Document 4119408

С.А. ШУСТРОВ1,2, А.В. ВОЛКОВ1,2, И.В. АРУТЮНЯН2, М.А. ПЕТРОВ3,
А.А. РЖАНИНОВА2, Г.Б. БОЛЬШАКОВА1, Д.В. ГОЛЬДШТЕЙН1,2
1
НИИ морфологии человека РАМН, Москва
2
ЗАО «РеМеТэкс», Москва
3
ГУ ВПО РГМУ, Кафедра детской хирургии, Москва
РАЗРАБОТКА ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ
ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЛОЖНЫХ СУСТАВОВ
Предложен метод лечения нарушения репаративного остеогенеза при повреждениях костей скелета с помощью
трансплантации тканеинженерной конструкции. Для экспериментального изучения патологического процесса была
использована модель ротационно-нестабильного остеосинтеза. В качестве клеточной культуры были использованы
стромальные клетки жировой ткани крыс, преддифференцированные в остеогенном направление, а матрицей-носителем
служит биокомпозиционный материал – высокоочищенный костный матрикс. Полученные данные свидетельствуют о
значительном улучшение состояния в зоне перелома после четырех месяцев наблюдения.
Одной из актуальных проблем современной травматологии и ортопедии является нарушение
репаративного остеогенеза [1]. Признанным фактом является удлинение сроков консолидации при
переломах у детей. За последние 30-40 лет сроки консолидации переломов увеличились в 1,5–2
раза. До 14 % подростков имеют отставание костного возраста от 1 года до 6 лет, что определяет
нарушение сроков регенерации повреждений костной ткани. Проявление нарушений
репаративного остеогенеза в виде замедленной консолидации переломов, формирования
псевдоартрозов и дефектов костей требует длительного лечения с использованием сложного
комплекса оперативных вмешательств, при этом не всегда достигается удовлетворительный
результат.
Цель данного исследования – разработка нового способа лечения ложных суставов в
экспериментальной модели у лабораторных животных.
В качестве такой модели была выбрана модель нестабильного остеосинтеза, на которой были
получены рентгенологическая и гистологическая картины ложных суставов, сопоставимая с
клинической картиной у человека.
Из литературных данных известно, что причиной развития патологического процесса в области
повреждения кости не является отсутствие или недостаток местного кровообращения, факторов
роста TGFb, PDGF и BMP 2/4 [2, 3]. По мнению авторов, главным условием для формирования
ложного сустава является отсутствие грануляционной ткани со стороны периоста и эндоста,
которая содержит малодифференцированные клетки (мультипотентные стромальные клетки,
МСК), способные к неоостеогенезу [4].
Современный уровень развития клеточных технологий позволяет создавать живые эквиваленты
костной ткани – тканеинженерные конструкции (ТИК), состоящие из матрикса и
предшественников клеток костной ткани.
Источником получения клеточной культуры прогениторных клеток могут служить
мультипотентные стромальные клетки костного мозга или жировой ткани. С точки зрения
наименьшей инвазивности для детского возраста, оптимальным источником МСК может служить
жировая ткань.
Для того чтобы поддержать объем необходимого количества вновь образованной костной
ткани, необходимо использовать материалы-носители для клеточной культуры, обладающие
достаточными механическими, остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами, а также
быть биорезорбируемыми и не вызывать токсическую или иммунную реакцию.
В качестве такого материала был выбран «Остеоматрикс» высокоочищенный костный матрикс
с сохраненными коллагеновым и минеральным компонентами и природной архитектоникой.
Материалы и методы
Экспериментальное изучение использования клеточных технологий для лечения ложных
суставах производились на крысах Wistar. С этой целью было сформированно 4 группы животных
по 5 крыс в каждой. Сроки вывода животных составили 4 месяца после повторной операции
(трансплантации ТИК) на ложном суставе.
Культура МСК стромально-васкулярной фракции жировой ткани
Для выделения первичных культур МСК использовали образцы жировой ткани холки
кроликов. Биоптаты в течение одного часа после операции доставляли в лабораторию в
транспортном контейнере. Жировую ткань многократно промывали раствором Хенкса , затем
добавляли стерильный раствор коллагеназы I типа (250 Ед/мл) и инкубировали при 37 °С в
течение 2–3 часов. Изолированные клетки осаждали центрифугированием и переносили в
культуральную посуду с полной ростовой средой (DMEM/F12 1:1 с добавлением эмбриональной
телячьей сыворотки до 10 %, L-глутамина и амикацина). Флаконы помещали в CO2-инкубатор при
стандартных условиях, через 24 часа проводили замену среды, удаляя при этом непрекрепленные
клетки.
В течение 1–1,5 недель культура МСК достигала субконфлюентного монослоя, после чего ее
рассаживали в 5–7 раз; в работе использовали клетки 4–5 пассажа.
Остеогенная дифференцировка
Для направленной дифференцировки клетки рассаживали на 90 мм чашки Петри или
6-луночные планшеты и после достижения ими конфлюентного монослоя заменяли ростовую
среду на дифференцировочную (ростовая среда с добавлением 1,25-дигидроксивитамина D3 10–
8
М, L-аскорбиновой кислоты 50 мг/Л, β-глицерофосфата 10–2 М). Для выявления очагов
минерализации клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером, фиксировали
охлажденным 70 %-этанолом и окрашивали 40мМ ализариновым красным S (pH = 4,1,
«Мосреактив») в течение 5 мин. Несвязанный краситель отмывали ФСБ.
Затем культуру клеток наносили на биокомпозитный материал. Полученная конструкция
транспортировалась в стерильной упаковке на операционный стол.
Хирургическая техника
Для получения модели ложного сустава необходимо каким-либо образом помешать
естественной консолидации костных отломков друг с другом.
Для этого была использована экспериментальная модель нестабильного внутрикостного
остеосинтеза [5]. Под общим наркозом производится продольный разрез кожи и подкожножировой клетчатки в медиальной области бедренной кости. Тупым и острым способом
разъединяются нижележащие слои мышц, обнажая среднюю часть диафиза. Остеосинтез
производили путем фиксации отломков тонкой спицей, заведомо меньшего диаметра
интрамедуллярного канала, моделируя ятрогенный нестабильный остеосинтез. В данной модели
развитие ложного сустава осуществляется за счет удаления сочленяемых отломков друг от друга и
деструктивных воздействий сдвиговых напряжений при контакте отломков в процессе активности
лабораторного животного.
После ренгенологического подтверждения об образование ложного сустава всем группам,
кроме контрольной, производилась повторная операция.
В группе с консервативным лечением производился остеосинтез с помощью спицы,
закрепленной в интрамедуллярном канале между отломками. Для этого под общим наркозом
производился доступ к ложному суставу, его рассечение и очистка концевых частей кости от
фиброзно-соединительной ткани и прочих фрагментов. После этого, через тазобедренный сустав
вводилась спица и закреплялась в дистальной части коленного сустава, а оставшийся конец
загибался под кожу в области бедра.
В группе опытной между отломками производилась установка тканеинженерной конструкции
(ТИК) на основе блока материала «Остеоматрикс» тороидальной формы с иммобилизированными
на нём ММСК жировой ткани, преддифференцированных в остеогенном направление.
Методы гистологического исследования
Образцы костной ткани, полученные от животных всех групп фиксировали в 10 %-ном
растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере по Лили на 72 часа, после чего в течение
24 часов образцы ткани промывали в проточной воде.
Декальцинацию проводили в перенасыщенном растворе ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) с
добавлением хлорида натрия (9 граммов на литр раствора) на электрофорезе. После стандартной
гистологической проводки образцы тканей заливали в парафин, используя гистологические
заливочные кольца (Биовитрум). Срезы получали на микротомах Reichert (7 мкм для
светооптического исследования).
Результаты гистологического исследования
При гистологическом исследовании образцов ткани (см. рис. 1), полученных из диафиза
бедренной кости, через 8 недель после наложения нестабильного остеосинтеза отмечается
бокаловидные расширения дистальной и каудальной частей бедренной кости формирующих
ложный сустав. Между костными отломками определяется плотная оформленная соединительная
ткань, бедная сосудами. Среди волокон определяются клетки как веретеновидной формы, так и
хондроцитоподобные. В ряде случаев на внутренней части отломков бедренной кости
обнаруживается прослойка гиалинового хряща и "суставной" щелью. Костно-мозговой канал
заполнен созревающим костным регенератом ретикуло-фиброзной и пластинчатой костью с
костно-мозговыми полостями. Область ложного сустава окружена соединительно-тканной
капсулой. Среди исследованных образцов 40 % имели суставную полость между отломками,
40 % имели гистологическую картину туголожного сустава, а в 20 % случаев в исследуемой
области обнаружена поперечно полосатая мышечная ткань – интерпозиция мягких тканей (рис 1).
При гистологическом исследовании образцов ткани, полученных из диафизов бедренной кости
крыс после операции по формированию ложного сустава выявлено, что между костными
отломками определяется фиброзная хрящевая ткань, бедная сосудами. Впереди полей
волокнистого хряща определяются некротические зоны с костными секвестрами разного размера
содержащие сенментоядерный клетки и макрофаги. Края отломков костей соединены между собой
капсулой из фиброзной ткани.
Рис. 1. Гистологическая картина ложного сустава: а – ложный сустав в модели, б – после операции
остеосинтеза, в – после имплантации материала, г – после трансплантации ТИК (Окраска
гематоксилин&Эозин)