На правах рукописи ШАБАЛИНА Ирина Алексеевна МОДУЛЯЦИЯ СТРЕССОРНОЙ ВАЗОКОНСТРИКЦИИ ПРИ
advertisement
На правах рукописи ШАБАЛИНА Ирина Алексеевна МОДУЛЯЦИЯ СТРЕССОРНОЙ ВАЗОКОНСТРИКЦИИ ПРИ СОЧЕТАННОЙ АКТИВАЦИИ µ- И δ-ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ АГОНИСТАМИ С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ СТАБИЛЬНОСТИ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Архангельск – 2012 2 Работа выполнена на кафедре медицинской биологии и генетики Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Бебякова Наталья Александровна Официальные оппоненты: Совершаева Светлана Леонидовна доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет», заведующая кафедрой физиологии и восстановительной медицины Поскотинова Лилия Владимировна доктор биологических наук, доцент, заведующая лабораторией биоритмологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Уральского отделения Российской академии наук Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится «15» мая 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.008.04 при Северном (Арктическом) федеральном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 163045, Архангельск, пр. Бадигина, д.3. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «13» апреля 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, Старцева Лариса Фёдоровна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. В настоящее время показано, что опиоидергическая система играет важную роль в модуляции деятельности сердечно-сосудистой системы, в том числе в условиях стрессорных воздействий. При изучении влияния опиоидной системы на различные вегетативные функции используют синтетические аналоги эндогенных опиоидных пептидов. Даларгин – первый отечественный препарат, аналог эндогенного лей-энкефалина, неселективный агонист µ- и δ-опиатных рецепторов (ОР) (Н.В. Коробов, 1988). Экспериментальные и клинические исследования демонстрируют высокую кардиоваскулярную активность данного препарата (С.Г. Донич, 1991, Л.Н. Маслов, Ю.Б. Лишманов, 1993, Н.А. Бебякова, 1997, А.В. Хромова, 2002, Т.В. Ласукова и соавт., 2004, Т.М. Командресова, С.Н. Курицын, 2006, Ю.Б. Лишманов и соавт., 2007, Л.Н. Маслов и соавт., 2008). Вместе с тем, значимые количества даларгина не удаётся зафиксировать радиоимунным методом уже через 2-3 минуты после его введения в кровь, что обусловлено не только рецепторным захватом, но и ферментативным гидролизом пептида (Е.И Каленикова и соавт., 1988). Определённые замены в структуре молекул пептидов позволяют создавать аналоги, более защищённые от действия пептидаз. С целью защиты молекулы даларгина от деградации ферментами был создан ряд его стабилизированных аналогов (Б.Л. Пекелис, 1981). Учитывая, что даларгин обладает высокой кардиоваскулярной активностью, снижает общее периферическое сопротивление и тонус сосудов (Л.Н. Маслов и соавт., 2003, Т.М. Командресова, 2006, С.Н. Курицын, 2007), важно оценить влияние стабилизации молекулы на вазоактивный эффект пептида. Даларгин считается препаратом периферического действия, реализующим свои эффекты через активацию периферических µ- и δ-ОР, поскольку его проникновение через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) затруднено (М.И. Титов, 1985). Вместе с тем, даларгин всё же способен преодолевать ГЭБ при введении его в дозах от 500 – 1000 мкг/кг и выше (В.М. Полонский и соавт., 1980), а значит активировать и центральные опиатные рецепторы. Кроме того, исследования демонстрируют, что активация периферических ОР носит дозозависимый характер (М.Б. Самаренко и соавт., 1983, S.Y. Hugghins et al., 2000, Z.C. Chen et al., 2011). Поэтому необходимо изучить влияние даларгина и его стабилизированных аналогов на тонус сосудистой стенки в дозах, способных активировать как периферические, так и центральные ОР. Наличие ОР как в высших вегетативных центрах головного мозга, регулирующих состояние сердечно-сосудистой системы (J. A. Kiritsy-Roy et al., 1986, Hassen A.H et al., 1987), так и на периферии в симпатических окончаниях, иннервирующих артерии (P.Illes et al., 1987) свидетельствует о том, что опиоидная система играет важную роль в регуляции деятельности сердечнососудистой системы. Вместе с тем, ОР обнаружены и на эндотелии сосудов (G.B. Stefano et al., 1998), который синтезирует и выделяет ряд вазоактивных 4 факторов, обеспечивающих сокращение или расслабление гладких мышц сосудистой стенки. Результаты исследования Hugghins S.Y. еt al (2000) демонстрируют наличие эндотелийзависимых механизмов расслабления сосудистой стенки на фоне активации ОР. Экспериментально показано, что активация периферических ОР даларгином сопровождалась изменением содержания вазоактивных эндотелиальных факторов (Т.М. Командресова, 2006, С.Н. Курицын, 2007). Таким образом, гипотензивный эффект данного пептида может быть опосредован эндотелиальными механизмами. Исходя из этого, изучение эндотелиопротективного действия стабилизированных аналогов даларгина актуально как с теоретической, так и с практической точки зрения. Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было выявление механизмов участия неселективного агониста µ- и δ-опиатных рецепторов даларгина и его стабилизированных аналогов в модуляции стрессорной вазоконстрикции. В рамках поставленной цели решались следующие задачи: 1. Установить влияние неселективной активации периферических µ- и δопиатных рецепторов даларгином и его стабилизированными аналогами на стрессобусловленные изменения сосудистого тонуса в дозах, в которых пептиды активируют периферические опиатные рецепторы (10, 100 мкг/кг). 2. Выявить участие центральных опиатных рецепторов в модуляции стрессорной вазоконстрикции при сочетанной активации µ- и δ-опиатных рецепторов даларгином и его стабилизированными аналогами в дозе, в которой они проникают через гематоэнцефалический барьер (1000 мкг/кг). 3. Выявить участие вазоактивных эндотелиальных факторов (эндотелина-1 и оксида азота) в регуляции периферического сосудистого тонуса на фоне острого стресса при сочетанной активации µ- и δ-опиатных рецепторов агонистами с различной степенью стабильности. Положения, выносимые на защиту. 1. Активация периферических µ- и δ-опиатных рецепторов даларгином и его стабилизированными аналогами (доза 10 мкг/кг) оказывала разнонаправленный эффект на периферический тонус сосудов в условиях стресса: даларгин, аналог 2 и аналог 3 ограничивали стрессобусловленные изменения тонуса сосудов, в то время как аналог 1 усиливал стрессорную вазоконстрикцию. Введение даларгина и его аналогов в дозе 100 мкг/кг сопровождалось ограничением стрессобусловленного роста сосудистого тонуса, при этом наиболее выраженный эффект в этой дозе оказывали даларгин и аналог 3. 2. Введение даларгина и его аналогов в дозе 1000 мкг/кг, в которой пептиды способны активировать центральные опиатные рецепторы, приводило к усилению стрессобусловленной вазоконстрикции. 3. Антиконстрикторный эффект даларгина в условиях острого стресса связан с увеличением уровня стабильных метаболитов оксида азота. Усиление стрессорной вазоконстрикции на фоне активации µ- и δ-опиатных рецепторов даларгином и его аналогами сопровождалось увеличением уровня эндотелина – 1 и снижением содержания стабильных метаболитов оксида азота, в то время 5 как на фоне введения аналогов даларгина подобных изменений не наблюдалось. Научная новизна исследования. Впервые выявлено дозозависимое действие даларгина и его аналогов на тонус сосудистой стенки в условиях острого стресса. При этом установлено, что введение даларгина и его аналогов в дозах 10 и 100 мкг/кг, сопровождалось снижением стрессобусловленного тонуса сосудов, за исключением этиламида даларгина (аналог 1), который в дозе 10 мкг/кг не оказывал протективного эффекта на стрессобусловленную вазоконстрикцию. Введение даларгина и его аналогов в дозе 1000 мкг/кг, наоборот, сопровождалось провокационным эффектом на стрессобусловленные изменения тонуса периферических сосудов. Установлено участие оксида азота в антиконстриктороном эффекте активации µ- и δ-ОР аналогом 1 и аналогом 3 даларгина в условиях острого стресса. Показано, что усиление стрессорной вазоконстрикции в условиях введения высокой дозы даларгина (1000 мкг/кг) сопровождалось увеличением концентрации эндотелина-1 и снижением содержания стабильных метаболитов оксида азота. Научно-практическая значимость исследования. Результаты исследования вносят определённый вклад в развитие теоретических представлений о механизмах опиоидергической модуляции тонуса сосудистой стенки, а так же служат предпосылкой для дальнейшего изучения и разработки новых средств, модулирующих состояние сердца и сосудов. Полученные экспериментальные данные позволяют предложить для дальнейшего изучения в качестве потенциальных средств коррекции стрессобусловленной вазоконстрикции даларгин и его N-метилированный аналог. Материалы диссертационного исследования используются в преподавании курса физиологии в программе обучения студентов Института естественных наук и биомедицины на кафедре физиологии человека и животных (акт внедрения от 03.11.2011) Северного (Арктического) федерального университета, на кафедрах нормальной физиологии и патологической физиологии Коми филиала Кировской государственной медицинской академии (акт внедрения от 01.12.2011). Диссертационное исследование выполнено в ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет (г. Архангельск) Министерства здравоохранения и социального развития РФ» при поддержке гранта РФФИ и администрации Архангельской области «Опиоидергическая модуляция стрессорной вазоконстрикции при сочетанной активации µ- и δ-опиатных рецепторов агонистами с различной степенью стабильности», проект № 08-04-98817 (2008–2010 гг). Апробация результатов исследования. Основные результаты исследования были представлены и обсуждены на XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов2010 (Москва, 2010), XXI Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (г. Калуга, 2010), IV Международной школе молодых учёных по 6 молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), IV Архангельской международной междисциплинарной конференции молодых учёных и студентов (г. Архангельск, 2010), Седьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (г. Судак, 2011). Структура и объём работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, раздела, посвящённого материалам и методам исследования, глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения и выводов. Работа содержит 11 таблиц и 22 рисунка, библиографический указатель содержит 213 наименований. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальное исследование было проведено на половозрелых бодрствующих самцах крыс популяции Wistar массой 200-250 г., характеризующихся вазоконстрикторными реакциями на острый стресс (А.В. Хромова, 2002, Т.В. Командресова, 2006). Экспериментальные животные содержались в условиях вивария СГМУ по 7–8 особей в клетке при свободном доступе к воде и пище при 9–10-часовом световом режиме. Масса крыс соответствовала весовым показателям возрастных норм. Всего в эксперименте было использовано 210 особей, которые составили 14 экспериментальных групп (фон, стресс-контроль и 12 опытных групп) по 15 животных в каждой группе. Протокол исследования одобрен Комитетом по этике при СГМУ (протокол № 04/08 от 24.03.2008 г.). В данной работе в качестве модели острого стресса использовали иммобилизацию животных в течение 1 часа в прозрачных пластиковых пеналах. Такое воздействие сопровождается выраженными изменениями параметров гемодинамики (К.В. Судаков и соавт., 1981,1988). Измерение тонуса сосудистой стенки производили методом тетраполярной реографии с использованием многофункционального диагностического комплекса «Диастом-01» (ГОСТ 15.013-94) (Н.А. Бебякова и соавт., 2002) в течение часа с интервалом в 15 мин. Функциональное состояние периферических сосудов оценивали с использованием количественных показателей: индекс периферического сопротивления (ИПС), индекс эластичности (ИЭ). В качестве агонистов ОР применяли отечественный препарат даларгин – синтетический аналог лей-энкефалина, неселективный агонист µ- и δ-ОР (утверждён Фармакологическим комитетом 03.03.92 в качестве средства для лечения язвенной болезни) и ряд его структурных аналогов: H-Tyr-D-Ala-GlyPhe-Leu-Arg-NHEt (аналог 1), модификация которого проведена за счёт этиламидирования С-концевого карбоксила; H-Tyr-D-Ala-Gly-МеPhe-Leu-ArgNHEt (аналог 2), модификация которого заключалась в этиламидировании Сконцевого карбоксила и N-метилировании фенилаланинового остатка; H-Tyr-DAla-Gly-МеPhe-Leu-Arg-OH (аналог 3), модифицированный за счёт N- 7 метилирования фенилаланинового остатка (Б.Л. Пекелис, 1981). Синтетические аналоги произведены и предоставлены лабораторией синтеза пептидов Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ (рук. к.х.н. Беспалова Ж.Д.). Опытным группам животных пептиды вводили в объёме 0,9 мл. раствора Рингера внутрибрюшинно за 5 мин. до начала эксперимента в дозах, в которых пептиды не проникают через ГЭБ (10 и 100 мкг/кг) и проникают через ГЭБ (500-1000 мкг/кг) (М.И. Титов и соавт., 1985, Ю.Б. Лишманов и соавт., 2002). Контрольной группе вводили 0,9 мл. раствора Рингера внутрибрюшинно. Концентрацию вазоактивных эндотелиальных факторов и кортикостерона определяли в плазме крови, стабилизированной ЭДТА. Уровень NO оценивали по его стабильным метаболитам (нитритам и нитратам) в реакции Грисса с использованием набора R&D Systems и молекулярных фильтров Amicon Ultra 0.5ML 10K (Millipore). Концентрацию ЭТ-1 и кортикостерона определяли иммуноферментным методом с использованием наборов фирм Biomedica и Assay Desings. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы SPSS 18.0. Для проверки типа распределения собранных количественных данных применяли критерий Шапиро-Уилка. Оценку статистических различий внутри групп проводили с использованием критерия Фридмана, с последующими апостериорными сравнениями с применением критерия Вилкоксона. Оценку статистических различий между группами проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса, с последующими попарными сравнениями с применением критерия Вилкоксона. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ У животных контрольной серии (стресс на фоне введения раствора Рингера) наблюдались вазоконстрикторные реакции, что выражалось в изменении показателей тонуса сосудов: ИПС увеличивался на 82,8% (р=0,001), а ИЭ снижался на 48,7% (р=0,001) по сравнению с 5-й мин. стрессирования. Иммобилизация сопровождалась увеличением уровня кортикостерона в контрольной группе животных по сравнению с интактными особями на 129,9% (р=0,002), а также некоторым изменением баланса вазоактивных эндотелиальных факторов в сторону констрикторных влияний (табл.). Для установления участия даларгина и его стабилизированных аналогов в модуляции изменений периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса пептиды вводили в дозах 10, 100, 1000 мкг/кг. Для выявления эндотелиальных механизмов коррекции стрессобусловленного тонуса сосудов на фоне активации ОР даларгином и его стабилизированными аналогами в плазме крови животных всех экспериментальных групп определяли концентрацию эндотелина-1 (ЭТ-1) и уровень стабильных метаболитов (нитритов/нитратов), который отражает продукцию оксида азота (NO) в организме. 8 Активация периферических ОР даларгином и его стабилизированными аналогами в дозе 10 мкг/кг вызывала разнонаправленные эффекты на тонус сосудов в условиях стресса. Протективный эффект на стрессорную вазоконстрикцию в данной дозе оказывал даларгин, N-метилированный этиламид даларгина (аналог 2) и N-метилированный аналог даларгина (аналог 3) (рис. 1в, 1с). Протективный эффект даларгина и аналога 2 наблюдался с 15-й мин. стрессирования и сохранялся к концу эксперимента: ИПС к 60-й мин. был ниже на 13,5% (р=0,003) на фоне введения даларгина и на 7,7% (р=0,001) на фоне введения его аналога по сравнению со стресс-контролем (рис. 1в). ИЭ к концу стрессирования остался выше на 51,9% (р=0,001) и 26,6% (р=0,001) на фоне введения даларгина и его аналога 2 соответственно в сравнении с контрольными значениями показателя. А В С Рис. 1. Изменение ИПС на фоне введения даларгина и его стабилизированных аналогов в дозе 10 мкг/кг. Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению со стрессом: * - р≤0,05, ** - р≤0,01, *** - р≤0,001 В то время как ведение аналога 3 в данной дозе уже с 5-й мин. сопровождалось снижением ИПС на 17,8% (р=0,005), а к 60-й мин. разница с 9 контролем составила 11,2% (р<0,001) (рис. 1с). ИЭ к концу эксперимента был выше контрольного на 19,8% (р=0,029) (рис.). Введение аналога 1 в дозе 10 мкг/кг, наоборот, приводило к росту ИПС и снижению ИЭ уже с 5-й мин. стрессирования (рис. 1а). Введение всех изучаемых пептидов в дозе 100 мкг/кг способствовало ограничению стрессобусловленных изменений сосудистого тонуса. Инъекция даларгина в дозе 100 мкг/кг сопровождалось снижением ИПС, начиная с 5-й мин. стрессирования на 22,8% (р≤0,001), ИЭ при этом был выше на 10% (р=0,04) аналогичных показателей в контроле. К 60-й мин. ИПС остался меньше на 18,3% (р=0,02), а ИЭ выше на 33,7% (р≤0,001) стрессовых показателей (рис. 2а). В А С Рис. 2. Изменение ИПС на фоне введения даларгина и его стабилизированных аналогов в дозе 100 мкг/кг . Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению со стрессом: * - р≤0,05, ** - р≤0,01, *** - р≤0,001 10 Протективный эффект аналога 1 так же наблюдался с 5-й мин стрессирования, т.к. ИПС был ниже контроля на 26,6% (р=0,02). Вместе с тем антиконстрикторный эффект аналога 1 был наиболее выражен до 30-й мин эксперимента, а к 60-й мин. такой эффект аналога исчезал (рис. 2а). Кроме того, с 30-й мин. иммобилизации были выявлены отличия между аналогом 1 и даларгином: снижение ИПС на фоне введения аналога 1 было менее выраженным на этом этапе (p=0,015). Аналог 2 способствовал ограничению стрессобусловленных изменений показателей тонуса сосудов на протяжении всего срока иммобилизации: уже с 5-й мин. наблюдения ИПС был меньше на 12,4% (р=0,001), а к 60-й мин. – на 11,7% (р≤0,001) по сравнению с контрольным уровнем показателя. Тем не менее, протективный эффект даларгина был более выраженным по сравнению с его аналогом 2 на 15-й. (р<0,001), 30-й (р<0,001), 45-й (р=0,034) мин., поскольку наблюдалось более значительное снижение ИПС (рис. 2в). Введение аналога 3 в дозе 100 мкг/кг так же сопровождалось протективным эффектом пептида на стрессобусловленные изменения тонуса периферических сосудов. На 5-й мин. стрессирования ИПС был ниже на 22,9% (р<0,001), а к 60-й мин. остался ниже на 8,2% (р=0,001) соответствующих значений в контроле (рис. 2с). ИЭ к концу иммобилизации остался выше контроля на 18,6% (р=0,019). Сравнение действия даларгина и его N-метилированного аналога (аналог 3) свидетельствует о том, что в данной дозе (100 мкг/кг) пептиды оказывали сходный эффект на показатели тонуса сосудов в условиях иммобилизации. Анализ уровня эндотелиальных факторов на фоне введения пептидов в дозах, в которых они не проникают через ГЭБ, показал, что изменение содержания стабильных метаболитов NO было наиболее выраженным при введении пептидов в дозе 100 мкг/кг (рис. 3, табл.). Рис. 3. Изменение уровня стабильных метаболитов NO на фоне введения даларгина и его аналогов в дозе 100 мкг/кг в условиях острого стресса. Условные обозначения: 1 – фон, 2 – стресс-контроль, 3 – даларгин, 4 – аналог 1, 5 – аналог 2, 6 – аналог 3. Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению со стрессом: * - р≤0,05, ** - р≤0,01, *** - р≤0,001 11 К концу стрессирования уровень NO на фоне введения даларгина увеличился на 73,7% (р=0,003) по сравнению с фоновым значением и на 100,0% (р=0,002) по сравнению со стрессовым значением данного показателя. На фоне введения аналога 3 увеличился на 75,3% (р<0,001) и на 101,2% (р<0,001) относительно фонового и стрессового уровня соответственно. Рост уровня метаболитов NO на фоне введения аналога 1 был несколько менее выражен и изменился на 43,4% (р=0,027) и на 65,1% (р=0,006) по сравнению с фоновым и стрессовым уровнем показателя. Таблица Изменение уровня эндотелиальных вазоактивных факторов на фоне введения даларгина и его аналогов в разных дозах, Ме (P25-75) Экспериментальная серия Фоновый уровень Стресс на фоне введения: Раствора Рингера (контроль) Даларгина в дозе 10 мкг/кг Даларгина в дозе 100 мкг/кг Даларгина в дозе 1000 мкг/кг Аналога 1 в дозе 10 мкг/кг Аналога 1 в дозе 100 мкг/кг Аналога 1 в дозе 1000 мкг/кг Аналога 2 в дозе 10 мкг/кг Аналога 2 в дозе 100 мкг/кг Аналога 2 в дозе 1000 мкг/кг Аналога 3 в дозе 10 мкг/кг Аналога 3 в дозе 100 мкг/кг Аналога 3 в дозе 1000 мкг/кг Метаболиты NO, мкмоль/л 19,8 (15,8; 26,8) ЭТ-1, фмоль/л 22,3 (19,6; 25,4) Индекс NO/ЭТ-1 0,95 (0,68;1,19) 17,2 (15,1; 19,5) 16,4 (14,6; 17) * 34,4**++ (27;35,6) 15 **+ (12,6;15,8) 19,4 (15,5; 28,5) 24,8 * ++ (22,7; 35,8) 21 (15,6; 30) 18,8 (15,6; 23,2) 20,8 (13,8; 25,6) 22,6 (16,2; 30,7) 30,3***+++ (26,4; 38,1) 34,7***+++ (26,4; 49,3) 32**+++ (23; 64,1) 24,2 (20,5; 26) 23,5 (18,1; 30,5) 20,6 (16,7; 25,2) 26,4* (23, 32,8) 22,1 (14,6; 24,3) 23 (13,2; 30,1) 25,8 (20,7; 31) 20,8 (18,2; 27,1) 22,1 (15,5; 28,1) 18,5 (16,2; 29) 23,9 (20,7; 26) 21,2 (20,1; 22,6) 21,3 (20,3; 21,8) 0,75 (0,71;0,89) 0,68 (0,61;0,83) 1,42***+++ (1,38;1,6) 0,53 (0,46;0,67) 0,91 (0,65;1,84) 1,4++ (1,4;1,74) 0,85 (0,54;1,07) 0,89 (0,73;1,09) 0,78 (0,71;1,17) 1,44+ (0,74;1,69) 1,43***+++ (1,15;1,64) 1,64**+++ (0,96;2,38) 1,58**+++ (0,99;2,61) Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с фоном, + - со стрессом: *+ - р≤0,05, **++ - р≤0,01, ***+++ - р≤0,001 12 Вместе с тем, активация ОР аналогом 2 в данной дозе не сопровождалась выраженным изменением уровня вазоактивных факторов. Значимых изменений уровня ЭТ-1 в данных условиях не выявлено. Снижение дозы вводимых пептидов до 10 мкг/кг сопровождалось выраженным увеличением продукции NO только на фоне введения аналога 3: концентрация метаболитов NO возрастала на 53,0% (p<0,001) и 76,0% (p<0,001) по отношению к фоновым и контрольным значениям соответственно. Вместе с тем введение даларгина в данной дозе не приводило к увеличению содержания стабильных метаболитов NO к концу стрессирования, хотя и сопровождалось антиконстрикторным эффектом, который был наиболее выражен с 15-й по 45-ю мин. стрессирования. В данных условиях введение аналога 1 сопровождалось вазоконстрикторными реакциями и не приводило к изменению содержания вазоактивных эндотелиальных факторов. Концентрация эндотелиальных факторов на фоне активации ОР аналогом 2 в дозе 10 мкг/кг (так же как и в более высокой – 100 мкг/кг) оставалась на уровне фоновых значений (табл.). Полученные результаты свидетельствуют, что протективный эффект активации периферических µ- и δ-ОР даларгином, аналогом 1 и аналогом 3 на стрессобусловленные изменения тонуса сосудов связан прежде всего с изменением продукции NO, что согласуется с данными других авторов о том, что активация ОР может сопровождаться активацией NO-синтазы и увеличением содержания оксида азота (Т.М. Командресова, 2006, G.B. Stefano, 1998). Ограничение стрессобусловленых изменений периферического сосудистого тонуса на фоне введения аналога 2 опосредуется другими механизмами, не связанными с изменением активности эндотелиальных вазоактивных систем. Одним из механизмов антиконстрикторного действия ОП можно рассматривать ограничение функциональной активности симпатического звена автономной нервной системы. Поскольку ОР обнаружены на симпатических окончаниях, иннервирующих артерии (P. Illes et al., 1987), ограничение стрессобусловленных изменений тонуса сосудов возможно за счёт угнетения выброса эндогенных катехоламинов из симпатических нервных окончаний (Л.Н. Маслов и соавт., 2001).Нельзя исключать и другие механизмы сосудорасширяющего действия активации ОР. Z.C. Chen et al. (2011) показали возможность расслабления гладких мышц сосудов на фоне активации ОР при участии КАТФ- каналов через цАМФпротеинкиназа А – зависимый путь. Таким образом, анализ показателей тонуса сосудов и изменений содержания эндотелиальных факторов, главным образом NO, на фоне активации периферических ОР даларгином и его аналогами свидетельствует о дозозависимом действии пептидов, что подтверждает данные других авторов о дозозависимом эффекте даларгина на деятельность сердечно-сосудистой системы (М.Б. Самаренко и соавт.,1983). Действие даларгина и его аналогов носит триггерный характер (В.А. Виноградов и соавт., 1982), и активация периферических ОР запускает механизмы, способствующие ограничению стрессобусловленных изменений тонуса сосудов. Пептиды, введенные в достаточном количестве (в оптимальной дозе), обеспечивают надёжный запуск 13 механизмов, регулирующих тонус сосудистой стенки, а изменение такой дозы ведёт к уменьшению протективного эффекта. Различия в степени влияния изучаемых пептидов на показатели стрессобусловленного тонуса сосудов, вероятно, связаны с эффектом модификации, поскольку выявлено, что модификация молекулы даларгина может сопровождаться изменением опиоидной активности и рецепторной селективности аналогов (Б.Л. Пекелис, 1981). Результаты экспериментальных серий с введением пептидов в наиболее высокой дозе (1000 мкг/кг) продемонстрировали провокационный эффект даларгина и его аналогов на показатели периферического тонуса сосудов (рис. 4). А В С Рис. 4. Изменение ИПС на фоне введения даларгина и его стабилизированных аналогов в дозе 1000 мкг/кг. Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению со стрессом: * - р≤0,05, ** - р≤0,01, *** - р≤0,001 14 Выявлено, что даларгин, введённый внутрибрюшинно экспериментальным животным в дозе от 500-1000 мкг/кг, способен преодолевать ГЭБ и активировать центральные ОР (В.М. Полонский и соавт.,1980). Способность преодолевать ГЭБ пептидами во многом зависит от их устойчивости к энзиматическому гидролизу (E.A. Brownson, 1994), следовательно, учитывая вероятность проникновения ОП через ГЭБ в дозах 500–1000 мкг/кг, можно предполагать, что и стабилизированные аналоги даларгина могут активировать центральные ОР. Исследования показывают, что активация центральных ОР сопровождается гипертензивными реакциями (G.E Sander, 1989). Установлено, что активация нейрональных µ- и δ-ОР приводит к активации симпатического звена автономной нервной системы, что в свою очередь отражается на реакциях сердечно-сосудистой системы (A.H. Hassen, 1987, J.A. Kiritsy-Roy et al., 1986). Анализ содержания эндотелиальных факторов показал, что введение даларгина в дозе 1000 мкг/кг на фоне острого стресса сопровождалось изменением соотношения вазоактивных эндотелиальных факторов: уровень стабильных метаболитов NO оказался ниже фонового и стрессового значений на 24,0% (p=0,003) и на 12,8 % (p=0,02) соответственно, а концентрация ЭТ-1, наоборот, выше фонового на 18,4% (р=0,036) и несколько выше стрессового уровня (на 7,3%) (рис.5, табл.). Таким образом, определённый вклад в вазоконстрикторный эффект высокой дозы даларгина (1000 мкг/кг) мог принадлежать изменению баланса между вазоконстрикторными и вазодилататорными факторами эндотелия. А Б Рис. 5. Изменение уровня NO (А) и ЭТ-1 (Б) на фоне введения даларгина и его аналогов в дозе 1000 мкг/кг в условиях острого стресса. Условные обозначения: 1 – фон, 2 – стресс-контроль, 3 – даларгин, 4 – аналог 1, 5 – аналог 2, 6 – аналог 3. Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с фоном, + - со стрессом: *+ - р≤0,05, **++ - р≤0,01, ***+++ - р≤0,001 15 Введение аналога 3 в данной дозе сопровождалось увеличением содержания стабильных метаболитов NO к концу стрессирования (рис. 5, табл.). Известно, что стимуляция рецепторов высокими дозами агонистов, может приводить к снижению афинности или плотности рецепторов, что и могло явиться возможной причиной снижения уровня NO в ответ на введение даларгина. Стабилизированный аналог, скорость деградации которого могла быть ниже, чем у даларгина, смог взаимодействовать с рецепторами после восстановления их плотности или афинности. Cледствием такого взаимодействия вероятно и явился рост уровня метаболитов NO (на 61,6%, р=0,003; 86,0%, р<0,001 в сравнении с фоном и стрессом соответственно) к концу иммобилизации (рис. 5, табл.). Заметных изменений содержания вазоактивных эндотелиальных факторов при введении остальных пептидов (аналог 1 и аналог 2) не зарегистрировано. Вместе с тем, анализ изменений эндотелиальных факторов показал, что на фоне введения аналога 2 в рассматриваемой дозе индекс NO/ЭТ-1 был повышен, хотя средние значения показателей статистически не отличались от фоновых и контрольных значений (табл.). Таким образом, наблюдалось смещение баланса в сторону вазодилататорных влияний эндотелия, что вероятно можно расценивать как компенсаторную реакцию в ответ на констрикцию на фоне активации ОР высокими дозами пептида. В результате проведённого исследования подтверждена роль даларгина и выявлено участие стабилизированных аналогов даларгина в модуляции стрессорной вазоконстрикции. В механизмах антиконстрикторного действия даларгина и его аналогов показана роль оксида азота, вместе с тем, не исключены и другие механизмы протективного действия опиоидных пептидов на тонус сосудов. На модели стрессорной вазоконстрикции были показаны особенности влияния структурных аналогов даларгина на тонус сосудистой стенки. Выявлено дозозависимое действие активации ОР даларгином и его аналогами на тонус сосудов в условиях иммобилизационного стресса, в том числе установлен провокационный констрикторный эффект высоких доз даларгина и его аналогов на тонус сосудов в условиях острого стресса. Этот факт свидетельствует о разной роли активации периферических и центральных µ- и δ- ОР в регуляции сосудистого тонуса в условиях острого стресса. ВЫВОДЫ 1. Неселективная активация периферических μ- и δ-опиатных рецепторов даларгином и его стабилизированными аналогами чаще всего сопровождалась снижением стрессобусловленного периферического тонуса сосудов. Выявленный протективный эффект пептидов на стрессобусловленную вазоконстрикцию был дозозависимым с максимальным эффектом в дозе 100 мкг/кг. 2. Активация периферических опиатных рецепторов пептидами в дозе 10 мкг/кг сопровождалась неодинаковым действием пептидов на показатели периферического тонуса сосудов. Даларгин и N-метилированный этиламид 16 даларгина (аналог-2) ограничивали стрессобусловленный рост тонуса сосудов, начиная с 15-й минуты стрессирования, в то время как N-метилированный даларгин (аналог 3) снижал стрессобусловленные изменения тонуса сосудов уже с 5-й мин. эксперимента, а этиламид даларгина (аналог 1) наоборот усиливал стрессобусловленную вазоконстрикцию. 3. При активации периферических опиатных рецепторов даларгином и его стабилизированными аналогами в дозе 100 мкг/кг наблюдался выраженный антиконстрикторный эффект пептидов на стрессобусловленный периферический тонус сосудов. Аналог 1 оказывал кратковременный протективный эффект, а наиболее выраженный протективный эффект на стрессобусловленную вазоконстикцию проявляли даларгин и аналог 3. 4. Активация центральных опиатных рецепторов на фоне введения даларгина и его стабилизированных аналогов в дозе, в которой они проникают через гематоэнцефалический барьер (1000 мкг/кг), приводила к увеличению стрессобусловленного периферического тонуса сосудов. 5. Протективный эффект на стрессобусловленный тонус сосудов даларгина, аналога 1 и аналога 3 сопровождался увеличением уровня стабильных метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов), что позволяет связать их протективный эффект с изменением уровня NO, в то время как протективный эффект аналога 2 обусловлен механизмами, не связанными с вазоактивными эндотелиальными факторами. В механизмах протективного действия пептидов на стрессобусловленную вазоконстрикцию не выявлено участие эндотелина-1. 6. Усиление констрикторного эффекта даларгина в дозе 1000 мкг/кг сопровождалось ростом уровня эндотелина -1 и снижением содержания NO, в то время как действие аналогов даларгина в данной дозе не сопровождалось подобными изменениями эндотелиальных факторов. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Участие эндотелиальных факторов в стрессобусловленных изменениях гемодинамики при сочетанной активации µ- и δ-опиатных рецепторов / Н.А. Бебякова, С.Н. Курицын, Т.М. Командресова, И.А. Шабалина // VI Сибирский физиологический съезд: Тезисы докладов. – Барнаул, 2008. – Т. 1. – С. 254. 2. Эндотелиальные механизмы селективной активации µ-опиатных рецепторов в условиях острого стресса / Н.А. Бебякова, С.Н. Курицын, Т.М. Командресова, И.А. Шабалина // VI Сибирский физиологический съезд: Тезисы докладов.– Барнаул, 2008.– Т. 1.– С. 254. 3. Bebyakova N.A. Participation of opioid peptides in the regulation of stress vasoconstriction / N.A. Bebyakova, S.N. Kuritsin, I.A. Shabalina // Materialy V Miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Nauka I inowacja – 2009». – Przemysl, 2009. – Р. 43-45. 17 4. Курицын С.Н. Влияние даларгина и его структурного аналога на стрессобусловленный сосудистый тонус у крыс линии Wistar / С.Н. Курицын, И.А. Шабалина // Ломоносов – 2010: XVII международная конференция студентов, аспирантов, молодых учёных: тез. докл. – М., 2010. – С. 292-293. 5. Бебякова Н.А. Участие неселективных агонистов μ- и δ-опиатных рецепторов с разной степенью стабильности в регуляции сосудистого тонуса при остром стрессе / Н.А. Бебякова, С.Н. Курицын, И.А. Шабалина // XXI Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова: Тезисы докладов. – М. – Калуга, 2010. – С. 54-55. 6. Шабалина И.А. Роль даларгина и его стабилизированных аналогов в стрессобусловленной модуляции сосудистого тонуса у крыс Wistar / И.А. Шабалина, С.Н. Курицын, И.Н. Филиппова // Труды VII Всероссийской научной конференции молодых учёных и студентов. – Краснодар, 2010. – Т. 1.– С. 129. 7. Шабалина И.А. Роль даларгина и его стабилизированного аналога в модуляции стрессобусловленного тонуса сосудов/ И.А. Шабалина // Медицинский академический журнал. – 2010. – № 5. – С. 39. 8. Бебякова Н.А. Участие синтетических аналогов опиоидных пептидов в модуляции стрессорной вазоконстрикции / Н.А. Бебякова, С.Н. Левицкий, И.А. Шабалина // Вестник Поморского университета. Серия «Физиологические и психолого-педагогические науки». – 2010. – № 4. – С. 38-42. 9. Шабалина И.А. Регуляция даларгином и его синтетическими аналогами стрессобусловленного тонуса сосудов / И.А. Шабалина // Образование и наука: ступени развити: Материалы региональной молодёжной научно-практической конференции. – Архангельск, 2011. – С. 306-308. 10. Бебякова Н.А. Эндотелиальные механизмы коррекции стрессобусловленного изменения сосудистого тонуса / Н.А. Бебякова, С.Н. Левицкий, И.А. Шабалина // Материалы седьмого международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». – Судак, 2011. – С. 85. 11. Шабалина И.А. Изменение уровня вазоактивных эндотелиальных факторов на фоне введения даларгина и его стабилизированного аналога / И.А. Шабалина // Бюллетень СГМУ. – 2011. – № 1. – С. 214. 12. Бебякова Н.А Влияние структурной модификации молекулы даларгина на вазоактивный эффект пептида при остром стрессе / Н.А. Бебякова, С.Н. Левицкий, И.А. Шабалина // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 12, вып. 4. – С. 704-707.
