На правах рукописи ПОНОМАРЕВА Елена Владимировна ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ИЗМЕНЕНИЯ
advertisement
На правах рукописи ПОНОМАРЕВА Елена Владимировна ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ ОДИНОЧНЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН ПРИ ГРАВИТАЦИОННОЙ РАЗГРУЗКЕ 03.03.01 – физиология 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Доктор биологических наук, профессор Шенкман Борис Стивович Доктор физико-математических наук Цатурян Андрей Кимович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор биологических наук Фомина Елена Валентиновна Доктор биологических наук, профессор Архипенко Юрий Владимирович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», биолого-почвенный факультет. Защита диссертации состоится « 24 » февраля 2011 г. в 1130 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медикобиологических проблем РАН по адресу: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д.76-а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения РАН ГНЦ РФ – Института медико-биологических проблем РАН. Автореферат разослан « 20 » января 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук М.А. Левинских 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Известно, что продолжительная невесомость сопровождается снижением тонуса, уменьшением силы и выносливости скелетных мышц человека (Григорьев А.И. и др., 2002; Fitts R.H. et. al., 2010). На уровне одиночного мышечного волокна гравитационная разгрузка также сопровождается атрофическими изменениями – уменьшением объема миофибриллярного аппарата и снижением основных сократительных характеристик. Важным параметром, описывающим сократительные способности мышечного волокна, является кальциевая чувствительность, которая характеризуется зависимостью развиваемой силы от концентрации ионов Са2+ в миоплазме, т.н. кривой «кальций-сила». Сдвиг этой кривой вправо Кальциевую свидетельствует чувствительность рСа = lg[Ca2+]), которая о снижении кальциевой характеризуют является отрицательным чувствительности. величиной рСа50 логарифмом (здесь концентрации кальция, при которой сила, развиваемая мышечным волокном, составляет половину максимальной. Уменьшение рСа50 наблюдают у животных и у человека в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки (Stevens L. et. al., 1993). Основными причинами снижения сократительных свойств одиночных мышечных волокон при гравитационной разгрузке являются отсутствие напряжения, в связи с устранением силы тяжести, и уменьшение нейромышечной активности. Сопутствующим условием невесомости является устранение опоры, которое приводит к уменьшению активности опорного афферентного входа и сопровождается снижением тонической мышечной активности (Григорьев А.И. и др. 2004). Другие факторы, сопутствующие функциональной разгрузке, такие как деградация цитоскелетных белков, накопление ионов кальция и сдвиг экспрессии тяжелых цепей миозина в сторону быстрых изоформ, также влияют на снижение сократительных параметров волокон скелетных мышц млекопитающих. Исследования в данной области ведутся достаточно давно, однако до сих пор неясно, какой из вышеперечисленных процессов является первичным в запуске гипогравитационного синдрома. 3 Цель работы. Исследование сократительных свойств одиночных волокон скелетных мышц человека и животных в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки и анализ возможных механизмов их изменения. Задачи исследования: 1. Проанализировать сократительные параметры волокон скелетных мышц крыс после трехсуточной моделируемой микрогравитации. 2. Сравнить изменения сократительных характеристик одиночных волокон постуральных и локомоторных мышц крыс после кратковременной гравитационной разгрузки. 3. Сравнить характер и степень изменений основных сократительных параметров одиночных мышечных волокон монгольских песчанок и крыс после космического полета одинаковой продолжительности. 4. Оценить, каким образом применение блокатора медленных кальциевых каналов L-типа отражается на сократительных параметрах волокон скелетных мышц крыс после моделируемой гравитационной разгрузки. 5. Исследовать роль опорного стимула и вызванного мышечного напряжения в качестве мер предотвращения снижения сократительных свойств волокон m. soleus человека после 7 суточной «сухой» иммерсии. Научная новизна работы: - впервые показано, что кратковременная трехдневная моделируемая гравитационная разгрузка приводит к снижению изометрической силы сокращения одиночных скинированных волокон m. soleus крыс. - впервые установлено, что при трехсуточном антиортостатическом вывешивании крыс основные сократительные параметры волокон быстрых мышц (m. gastrocnemius, m. tibialis anterior) остаются без изменений. - впервые показано, что после 7 суток антиортостатического вывешивания крыс снижаются основные сократительные параметры одиночных волокон быстрых m. gastrocnemius и m. tibialis anterior. 4 - впервые обнаружено, что после двенадцатисуточного космического полета монгольских песчанок наблюдается уменьшение диаметра и максимальной силы сокращения волокон камбаловидной мышцы. - впервые установлено, что трехсуточное антиортостатическое вывешивание крыс с одновременным пероральным приемом нифедипина препятствует снижению максимальной изометрической силы сокращения волокон камбаловидной мышцы. - впервые показано, что электромиостимуляция мышц голени человека во время семисуточной «сухой» иммерсии не предотвращает снижения максимальной и удельной силы сокращения одиночных волокон m. soleus. Научная и практическая значимость Работа в значительной мере расширяет наши представление об изменениях сократительных параметров одиночных мышечных волокон млекопитающих после гравитационной разгрузки. Представленные результаты позволяют предположить, что ключевую роль в снижении сократительных параметров мышечных волокон играют потеря напряжения и активности на разных сроках гравитационной разгрузки. Методы тензометрических измерений сократительных свойств мышечных волокон и результаты данной работы успешно используются в процессе обучения аспирантов Института медико-биологических проблем РАН и студентов-практикантов Московского физико-технического института (ГУ). Основные положения, выносимые на защиту: 1. Снижение сократительных параметров одиночных волокон постуральных мышц начинаются уже на третьи сутки моделируемой гравитационной разгрузки. 2. На раннем этапе гравитационной разгрузки у человека и животных изменения сократительных характеристик одиночных волокон определяются в первую очередь снижением нейромышечной активности. 3. Характер изменений сократительных свойств одиночных волокон в условиях микрогравитации имеет видовые отличия и зависит от функциональных особенностей мышц. 5 Публикации. Результаты диссертации изложены в 21 публикациях в научных журналах и сборниках конференций, из них 5 в ведущих российских и международных рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК. Апробация работы. Основные результаты были доложены на XXXVII Европейской мышечной конференции (Оксфорд, Великобритания, 2008); на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: новые методы исследования» (Пущино, 2010); на XXXI Международном гравитационном симпозиуме (Триест, Италия, 2010); на VII, IX «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов», посвященной дню космонавтики (Москва, 2008, 2010); на V Международной конференции по физиологии мышечной деятельности (Москва, 2009). Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол № 7 от 02.11.2010 г.). Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований ГНЦ РФ – ИМБП РАН, программ отделения биологических наук РАН, грантов РФФИ: 0704-00763а, 07-04-12153-офи, 10-04-00106-а. Структура диссертации. Работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждение, а также выводы. Диссертационная работа изложена на 107 страницах, содержит 22 рисунка, 6 таблиц и список цитируемой литературы из 132 источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальный материал. Основную часть данной работы составлял тензометрический анализ сократительных параметров одиночных волокон скелетных мышц млекопитающих. Эксперименты проводили с участием человека, а также с использованием экспериментальных животных: крыс породы Wistar (в возрасте 2 месяца, средней массой 190-220 г.) и монгольских песчанок (в возрасте 2 месяца, средней массой 55-60 г), выращенных в виварии Учреждения РАН ГНЦ РФ – ИМБП РАН. Для человека применяли модель семисуточной «сухой» иммерсии (Шульженко Е.Б., Виль-Вильямс И.Ф., 1976). Все испытуемые были добровольцами и 6 официально дали согласие на участие в исследованиях в соответствии с нормами Хельсинской Декларацией. Условия микрогравитации для крыс воспроизводили с помощью модели антиортостатического вывешивания (Ильин Е.А., Новиков В.Е., 1980; Wronski T.J., Morey-Holton E.R., 1987). Все экспериментальные процедуры были одобрены Комиссией по биомедицинской этике Учреждения РАН ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Забор мышечной пробы из m. soleus человека производили методом игольчатой биопсии по Бергстрему. У крыс и монгольских песчанок, умерщвленных овер-дозой пентобарбитала натрия или декапитацией, m. soleus, m. tibialis anterior и m.gastrocnemius выделяли целиком. Мышечные пробы обрабатывали по стандартной методике химического скинирования, то есть частичного разрушения клеточной мембраны. Согласно этому протоколу, подробно изложенному в работах группы Mounier (Mounier Y. et. al., 1989), образцы мышечной ткани помещали в скинирующий раствор, содержащий ЭГТА, непосредственно после выделения. После 24 часов обработки в скинирующем растворе мышечные пробы помещали в раствор для хранения, содержащий в равных долях скинирующий раствор и глицерин. Во всех растворах, использованных для отмывки мышечных проб, содержалось 2,5 мМ АТФ, для предотвращения образования состояния ригора. Экспериментальный материал использовали не ранее, чем через неделю, но не позднее 2 месяцев со дня помещения в раствор для хранения. Мышечные волокна выделяли из проб мышечной ткани с использованием микрохирургических инструментов. Из одной пробы получали в среднем 7 волокон. Сегмент волокна длиной 1-2 мм помещали в кювету с расслабляющим раствором R. Один конец волокна крепили к датчику силы (модель FORT 10, World Precision Instruments, США, чувствительность 1 В/мН, уровень шума <3 мкН), а другой – к неподвижному рычагу. Механическое сокращение одиночного мышечного волокна регистрировали 2канальным высокочастотным аналого-цифровым преобразователем, который был специально разработан Д.Д. Мациевским (Институт общей патологии и патофизиологии РАМН). Силу сокращения измеряли при 8 значениях концентраций ионов кальция, длительность записи сокращения для каждой концентрации составляла, в среднем, 1,5 минуты. Для регистрации сигналов датчика силы в нашем 7 институте была разработана программа управления экспериментом и сбора данных в память персонального компьютера (Литвинова К.С., 2005). Для анализа эксперимента использовали программный пакет, созданный на базе программы Лилльского технологического университета (Франция) в модификации ИМБП РАН, которая работала в среде Microsoft Excel. У каждого исследуемого волокна измеряли длину саркомеров по дифракции света гелий-неонового лазера (длина волны 633 нм, мощность 4 мВт). Под контролем дифракции устанавливали длину саркомеров 2,6 ± 0,1 мкм − для волокон из мышц крыс и песчанок и 2,4 ± 0,1 мкм − для волокон из мышц человека, что позволяло стандартизировать данные при измерении максимальной силы (Р0). Диаметр волокна измеряли с помощью бинокулярного микроскопа (×80) по микрометрической шкале, расположенной в окуляре (1 деление = 20 мкм). В начале эксперимента для каждого волокна прописывали нулевое значение силы в расслабляющем растворе, а затем максимальное изометрическое напряжение P0 при насыщающей концентрации Ca2+, соответствующей рСа = 4,2. После этого волокно расслабляли в растворе R в течение 3 минут, а затем регистрировали силу сокращения в каждом из 8-ми растворов с различными концентрациями Ca2+, начиная от минимальных значений к максимальным. Рассчитывали взаимосвязь сила – концентрация Ca2+. Каждая амплитуда силы сокращения, полученная для соответствующих растворов с различными концентрациями Ca2+, была нормализована на величину максимальной силы Р0. Экспериментальные результаты обрабатывали с использованием уравнения Хилла: P/P0 = ([Ca2+]/Kd)N / 1+([Ca2+]/Kd)N, где N – коэффициент Хилла, характеризующий крутизну зависимости P/P0 от рСа; Са2+ – данная концентрация ионов кальция, а Кd – постоянная Хилла (рКd= -logKd=pCa50); Р − сила, с которой сокращается волокно при данной концентрации Са2+; Р0 − сила максимального сокращения волокна в растворе с насыщающей концентрацией Са2+. Здесь pCa50 – это значение рСа, при котором развиваемая сила равна половине ее максимального значения. На основании полученных данных определяли удельную силу сокращения Pуд, которую рассчитывали как отношение максимальной изометрической силы поперечного сечения волокна: Руд= Р0 10-4/R2, где R=D/2. 8 сокращения к площади Растворы. Концентрацию компонентов во всех растворах рассчитывали по методике Fabiato A. (Fabiato A., 1974), конечная ионная сила растворов составляла 200 мМ, а рН 7,00. Скинирующий раствор содержал (в мМ): 20 MOPS, 2,5 Mg ацетат и 5 K 2-EGTA, 170 пропионат калия. Расслабляющий раствор R был такой же по составу, как и скинирующий. Активирующие растворы были приготовлены на основе расслабляющего раствора, содержавшего различные концентрации Са2+ (свободные ионы поступали из CaCO3). Во все экспериментальные растворы непосредственно перед их применением добавляли 2,5 мМ АТФ. Статистическую обработку проводили на персональном компьютере с использованием стандартной программы Microsoft Excel 2007®. Различие средних значений показателя в сравниваемых выборках считали значимым при уровне р <0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменения сократительных параметров одиночных волокон m. soleus, m. tibialis anterior и m. gastrocnemius после 3-х и 7-ми суточного антиортостатического вывешивания крыс Как известно, в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки наблюдается снижение сократительных параметров волокон скелетных мышц млекопитающих. Однако в литературе речь идет, как правило, о длительном воздействии невесомости. Нами было сделано предположение, что снижение сократительных свойств мышечных волокон начинается уже с самых ранних этапов гравитационной разгрузки. Для проверки данного предположения было проведено антиортостатическое вывешивание крыс сроками 3 и 7 суток. Исследование сократительных параметров проводили на одиночных волокнах медленного экстензора m. soleus, быстрого флексора m. tibialis anterior и быстрого экстензора m. gastrocnemius. Животные были разделены на 3 группы по 7 особей в каждой: «контроль», «3HS» и «7HS». Во всех экспериментальных группах крысы получали комбинированный корм в соответствии с кормом для лабораторных животных и воду ad libitum. В группе «контроль» крысы находились в стандартных условиях вивария. 9 В экспериментальных группах «3HS» и «7HS» крысы находились в положении антиортостатического вывешивания в течение 3 и 7 суток, соответственно. Анализ сократительных свойств одиночных мышечных волокон выявил, что после 3 суток вывешивания максимальная сила сокращения волокон m. soleus снизилась на 13%, при этом остальные параметры оставались без изменений. А после 7 суток моделируемой микрогравитации Р0 волокон постуральной мышцы упала уже на 46% относительно контрольных значений. Наряду с этим снизился диаметр волокон на 22%, а удельная сила уменьшилась на 12%, соответственно. Кроме того кривая кальциевой чувствительности сдвигалась вправо, а коэффициент Хилла, описывающий наклон кривой увеличился на 24%. Из полученных результатов ясно, что в волокнах постуральной мышцы начало деструктивных изменений было зарегистрировано, уже начиная с 3 суток функциональной разгрузки, а к 7-м суткам наблюдалось снижение всех основных сократительных параметров. Наряду с этим, известно, что после 3 суток антиортостатического вывешивания содержание цитоскелетных белков, титина и нибулина, остается на контрольном уровне, а после 7 суток заметно снижается (Подлубная и др., 2004). Можно предположить, что снижение рСа50 в какой-то мере обусловлено деградацией этих цитоскелетных белков. Рис.1. Зависимость максимальной силы от рСа скинированных волокон m. soleus крыс после 7суточного антиортостатического вывешивания. Представлены средние значения Р/Р0. Пунктирная линия – контроль, гладкая линия – антиортостатическое вывешивание. В волокнах быстрой мышцы m. tibialis anterior после 3 суток антиортостатического вывешивание не было отмечено достоверных изменений сократительных характеристик. Однако после 7 суток воздействия наблюдали достоверные снижения диаметра на 11%, максимальной изометрической силы сокращения на 33% и 10 удельной силы на 15%. Чувствительность миофибрилл к ионам кальция достоверно уменьшилась при неизменном значении коэффициента Хилла (табл. 1). Эти результаты доказывают, что в условиях 7-суточной гравитационной разгрузки снижение наблюдается снижение не только в медленной камбаловидной мышце, но и в быстром m. tibialis anterior, хотя изменения во флексоре менее выражены. Таблица 1. Сравнение основных сократительных параметров одиночных волокон m. soleus, m. tibialis anterior и m. gastrocnemius после 3 и 7 суток антиортостатического вывешивания контроль 3 HS 7 HS m. soleus D, мкм 67,8 ± 1,2 64,0 ± 1,0 53,1 ± 1,2 * Р0, мН 0,385 ± 0,012 0,334 ± 0,016 * 0,206 ± 0,008 * Руд, кН/м2 108 ± 4 104 ± 5 95 ± 4 * N 1,90 ± 0,10 2,02 ± 0,20 2,35 ± 0,11 * рСа50 5,93 ± 0,02 5,93 ± 0,02 5,72 ± 0,01 m. tibialis anterior D, мкм 71,2 ± 1,4 68,4 ± 1,7 63,3 ± 0,9 * Р0, мН 0,532 ± 0,022 0,513 ± 0,033 0,356 ± 0,012 * 2 Руд, кН/м 134 ± 4 138 ± 6 114 ± 4 * N 3,58 ± 0,18 3,43 ± 0,13 3,22 ± 0,11 рСа50 6,02 ± 0,01 6,01 ± 0,02 5,88 ± 0,01 * m. gastrocnemius D, мкм 64,1 ± 1,8 63,1 ± 1,2 57,8 ± 1,1 * Р0, мН 0,401 ± 0,013 0,420 ± 0,023 0,339 ± 0,010 * Руд, кН/м2 126 ± 6 134 ± 6 132 ± 7 N 3,34 ± 0,21 3,43 ± 0,25 3,34 ± 0,14 рСа50 6,06 ± 0,02 6,02 ± 0,02 5,94 ± 0,01 * *- достоверные отличия от контроля (р < 0,05) Из классической работы Юганова с соавторами (1963) известно, что при гравитационной разгрузке фоновая активность m. tibialis anterior крыс повышается, а активность m. soleus падает. Но, несмотря на повышение электромиографической активности, атрофические процессы, вызванные разгрузкой, продолжают развиваться. Можно сделать предположение, что на данном этапе разгрузки снижение сократительных параметров обусловлено в большей мере снижением механического напряжения. Повышенная электромиографическая активность m. tibialis anterior может сказываться небольшим компенсаторным эффектом при 7 суточной разгрузке. В m. gastrocnemius мы также не наблюдали изменений сократительных свойств волокон после 3 суток функциональной разгрузки. Однако было отмечено достоверное снижение диаметра волокон на 10% и максимальной силы сокращения 11 на 15% в группе «7 HS». При этом кривая кальциевой чувствительности сдвинулась вправо относительно контроля. Изменения сократительных параметров данного синергиста m. soleus описывались ранее в экспериментах на биоспутниках (Holy X., Mounier Y., 1991). По-видимому, основной причиной подобных изменений наряду со снижением напряжения, является накопление ионов кальция, что может быть сигналом к разрушению цитоскелетных и саркомерных белков. Изменения сократительных характеристик мышц монгольской песчанки после 12-суточного космического полета В 2007 году после длительного перерыва были возобновлены исследования на животных на борту российского биоспутника ФОТОН-М3. В предыдущих подобных экспериментах было показано снижение сократительных параметров одиночных волокон скелетных мышц обезьян и крыс (Szilagyi T., 1980, Оганов В.С., 1992,). На борту ФОТОН-М3 впервые использовался новый для космической физиологии объект – монгольская песчанка. Было выдвинуто предположение, что после космического полета изменения сократительных параметров одиночных мышечных волокон монгольских песчанок будут сопоставимы и аналогичны изменениям крыс после таких же сроков невесомости. Экспериментальные животные были разделены на 2 группы (n – количество особей): «контроль» (n = 11) и «полет» (n = 12). Монгольские песчанки в группе «полет» находились в условиях реального космического полета на космическом биоспутнике в течение 12 дней, а особи из группы «контроль» содержались в наземных условиях. В обеих группах животные были помещены в специальный модуль малого объема с автономной системой жизнеобеспечения, специально разработанный для этого проекта. В ходе этого эксперимента было получено, что изменения сократительных характеристик наблюдали только в волокнах m. soleus, тогда как в волокнах быстрой мышцы m. tibialis anterior достоверных изменений обнаружено не было (табл. 2). После полета диаметр волокон уменьшился на 20%, а снижение максимальной изометрической силы сокращения составило 22%. Поскольку в волокнах m. soleus снижение площади поперечного сечения волокон было более выраженным, чем уменьшение максимальной силы, то удельная сила сокращения после космического полета даже увеличилась на 18%. При этом после космического полета не изменялась 12 ни чувствительность миофибрилл к ионам кальция, ни коэффициент Хилла для m. soleus. Таблица 2. Сравнение сократительных характеристик волокон m. soleus и m. tibialis anterior до и после 12-дневного космического полета m. soleus контроль полет D, мкм 38,0 ± 1,9 30,5 ± 1,6 * Р0, мН 0,266 ± 0,021 0,208± 0,012 * 2 Руд, кН/м 226 ± 16 267 ± 16 * N 3,21 ± 0,19 3,50 ± 0,30 рСа50 5,78 ± 5,72 5,72 ± 0,04 *- достоверные отличия от контроля (р < 0,05) m. tibialis anterior контроль полет 41,8 ± 2,1 38,7 ± 1,5 0,347 ± 0,013 0,310 ± 0,017 242 ± 9 251 ± 18 4,10 ± 0,15 3,93 ± 0,23 5,74 ± 0,03 5,72 ± 0,04 Деградационные изменения в волокнах монгольской песчанки менее выражены по сравнению с данными, полученными ранее у крыс после 14 суточного полета (Szilagyi T., 1980). Такие расхождения в результатах могут определяться физиологическими особенностями нового объекта. Монгольская песчанка является пустынным видом и имеет характерные отличия в строении выделительной системы. Для нее характерна удлиненная петля Генле, что обеспечивает более эффективную реабсорбцию воды, приводит к уменьшению количества мочи и резко сокращает объем потребления жидкости. Специфический водно-солевой обмен этих животных определяет иной гомеостаз в клетках организма. Можно предположить, что существует некая система защиты структуры, а, следовательно, и сохранения функции в волокнах мышц монгольских песчанок в условиях гравитационной разгрузки. Изменения сократительных параметров одиночных волокон m. soleus, m. tibialis anterior и m. gastrocnemius после 3-суточного вывешивания крыс на фоне нифедипина Уже с первых дней гравитационной разгрузки в мышечных волокнах зарегистрировано повышение концентрации ионов кальция. Считается, что данный процесс запускает активацию специфических кальциевых протеаз – кальпаинов, чьими субстратами является ряд миофибриллярных белков, разрушение которых может быть одной из причин снижения сократительных параметров мышечных 13 волокон (Enns D.L., Belcastro A.N., 2006). Для проверки данного предположения был поставлен эксперимент по 3- суточному вывешиванию крыс на фоне потребления нифедипина. Нифедипин является селективным блокатором медленных кальциевых каналов L-типа, который препятствует накоплению ионов кальция. Животные были разделены на 3 группы по 7 особей в каждой: «контроль» – животные содержались в стандартных виварных условиях; «3 HS» – антиортостатическое вывешивание 3 суток; «3 HS nif» – антиортостатическое вывешивание крыс на фоне перорального потребления нифедипина (разведение в питьевой воде: 10 мг/ 1 кг веса животного). Таблица 3 Сократительные характеристики волокон m. soleus, m. tibialis anterior и m. gastrocnemius крыс после 3-суточного антиортостатического вывешивания без и на фоне потрбления нифедипина Контроль 3 HS m. soleus D, мкм 67,8 ± 1,2 64,0 ± 1,0 Р0, мН 0,385 ± 0,012 0,334 ± 0,016 * 2 Руд, кН/м 108 ± 4 104 ± 5 N 1,90 ± 0,10 2,02 ± 0,20 рСа50 5,93 ± 0,02 5,93 ± 0,02 m. tibialis anterior D, мкм 71,2 ± 1,4 68,4 ± 1,7 Р0, мН 0,532 ± 0,022 0,513 ± 0,033 Руд, кН/м2 134 ± 4 138 ± 6 N 3,58 ± 0,18 3,43 ± 0,13 рСа50 6,02 ± 0,01 6,01 ± 0,02 m. gastrocnemius D, мкм 64,1 ± 1,8 63,1 ± 1,2 Р0, мН 0,401 ± 0,013 0,420 ± 0,023 2 Руд, кН/м 126 ± 6 134 ± 6 N 3,34 ± 0,21 3,43 ± 0,25 рСа50 6,06 ± 0,02 6,02 ± 0,02 *- достоверные отличия от контроля (р < 0,05) 3 HS nif 66,5 ± 1,7 0,363 ± 0,015 108 ± 5 2,59 ± 0,15 * 5,65 ± 0,02 * 67,9 ± 2,1 0,469 ± 0,02 136 ± 7 4,54 ± 0,15 * 5,80 ± 0,02 * 64,5 ± 1,6 0,438 ± 0,01 138 ± 5 4,81 ± 0,07 * 5,79 ± 0,02 * Потребление нифедипина во время антиортостатического вывешивания привело к предотвращению снижения максимальной силы сокращения волокон m. soleus, которое наблюдалось при разгрузке без дополнительных воздействий. Сократительные характеристики других исследуемых мышц не менялись при антиортостатическом вывешивании и вывешивании на фоне потребления нифедипина. А вот кальциевая чувствительность при вывешивании с нифедипином 14 достоверно снижалась в волокнах как m. soleus, так и m. tibialis anterior и m. gastrocnemius. Кроме того, коэффициент Хилла в группе «3 HS nif» достоверно увеличивался по сравнению с контролем на 36%, 27% и 44% в m. soleus, m. tibialis anterior и m. gastrocnemius, соответственно (табл. 3). Таким образом, применение нифедипина позволило предотвратить снижение максимальной изометрической силы m. soleus, но при этом снизилась чувствительность миофибрилл к ионам кальция. Возможно, такая неоднозначность данных в нашем случае вызвана системным влиянием нифедипина. В связи с этим могла возникнуть некая «раскачка» системы поддержания ионного баланса, за счет искусственного воздействия на концентрацию ионов кальция. И, если, в случае 12дневного вывешивания применение другого хелатора кальция, ЭГТА, позволило предотвратить уменьшение рСа50 (Литвинова К.С., 2005), то на более ранних этапах разгрузки влияние нифедипина пока остается неясным. В любом случае, данный вопрос не должен в дальнейшем оставаться без внимания и последующие исследования в данной области могут пролить свет на эту проблему. Изменения сократительных характеристик волокон мышц человека после 7суточной «сухой» иммерсии Основными причинами развития гипогравитационного синдрома является снижение механического напряжения и нейромышечной активности. Оценить вклад данных факторов в изменения сократительных свойств волокон скелетных мышц человека можно с помощью «сухой» иммерсии (Шульженко Е.Б., Виль-Вильямс И.Ф., 1976). Данный экспериментальный подход обеспечивает практически полную безопорность и биомеханические условия организации двигательной деятельности, аналогичные действию невесомости. В проведенной в нашем институте 7-суточной «сухой» иммерсии принимали участие 9 мужчин – добровольцев (в возрасте 20-30 лет, вес 72 ± 3 кг), которые были разделены на 3 группы. В группе «чистая иммерсия» – добровольцы проводили 7 суток в иммерсионной ванной без дополнительных воздействий. В группе КОР – на фоне 7-суточной иммерсии применяли компенсатор опорной разгрузки, Действующим фактором КОР являются пневмостельки, размещенные в фиксирующей обуви и обеспечивающие давление на 15 ступни в локомоторном режиме. В группе ЭС – испытуемые пребывали в условиях иммерсии с применением высокочастотной электромиостимуляции мышц. Исследовали сократительные свойства одиночных волокон m. soleus, взятых у каждого испытуемого до и после иммерсии (табл. 4). Таблица 4. Сократительные параметры волокон m.soleus человека после 7-суточной «сухой» иммерсии Чистая иммерсия до после КОР до после 92,0 ±7,4 75,5 ±7,2 * 117,3 ±8,7 109,7 ±10,6 D, мкм 0,913±0,081 0,673±0,091* 1,187±0,043 1,045±0,094 Р0, мН 2 Руд, кН/м 137 ± 7 150 ± 5 $ 110 ± 10 111 ± 8 3,71±0,56 3,55±0,36 4,29±0,50 2,64±0,28* N 5,99±0,008 5,93±0,025 * 5,92±0,03 5,88±0,04 рСа50 *- достоверные отличия от преиммерсионных значений (р < 0,05) $ Электростимуляция до после 93,0 ±1,0 1,010±0,040 89,8 ±9,6 0,795±0,125$ 149 ± 5 126 ± 4 * 3,64±0,48 5,93±0,005 3,45±0,35 5,97±0,075 - отличия от преиммерсионных значений имеют тенденцию (р < 0,1) Рис.2. Зависимость максимальной силы (P0) от рСа скинированных волокон m. soleus человека после 7суточной «сухой» Представлены средние иммерсии. значения Р/Р0. Пунктирная линия – контроль, гладкая линия – чистая иммерсия. В группе «чистая иммерсия» наблюдали достоверное снижение максимальной изометрической силы одиночных мышечных волокон на 26% по сравнению с контрольным исходным значением данного параметра. При этом в группе «электростимуляция» снижение максимальной силы сокращения на 20% отражало лишь тенденцию (р < 0,1), а в группе «КОР» мы не наблюдали значимых отличий между значениями Р0 до и после иммерсии. Изменения диаметра мышечных волокон 16 наблюдали лишь в группе «чистая иммерсия», где его значение достоверно снижалось на 18% по сравнению с контролем (р < 0,05). В группах «КОР» и «электростимуляция» средний диаметр волокон до и после иммерсии не различался. Удельная сила сокращения имела тенденцию к увеличению в группе «чистая иммерсия», а в группе «КОР» оставалась без изменений. При применении электростимуляции удельная сила сокращения достоверно снижалась на 15%. Изменения кальциевой чувствительности мышечных волокон, которую оценивали по параметру рСа50, были аналогичными изменениям диаметра волокон. В группе «чистая иммерсия» его значение достоверно уменьшалось с 5,993 ± 0,008 до 5,927 ± 0,025 (р < 0,05) (рис. 2), а в группах «КОР» и «электростимуляция» – не отличалось от контрольных значений. Другим параметром, отражающим кальциевую чувствительность сократительного аппарата, является коэффициент Хилла. В группах «чистая иммерсия» и «электростимуляция» он не изменялся после иммерсии. В группе «КОР» он снижался почти вдвое: с 4,3 ± 0,5 в контроле до 2,64 ± 0,28 после иммерсии (р < 0,05). Данные результаты подтверждают ранее проведенные в нашем институте работы и свидетельствуют о развивающейся атрофии в m. soleus после 7-суточной сухой иммерсии, вызванные, в первую очередь, отсутствием опоры, что приводит к снижению напряжения в мышечном волокне (Григорьев А.И. и др., 2004). Применение КОР предотвращает снижение основных сократительных параметров после разгрузки за счет повышения активности опорного афферентного входа, однако уменьшение коэффициента Хилла может обозначать нарушение в структуре волокна, например, изменение кооперативности тропонин-тропомиозинового комплекса. Применение электромиостимуляции не предотвращало снижение максимальной и удельной силы сокращения волокон m. soleus. Возможно, это вызвано недостаточным временем электромиостимуляции по сравнению с действием компенсатора опорной разгрузки. Используемый режим электромиостимуляции, разработанный и описанный Я.М. Коцем (1970) специально для тренировки спортсменов перед соревнованиями, был направлен на прирост мышечной силы. Было показано, что при использовании высокочастотной электромиостимуляции происходит гипертрофия мышц за счет одинакового прироста объема волокон медленного и быстрого типа 17 (Коц Я.М. и др., 1994). Однако впоследствии было показано, что выбранный режим стимуляции с относительно высокой частотой и крутизной нарастания тока оказывает больший эффект на мышечные волокна быстрого типа (Коряк Ю.А., 1993). В то же время, известно, что в условиях невесомости наибольшие атрофические изменения наблюдаются в постуральной камбаловидной мышце, состоящей преимущественно из волокон медленного типа, атрофия которых во многом определяет гипогравитационный синдром. ВЫВОДЫ 1. Трехсуточное антиортостатическое вывешивание крыс приводит к достоверному снижению максимальной изометрической силы одиночных волокон m. soleus. 2. После семисуточного антиортостатического вывешивания крыс наблюдается снижение основных сократительных параметров как в волокнах m. soleus, так и в m. tibialis anterior и в m. gastrocnemius. Однако изменения в быстрых мышцах выражены слабее, чем в медленной. 3. После двенадцатисуточного космического полета зарегистрировано снижение силовых параметров волокон m. soleus монгольских песчанок, однако изменения сократительных свойств, в целом, менее выражены у пустынного вида, чем у крыс в аналогичных условиях. 4. Блокатор кальциевых L-каналов, нифедипин, предотвращает снижение максимальной изометрической силы сокращения волокон m. soleus после трех суток антиортостатического вывешивания крыс. 5. Применение опорной стимуляции при семисуточной «сухой» иммерсии позволило сохранить сократительные параметры одиночных волокон m. soleus человека на уровне предиммерсионных значений. 6. Вызванное мышечное напряжение не предотвращает снижения силовых характеристик волокон m. soleus человека во время семисуточной «сухой» иммерсии. 18 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Поперечная жесткость одиночных мышечных волокон после кратковременной гравитационной разгрузки. // «Научное наследие академика Л.А. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний». Санкт-Петербург . - 2008. - С. 120 – 121. (соавт. Огнева И.В.) 2. Сократительные свойства изолированной musculus soleus и ее скинированных волокон на ранних этапах гравитационной разгрузки: факты и гипотезы // Биофизика. – 2008. – 53(6). – С.1087-1094. (соавторы Алтаева Э.Г., Кравцова В.В., Качаева Е.В., Вихлянцев И.М., Подлубная З.А., Кривой И.И., Шенкман Б.С.) 3. Сократительные характеристики волокон и цитоскелетные белки m. soleus у монгольских песчанок после космического полета. // Материалы XLIII научных чтений памяти К.Э. Циолковского. Калуга. – 2008. – С. 161-162. (соавт. Липец Е.Н., Огнева И.В., Вихлянцев И.М., Карадулева Е.В., Подлубная З.А.) 4. Сократительные характеристики одиночных скинированных мышечных волокон после 3-х суточной моделируемой гравитационной разгрузки. // VII «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная дню космонавтики и приуроченная к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Москва. – 2008. – С. 50-51. 5. Early adaptations in rat soleus under simulated gravitational unloading (contractility and sarcomeric cytoskeletal proteins). // Journal of Gravit. Physiology. – 2008. – 15(1). – P. 89-90. (coauthors Kachaeva E.V., Altaeva E.G., Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A., Shenkman B.S.) 6. Early contractile adaptations to stimulated microgravity in rat soleus fibers: hypothesis and facts. // Biological Moltility: achievements and perspectives. Pushchino. – 2008. – P. 111. (coauthors B. Shenkman, E. Kachaeva, i. Vikhlyantsev, Z. Podlubnaya). 19 7. Functional alterations of single muscle fibers of m. soleus at the early stage of unloading. // XXXVI European Muscle Conference. Stockholm. – 2007. – P. 106. (coauthors E. Kachaeva, E. Altaeva, B. Shenkman) 8. The fiber contractility and cytoskeleton losses after 3-day hindlimb unloading // J. Muscle Res. Cell Motil. – 2008. – P.132. (coauthors E. Altaeva, I. Vikhlyantsev, Z. Podlubnaya, E. Kachaeva) 9. The fiber contractility and cytoskeleton losses in space are less pronounced in Mongolian gerbils. // Journal of Gravit. Physiology. – 2008. – 15(1). – P. 99-100. (coauthors Shenkman B., Lipets E., Ogneva I., Vikhlyantsev I., Koroduleva E., Podlubnaya Z., Kartashkina N.L., Kuznetsov S.L.) 10. The muscle fiber contractility and cytoskeleton losses in space are less pronounced in Mongolian gerbils. // Life in Space for life on Earth. Angers. – 2008. – Р. 126. (coauthors Shenkman B., Lipets E., Ogneva I., Vikhlyantsev I., Koroduleva E., Podlubnaya Z.) 11. Кратковременная изменениям в сократительных гравитационная мышечном разгрузка волокне способностей. // V и приводит последующему Международная к структурным снижению его конференция по физиологии мышечной деятельности. Москва. – 2009. – С. 71. (соавт. Огнева И.В.) 12. Сократительные характеристики волокон и цитоскелетные белки мышц задних конечностей монгольских песчанок после космического полета. // Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2009. – 43(3). – С. 34-39. (соавт. Липец Е.Н., Огнева И.В., Вихлянцев И.М., Карадулева Е.В., Карташкина Н.Л., Кузнецов С.Л., Подлубная З.А., Шенкман Б.С.) 13. Changes of transverse stiffness, contractile properties and resting calcium level in myofibres of postural muscles in Mongolian gerbils after 12-day simulated gravitational unloading // 30th Annual International Gravitational Meeting. – Xian. – 2009. – P. 105. (coauthors Ogneva I.V., Kurushin V.A., Altaeva E.G., Shenkman B.S.) 14. Decrease of contractile properties and transversal stiffness of single fibers in human soleus after 7-day dry immersion // 17th IAA Humans in space Symposium. Book of 20 abstracts. – 2009. – Moscow. – P.97. (coauthors I.V. Ogneva, E.G. Altaeva, N.M. Fokina, I.B. Kozlovskaya, B.S. Shenkman) 15. Effect of short-time gravitational unloading on rat and Mongolian gerbil muscles // J. Muscle Res. Cell Motil. XXXVIII European Muscle Conference. – Lille. – 2009. – P. 58. (coauthors Ogneva I.V., Kurushin V.A., Altaeva E.G., Shenkman B.S.) 16. Effect of short-time gravitational unloading on rat and Mongolian gerbil muscles // J. Muscle Res. Cell Mot. – 2009. – V. 30. – P. 261-265 (coauthors Ogneva I.V., Kurushin V.A., Altaeva E.G., Shenkman B.S.) 17. Влияние 3 и 7 суточного антиортостатического вывешивания на сократительные характеристики одиночных волокон m.soleus и m.tibialis anterior крыс. // IX «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная Дню космонавтики. Москва. – 2010. – С. 62-63. 18. Сравнительный камбаловидной анализ мышцы структурно-функциональных крысы и монгольской песчанки характеристик в условиях гравитационной разгрузки различной длительности. // Биофизика. – 2010. – 55(6). – С. 1117-1123 (соавт. И.В. Огнева, В.А. Курушин, М.М. Глашев, Е.В. Михайлова, Э.Г. Алтаева, И.И. Кривой, Б.С. Шенкман) 19. Decrease of contractile properties and transversal stiffness of single fibers in human soleus after 7-day “dry” immersion. // Acta Astronautica. – 2010. – (coauthors I.V. Ogneva, N.L. Kartashkina, E.G. Altaeva, N.M. Fokina, V.A. Kurushin, I.B. Kozlovskaya, B.S. Shenkman) 20. Gravitational unloading affects contractile properties of m.soleus fibers in mongolian gerbils differently than in rats. // Life in Space for life on Earth. Trieste. – 2010. – P. 85. (coauthors Kurushin V.) 21. Influence of species differences on contractile properties of soleus muscle fibers during rodent antiorthostatic unloading. // Biological Motility from fundamental achievements to nanotechnologies. Puschino. – 2010. – Р. 219-220. 21
