Основная часть
advertisement
Содержание Введение ................................................................................................................... 2 Основная часть ...................................................................................................... 29 Аналитический отчет о проведении экспериментальных исследований..... 29 Результаты экспериментальных исследований. ............................................. 44 Публикации результатов НИР ............................................................................. 53 Заключение ............................................................................................................ 55 Список использованных источников .................................................................. 56 Приложение ........................................................................................................... 57 1 Введение Гели – перспективные лекарственные формы для лечения гинекологических заболеваний Одним из направлений развития фармацевтической науки является разработка и внедрение в медицинскую практику новых высокоэффективных лекарственных препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов. Рост числа заболеваний данной группы, увеличение случаев токсикоаллергических реакций, неудовлетворительные результаты лечения свидетельствуют о нерешённости данной проблемы. Для лечения гинекологических заболеваний широко используют мягкие лекарственные формы, а именно мази или гели. Преимуществом данных лекарственных форм является возможность создания одновременно антимикробного, обезболивающего, противовоспалительного действия и необходимой концентрации лекарственных веществ непосредственно в очаге поражения (например, при лечении пиодермий в области воспалительного узелка, пустулы и фликтены); способность пролонгировать терапевтический эффект и обеспечивать минимальное травмирующее действие на кожу. Использование мазей или гелей позволяет снизить вероятность возникновения побочных реакций, которые часто имеют место при пероральном и инъекционном применении. Вспомогательные вещества для мазей и гелей выбирают с учетом области назначения и длительности применения препарата, его эффективности и безвредности, биодоступности лекарственного вещества, совместимости лекарственного и вспомогательного вещества, технологии изготовления ЛФ, реологических свойств, физико-химической, химической и микробиологической стабильности, а также срока хранения. В процессе изготовления и хранения мазей и гелей необходимо принимать меры, обеспечивающие их однородность (равномерное 2 распределение лекарственных и вспомогательных веществ, отсутствие посторонних включений, а также физическую стабильность). Если в ходе технологического необходимо процесса проводить возможно контроль нарушение продукции однородности, путем то количественного определения лекарственных веществ при специальном отборе проб. При производстве лекарственных форм, содержащих диспергированные частицы, предусматривается контроль размера частиц, обусловленного назначением данного лекарственного препарата. При изготовлении, упаковке, хранении и реализации мягких лекарственных форм должны быть приняты соответствующие меры, обеспечивающие необходимую микробиологическую чистоту. Микробиологическую чистоту гелей и кремов обеспечивают посредством антимикробного действия и надлежащих условий производства. Мази и гели, предназначенные для нанесения на раны или на сильно поврежденную кожу должны быть стерильными. Для таких препаратов устанавливают срок хранения после первичного вскрытия упаковки. Таким образом, современные мази и гели должны обеспечивать необходимый фармакологический эффект; иметь оптимальный размер частиц лекарственного вещества, обеспечивать равномерное распределение лекарственного вещества во всей массе лекарственной формы; быть однородными, стабильными при хранении, иметь надлежащий товарный вид. При длительном применении лекарственной формы не должно быть токсических и аллергических реакций; производство мазей и гелей должно быть экономически целесообразным. 3 Исследования в области разработки гелевых лекарственных форм Гели — это мягкие лекарственные формы для местного применения, представляющие собой дисперсные системы с жидкой дисперсионной средой, реологические свойства которых обусловлены присутствием гелеобразователей в сравнительно небольших концентрациях. В этой лекарственной форме гелеобразователи дополнительно могут выполнять роль стабилизаторов дисперсных систем: суспензий или эмульсий; такие гели могут называться соответственно суспензионными гелями или эмульгелями. Гели – это бинарные системы, состоящие из пространственной сетки, образованной макромолекулами, в которой распределены молекулы низкомолекулярной жидкости. Основным отличием геля от раствора является то, что в растворах такие сетки непрерывно разрушаются, а в гелях сетка устойчива и не разрушается под действием тепла. 4 ГЕЛИ 1. По типу дисперсионной среды 1. Гели гидрофильны е 2. Гели гидрофобные 2. По пути введения 3. По способу введения 4. По другим признакам 1. Гель аппликационный 1. Гель гомеопатический 3. Гель дентальный 2. Гель ингаляционный 2. Гель липосомальный 4. Гель назальный 3. Гель смазывающий 1. Гель вагинальный 2. Гель глазной 5. Гель накожный 3. Гель с модифицированным высвобождением 6. Гель оральный 7. Гель пероральный 8. Гель раневой 9. Гель ректальный 10. Гель уретральный 11. Гель эндоцервикальный Рисунок 1 Классификация гелей Гели действуют преимущественно поверхностно, охлаждают кожу, уменьшают воспаление и зуд, могут применяться при остром и подостром воспалении с небольшим мокнутием, так как оказывают умеренное подсушивающее действие. Гели способны сохранять форму, обладают 5 пластичностью и упругостью, легко наносятся на поврежденный участок и хорошо удаляются с поверхности кожного покрова. Они применяются преимущественно в тех случаях, когда кожа не переносит жиров и необходимо избежать жировой мазевой основы. Гели являются идеальной лекарственной формой для использования их на слизистых оболочках (прямой кишки, влагалища, ротовой полости). Существует два типа гелей. Гель первого типа - это система полимер низкомолекулярная жидкость, в которой пространственная сетка образована химическими связями между молекулами. Такие гели не способны к течению, так как макромолекулы, будучи крепко сшиты, не способны перемещаться друг относительно друга. Примером этого типа гелей является сополимер стирола. Гели второго типа образуются при взаимодействии линейных или разветвленных полимеров, имеющих дифильные группы, со слабыми растворителями. Следовательно, при гелеобразовании происходит ухудшение растворяющей способности среды. К гелям этого типа относится охлажденный гель желатина Кроме того, гели подразделяют на разбавленные и концентрированные. К признакам разбавленного геля относится наличие небольшого количества локальных связей (узлов сетки), отсутствие взаимодействия между цепными участками и связанные с этим малые периоды релаксации. Признак концентрированного геля - сильное взаимодействие между участками цепей, приводящее к большим периодам релаксации. Наибольшая концентрация, при которой молекулы полимера начинают соприкасаться друг с другом является критической концентрацией, значение ее зависит от молекулярной массы полимера, его химического строения, природы растворителя, температуры. Возникновение в структуре каркаса обусловливает 6 специфические структурно-механические свойства гелей, такие как, прочность, обратимая деформация, отсутствие течения, эластичность. Гидрофобные гели (олеогели) приготовлены на основах, состоящих из гидрофобного растворителя (вазелиновое или растительное масло и др.) и липофильного гелеобразователя (полиэтилен, диоксид кремния и др.). Гидрофильные гели (гидрогели) приготовлены на основах, состоящих из воды, гидрофильного смешанного или неводного растворителя (глицерин, пропиленгликоль, спирт этиловый, спирт изопропиловый) и гидрофильного гелеобразователя (карбомеры, производные целлюлозы, трагакант и др.). По назначению гели классифицируют на медицинские (лечебные и лечебно-профилактические) и косметические. Лечебные и лечебно-профилактические гели широко применяются в различных областях медицины, например, гинекологии, дерматологии, стоматологии, офтальмологии, урологии и т.д. Следует отметить, что гель является наиболее удачной лекарственной формой для проведения локальной противовоспалительной, антимикробной и противовирусной терапии. В ряде исследовательских работ, посвящённых вопросам изучения вспомогательных веществ в технологии мягких лекарственных форм, указывается, что мази, изготовленные на гидрофильных основах с использованием полимеров, имеют ряд преимуществ перед мазями на традиционных мазевых основах. Высвобождение лекарственного вещества из мазей на основе полимеров идет наиболее полно и равномерно. Адсорбционные свойства таких основ позволяют поглощать кожные экскреторные и секреторные продукты. Обладая гидрофильными свойствами, полимерные основы хорошо распределяются по слизистым и кожной поверхности, применение их сопряжено с появлением охлаждающего эффекта. Гелевые основы с использованием полимеров способны образовывать при нанесении на кожу тончайшие гладкие пленки, обеспечивая пролонгированный эффект 7 препаратов. Полимерные основы, разрешенные для применения в фармации, не обладают канцерогенными, эмбриотоксическими и тератогенными свойств, не оказывают раздражающего, сенсибилизирующего, парааллергизирующего действия на кожу. Гидрогели широко применяются для лечения кожных заболеваний, вызванных грибковыми и бактериальными возбудителями, при поражении слизистых оболочек (гинекология, проктология, стоматология и т.д.) Учитывая охлаждающее и уменьшающее зуд действие, гели можно использовать при высыпаниях, связанных с укусами насекомых, а также при солнечном дерматите. Известны исследования Т.А. Панкрушевой и соавторов в области разработок новых составов мазей, имеющих гелеобразную консистенцию и обладающих многофакторным воздействием на воспалительные процессы кожи. В качестве субстанций использованы антибиотики и антисептики (левомицетин, эритромицин, ампициллин, фурацилин, этоний и т.д.). Их сочетание с тримекаином, пиромекаином, новокаином обеспечивало антибактериальное и обезболивающее действие мазей, которое, как отмечают авторы, усиливается в присутствии эфирных масел: укропного, мятного и эвкалиптового. В настоящее время на отечественном рынке возрастает количество противовоспалительных гелей, используемых в качестве средств против угревой сыпи. Например, гель дневной для жирной проблемной кожи, выпускаемый фирмой GreenMama (Россия). В состав геля входят: экстракты корня лопуха, лимонника, фиалки, череды, масло чайного дерева, азелаиновая кислота, агар-агар и т.д. Благодаря высокому содержанию фитоэкстрактов, гель обладает выраженным противовоспалительным характером, регулирует естественный жировой баланс, не сушит кожу, увлажняет её и витаминизирует. 8 Косметические средства в форме геля используются для ухода за сухой кожей, склонной к образованию морщин (для снятия макияжа, очищения и увлажнения кожи, повышения ее эластичности, массажа), для удаления кутикулы, до и после бритья. Сравнительно широко применяют маскирующие гели, предназначенные для ухода за проблемной кожей с целью очистки и подсушивания пятен, возникающих в результате угревой сыпи, и маскировки поврежденных участков кожи. Например, очищающий гель для жирной и проблемной кожи фирмы Oriflame (Швеция) предназначен для людей, страдающих угревой болезнью. В состав геля включены следующие активные ингредиенты: экстракт эхинацеи пурпурной, цинковая соль пирролидонкарбоновой кислоты и триклозан. Обладая антибактериальным и противовоспалительным действием гель не только эффективно устраняет процесс воспаления, но и удаляет загрязнения с поверхности кожи, не вызывая ее пересушивания. В производстве лечебных и лечебно-профилактических препаратов (мазей, гелей) широкое распространение получили: гели коллагена, гели полисахаридов (например, производные метилцеллюлозы, аубазидан), гели глинистых минералов (например, бентонитовых глин), гели полиэтиленгликолей (полиэтиленоксидов), гели сополимеров акриловой кислоты (карбопол, ареспол, мАРС), эфтидерм (водно-глицериновый комплекс (2,3-диоксипропил)-орто-титаната гидрохлорида), эфтиллин (смесь эфтидерма с эуфиллином и вазелином медицинским), эмульсионные воски, моноглицериды дистиллированные (МГД марки-1 на основе животных жиров, МГД марки-2 на основе растительных масел), стеарин косметический-D, высокомолекулярные спирты синтетических жирных кислот фракции С16-С21, Hispagel 200 и т.д. Среди большого многообразия полимерных материалов, используемых в качестве носителей, определенный интерес представляют редкосшитые 9 акриловые полимеры (РАП), выпускаемые фирмой “B.F. Goodrich company” (США) под названием Carbopol 934 Р, 940 Р, 941 Р и др. Отечественной промышленностью выпускаются его аналоги, получившие название «Акмид», «Аксам», «Ареспол», «мАРС». Высокая степень набухания редкосшитых акриловых полимеров (РАПов) в различных растворителях, исключительно сильная загущающая способность, стабильность вязкостных свойств в широком диапазоне температур и значений рН определяют возможность его использования для изготовления мазей, гелей и линиментов. Карбополы (USP) – набухающие в воде, высокомолекулярные соединения, редкосшитые монополимеры и сополимеры акриловой кислоты, которые образуют гидрогели в водном растворе. Монополимеры марки ˝карбопол˝ – полимеры акриловой кислоты, редкосшитые аллилсахарозой или аллилпентаэритритом. Сополимеры марки ˝карбопол˝ – полимеры акриловой кислоты, модифицированные длинной цепочкой алкилакрилатов (С 10 – С30) и редкосшитые аллилпентаэритритом. Структурная формула карбомеров состоит из следующих мономерных единиц (рис.2): Рисунок 2 Структурная формула РАПов 10 Карбопол 934 высокоэффективен в вязких формах, таких как вязкие гели, высококонцентрированные эмульсии и суспензии. Обеспечивает высокую стабильность. В водных средах имеет низкую текучесть, быстрое восстановление. Карбопол 940 – образует прозрачные гели с водой или водноспиртовой смесью, обладает максимально низкой текучестью и применим в форме спрея. Карбопол 980 - является наиболее эффективным загустителем из полимеров марки «карбопол», легко диспергируется и перемешивается. Карбополы Ultrez 10 и 21 образуют водные дисперсии, которые обладают следующими свойствами: легко диспергируются и перемешиваются; менее подвержены комкообразованию; обладают гораздо более низкой вязкостью перед нейтрализацией, что позволяет легко прокачивать концентрированные дисперсии. По внешнему виду представляют собой хлопьевидные порошки; диаметр фракций – от 2 до 7 микрон. Рисунок 3 Форма и размер частиц Карбопола 11 Основу можно использовать для введения антибиотиков (несмицина, полимиксина В), гормонов (преднизолона, дексаметазона, гидрокортизона), противогрибковых средств (гризеофульвина), витаминов А, В2, В6, Е, Д), антагонистов микроорганизмов и др. Для лечения дерматофитоза предложен линимент: Нафтилового эфира тиокарбаминовой кислоты 1,0 - 3,0 Этанола 5,0 - 30,0 Карбопола 1,0 - 2,0 Воды очищенной 0,00 - 15,0 ПЭГ- (200-1000) 10,0 - 80,0 Триэтаноламина 0,05 - 1,0 Мазь образует на коже тонкую пленку, легко смываемую водой, не пачкает белье, пролонгирует действие лекарственного вещества. В хирургии и дерматологии применяют пленкообразующую основу состава: Карбопола 934 4,0 Триэтаноламина 6,0 Этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) 0,5 ПВС 5,0 Лувиспола 10,0 ПЭГ-400 3,0 Глицерина 2,0 Воды очищенной до 1000,0 12 Предложены охлаждающие гели состава: Этанола 96% (или пропанола) 45,0 Карбопола 0,2 - 2,0 Триэтаноламина 0,2 - 2,0 Глицерина 0,2 - 5,0 Карбополы широко применяется в косметической практике как загустители при получении кремов в сочетании с эмульгаторами. В нашей стране в 1984 г. предложен в качестве компонента основ редкосшитый сополимер производного акриловой кислоты с аллиловым эфиром пентаэритрита (NH4 САКАП). NH4 САКАП - аморфный порошок белого цвета, набухает и растворяется в воде, этаноле и ряде других гидрофильных растворителей. Не обладает эмбриотоксичным, тератогенным и канцерогенным действием. По свойствам практически не отличается от карбопола 934 (США). Обладает высокой набухающей и загущающей способностью в концентрации 1-2%. В качестве основы для лечения гнойных ран применяют гели САКАПА, содержащие ПЭГ-400. Основы обладают большой осмотической активностью. Их используют для изготовления 0,2 % мази фурацилина. Состав Основа I Основа II Основа III САКАП 2,0 2,0 2,0 ПЭГ-400 20,0 40,0 60,0 0,1 м раствор NaOH до рН 5,0-7,0 13 Вода очищенная до 100,0 Основа II - лучше высвобождает фурацилин. Основа III - обладает более высокой осмотической активностью. В настоящее сополимерами время наиболее перспективными акриловой кислоты являются отечественными Ареспол и мАРС, представляющие собой аморфные порошки белого цвета, которые хорошо набухают и растворяются в воде, этаноле и ряде других гидрофильных растворителях. Как правило, технология изготовления геля состоит из двух этапов: изготовление гелевой основы и введение в основу лекарственного вещества. Порошок полимера насыпают тонким слоем на поверхность рассчитанного количества воды очищенной и оставляют набухать в воде в течение нескольких часов. Затем перемешивают с помощью механической мешалки MR-25 со скоростью 100 об/мин. до получения гомогенного гидрогеля, имеющего низкое значение рН, что связано с наличием в исходном продукте 56-68 % концевых карбоксильных групп. Для достижения оптимального значения рН (5,5-7,5) к гелю добавляют нейтрализующие агенты, в качестве которых могут быть использованы различные амины, гидроокиси щелочных и щелочноземельных металлов. Кроме полимеров редкосшитой акриловой кислоты широкое применение при разработке гелевых композиций нашли полиэтиленгликоли. Установлено, что важным свойством полиэтиленгликолей (ПЭГ) является способность образовывать с различными лекарственными веществами продукты взаимодействия, которые могут значительно влиять на биофармацевтические свойства лекарственных веществ. Например, понижать их раздражающее действие, повышать растворимость и пролонгировать фармакологический эффект. Доказано, что ПЭГ обезвоживают микробную клетку, резко снижают ее биологическую активность и ослабляют сопротивляемость к различным лекарственным препаратам. В результате 14 чего существенно возрастает антимикробная активность антибиотиков, сульфаниламидов и антисептиков. Благодаря способности ПЭГ абсорбировать экссудат, а вместе с ним и микробные токсины, продукты распада тканей, различные биологически активные вещества, например медиаторы воспаления, полимеры оказывают потенцирующее влияние на лечебный эффект лекарственной формы в целом. Для изготовления гелей полисахаридов наиболее широкое применение нашли различные производные целлюлозы: метилцеллюлоза (МЦ), натрийкарбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ). Эфиры целлюлозы – применяются в качестве стабилизирующих, пролонгирующих, структурообразующих средств для повышения качества лекарственных форм. Используют простые и сложные эфиры целлюлозы. Общая формула целлюлозы: [C6H702 (ОН)3 - x ОR)х]n Метилцеллюлоза растворимая (Меthylcellulosum solubile) является простым эфиром целлюлозы и метилового спирта [C6H702 (ОН)3-x (ОСН3)х]n, где х — число замещенных ОН-групп в одном звене; n —степень полимеризации. Натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Methytcellulosum-natrium) – натриевая соль простого эфира целлюлозы и гликолевой кислоты (Na-КМЦ): [С6Н702(ОН)3 (ОСН2СООNа)x] n - натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (Na-KМЦ) - представляет собой белый порошок слегка кремоватого оттенка с насыпной массой 400-800 кг/м3; плотность соли 1,59 г/см3. Растворимость Na-KМЦ в щелочах или в воде определяется степенью этерификации целлюлозы и условиями растворения. Получают 15 КМЦ взаимодействием целлюлозы с монохлоруксусной кислотой или (в производстве Na-KМЦ) с её натриевой солью в присутствии NaOH. Метилцеллюлоза представляет собой порошок или волокнистый материал без вкуса и запаха, гели МЦ и Na-КМЦ фармакологически безвредны. Применяют 2-8% гели МЦ и 3-6% гели Na-КМЦ. Для изготовления глазных мазей может быть использован 2-3% гель МЦ. Гели эфиров целлюлозы представляют собой вязкие, структурированные, прозрачные гели, без запаха; хорошо высвобождают лекарственные вещества, обеспечивая их резорбцию. Однако следует помнить, что гели эфиров целлюлозы могут быть несовместимы с резорцином, танином, растворами йода, аммиака, известковой водой, серебра нитратом, натрия тиосульфатом и др. веществами. Наиболее часто применяют следующие медленно высыхающие, благодаря наличию в них глицерина, основы: 1. Метилцеллюлоза 6,0 Глицерина 20,0 Воды очищенной 74,0 2. Na-карбоксиметилцеллюлоза 6,0 Глицерина 10,0 Воды очищенной 84,0 Процесс изготовления гелей метилцеллюлозы состоит в следующем: порошок МЦ заливают горячей водой (80-90 °С) в количестве 1/2 от всего объема, оставляют при комнатной температуре до охлаждения, приливают остальной объем холодной воды и выдерживают при температуре от 4С и 16 ниже до полного растворения. Получается прозрачный гель, который мутнеет при нагревании до 50 °С, но при охлаждении вновь образует прозрачный раствор. Гель МЦ входит в состав мазей "Ундецин", "Цинкундан", рекомендован для мазей с цинка оксидом, ихтиолом, кислотой салициловой и другими веществами; может применяться в мазях для защиты от света, для защиты кожи рук от органических растворителей, в покрывающих и охлаждающих мазях. При изготовлении гелей Na-КМЦ порошок предварительно заливают половинным объемом холодной воды, через 60 минут добавляют остальную воду и нагревают до 50-70 °С до полного растворения. В концентрации 2% Na-КМЦ входит в состав фурацилиновой пасты, рекомендована для мази с пиромекаином состава: Пиромекаина Метилурацила поровну по 5,0 Na-КМЦ 3,6 Глицерина 9,0 Воды очищенной до 100,0 В качестве основы 2-5% гели МЦ и Na-KMЦ, предложены для вагинальных мазей (например, 10% метронидозоловой), 3 - 5% гель МЦ и 4 - 7% гель NaKMЦ - для ректальных мазей. Гидроксипропилметилцеллюлоза ГПМЦ (Eph, USP) - химически модифицированная целлюлоза с вязкостью 3200- 4800 мПас, с содержанием метокси - групп 28-30% и гидроксипропилокси - групп - 7-12 %, структурная формула вещества приведена на рис 4. 17 Рисунок 4 Структурная формула гидроксипропилметилцеллюлозы Гидроксипропилметилцеллюлоза представляет собой белый порошок без вкуса и запаха, растворимый в холодной и водных растворах некоторых неорганических растворителей. Обладает высокой химической инертностью и относительно устойчива к микробной деградации. Применяется в качестве гелеобразующего агента. ГПМЦ прописана в монографиях USP и EP. В USP описано 4 различных типа ГПМЦ: 1828, 2208, 2906, 2910. Два первых знака означают количество метокси групп в структуре молекулы, и вторые два знака означают содержание гидроксипропильных групп. ГПМЦ — продукт неживотного происхождения. Обладает следующими физико-химическими свойствами: Порошок обладает хорошей текучестью и не образует пыли в воздухе; Растворим в воде в любых пропорциях с образованием прозрачной жидкости различной вязкости, в зависимости от типа ГПМЦ. При увеличении температуры или скорости перемешивания, вязкость обратимо уменьшается. ГПМЦ может растворяться в некоторых органических растворителях, например смесь этанола и 18 метиленхлорида. Соединения органических растворителей с водой также эффективны; Может выпадать в осадок при температуре превышающей 60°С. Из-за полимерной структуры, может образовывать комки. Существует несколько методов предотвращения неравномерного сгущения; ГПМЦ образует упругую пленку, не растворимую в масле и жире; В результате неионного строения, растворы ГПМЦ стабильны к различным значениям pH и толерантны к солям. В зависимости от природы солей, в высоких концентрациях могут образовываться хлопья даже при комнатной температуре. Вещество нетоксично и безопасно в использовании. Метоцель 4M Premium EP разновидность ГПМЦ, обладающая отличными от неё, менее выраженными вязкостными характеристиками. Гели глинистых минералов (бентонитовых глин). Бентонитовые глины имеют сложный состав. Это - алюмогидросиликаты, полимеры неорганической природы. Содержат примеси оксидов кальция, натрия, калия, магния, титана; алюминий может быть частично заменён на железо и магний. В состав кристаллической решетки входит вода. Благодаря ценным свойствам, бентонитовые глины в древности называли "земли аллаха". Наибольшее распространение получили бентониты гекмалинского месторождения (Азербайджан), черкасский бентонит (Украина), грузинский бентонит "Тиха-аскане". В настоящее время изучаются глины таджикского месторождения. Впервые бентонитовые глины применили в 1925 году в составе мазей с инсектицидами. В годы 2-ой мировой войны на основе бентонитовых глин успешно применялись мази с сульфаниламидами. Их способность образовывать пленку после высыхания давала возможность не использовать перевязочный материал. 19 Бентонитовые глины хорошо поглощают воду, набухают, образуя мягкие индифферентные гели, которые хорошо намазываются на кожу, легко отдают лекарственные вещества и сами способны поглощать кожные выделения. Перед использованием бентониты следует стерилизовать. В состав бентонитовых гелей входят бентониты 13-20%, глицерин 10% (для уменьшения высыхания), вода очищенная 70-77%. В аптеках Украины используется бентонитовая основа резорбин. Широко применяются бентонитовые основы в Болгарии, например, Состава: Бентонита 15,0 Глицерина 30,0 Полиэтиленгликоля 10,0 Воска 10,0 Воды очищенной до 100,0 Бентонитовые гели применяются как в дерматологии, так и в косметике для изготовления мазей, масок. Бентонитовые глины могут использоваться для получения сухих мазейконцентратов, порошков и таблеток. В настоящее время изготавливается 5% мазь цинковая "Т" с цинка оксидом на бентоните марки Тиха-аскане состава: Цинка оксида 5,0 Бентонита марки "Тиха-аскане", 25,0 20 Полиэтиленгликоля-400 55,0 Воды очищенной 15,0 5% стрептоцидовая мазь, мазь прополиса. Бентонитовые глины могут быть использованы также для изготовления мазей с серой, ксероформом, амидохлорной ртутью, дерматолом, борной кислотой, 10% ихтиоловой мази, 1% анестезиновой, 10% мази с калия иодидом. В эти мази рекомендовано добавлять до 0,5% фенола. Бентонитовые гели могут использоваться в качестве защитных мазей на вредных производствах. Например, для защиты рук от стекловолокна на производстве применяется 5% цигероловая мазь на эсилон- аминобентонитовой основе. Натриевые формы глинистых минералов применяют в лекарственных формах для внутреннего применения (таблетках, адсорбентах при отравлении и др.) HISPAGEL® - глицерин и глицерилполиакрилатный гель. Прозрачный гель без запаха, значение рН = 4,7-5,5; вязкость 10% геля в воде 12000 – 17000 мПа х с при 20 об / мин, 25 ºC. Благодаря своим реологическим свойствам, растворимости в воде и возможности гидратации, Hispagel 200 может быть использован как основа для растворимых в воде и увлажняющих водных гелей, сохраняющих свои реологические качества даже при концентрации 30 - 50%. 21 Рисунок 5. Зависимость вязкости от концентрации геля. Гели на основе Hispagel при применении образуют на коже проницаемую пленку, превосходно удерживают воду, обладают смягчающем действием. Hispagel может использоваться как увлажняющий компонент для косметических средств по уходу за кожей и волосами, или как загуститель и стабилизирующий компонент для косметических средств, например кремов, гелей, лосьонов. Производство гидрофильных гелей на основе полимеров является трудоемкой операцией, которая обычно требует специального оборудования, такого как высокоскоростные мешалки. Получить постоянные и воспроизводимые вязкости в конечном продукте не так легко. Hispagel делает производство лечебно-косметической продукции гораздо легче, потому что он немедленного и легко растворяется в воде и не требует нейтрализации. Вода просто медленно добавляется в Hispagel, на малой 22 скорости вращения оборудования, чтобы избежать попадания в гель воздуха. При включении фармакологически активных компонентов в состав геля Hispagel необходимо учитывать растворимость субстанций в воде и глицерине, чтобы избежать помутнения системы. Если используются ионные компоненты, вязкость может уменьшаться. Рисунок 6. Увлажняющие свойства Hipagel 200 Hispagel является отличным выбором для инкапсулированных продуктов, лечебно-косметических средств например на основе хитозана, витамина А и ментола. Небольшие количества липофильных веществ, консервантов и корригентов запаха могут быть легко солюбилизированы в состав геля не оказывая влияния на прозрачность. Примеры такого применения приведены в таблице 1, прозрачный гель для ног. 23 Таблица 1 Фаза I. II. III. Компоненты INCI % Функция Hispagel 200 Glycerin and Glyceryl polyacrylate 25 Увлажняющий гель, структурообразователь Вода, деионизированной Aqua До 100 Растворитель Витацель (Vitacell LS 8430) Yeast Extract 3 Дрожжевой экстракт Консерванты, коррегенты запаха q.s Эмульгин (Eumulgin L) PPG-1-PEG-9 Lauryl Glycol Ether q.s. Солюбилизатор Инкапсулированный ментол (Menthol) 0,5 Охлаждающее действие Encapsulated Menthol Значение pH: 5,5 Вязкость (мПа х с) Брукфилд, температура 20º C, 10 об / мин: 12000 Технология изготовления. Добавить воды в Hispagel 200, помешивая, с малой скоростью, до однородного набухания (Фаза I). Добавить Фазу II при низкой скорости перемешивания. Затем добавить ментол и скорректировать значение рН. Hispagel совместим с этанолом и не оставляет перхоти, не сушит кожу головы, поэтому может использоваться для изготовления гелей для укладки волос. В кремах и лосьонах Hispagel может использоваться в качестве загустителя и стабилизатора для эмульсий (масло/вода и вода/масло), т.к. стабилен в большом диапазоне значений рН от 5 до 11. 24 Рисунок 7 Зависимость вязкости от значения рН (Hispagel 200) Альгиновая кислота и ее соли являются полисахаридами. Широкое использование морских полисахаридов связано с такими их свойствами, как вязкость, способность к набуханию. Альгиновая кислота и альгинаты широко применяются в медицине (в качестве антацида) и как вспомогательные вещества (структурообразователи). Альгиновая кислота выводит из организма тяжёлые металлы (свинец, ртуть и др.) и радионуклиды. Многие целебные свойства морской капусты объясняются именно наличием альгиновой кислотой. Рисунок 8 Химическая формула альгиновой кислоты Звенья полигулуроновой и полиманнуроновой кислот, связанные в основном β-(1,4)-гликозидными связями, с небольшими разветвлениями. Соотношение маннуроновая: гулуроновая кислота меняется в зависимости от вида водорослей от 1:0,4 до 1:1,9. 25 Альгиновая кислота - желтовато-белый волокнистый порошок. Плохо растворима в карстворах карбоната, гидроксида и фосфата натрия; нерастворима в воде, органических растворителях. Свойства меняются в зависимости от вида водорослей и соотношения гулуроновой и маннуроновой кислот. Альгиновая кислота является составной частью клеточных стенок (до 40%) бурых водорослей (сем. Phaeophyceae), например вида Macrocystis pyrifera, а также родов Sargassum, Laminaria и Eklonia. Получают путем выделения из щелочного растворара водорослей с последующей очисткой осаждением. Примеси: другие ингредиенты и стабилизатора, водорослей, хлориды. Разрешена в качестве гелеобразователя плёнкообразующих покрытий и для капсулирования. Альгинаты в организме человека не перевариваются и выводятся через кишечник. Альгинат натрия — соль альгиновой кислоты. Рисунок 9 Химическая формула альгината натрия Звенья гулуроновой и маннуроновой кислот, связанные в основном 1,4-ßгликозидньми связями, с небольшими разветвлениями. В карбоксильных группах водород замещён на натрий. Соотношение маннуроновая : 26 гулуроновая кислота меняется в зависимости от вида водорослей от 1:1,04 до 1:1,9. Натрия альгинат - желтовато-белый, иногда с сероватым оттенком, волокнистый порошок, гранулы или пластинки. Медленно образует вязкий коллоидный раствор в воде; нерастворим в спирте (и водно-спиртовых растворах с содержанием спирта более 30%), органических растворителях, кислых средах со значением рН < 3. Давая нерастворимые соли с ионами Са, Fe и др., может снижать степень их всасывания и эффективность усваивания. Альгиновая кислота, образующаяся из альгината натрия в желудке человека под действием содержащейся там соляной кислоты, в кишечнике не всасывается, но возможно её незначительное расщепление кишечной микрофлорой.В РФ разрешён в пищевых продуктах согласно ТИ в количестве согласно ТИ индивидуально или в комбинации с другими альгинатами (п. 3.6.3 СанПиН 2.3.2.1293-03); в качестве вспомогательного средства (материалы и твёрдые носители) для иммобилизации ферментных препаратов (п.5.6.4.1 СанПиН 2.3.2.1293-03). Применяется в качестве загустителя, гелеобразователя или стабилизатора в косметических и фармацевтических препаратах, например входит в состав лекарственного средства "Гевискон". 27 Составы гелей на гидрофильных основах. Таблица 2 Наименование компонента Гель на Карбополе Гель на ГПМЦ 0,06 Гель на МЦ Гель на Na-КМЦ Гель на основе Метоцель 0,06 0,06 0,06 - - Гель на основе бентонитовых глин Гель на основе Hispagel Гель на основе натрия альгината 0,06 0,06 0,06 - - - - Фермент (лактобактерии) 0,06 Карбопол 0,01 - до рН 4,5-5,0 - - - - - - - - 0,15 - - - - - - Триэтаноламин ГПМЦ вариант 1 ГПМЦ вариант 2 0,25 МЦ - - 0,2 - - - - - Na-КМЦ - - - 0,35 - - - - Метоцель - - - - 0,25 - - - Hispagel 200 - - - - - - 0,3 - Бентонитовые глины - - - - - 0,6 - - Натрия альгинат - - - - - - - 0,35 Вода очищенная До 10,0 До 10,0 До 10,0 До 10,0 До 10,0 До 10,0 До 10,0 До 10,0 28 Основная часть Аналитический отчет о проведении экспериментальных исследований Исследования, проведенные нами в период с 2006 по 2008 год в отношении поверхностных структур лактобактерий показали, что некоторые виды лактобацилл продуцируют в культуральную жидкость вещества гликопротеидной природы, избирательно реагирующие с природным лектином – конканавалином А [1, 3]. Проведенные эксперименты в условиях in vitro на эпителиоцитах влагалища подтвердили предположение, что данный лектинсвязывающий лактобактерий может компонент препятствовать (ЛСК) первому клеточной этапу стенки инфекционного процесса – адгезии, т.е. это вещество экранирует рецепторный аппарат эукариотической клетки и не допускает или значительно снижает степень адгезии патогенной и условно-патогенной флоры к клеткам-мишеням [2, 4, 5]. В настоящей работе мы продолжили наши изыскания в отношении модулирующего действия ЛСК L.fermentum 90 TS-4 (21) в условиях in vivo. Исследования проводились на 60 мышах «дикого» типа массой 30-40г, разделенных на шесть групп (2 группы контроля и 4 группы опыта). В экспериментальных условиях моделировался острый и рецидивирующий кандидоз влагалища с его последующей профилактикой и лечением с помощью ЛСК L.fermentum 90 TS-4 (21). ЛСК вводили в гель – Hispagel в концентрации 6мг/мл со значение рН – от 5 до 6. Группа мышей, обработанная гелем с ЛСК, давала снижение обсемененности слизистой влагалища, тогда как контрольная группа мышей демонстрировала начало процесса очищения намного позже. Для реализации экспериментальной части работы были использованы материалы и методы перечисленные далее. 29 Материалы. 1.1 Гели В работе были использованы следующие гели: 1.Карбопол набухающие в воде, высокомолекулярные соединения, редкосшитые монополимеры и сополимеры акриловой кислоты, которые образуют гидрогели в водном растворе. Монополимеры марки ˝карбопол˝ – полимеры акриловой кислоты, редкосшитые аллилсахарозой или аллилпентаэритритом. Сополимеры марки ˝карбопол˝ – полимеры акриловой кислоты, модифицированные длинной цепочкой алкилакрилатов (С10 – С30) и редкосшитые аллилпентаэритритом. Структурная формула карбомеров состоит из следующих мономерных единиц рис.10: Рисунок 10 Структурная формула РАПов 2. Карбопол ЕС 311 30 3. Гидроксипропилметилцеллюлоза химически модифицированная целлюлоза с вязкостью 3200- 4800 мПас, с содержанием метокси - групп 2830% и гидроксипропилокси - групп - 7-12 %, структурная формула вещества приведена на рис.11. Рисунок 11 Структурная формула гидроксипропилметилцеллюлозы 4. Метилцеллюлоза - является простым эфиром целлюлозы и метилового спирта [C6H702 (ОН)3-x (ОСН3)х]n, где х — число замещенных ОН-групп в одном звене; n —степень полимеризации. 5. HISPAGEL® - глицерин и глицерилполиакрилатный гель. Прозрачный гель без запаха, значение рН = 4,7-5,5; вязкость 10% геля в воде 12000 – 17000 мПа х с при 20 об / мин, 25 ºC. Благодаря своим реологическим свойствам, растворимости в воде и возможности гидратации, Hispagel 200 может быть использован как основа для растворимых в воде и увлажняющих 31 водных гелей, сохраняющих свои реологические качества даже при концентрации 30 - 50%. 1.2 Культуры бактерий Для оценки модулирующего действия ЛСК введенного в гель на адгезию условно-патогенной флоры к клеткам-мишеням использовали дрожжеподобные грибы рода Candida, выделенные от женщин с манифестной формой влагалищного кандидоза. 1.3 Питательные среды Для культивирования дрожжеподобных грибов рода Candida использовали плотную и жидкую среду Сабуро (таб.3) Таблица 3 Компоненты среды Плотная среда, г/300мл Жидкая среда, /300мл Пептон 3 3 Глюкоза 12 12 Дрожжевой экстракт 2 2 5,4 - Сабуро Агар-агар 32 1.4 Культуры клеток Для оценки модулирующего действия ЛСК введенного в гель на адгезию ДПГ рода Candida к эукариотическим клеткам, использовали эпителиоциты влагалища, полученные от здорового донора, подписавшего информированное согласие. 1.5 Лабораторные животные Для моделирования влагалищного кандидоза и его лечения в условия in vivo были использованы мыши «дикого» типа (самки) массой 30-40 г в количестве 60 шт. 1.5 Буферные растворы и реагенты 1. Забуференный фосфатами физиологический раствор (ФР) (ЗФР) рН7,2. К 100 мл 0.147 М раствора хлорида натрия добавляли 76 мл 0,15 М раствора Na2HPО4x2H2O и 24 мл 0,15 М раствора КН2РО4. 2. Фосфатный буфер (PBS) рН=7,2. Для приготовления 500 мл фосфатного буфера брали 360 мл 1,2% раствора Na2HPО4x2H2O и 140 мл 0,9% раствора КН2РО4. 3. Мессалин - действующее вещество эстрадиола бензоат. Регулирует развитие и нормальную функцию репродуктивной системы у самок. При повышении концентрации эстрадиола в крови стимулируется течка и, после достижения его определённого уровня, становится невозможным оплодотворение 33 яйцеклетки. Препарат биотрансформируется в печени, выводится с желчью, период полувыведения из организма собак 60 мин. СОСТАВ Содержит 0,2 мг/мл эстрадиола бензоата. ДОЗИРОВАНИЕ Вводят 0,01 мг/кг (0,5 мл/10 кг) на 3-й и 5-й день после вязки. Если сука вязалась несколько раз или время вязки точно не известно, препарат вводят дополнительно на 7 день. 4. Доксициклин - полусинтетический антибиотик группы тетрациклинов широкого спектра действия. Оказывает бактериостатическое действие за счет подавления синтеза белка возбудителей. Активен в отношении аэробных грамположительных бактерий: Staphylococcus spp. (в том числе штаммы, продуцирующие пенициллиназу), Streptococcus spp. (в том числе Streptococcus pneumoniae), Bacillus anthracis, Listeria monocytogenes; анаэробных бактерий: Clostridium spp. Доксициклин активен также в отношении аэробных грамотрицательных бактерий: Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Shigella spp.., Salmonella spp.., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Bordetella pertussis, а также в отношении Rickettsia spp., Treponema spp., Mycoplasma spp. и Chlamydia spp. К доксициклину устойчивы Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., Serratia spp., большинство штаммов Bacteroides fragilis. 5. Пенициллин – антибиотик группы биосинтетических пенициллинов. Оказывает бактерицидное действие за счёт ингибирования синтеза 34 клеточной стенки микроорганизмов. Активен в отношении: грамположительных бактерий: Staphylococcus spp., Streptococcus spp. (в том числе Streptococcus pneumoniae), Corynebacterium diphtheriae, Bacillus anthracis; грамотрицательных бактерий: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis; анаэробных спорообразующих палочек; Actinomyces spp., Spirochaetaceae. 5. Оборудование. 1. Микроскопию мазков и изучение адгезии ДПГ рода Candida на клетках ЭВ проводили с помощью светового микроскопа МБИ-15-2, производства ЛОМО. 2.Измерение оптической плотности культур проводили на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2МП. Методы 1. Культивирование ДПГ рода Candida Дрожжеподобные грибы вида Candida albicans культивировали на плотных и жидких питательных средах Сабуро при температуре 370С в течение 24-48 часов. 2. Изучение адгезии ДПГ рода Candida на поверхности клетокмишений, обработанных гелями с ЛСК После культивирования клетки ДПГ рода Candida трехратно отмывали от культуральной среды забуференным физиологическим раствором с помощью центрифугирования при 3000 об/мин – 15 мин. Концентрацию суспензии клеток формировали с помощью стандарта мутности 5ЕД. 35 Адгезия ДПГ рода Candida: Эпителиоциты влагалища получали в начале менструального цикла. Трижды отмывали ЗФР рН=7,2 путем центрифугирования при 1000 об./мин в течение 3 минут. Суточные культуры ДПГ рода Candida трижды отмывали забуференным физиологическим раствором и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 15 мин. Затем готовили клеточные взвеси по стандарту мутности, соответствующие 5 ед.. Адгезию ДПГ на ЭВ проводили при температуре 370С, объединяя взвесь клеток-мишеней и микробов в соотношении: 100 микробных клеток на один эпителиоцит. После 30 мин. инкубации клетки отмывали ЗФР и центрифугировали 2 мин, при 1000 об./мин. Таким способом клетки отмывали 3 раза. Из отмытого осадка готовили мазки (окраска по Граму), в качестве контроля делали мазки эпителиальных клеток до взаимодействия с лактобактериями. Учет адгезии лактобактерий проводили в 31-ом поле зрения. Подсчитывали количество бактерий на одну эпителиальную клетку. Определяли среднее значение адгезировавшихся микроорганизмов, ошибку среднего и стандартное отклонение. 3. «Стандартизация» лабораторных животных (мыши) по циклу овуляции с помощью препарата «Месалин» Каждому животному в течение 5 дней п/к вводили по 200 мкл раствора препарата «Мессалин» из расчета 200мкл гормона на 1мл физиологического раствора. 4. Моделирование дисбактериоза у лабораторных животных с использованием антибиотиков пенициллин и доксициклин (per os) 36 Для моделирование дисбактериоза у лабораторных животных каждой мыши на протяжении 5 дней в\в вводили по 0,05мл раствора пенициллина с концентрацией 3,2 мг в 1мл. Кроме того животные per os получали доксициклин в концентрации 40 мг в 1 мл. 5. Моделирование острого влагалищного кандидоза у лабораторных животных После «стандартизации» животных и моделировании дисбактериоза, каждому животному внутривлагалищно вводилась чистая культура дрожжеподобных грибов вида Candida albicans в концентрации 5ЕД в объеме 25 мкл. Через сутки проводили смыв со слизистой влагалища животного с целью определения обсемененности. Смывы отсевались на поверхность плотной питательной среды Сабуро. Культивировали микроорганизмы при 370С 24-48 часов. 6. Моделирование рецидивирующего влагалищного кандидоза у лабораторных животных После полной санации все животным п/к вводили по 200 мкл раствора препарата «Мессалин» из расчета 200мкл гормона на 1мл физиологического раствора, в\в вводили по 0,05мл раствора пенициллина с концентрацией 3,2 мг в 1мл и per os животные получали доксициклин в концентрации 40 мг в 1 мл. Данные мероприятия позволяли вызвать у животных рецидив инфекции. 7. Определение степени обсемененности слизистой влагалища мышей на протяжении всего эксперимента. На протяжении всей работы каждый два дня у всех животных брали смыв со слизистой влагалища. С помощью пипетки-дозатора и индивидуального наконечника животному во влагалище вводилось 25 мкл физиологического 37 раствора. Полученный материал отсевался на плотную питательную среду Сабуро. Посевы культивировались 24-48 часов при температуре 370С. В дальнейшем подсчитывалось количество колоний образующих единиц на поверхности среды. 8. Изучение модулирующего действия геля содержащего ЛСК и лишенного данного вещества на адгезию дрожжеподобных грибов вида Candida albicans к эпителиоцитам влагалища. Для предварительного тестирования модулирующего действия ЛСК введенного в гель было необходимо протестировать сами гели на их способность уменьшать или увеличивать адгезию условно-патогенной флоры к эпителиоцитам влагалища. Эпителиоциты влагалища получали в начале менструального цикла. Трижды отмывали ЗФР рН=7,2 путем центрифугирования при 1000 об./мин в течение 3 минут. Суточные культуры ДПГ рода Candida трижды отмывали забуференным физиологическим раствором и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 15 мин. Затем готовили клеточные взвеси по стандарту мутности, соответствующие 5 ед. Адгезию ДПГ на ЭВ проводили при температуре 370С, объединяя взвесь клеток-мишеней и микробов в соотношении: 100 микробных клеток на один эпителиоцит, предварительно эпителиоциты были обработаны гелями, содержащими ЛСК (6мг/мл) – опыт, и гелями лишенными данного компонента (контроль). В работе были протестированы следующие гели: 1. Карбопол 2. Метилцеллюлоза 3. Гидроксипропилметилцеллюлоза 38 4. Hispagel 5. Карбопол ЕС.311 9. Технология приготовление геля содержащего ЛСК для лечения и профилактики кандидозного вагинита. Технология изготовления гелей включает подготовительный этап и собственно процесс изготовления геля на основе фермента. Подготовительный этап производства: изготовление дезинфицирующих растворов, подготовку производственных помещений, оборудования, персонала, а также упаковки (тубы или банки). Технологический процесс состоит из следующих стадий: изготовление геля, фасовка, упаковка, оформление готовой продукции (маркировка) и оценка качества лекарственной формы. Изготовление геля начинают с подготовки лекарственной субстанции и основы. В операцию подготовки лекарственного вещества входят оценка качества по показателям ФС, дозирование ингредиентов и растворение фермента. В операцию подготовки основы входит процесс растворения и набухания полимера (ГПМЦ, РАПы, МЦ, Na-КМЦ, альгинат натрия), а также регулирование значения рН с помощью ТЭА (в случае использования РАПов). Изготовление основы РАП : вода (гель на карбополе). В производственную ёмкость отмеривают рассчитанное количество воды очищенной. Порошок карбопол наслаивают на поверхность воды и оставляют набухать в течение 4-х часов, затем систему перемешивают с помощью лопастной мешалки (ЭКРОС-8100) со скоростью 100-120 об/мин. 39 до получения гомогенного геля. После этого при постоянном перемешивании добавляют рассчитанное количество триэтаноламина, для получения заданного значения рН среды (5,5-6,5). Введение нейтрализующего агента приводит к загущению системы и повышает уровень вязкости. Ингредиенты тщательно перемешивают с помощью высокоскоростной мешалки. Полученный гель оставляют до полного завершения структурообразования в течение 10-12 ч. Изготовление основы ГПМЦ, МЦ, Na-КМЦ и т.д. : вода. В производственную ёмкость отмеривают рассчитанное количество воды очищенной. Порошок МЦ, Na-КМЦ, ГПМЦ и т.д. наслаивают на поверхность воды и оставляют набухать в течение нескольких часов, меняя температурный режим (3-8C), затем систему перемешивают с помощью лопастной мешалки (ЭКРОС-8100) со скоростью 50-80 об/мин. до получения гомогенного геля. Полученный гель оставляют до полного завершения структурообразования в течение 8 – 10 ч. Изготовление геля. Фермент растворяют в системе в части воды очищенной и смешивают с полученной на второй стадии основой полимер : вода очищенная, гомогенизируют. Изготовление геля на основе Hispagel 200 Фермент растворяют в рассчитанном количестве воды очищенной и смешивают с основой Hispagel 200, затем систему перемешивают с помощью лопастной мешалки (ЭКРОС-8100) со скоростью 50-80 об/мин. до получения гомогенного геля. Полученный гель оставляют до полного завершения структурообразования в течение 5- 6 ч. Фасовка готовой продукции. 40 Готовый гель фасуют по 10 г в алюминиевые тубы (ТУ- 64-7-678-90) с внутренним лакированным покрытием или пластмассовые контейнеры. Полученный гель представляет собой однородную, гелеобразную массу, без механических включений, светло – коричневого цвета. 10. Алгоритм выполнения эксперимента в условиях in vivo. Для выполнения экспериментальной работы было сформировано 6 групп мышей по 10 мышей в каждой группе. Группы распределились следующим образом: 1 группа – предупреждение рецидивирующего влагалищного кандидоза с помощью ЛСК (6 мг/мл) введенного в гель; 2 группа – контроль лечения рецидивирующего влагалищного кандидоза; 3 группа – лечение рецидивирующего влагалищного кандидоза с помощью ЛСК (6 мг/мл) введенного в гель; 4 группа - контроль влияния геля на лечение рецидивирующего влагалищного кандидоза; 5 группа - лечение рецидивирующего влагалищного кандидоза с помощью ЛСК (6 мг/мл) введенного в гель и взвеси нативной культуры Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21); 6 группа - лечение острого влагалищного кандидоза с помощью ЛСК (6 мг/мл) введенного в гель. Каждое животное в группе имело свой индивидуальный номер, например, 1 группа 1 мышь – 1.1, 1 группа 2 мышь – 1.2, 1 группа 3 мышь – 1.3 и т.д. 2 группа 1 мышь – 2.1, 2 группа 2 мышь – 2.2, 2 группа 3 мышь – 2.3 и т.д. Номерные метки наносились на шерсть животного с использованием химического красителя следующим образом: 41 1 мышь – метка на голове; 2 мышь – метка на шее; 3 мышь – метка на спине; 4 мышь – метка у основания хвоста; 5 мышь – метка на правой передней лапке; 6 мышь – метка на левой передней лапке; 7 мышь – метка на правой задней лапке; 8 мышь – метка на левой задней лапке; 9 мышь – метка на животе; 10 мышь – без метки. Все животные были женского пола, массой 30-40 г, в возрасте 90 дней. Эксперимент проводили по схеме представленной ниже (табл.4). Таблица 4 Схема эксперимента 1-5 1-5 Дни Манипуляции 1 2 3 4 5 6 группа группа группа группа группа группа 1.«Стандартизация» животных по циклу овуляции + + + + + + 2. Моделирование дисбактериоза + + + + + + 42 + + + + + + 8 8-32 4. Спонтанная санация слизистой влагалища + + + + + + 5. Моделирования рецидива ВК + + + + + + + 35-38 6. Предупреждение развития рецидива ВК с помощью введения геля с ЛСК (6мг/мл) 39/42 7. Введение во влагалище геля с ЛСК (6 мг/мл) 39/42 8. Введение во влагалище геля без ЛСК 39/42 9. Введение во влагалище геля с ЛСК (6 мг/мл) и живой культуры лактобактерий 39/42 10. Введение во влагалище геля с ЛСК (6 мг/мл) для лечения острого ВК 45-68 35-38 3. Моделирование острого влагалищного кандидоза (ВК) 11. Регистрация санации слизистой влагалища + + + + + + + + + + 43 Примечание: на протяжении всех дней эксперимента каждому животному проводили смывы со слизистой влагалища с цель контроля обсемененности ДПГ вида Candida albicans. Результаты экспериментальных исследований. 1. Изучение модулирующего действия геля, содержащего ЛСК или же лишенного данного вещества, на адгезию дрожжеподобных грибов вида Candida albicans к эпителиоцитам влагалища в условиях in vivo. В результате тестирования 5 видов гелей с концентрацией ЛСК 6 мг/мл и значением рН=5,0-6,0 было установлено, что из пяти гелей (карбопол, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, Hespagel, карбопол ЕС.311), содержащих ЛСК, первые три либо усиливают адгезию C.albicans на поверхности влагалищных эпителиоцитов, либо торможение адгезии не является статистически значимым по отношению к контролю. Пятый гель был исключен из дальнейшего эксперимента по причине высокой вязкости и увеличения адгезии Candida на клетках-мишенях. Хорошие показатели демонстрировал Hispagel. Поскольку введение в состав ЛСК в концентрации 6 мг/мл приводил к значительному снижение адгезии, а свободный от ЛСК гель, не изменял адгезии ни в каком направлении. Из данных на рисунке 12 видно, что гель карбопол, содержащий ЛСК (ГЛСК1) незначительно снижает адгезию ДПГ рода Candida к клеткам-мишеням. При этом тот же самый гель, но не содержащий ЛСК, абсолютно в той же степени влияет на способность микроорганизма взаимодействовать с эпителиоцитам влагалища. Тоже демонстрирует гель – метилцеллюлоза, который способствуя увеличению адгезии тестируемой культуры на клетках-мишени, не дает статистически значимого различия внутри системы. Гидроксипропилметилцеллюлоза в чистом виде, без ЛСК, стимулирует торможение адгезии ДПГ рода Candida, 44 но в присутствии активного компонента концентрата культуральной жидкости L.fermentum 90 TS-4 (21) исследуемый показатель значительно не изменяется. Только Hispagel (ГЛСК 4) уменьшает уровень адгезии с 5,7±0,7 до 0,5±0,1 тогда как тот же гель в чистом виде не увеличивал адгезивную активность ДПГ вида Candida albicans в статистически значимых пределах по отношению к контроль (физ.раствор) (рис.12). Основываясь на данных эксперимента для дальнейшей поисковой работы в отношении модулирующего действия ЛСК на адгезию ДПГ рода Candida в условиях in vivo был выбран гель – Hispagel. Рисунок 12 р тв о фи з .р ас ЛС К 4 Г 4 ГЛ СК 3 Г 3 ГЛ СК 2 Г 2 ГЛ СК 1 Г 1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ГЛ СК количество ДПГ C.albicans на поверхности одной клетки-мишени Модулирующие действие гелей на адгезию ДПГ Candida albicans к клеткам-мишеням биологические системы эксперимента 45 2. Изучение модулирующего действия геля содержащего ЛСК на адгезию ДПГ вида Candida albicans к эпителиоцитам влагалища в условиях in vivo. При введении во влагалище мыши 25 мкл Hispagel содержащего ЛСК в концентрации 6 мг/мл, на 39 и 42 день эксперимента, было получено снижение обсемененности слизистой влагалища ДПГ рода Candida уже на 48 день полня санация регистрировалась на 56 день (рис.13). Рисунок13 Терапевтическое действие ЛСК (6 мг/мл) введенного в гель Hispagel 40 КОЕ Candida albicans в мл 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 11 13 17 20 23 26 29 32 35 36 37 38 39 42 45 48 51 53 56 59 62 65 68 Дни эксперимента контроль опыт (лечение гелем с ЛСК) 46 В группе мышей, получающей внутривлагалищно гель, лишенный ЛСК, снижение обсемененности слизистой ДПГ рода Candida наступало лишь на 56 день эксперимента, а полное очищение на 62-ой (рис.14). Рисунок14 Терапевтическое действие геля Hispagel, содержащего ЛСК (6 мг/мл) и лишенного данного вещества 100 КОЕ Candida albicans в мл 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 11 13 17 20 23 26 29 32 35 36 37 38 39 42 45 48 51 53 56 59 62 65 68 Дни эксперимента контроль опыт (лечение ЛСК) контроль (без ЛСК) С целью предупреждения рецидива влагалищного кандидоза мышам первой группы с 35 по 38 день эксперимента вводили по 25 мкл геля с ЛСК. Полученные результаты свидетельствую, что к статистически значимому предупреждению инфекции ЛСК введенное в гель не приводит. Но вместе с тем провоцирует снижение обсемененности слизистой влагалища ДПГ вида Candida albicans на 48 день (рис.15). Данный результат перекрывается с результатом, полученным в группе мышей, которых лечили гелем с ЛСК (группа 3). 47 Рисунок15 Профилактическое действие ЛСК (6мг/мл) введенного в гель на развитие рецидива влагалищного кандидоза 40 КОЕ Candida albicans в мл 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 11 13 17 20 23 26 29 32 35 36 37 38 39 42 45 48 51 53 56 59 62 65 68 дни эксперимента предупреждение рецидива контроль опыт (лечение) 48 При комбинировании ЛСК, введенного в гель, с живой культурой Lactobacillus fermentum 90TS-4 (21) в группе мышей №5 было получено резкое увеличение обсемененности слизистой влагалища ДПГ рода Candida на 42 день эксперимента. На 48 день КОЕ Candida albicans в 1 мл снизилось почти в 20 раз до уровня КОЕ Candida albicans в 1 мл в группе мышей №3 (рис.16). Данный результат может быть дополнительным подтверждением тому, что применение пробиотических препаратов на основе лактокультур в период обострения инфекции приводит к осложнению течения влагалищного кандидоза и способствует увеличению обсемененности слизистой терминальной ниши. Однако, использование в качестве терапевтического средства ЛСК в концентрации 6мг/мл сглаживает этот эффект, возникший на фоне применения живой культуры Lactobacillus fermentum 90TS-4 (21). 49 Рисунок16 Терапевтическое действие ЛСК (6мг/мл) введеного в гель в сочетании с использованием чистой культуры Lactobacillus fermentum 90-TS4 (21) КОЕ Candida albicans в мл 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 11 13 17 20 23 26 29 32 35 36 37 38 39 42 45 48 51 53 56 59 62 65 68 дни эксперимента контроль опыт (лечение гелес с ЛСК) опыт (лечение гелем с ЛСК и L.fermentum 90-TS4 (21)) 50 3. Расчет дозы на единицу площади терминальной ниши. При определении дозы исходили из экспериментальной модели вагинального кандидоза. Проведен расчет, позволяющий экстраполировать экспериментальные данные, полученные iv vitro и in vivo на животных, на терапевтические дозы лечения для человека. Исходили из следующего. Объем влагалища мыши – 25 мкл (25*10-6л). Лечебная терапевтическая доза, выведенная в эксперименте, составляла 6 мг лектинсвязывающего компонента в мл каждые два дня в течении 5 дней. Объем влагалища женщины 0,05 л. Соответственно, экстраполируя дозу на объем влагалища женщины получаем значение – 30 мг лектинсвязывающего компонента в мл (или грамм) носителя (гель, суппозитории, микрокапсулы). Систематизируя и предварительно оценивая полученные результаты можно сказать, что использование при лечении ВК живых культур лактобактерий является не целесообразным вследствие углубления инфекционного процесс (увеличение обсемененности слизисто ДПГ Candida albicans). Лечение ВК комбинированным препаратом, в котором присутствует и культура и продукты жизнедеятельности лактобактерий (например, ЛСК), напротив может снижать обсемененность слизистой влагалища ДПГ Candida albicans за счет экранирования рецепторного аппарата эукариотических клеток ЛСК одновременно обогащая нишу транзиторными лактокультурами с последующим накоплением собственных представителей нормальной микрофлоры. На данном этапе все задачи полностью решены и достигнутая цель соответствует поставленной: 51 1. Изготовлена мягкая лекарственная форма (гель) разного состава: гель, содержащий ЛСК; - гель, содержащий ЛСК и Lactobacillus fermentum 90TS-4 (21). 2. Проведены экспериментальные исследования в условиях in vivo с использованием лабораторных животных, направленные на определение модулирующей активности Lactobacillus fermentum 90TS-4 (21) в отношении адгезивных свойств ДПГ Candida albicans. 3. Рассчитана доза ЛСК на единицу площади терминальной ниши. В настоящее урогенитального время тракта лечение микотических проводится с инфекции помощью специализированных антибиотиков, которые усугубляют состояние нормальной микрофлоры влагалища. Данные исследования позволяют надеется на создание препарата, который на фоне терапевтического действия сможет стимулировать резидентную микрофлору и предупреждать развитие рецидива ВК. 52 Публикации результатов НИР 53 54 Заключение Введение ЛСК в гель позволило оценить модулирующее действие компонента на адгезивную активность ДПГ Candida albicans по отношению к эпителиоцитам влагалища в условиях in vivo при остром и рецидивирующем ВК. Было установлено, что гель с ЛСК дает снижение обсемененности слизистой влагалища мышей уже на девятый день после первого применения препарата. В контрольной группе снижение обсемененности наступало лишь на 18 день. Применения в качестве дополнительного компонента живой культуры лактобактерий спровоцировало усугубление течения процесса ВК. Данные эксперименты показали терапевтического целесообразным средства жизнедеятельности, не например, сами применять культуры, лектинсвязывающий а в качестве продукты их компонент в концентрации 6 мг/мл. Дальнейшие поисковые исследования должны быть направлены на изучение адгезивной активности ДПГ, населяющими биотоп. Подобные эксперименты позволят в условиях in vitro составить представление о корреляционной зависимости между терапевтическим действием ЛСК и индивидуальным течением ВК. 55 Список использованных источников 1. Анохина И.В., Кравцов Э.Г., Яшина Н.В. и др. Характеристика поверхностных адгезинов лактобактерий, используемых при изготовлении препаратов пробиотиков.// Бюл.экспер.биол.- 2006.- Т.141. №6.- С.664 -667. 2. Анохина И.В., Кравцов Э.Г., Яшина Н.В. и др. Поверхностные адгезины лактобацилл, рыхло связанные с клеточной стенкой и элиминирующиеся во внешнюю среду при культивировании на жидких питательных средах // Бюл. Экспер. Биол. 2006. Т. 142, №11. С.557-561. 3. Анохина И.В., Кравцов Э.Г., Проценко А.В. и др. Бактерицидная активность компонентов культуральной жидкости Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) клон 3 и их способность оказывать модулирующее действие на адгезию дрожжеподобных грибов Candida albicans к клеткам влагалищного эпителия // Бюл.экспер.биол.- 2007.- Т.143. №3.- С.330 -334. 4. Анохина И.В., Кравцов Э.Г., Яшина Н.В. и др. Лектинзависимый адгезин как перспективный компонент композитного пробиотика // Вестник РУДН. 2007. Т.35, №2. С. 52-57. 5. Кравцов Э.Г., Ермолаев А.В., Анохина И.В. и др. Адгезивные свойства лактобактерий как один из критериев выбора пробиотиков // Бюл.экспер.биол.- 2008.- Т.145. №2.- С.192 -195. 56 Приложение Приложение 1 57 58
