток. Выявленные отклонения Количество женщин с выявленными отклонениями Остроконечные кондиломы Папилломатозные измеИод-негативные зоны нения Лейкоплакия Ацетобелый эпителий Атипические зоны трансформации Нарушение состояния сосудистой сети Процент выявленных отклонений 10 9 13 2 2 27,7% 25% 36,1% 5,5% 5,5% 2 5,5% 4 11,1% Диаграмма № 4. " Возрастные соотношения в общей группе пациенток (130), имевших отклонения от нормальной кольпоскопической картины". 60% 50% 40% 30% 20% 59% 10% 41% 0% Возрастная Возрастная группа до 30 летгруппа старше 30 лет 18 Из всех исследуемых женщин 76 (58,4%) были HPV негативны. В результате проведенного ПЦР скрининга у них не обнаруживались высоко канцерогенногенные типы вируса, но, не смотря на отсутствие ВПЧ инфекции 17 (22,4%) из них имели отклонения от нормальной кольпоскопической картины. Остроконечные кондиломы встречались у 6 женщин (35,3%), образования располагались в нижней трети влагалища, на вульве, в области задней спайки (прианальной области). Чаще кондиломы носили характер множественных разрастаний по типу " цветной капусты". Папилломатозные изменения вульвы обнаружены у 3 (17,6%) женщин. Причем данные изменения характеризовались множественными, мелкими, сосочковыми разрастаниями, равномерно - расположенными, с умеренной васкуляризацией. Группа HPV позитивных женщин составила 54 человека, и имела следующие результаты цитологического скрининга: ASCUS - atypical squamous cells of undetermined significance, атипичные плоскоэпителиальные клетки неясного значения (АПКНЗ) - этот тип мазка был выявлен у 5 (2,7%) из 54 женщин. HSIL - high grade squamous intraepithelial lesion, высокая степень внутриэпи-телиального поражения (В - ПИП), соответствует в гистологической классификации средней и тяжелой дисплазии CIN 2, CIN 3 этот тип мазка был выявлен у 5 (2,7%) женщин из всей обследуемой группы. LSIL - low grade squamous intraepithelial lesion, низкая степень внутриэпите-лиального поражения (Н - ПИП), соответствует в гистологической классификации легкой дисплазии CIN1 - обнаружена у 13 (%) пациенток всей обследуемой группы. В группе позитивных женщин прошедших цитологический скрининг 31 имели нормальную цитологическую картину (диаграмма№5). 19 Диаграмма №5 Цитологическая картина в группе HPV-позитивных пациенток 54 44 34 24 14 4 -6 31 23 HPV позитивные цитологическая норма Группа HPV негативных пациенток составила 76 человек, и имела следующие результаты цитологического скрининга: ASCUS - atypical squamous cells of undetermined significance, атипичные плоскоэпителиальные клетки неясного значения (АПКНЗ) - этот тип мазка был выявлен у 4(%) из 76 женщин. HSIL - high grade squamous intraepithelial lesion, высокая степень внутриэпи-телиального поражения (В - ПИП), соответствует в гистологической классификации средней и тяжелой дисплазии CIN 2, CIN 3 - этот тип мазка не был выявлен у женщин данной обследуемой группы. LSIL - low grade squamous intraepithelial lesion, низкая степень внутриэпите-лиального поражения (Н - ПИП), соответствует в гистологической классификации легкой дисплазии CIN1 - обнаружена у 7 (%) пациенток HPV негативной группы. В группе негативных женщин прошедших цитологический скрининг, 65 пациенток имели нормальную цитологическую картину (диаграмма №6) Диаграмма №6. Цитологическая картина в группе HPV- негативных женщин. 20 76 66 56 46 36 26 16 6 -4 65 11 HPV негативные цитологическая норма HPV негативные АПКНЗ, В-ПИП, НПИП \ Таблица №3. "Результаты ВПЧ-тестирования и цитологического скрининга'\ Group Num. HPV positive 54 (clinically relevant) HPVnegative negative 76 Cytology Num. %% H-SIL 5 9.5 L-SIL 13 23.4 ASCUS 5 9.5 Normal+Inflammatory H-SIL L-SIL ASCUS 31 0 7 4 57.1 0.0 8.8 5.3 Normal+Inflammatory 65 85.9 Как видно из таблицы №3 в группе ВПЧ-позитивных женщин значительно выше частота встречаемости атипии легкой степени и только в ней были выявлены случаи тяжелой дисплазии (предрака). После определения группы пациенток инфицированных вирусом папилломы человека высокого онкогенного проявлениями заболевания (рис. №1). риска с клиническими 21 Рис.№1 Местное прогрессирование ВПЧ. Проводилось комплексное лазеровапоризацию папилломатозных радиохирургическое разрастаний, изоприназином и фторурацилом. и лечение, а также включавшее удаление в себя кондилом противовирусную и терапию местное использование свечей, включая свечи с 512 пациенткам комплексное лечение было дополнено эндолимфатической терапией с введением цитостатиков. 5-фторурацила, обладая активным цитостатическим действием, блокирует синтез ДНК (путем угнетения активности фермента) и вызывает образование структурно несовершенной РНК (путем внедрения фторурацила в ее синтез). Исследования объема распределения показали, что концентрация препарата, например, в опухолевой ткани через несколько часов после введения выше, чем в здоровой. Эндолимфатическое введение 5-фторурацила останавливает деление пораженных вирусом клеток, верифицировать которые в процессе хирургического лечения не представляется возможным и которые в дальнейшем могут стать источником рецидива заболевания и злокачественной трансформации. Эндолимфатическая терапия выполнялась по общепринятой методике, и включал в себя пять ежедневных введений в средней дозе 5 мл раствора из расчета 5-10 мг на кг массы тела. При сравнении результатов лечения основной группы и группы сравнения, отмечено: 1) отсутствие в послеоперационном периоде выраженного болевого 22 синдрома, уменьшение таких ощущений как жжение, покалывание, тяжести внизу живота; 2) отсутствие кровотечения в момент оперативного вмешательства и после него; 3) отторжение некротического струпа происходило на 4-5 сутки, раннего отторжения некроза с развитием кровотечения не отмечено; краевая эпителизация была отчетливо видна на 8-9 сутки в отличие от группы сравнения, в которой эти явления установлены только на 14-15 день, а полная эпителизация наступила на 18-20 день в отличие от контрольной группы, где эти сроки составили 24-26 дней; 4) ни у одной из больных основной групп рецидива заболевания не было, в то время как в группе сравнения эти осложнения возникли у 4 пациенток; 5) в послеоперационном периоде в основной группе не отмечено неспецифических заболеваний влагалища и шейки матки, тогда как в группе сравнения у 11(34%) пациенток воспалительные изменения потребовали дополнительного амбулаторного лечения; 6) существенное улучшение микробиоциноза влагалища; 7) при динамическом цитологическом исследовании отмечается уменьшение диспластических изменений с превалированием элементов воспаления, появлением клеток плоского и цилиндрического эпителия; 8) в основной группе отмечается полное исчезновение эрозий через три недели, а в группе сравнения только к концу третьего месяца, при том что у 4(12%) пациенток эрозии и мокнутие сохранялись и в более поздние сроки; 9) Уже через месяц наблюдения у 6 (19%) пациенток отмечался рецидив кондилом, в то время как в основной группе клинического рецидива не было. Чаще рецидивировали папилломатозные изменения в зоне уретры, задней спайки, малых половых губ и влагалища; 10) Длительный период заживления эрозий и рецидивы отмечались в группе сравнения вне зависимости от проведения противовирусной терапии, что позволяет оценивать это составную часть лечения как малоэффективную. 23 ВЫВОДЫ 1. Метод полимеразноцепной реакции имеет высокую диагностическую ценность для раннего выявления папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста. 2. Метод ПЦР отличается относительно низкой себестоимостью, высокой чувствительностью и специфичностью, однако для выбора правильного метода лечения его результаты необходимо трактовать в совокупности с другими методами исследования. 3. Проведенные исследования позволили выявить высокую (41,5%) частоту обнаружения папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста и высокую (93%) частоту выявления ВПЧ высокого онкогенного риска. Он позволяет выделить группу риска по развитию рака шейки матки. 4. Методика эндолимфатической лекарственной терапии с использованием цитостатиков безопасна и должна применяться параллельно с хирургическим лечением и лазеровапоризацией. 5. Методика эндолимфатической лекарственной терапии у больных с ВПЧ высокого онкогенного риска эффективна, поскольку позволяет существенно улучшить результаты лечения, уменьшить число послеоперационных осложнений и ускорить сроки лечения больных в 1,5 раза. Останавливая деление пораженных вирусом и патологически измененных клеток предупреждает развитие рака шейки матки в будущем, обеспечивая полноценность лечения. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для практического здравоохранения очевидна целесообразность внедрения данных тестов в программу скрининга женщин репродуктивного возраста для выявления характера патологии шейки матки, поскольку из большого числа пациенток формируется группа риска, включающая в себя тех, кто нуждается в немедленном комплексном лечении с использованием эндолимфатическое введение цитостатиков. Тесты по выявлению ДНК ВПЧ являются высоко информативными и 24 могут использоваться для массового тестирования на наличие ДНК ВПЧ в рамках скрининговых программ, дополнения цитологических исследований. Совместное применение цитологических исследований и тестов на ДНК ВПЧ позволяет значительно повысить эффективность мероприятий направленных на уточнение сомнительных результатов цитологических и гистологических анализов для тестирования на ВПЧ после проведенного лечения. При выявлении пациенток инфицированных ВПЧ высоко онкогенного риска с клиническими проявлениями заболевания (кондиломы, папилломы, дисплазии тяжелой степени) параллельно с хирургическим лечением необходимо проводить курс эндолимфатической терапии 5-фторурацилом для предупреждения развития рака шейки матки. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Марченко А.И., Попов Ю.П., Коновалова Е.В., Попова С.Ю. Возможности эндолимфатической терапии цитостатиками в профилактике рака шейки матки на фоне персистенции вируса папилломы человека// Материалы научно-практической конференции к 90 летию со дня рождения профессора Р.Т. Панченкова// М. 2012, С.129-130. 2. Марченко А.И., Попова С.Ю., Коновалова Е.В., Данилевская О.В., Попов П.А. Комплексная диагностика папилломавирусной инфекции высокого онкогенного риска// Сборник трудов IX Всероссийской научно-практической конференции «образование, наука и практика»//М. 2012, С. 328-331. 3. Коновалова Е.В., Марченко А.И., Попов Ю.П. Эндолимфатическая лекарственная терапия в комплексном лечении папилломавирусной инфекции высокого онкогенного риска.//Хирург №7, 2012, С.48-51.