На правах рукописи БАРЫГИН Олег Игоревич
advertisement
На правах рукописи БАРЫГИН Олег Игоревич МЕХАНИЗМЫ БЛОКАДЫ NMDA И AMPA РЕЦЕПТОРОВ ТРИЦИКЛИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ 03.03.01 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН Научный руководитель: доктор биологических наук Тихонов Денис Борисович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Кривой Игорь Ильич доктор биологических наук Антонов Сергей Михайлович Ведущее научное учреждение: Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН Защита диссертации состоится «9 марта» 2010 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44). Автореферат разослан «______» _____________ 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор 2 М.Н. Маслова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Глутамат – это наиболее распространенный возбуждающий медиатор в центральной нервной системе позвоночных животных (Curtis et al., 1959). Свое быстрое постсинаптическое действие он опосредует через ионотропные глутаматные рецепторы, принадлежащие к суперсемейству лиганд-управляемых ионных каналов (Dingledine et al., 1999). Чрезмерная активация ионотропных глутаматных рецепторов вовлечена во многие патологические состояния (Lipton & Rosenberg, 1994). К их числу относятся, например, болезни Паркинсона (Johnson et al., 2009) и Альцгеймера (Koutsilieri & Riederer, 2007), глаукома (Seki & Lipton, 2008). При шизофрении, напротив, наблюдается пониженная активность NMDA рецепторов (Stone, 2009). К настоящему моменту известно множество блокаторов этих ионных каналов, однако их применение в клинической практике затруднено из-за серьезных побочных эффектов у большинства соединений. Действие каналоблокаторов характеризуется не только величиной активности, но и рядом особенностей механизма взаимодействия с каналоммишенью и внешними условиями, такими как ионный состав, pH среды, потенциал на мембране (Hille, 2001). Соответственно и поиск клинически толерантных препаратов отнюдь не сводится к поиску наиболее активных соединений. Например, единственный используемый в клинике блокатор NMDA рецепторов мемантин наиболее активным не является. Считается, что клиническая толерантность мемантина определяется такими особенностями его механизма действия, как быстрая кинетика и частичная ловушка (Chen & Lipton, 2006). Известно, что блокада рецепторов NMDA 9-аминоакридином (9АА) осуществляется по механизму «foot-in-the-door». Закрытие ионного канала в этом случае может происходить только после диссоциации блокатора. К настоящему моменту остается до конца не выясненным вопрос о структурных детерминантах, определяющих такой характер взаимодействия 9АА с воротным механизмом NMDA рецепторов. Недавно было показано, что 9AA и его трициклические производные способны блокировать не только NMDA, но и AMPA рецепторы (Ким и др., 2007). При этом не наблюдались структурно-функциональные отношения, характерные для классических блокаторов AMPA рецепторов (Bolshakov et al., 2005). В работе было проведено подробное исследование механизмов действия трициклических производных на AMPA и NMDA рецепторы. 3 9АА и ряда его Такое исследование представляется важным сразу с нескольких сторон. Вопервых, блокаторы являются ценным инструментом для исследования структуры и механизмов функционирования каналов-мишеней. Так, из сопоставления структурнофункциональных отношений в рядах блокаторов можно получить детальные сведения о строении участков их связывания в канале. Во-вторых, применение каналоблокаторов позволяет выявить роль конкретных каналов в различных процессах. Если же действие блокатора зависит от внешних условий, то его использование дает возможность определить те физиологические или патологические процессы, при которых эти условия реализуются. И, наконец, выявление фундаментальных связей между молекулярными механизмами физиологических и блокады патологических каналов условиях и действием может блокаторов позволить в предложить соединения-прототипы, которые наиболее перспективны для дальнейшей работы по созданию нейропротекторов. Цель исследования. Изучить механизм действия трициклических соединений на ионотропные глутаматные рецепторы NMDA и AMPA подтипов. Конкретные задачи исследования. 1. Разработать набор критериев, позволяющий определить характер взаимодействия блокаторов с воротным механизмом NMDA рецепторов. 2. Выявить структурные детерминанты, определяющие принадлежность 9АА к «foot-in-the-door» блокаторам NMDA рецепторов. 3. Исследовать зависимость блокирующего действия трициклических соединений на Ca2+-проницаемые и Ca2+-непроницаемые AMPA рецепторы от потенциала. 4. Сравнить действие трициклических соединений на АМРА и NMDA рецепторы. Научная новизна. В работе впервые был подробно проанализирован механизм действия ряда трициклических соединений, производных 9АА, на NMDA рецепторы. Систематический анализ влияния внесенных в структуру исходной молекулы изменений на механизм действия позволил выявить одну из ключевых детерминант, определяющих принадлежность 9АА к группе «foot-in-the-door» блокаторов. Было показано, что трициклические производные с плоской трехмерной структурой сохраняют «foot-in-the-door» механизм действия 9АА, в то время как вещества с «Vобразной» структурой начинают проявлять ловушку. 4 Также в работе было впервые показано, что 9АА и его производные с плоской трехмерной структурой взаимодействуют с особым сайтом в AMPA рецепторах. Блокирующее действие этих соединений носило потенциал-независимый характер и развивалось в отсутствие агониста, что отличает их от классических потециалзависимых блокаторов открытого канала - дикатионных производных адамантана и фенилциклогексила. Еще одним отличием от классических блокаторов явилось отсутствие выраженной избирательности по отношению к Ca2+-проницаемым AMPA рецепторам. Основные положения, выносимые на защиту. 1. При блокаде NMDA рецепторов одной из ключевых детерминант «foot-in-the-door» механизма действия 9АА является его плоская трехмерная структура. 2. Трициклические соединения с плоской структурой связываются с особым сайтом в АМРА рецепторах. 3. Сайт расположен вне поры канала и устроен похожим образом в Са2+-проницаемых и Са2+-непроницаемых AMPA рецепторах. Для связывания антагонистов с этим сайтом открытие канала не требуется. Теоретическая и практическая значимость. Одним из следствий «foot-in-the-door» механизма действия является то, что активность таких блокаторов усиливается при увеличении концентрации агониста. То есть такие вещества могут более эффективно блокировать синаптическую передачу в патологических условиях, чем в нормальных. К сожалению, этот потенциально интересный эффект не может быть использован, поскольку 9АА обладает анти-холинэстеразным и мутагенным действием. Другие активные блокаторы NMDA рецепторов, действующие подобно 9АА, в настоящее время не известны. Мы показали, что одной из ключевых детерминант «foot-in-thedoor» механизма действия этого вещества является его плоская трехмерная структура. В дальнейшем это открытие может позволить направленно синтезировать новые «footin-the-door» блокаторы этих ионных каналов. При исследовании действия 9АА и его производных на AMPA рецепторы было показано, что они связываются со специфическим сайтом. Обнаружение нового класса антагонистов, имеющих механизм действия, отличающийся от описанных ранее, имеет большое значение для физиологических исследований и может способствовать появлению клинически перспективных препаратов. Антагонисты, действие которых не 5 зависит от потенциала на мембране имеют то преимущество для защиты нейронов от повреждающего действия глутамата, что их эффект не ослабляется в том случае, когда нейрон деполяризован. Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на 11-й и 12-й Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008 и 2009), 11-й и 12-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – Наука XXI века» (Пущино, 2007 и 2008), Международной школе «Contemporary problems of neurobiology: molecular mechanisms of synaptic plasticity» (Казань, 2007) и Международной научной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009) Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в реферируемых журналах и тезисы 6 докладов. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 130 источников. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 35 рисунками. Методы исследования. Крыс линии Вистар (возраст 13 – 18 дней) декапитировали под уретановым наркозом. Мозг быстро извлекали и охлаждали до 2 – 4оС. Затем на вибратоме “Сampden Instruments” (Великобритания) приготавливали поперечные срезы стриатума и гиппокампа толщиной 250 мкм, которые сохраняли в растворе (мМ): NaCl – 124, KCl – 5, CaCl2 – 1.3, MgCl2 – 2, NaHCO3 – 26, NaH2PO4 – 1.24, D-глюкоза – 10. Раствор аэрировали карбогеном (95% О2, 5% СО2), рН 7.4–7.5, при 24–26оС. Нейроны, экспрессирующие определенный вид глутаматных рецепторов, изолировали из срезов методом вибродиссоциации (Vorobjev, 1991) не ранее двух часов с момента их приготовления. Для исследования NMDA-каналов и Са2+-непроницаемых AMPAрецепторов выбирали пирамидные нейроны, выделенные из поля CA1 гиппокампа, а для исследования Са2+-проницаемых AMPA-рецепторов – гигантские интернейроны стриатума. Для идентификации нейронов использовали морфологический и фармакологический критерии. Регистрацию трансмембранных токов осуществляли методом локальной фиксации потенциала. Микропипетку заполняли раствором (мМ): CsF – 100, CsCl – 40, NaCl – 5, CaCl2 – 0.5, EGTA – 5, HEPES – 10 (pH доводили до 7.2 с помощью CsOH). Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl – 143, KCl – 5, CaCl2 – 2.5, D-глюкоза – 18, 6 HEPES – 10 (pH доводили до 7.4, добавляя HCl). При исследовании AMPA-рецепторов во внеклеточный раствор добавляли MgCl2 в концентрации 2 мМ. Рецепторы активировали аппликацией соответствующих агонистов глутамата: NMDA-рецепторы – NMDA (40 мкМ) в присутствии глицина (10 мкМ); AMPA-рецепторы – каинатом (100 мкМ). Для аппликации применяли систему быстрой замены растворов (Vorobjev et al., 1996). При изучении механизмов блокады AMPA рецепторов использовалась 8канальная система быстрой замены растворов с электромагнитными клапанами и шаговым двигателем RSC-200 “BioLogic” (Франция). Время смены растворов составляет для этих систем примерно 10-15 мс. Регистрацию проводили в конфигурации “целая клетка” c помощью усилителя EPC-8 “HEKA Elektronik” (Германия). Контроль мембранного потенциала, управление системой аппликации, регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью компьютера. Использовались реактивы фирм Трициклические “Sigma” (США), производные “Tocris” 9АА были (США) и “BioVectra” синтезированы в (Канада). Институте Экспериментальной Медицины РАМН. Статистическая обработка проводилась с использованием программы Microcal(TM) Origin 6.0. Все результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение в серии как минимум четырех экспериментов. Для определения значений ИК50 использовали уравнение: B = 100/(1+(C/ИК50)n), где B – процент блокады, С – концентрация блокатора, ИК50 – концентрация блокатора, вызывающая 50% угнетение ответов, n – коэффициент Хилла. Анализ потенциал-зависимости проводился с помощью формулы Вудхол (Woodhull, 1973) для непроникающих через канал частиц: B = 100/(1+ИК50(0)exp(VFz/R/T)/C), где B – процент блокады, ИК50(0) – расчетное значение ИК50, которая наблюдалась бы при потенциале 0 мВ, V – потенциал фиксации, z – заряд блокатора, - доля падения потенциала в мембране, соответствующая глубине нахождения участка связывания блокатора, С – концентрация блокатора. R, T и F имеют свои стандартные значения. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Блокада NMDA рецепторов трициклическими соединениями. Кинетическая схема блокады. Одной из важных особенностей механизма действия блокатора служит наличие или отсутствие эффекта ловушки. Наиболее общая схема блокады открытого канала может быть представлена следующим образом: 7 RD2A kd ↕kr kf 2kf 2A + R ↔ A + RA ↔ R2A ↔ R*2A + B kb 2kb k-↨k+ 2kf k-↕ k+ Схема 1 ’ kf 2A + RB ↔ A + RAB ↔ R2AB ↔ R*2AB kb ’ 2kb kd ↕kr RDB2A Здесь A – молекула агониста, R, R* и RD обозначают соответственно закрытое, открытое и десенситизированное состояния рецептора, B – молекула блокатора. Прямая и обратная константы скоростей связывания агониста обозначены соответственно как kf и kb; константы скоростей открытия и закрытия канала обозначены, соответственно, как и ; k+ и k- - константы скоростей ассоциации и диссоциации блокатора; kd и kr – константы скоростей десенситизации и выхода из десенситизированного состояния. Ловушкой называется ситуация, когда блокатор способен оставаться в закрытом канале, то есть возможно состояние RB. Диссоциация блокатора из ловушки, как правило, возможна только после повторной активации канала. В случае ’=0, канал не может закрыться в присутствии блокатора («foot-in-thedoor»). Следует отметить, что к настоящему моменту не существует универсального критерия, позволяющего однозначно определить механизм действия блокатора. Это связано с тем, что для веществ с разной кинетикой информативными оказываются разные протоколы. Для веществ с быстрой кинетикой действия «foot-in-the-door» механизм можно выявить по характеру переходных процессов, возникающих после окончания совместной аппликации агониста и блокатора. Для веществ с медленной кинетикой можно выявить ловушку в протоколе «последовательных аппликаций». 8 Для анализа структурных детерминант ловушки в NMDA рецепторах был использован ряд трициклических соединений – производных классического «foot-inthe-door» блокатора 9АА. Структурные формулы изучавшихся соединений приведены в таблице 1, а количественные характеристики блокирующего действия - в таблице 2. Таблица 1. Химические формулы использованных в работе соединений. 1. 9AA 2. ИЭМ-2120 N N N+H2-(CH2)6-N+H3 N+H3 3. ИЭМ-2115 4. ИЭМ-2116 N+H2-(CH2)5-N+Me3 N+H3 5. ИЭМ-2117 6. ИЭМ-2118 N+H2-(CH2)5-N+Me3 N+H3 7. ИЭМ-1921 8. ИЭМ-1925 N+H3 9. Такрин 10. ИЭМ-2129 N N+H2Me N+H3 11. ИЭМ-2130 12. ИЭМ-2128 N действия производных N N+HEt2 N+H2Et Механизм N 9АА с алкильными заместителями у аминогруппы. В экспериментах с 9АА мы наблюдали классические признаки «foot-in-the-door» блокады: хвостовой ток при отмыве в отсутствие агониста (рис. 1А) и овершут при отмыве в его присутствии (рис. 1Б). ИЭМ-2129, ИЭМ-2130 и ИЭМ-2128 отличаются от 9 9АА наличием алкильных заместителей при аминогруппе. У ИЭМ-2129 этот заместитель метильный, у ИЭМ-2130 – этильный, а у ИЭМ-2128 – диэтильный. Активность этих веществ оказалась в 2-3 раза ниже, чем у 9АА. А NMDA +/- 9АА (50 мкМ) В NMDA +/- ИЭМ-2129 (100 мкМ) NMDA Б 9AA, 200 мкM контроль 200 пА 200 пА 1с 200 пА ИЭМ-2129 (100 мкМ) 100 мс 1с NMDA Г ИЭМ-2129 (400 мкМ) Д NMDA +/- ИЭМ-2130 (100 мкМ) Е NMDA +/- ИЭМ-2128 (50 мкМ) 1-я аппликация контроль 200 пА 1с 200 пА ИЭМ-2130 (100 мкМ) 100 мс 200 пА 2-я аппликация 1с контроль отмыв Рисунок 1. Блокада интегральных токов клетки 9АА и его производными с алкильными заместителями у аминогруппы. А. Хвостовой ток при действии 9АА. Б. Овершут при действии 9АА. В. Хвостовой ток при действии ИЭМ-2129. Г. Овершут при действии ИЭМ-2129. Д. Хвостовой ток при действии ИЭМ-2130. Е. Отсутствие кумулятивного блока при действии ИЭМ-2128 в протоколе «последовательных аппликаций». Кинетика отмыва ИЭМ-2129 (τ =90 ± 20 мс) была даже чуть быстрее, чем у 9АА (τ = 140 ± 20 мс). Сохранились и все признаки механизма действия исходного соединения: хвостовой ток (рис. 1В) и овершут (рис. 1Г). У ИЭМ-2130 кинетика уже была заметно медленнее (τ = 650 ± 90 мс). Овершут при отмыве в присутствии агониста не наблюдался. Но наличие хвостового тока позволило сделать вывод, что ИЭМ-2130 также является «foot-in-the-door» блокатором (рис. 1Д). Действие ИЭМ-2128 было еще медленнее (τ = 2600 ± 800 мс). Сооответственно, хвостовой ток и овершут отсутствовали. И для определения механизма действия потребовался протокол «последовательных аппликаций» (рис. 1Е). Развитие блокады наблюдалось в обеих аппликациях ИЭМ-2128, а форма ответа в тестирующей аппликации агониста не 10 отличалась от контроля. Это признаки «foot-in-the-door» блокаторов. Можно заключить, что добавление алкильных заместителей к структуре 9АА повлияло на активность и кинетику, но не привело к изменению механизма действия веществ. Механизм действия производных 9АА с измененной структурой центрального цикла. ИЭМ-2117 обладает 5-членным центральным циклом. В экспериментах с этим блокатором не наблюдались ни овершут, ни хвостовой ток. Из протокола «последовательных аппликаций» (рис. 2А) видно, что развитие блокады происходило как при первой, так и при второй аппликации ИЭМ-2117. Также видно, что форма ответов на контрольную и тестирующую аппликацию блокатора была одинаковой. Это позволило нам сделать вывод, что ИЭМ-2117 является «foot-in-the-door» блокатором. ИЭМ-2115 – это другое вещество с измененной структурной центрального цикла. В этом случае атом азота также отсутствует, а сам цикл 7-членный. Из-за медленной кинетики диссоциации ИЭМ-2115 для определения механизма действия снова был использован протокол «последовательных аппликаций». Однако в этом случае мы увидели классическую феноменологию блокатора, способного оставаться в ловушке. Развитие блокады было заметно только при первой аппликации ИЭМ-2115 (10 ± 3% блокады пика). В начале второй уже наблюдалась существенная блокада (65 ± 5%). А при тестирующей аппликации агониста мы видели постепенный рост тока. Таким образом, ИЭМ 2115 является блокатором, способным оставаться в ловушке. А Б NMDA +/- ИЭМ-2117 (50 мкM) NMDA +/- ИЭМ-2115 (8 мкM) 2-я аппликация 1-я аппликация 1-я аппликация отмыв 2-я аппликация 200 пА 1с 200 пА отмыв 1с контроль контроль Рисунок 2. Блокада интегральных токов клетки производными 9АА с измененной структурой центрального цикла. Протокол «последовательных аппликаций» для ИЭМ2117 (А) и ИЭМ-2115 (Б). 11 Таблица 2. Количественные характеристики блокады NMDA рецепторов трициклическими соединениями. Отмыв Блокатор ИК50 мкM Блокa мкM / % Кинетикаб мс Протокол «последовательных аппликаций» Овершут Ампл.в Блока мкM / % 1й пикг (%) 2й пикд (%) отмыве (%) Хвостовой ток Блокa мкM / % Ампл.в Рост мс Спад мс Ловушка 9AA 15 ± 2 200 / >90 140 ± 20 1.5±0.3 Спад мс 1230±210 ИЭМ2117 ИЭМ 2115 ИЭМ 2129 ИЭМ 2130 ИЭМ 2128 25 ± 4 250 / >90 380 ± 60 НЕТ НЕТ 50 / 66±10 26±4 20±3 3±2 100 / 81±8 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ 3±1 40 / >90 2500 ± 600 НЕТ НЕТ 8 / 71±6 10±3 65±5 64±7 10 / 77±5 НЕТ НЕТ НЕТ ДА 40 ± 2 400 / >90 90 ± 20 1.6±0.3 240±60 75 / 66 ±8 78±5 78±6 5±2 100 / 79±10 1.3±0.2 16±8 62±18 НЕТ 42 ± 3 400 / >90 650 ± 90 НЕТ НЕТ 75 / 66±6 62±6 60±4 4±2 100 / 74±7 0.7±0.2 15±7 100±30 НЕТ 28 ± 2 200 / >90 2600 ± 800 НЕТ НЕТ 50 / 65±7 9±4 14±6 5±3 100 / 87±6 НЕТ НЕТ НЕТ НЕТ 30 / 72±7 65±4 67±6 4±3 50 / 87±5 0.5±0.15 54±13 550±170 НЕТ Признаки, имеющие решающее значение при определении механизма действия, показаны жирным шрифтом. а – в колонке указана использованная концентрация блокатора и процент блокады стационарного тока б – взвешенная постоянная времени двухэкспоненциальной аппроксимации в – амплитуда относительно стационарного уровня контрольного ответа г – ингибирование пика ответа при первой коаппликации блокатора и NMDA д –ингибирование пика ответа при второй коаппликации блокатора и NMDA е – ингибирование пика ответа при тестирующей аппликации NMDA 12 При взгляде на химические структуры блокаторов причина разницы в механизме действия 9АА, ИЭМ-2117 и ИЭМ-2115 совершенно не очевидна. Это три монокатионных трициклических соединения, но 9АА и ИЭМ-2117 имеют «foot-in-thedoor» механизм действия, а ИЭМ-2115 проявляет ловушку. Для разрешения этого парадокса мы попробовали посмотреть на трехмерные структуры этих соединений, рассчитанные методом молекулярной механики. Мы обнаружили, что 9АА и ИЭМ2117 не превосходят по размерам ИЭМ-2115. Но оказалось, что и 9АА, и ИЭМ-2117 обладают плоской структурой сопряженных ароматических циклов. А 7-членное кольцо ИЭМ-2115 подобную плоскую организацию нарушает (рис. 3). Это связано с появлением в структуре центрального цикла двух sp3-гибридизованных атомов углерода. В результате структура ИЭМ-2115 становится «V-образной» и приобретает заметное сходство с классическими ловушковыми блокаторами NMDA рецепторов, например, МК-801. Следует отметить, что добавление алкильных заместителей к аминогруппе 9АА (ИЭМ-2129, ИЭМ-2130, ИЭМ-2128) не вызывает нарушения плоской структуры трициклической группировки. Соответственно, добавление этих заместителей приводило к изменению активности и кинетики действия веществ, но не меняло механизма действия. Таким образом, можно сделать вывод, что плоская ароматическая структура является одной из основных детерминант «foot-in-thedoor» механизма действия 9АА. Рисунок 3. Трехмерные структуры блокаторов. Пространственное строение ИЭМ-2115 похоже на строение МК-801, классического рецепторов блокатора NMDA проявляющего ловушку. Оба имеют «V-образную» структуру с ароматическими «крыльями» и аминогруппой на вершине. ИЭМ-2117, как и 9АА, имеет плоскую структуру. 13 Блокада AMPA рецепторов трициклическими соединениями. AMPA рецепторы являются близкими родственниками NMDA рецепторов. При исследовании действия трициклических соединений на NMDA рецепторы мы обнаружили серьезные различия в механизмах блокады между веществами с плоской и «V-образной» структурой. Была поставлена задача сравнить механизмы действия плоских и «V-образных» веществ на Ca2+-проницаемые и Ca2+-непроницаемые AMPA рецепторы. Активность и потенциал-зависимость действия трициклических соединений. А 10 Ca Б 2+ -проницаемые AMPA рецепторы 1,2 Ca 2+ -проницаемые AMPA рецепторы 0,8 1 z ИК50(0), мM 1,0 0,6 0,4 0,1 0,2 0,0 0,01 1 5 "Плоские" моно- В 10 Ca 2 6 ди- 3 7 "V" моно- 4 1 8 ди- 5 "Плоские" моно- 2+ -непроницаемые AMPA рецепторы Г 1,2 Ca 2 6 ди- 3 7 "V" моно- 4 8 ди- 2+ -непроницаемые AMPA рецепторы 0,8 1 z ИК50(0), мM 1,0 0,6 0,4 0,1 0,2 0,0 0,01 1 5 "Плоские" моно- 2 6 ди- 3 7 "V" моно- 4 1 8 5 "Плоские" моно- ди- 2 6 ди- 3 7 "V" моно- 4 8 ди- Рисунок 4. Активности (А, В) и потенциал-зависимости (Б, Г) блокады Са2+проницаемых (А, Б) и Са2+-непроницаемых (В, Г) AMPA рецепторов. Номера соединений соответствуют номерам в таблице 1. На диаграммах вещества разбиты на 4 группы: плоские монокатионы, плоские дикатионы, «V-образные» монокатионы и «V-образные» дикатионы. 4 диаграммы 14 иллюстрируют полученные значения ИК50(0) и zδ для Са2+-проницаемых (А, Б) и Са2+непроницаемых (В, Г) рецепторов. Из рисунка 4А видно, что максимальной активностью по отношению к Са2+-проницаемым рецепторам обладают «V-образные» дикатионы ИЭМ-2116 и ИЭМ-1925. Для Ca2+-непроницаемых рецепторов (рис. 4Б) ситуация оказалась качественно иной. Ни одно из веществ не обладало ИК 50(0) в диапазоне десятков мкМ, и активность веществ из разных групп не настолько сильно отличалась друг от друга. Диаграммы 4В и 4Г отражают полученные значения zδ для Са2+-проницаемых и Са2+-непроницаемых рецепторов. Наибольшие значения zδ демонстрировали на обоих типах рецепторов «V-образные» дикатионы ИЭМ-2116 и ИЭМ-1925. Напротив, действие плоских монокатионов 9АА и ИЭМ-2117, а также плоского дикатиона ИЭМ2120, практически не зависело от потенциала (zδ около 0.1). Для остальных веществ наблюдались промежуточные значения zδ, причем для Са2+-проницаемых рецепторов они были выше, чем для Са2+-непроницаемых рецепторов. Полученные данные позволяют сделать вывод о существовании как минимум двух сайтов в AMPA рецепторах. Связывание с глубоким сайтом приводит к потенциал-зависимому блоку открытого канала с ловушкой, механизмы которого были подробно описаны ранее (Magazanik et al., 1997; Bolshakov et al., 2005). Присутствие в AMPA рецепторах поверхностного сайта описано впервые. В дальнейшем мы попробовали охарактеризовать механизмы, определяющие взаимодействие с этим сайтом. Механизм действия веществ с плоской трехмерной структурой. Чтобы определить, является ли открытие канала необходимым для связывания веществ с плоской трехмерной структурой, мы сравнили эффекты, которые возникают при преаппликации ИЭМ-2117 (1.5 мМ) без агониста и совместной аппликации ИЭМ2117 и каината на Са2+-непроницаемых AMPA рецепторах. Примеры токов приведены на рисунке 5А. Ингибирование ответа происходило и в случае преаппликации ИЭМ2117, и в случае совместной аппликации. Стоит отметить практически одинаковую кинетику медленной фазы отмыва. Похожие результаты были получены нами в экспериментах на Са2+-проницаемых AMPA рецепторах. Основным отличием в действии на 2 типа рецепторов оказалась более быстрая кинетика во втором случае. Мы показали, что, в отличие от блокаторов с «V-образной» трехмерной структурой, для развития эффекта ИЭМ-2117 присутствие агониста не является необходимым. 15 Естественно, на следующем этапе мы попробовали определить, может ли происходить отмыв ИЭМ-2117 в отсутствие агониста. Оказалось, что восстановление амплитуды ответа происходило и в присутствии (рис. 5В, кривая 1) и в отсутствие каината (рис. 5В, кривые 2 и 3). Не отличалась даже скорость отмыва ИЭМ2117: амплитуда тока после односекундной (кривая 2) или трехсекундной (кривая 3) паузы в общем растворе быстро достигала того же уровня, что и при отмыве в постоянном присутствии каината. Таким образом, ИЭМ-2117 не способен оставаться в ловушке в закрытых каналах AMPA рецепторов. А 1 2 Каинат Б ИЭМ-2117 3 4 1 ИЭМ-2117 2 Каинат 3 4 200 пА 4 3 200 пA 1c 1с 4 3 2 2 1 1 В ИЭМ-2117 Г1 Каинат 1 2 3 9AA 2 3 2 3 Каинат ИЭМ-2117 500 пA 200 пA 1с 1с 2 1 3 1 Рисунок 5. Сравнение эффектов преаппликации и совместной аппликации ИЭМ-2117 на Са2+-непроницаемые (А) и Са2+-проницаемые (Б) рецепторы. В. Отмыв ИЭМ-2117 в отсутствие и в присутствии агониста. Г. Конкуренция между ИЭМ-2117 (1.5 мМ) и 9АА (1.5 мМ). Чтобы определить, связывается ли быстрый потенциал-независимый блокатор 9АА с тем же сайтом, что и медленный потенциал-независимый блокатор ИЭМ-2117, мы использовали эксперименты на конкуренцию. Присутствие медленной компоненты при отмыве смеси блокаторов в присутствии каината может служить свидетельством 16 того, что значительная часть каналов заблокирована ИЭМ-2117. Мы обнаружили (рис. 5Г), что после совместной аппликации 9АА и ИЭМ-2117 (кривая 3) каинатный ответ восстанавливался также быстро, как после аппликации одного 9АА (кривая 1). Из этого следует, что в присутствии избыточной концентрации 9АА связывания ИЭМ2117 не происходит, т.е. блокаторы конкурируют за один и тот же участок связывания. Взаимосвязь между связыванием потенциал-зависимых и потенциал-независимых блокаторов. Нам удалось показать, что существуют как минимум два сайта связывания неконкурентных антагонистов AMPA рецепторов: глубокий и поверхностный. Для связывания блокаторов с глубоким сайтом необходимо предварительное открытие канала, связывание с поверхностным сайтом этого не требует. Но является ли связывание антагонистов с этими сайтами независимым? Чтобы ответить на этот вопрос мы исследовали влияние быстрого потенциал-независимого блокатора 9АА на действие медленного потенциал-зависимого блокатора ИЭМ-1925. Эксперименты проводились на Са2+-проницаемых AMPA рецепторах, что позволило использовать более низкие концентрации блокаторов. Концентрация быстрого блокатора 9АА (1.5 мМ, примерно 6 ИК50) снова была значительно эффективнее, чем концентрация медленного блокатора ИЭМ-1925 (1.5 мкМ, примерно ИК50). А1 2 3 ИЭМ-1925 9АА Б Каинат Каинат ИЭМ-1925 9AA 1, 3 2 100 пA 1 3 2 3 1 4 100 пA 2c 5с Рисунок 6. Влияние 9АА на блокирующее действие ИЭМ-1925. А. 9АА вытесняет ИЭМ-1925 из сайта связывания. Б. 9АА замедляет отмыв ИЭМ-1925. 17 Кривая 1 рисунка 6А демонстрирует медленный процесс отмыва блокатора ИЭМ-1925 (1.5 мкМ) в присутствии каината. T составила 4.8 ± 0.8 с. Кривая 2 иллюстрирует отмыв смеси блокаторов 9АА и ИЭМ-1925. Видно, что медленная фаза отмыва сохраняется, однако ее амплитуда достоверна снижена по сравнению с экспериментом 1 (на 40 ± 10%). Бросается в глаза отличие от эксперимента с отмывом смеси блокаторов 9АА и ИЭМ-2117 (рис. 5Г), где медленная фаза отмыва ИЭМ-2117 в присутствии 9АА исчезала полностью. В эксперименте 3 мы сначала регистрировали ответ на совместную аппликацию ИЭМ-1925 и 9АА, наблюдалась практически полная блокада каинатного ответа. После чего мы убрали 9АА из раствора и наблюдали доразвитие блока ИЭМ-1925 до уровня в эксперименте 1. Поскольку ИЭМ-1925 постоянно находился в растворе, такое доразвитие блока можно объяснить только частичным отмывом ИЭМ-1925 в присутствии 9АА. Эти результаты позволяют сделать вывод, что связывание антагонистов с глубоким и поверхностным сайтами в AMPA рецепторах независимым не является. Но что же лежит в основе взаимодействия между медленным потенциалзависимым блокатором ИЭМ-1925 и быстрым потенциал-независимым блокатором 9АА? Прямая конкуренция выглядит не слишком правдоподобно из-за разницы в механизме действия. Одной из гипотез может быть аллостерический эффект, в результате которого при связывании 9АА снижается сродство ИЭМ-1925 к каналу. Если бы такое снижение сродства действительно происходило, ожидалось бы увеличение скорости отмыва ИЭМ-1925 в присутствии 9АА. Для проверки этой гипотезы и был проведен следующий эксперимент (рис. 6Б). Мы сравнили кинетику восстановления ответа после блокады ИЭМ-1925 (1.5 мкМ) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривые 2-4) 1.5 мМ 9АА. Время аппликации 9АА было равно 2, 5 и 10 секунд в экспериментах 2, 3 и 4, соответственно. Точки перегиба между быстрой и медленной фазами восстановления ответа на этих трех кривых отражают сохранившийся уровень блокады ИЭМ-1925. Очевидно, что аппликация 9АА во время отмыва ИЭМ-1925 в присутствии каината замедляет восстановление амплитуды ответа. В отсутствие 9АА τ была равна 4.8 ± 0.8 с, а оценка по 3 точкам в присутствии 9АА дала значение 18 ± 2 с. Таким образом, замедление отмыва ИЭМ-1925 в присутствии 9АА свидетельствует против простой гипотезы об аллостерическом эффекте связывания 9АА на сродство ИЭМ-1925 к каналу. 18 Рисунок 7. расположения связывания Схема сайтов потенциал- зависимых (1) и потенциалнезависимых (2) блокаторов в AMPA рецепторах. Полученные результаты позволили нам предложить следующую схему расположения сайтов связывания в канале AMPA рецепторов (рис. 7). Вероятно, потенциал-независимые блокаторы связываются в наружном вестибюле канала вне мембраны. Такое поверхностное расположение сайта связывания (выше, чем активационные ворота канала) приводит к отсутствию зависимости связывания и диссоциации блокатора от присутствия агониста. Близость глубокого и поверхностного сайта друг к другу объясняет эффект неполной конкуренции между блокаторами разных типов. Действительно, связывание ИЭМ-1925 только уменьшается, а не исчезает, в присутствии высокой концентрации 9АА, что говорит об отсутствии стерического перекрывания между двумя сайтами. С другой стороны, положительно заряженные лиганды, связывающиеся c близко расположенными сайтами, должны вытеснять друг друга, и связывание одного будет приводить к снижению связывания другого. Предложенная схема расположения сайтов связывания способна объяснить и обнаруженное нами в эксперименте (рис. 6Б) замедление отмыва ИЭМ-1925 в присутствии 9АА. В самом деле, при связывании 9АА с поверхностным сайтом выход ИЭМ-1925 из глубокого сайта наружу становится затрудненным. Таким образом, связывание потенциал-независимого блокатора с поверхностным сайтом приводит к «запиранию» потенциал-зависимого блокатора внутри канала. Аналогичный эффект 19 был ранее обнаружен Антоновым с соавторами (Antonov et al., 1998) на NMDA рецепторах. Связывание внешних ионов натрия с поверхностным сайтом препятствовало диссоциации дикатионного блокатора ИЭМ-1754 из глубокого сайта. Таким образом, данная схема объясняет все основные феномены, наблюдаемые при блокаде АМРА каналов исследованными соединениями. Безусловно, стоит отметить, что одна и та же структурная детерминанта определяет принадлежность к группе «foot-in-the-door» блокаторов в случае NMDA рецепторов и к потенциал-независимым блокаторам в случае AMPA рецепторов. Новосинтезированные соединения и экспериментальные протоколы, разработанные в рамках данной работы, могут служить для дальнейшего сравнения этих двух типов ионных каналов. Выводы: 1. При регистрации интегральных токов клетки протоколы отмыва блокатора в присутствии и в отсутствие агониста информативны для выявления характера взаимодействия с воротным механизмом канала у блокаторов с быстрой кинетикой диссоциации. Протокол «последовательных аппликаций» позволяет обнаружить ловушку у блокаторов с медленной кинетикой диссоциации. 2. При блокаде NMDA рецепторов монокатионные трициклические соединения с плоской ароматической структурой демонстрируют «foot-in-the-door» механизм действия, в то время как монокатионные трициклические соединения с «Vобразной» структурой проявляют ловушку. 3. Трициклические соединения с плоской ароматической структурой блокируют Са2+-проницаемые и Са2+-непроницаемые AMPA рецепторы потенциал- независимым образом. 4. При действии на AMPA рецепторы связывание и отмыв блокаторов с плоской структурой может происходить как в присутствии, так и в отсутствие агониста. 5. При связывании антагонистов с плоской структурой с поверхностным сайтом в AMPA рецепторах происходит замедление отмыва блокатора, связавшегося с глубоким сайтом. 20 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. Dorofeeva N.A., Tikhonov D.B., Barygin O.I., Tikhonova T.B., Salnikov Y.I., Magazanik L.G. Action of extracellular divalent cations on native alpha-amino-3hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA) receptors// J. Neurochem. – 2005 – V. 95 – N. 6 – P. 1704-1712. 2. Tikhonova T.B., Barygin O.I., Gmiro V.E., Tikhonov D.B., Magazanik L.G. Organic blockers escape from trapping in the AMPA receptor channels by leaking into the cytoplasm// Neuropharmacology – 2008 – V. 54 – N.4 – P. 653-664. 3. Barygin O.I., Gmiro V.E., Kim K.Kh., Magazanik L.G., Tikhonov D.B. Blockade of NMDA receptor channels by 9-aminoacridine and its derivatives// Neurosci. Lett. – 2009 – V. 451 – N. 1 – P. 29-33. 4. Барыгин О.И., Лучкина Н.В., Гмиро В.Е., Тихонов Д.Б. Различный механизм блокады 9-аминоакридином ионных каналов NMDA- и АМРА-рецепторов// Биол. Мембраны – 2009 – Т. 26 – N. 4 – С. 280-286. Тезисы докладов 1. Барыгин О.И., Ким К.Х., Гмиро В.Е., Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б. Эффект ловушки при блокаде ионных каналов NMDA рецепторов трициклическими соединениями// Тезисы 11-й международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» – Пущино – 2007 – С. 5-6. 2. Barygin O.I., Kim K.H., Gmiro V.E., Magazanik L.G., Tikhonov D.B. Blockade of NMDA receptors with tricyclic compounds: paradoxes of trapping// Contemporary problems of neurobiology: molecular mechanisms of synaptic plasticity – Kazan – 2007 – P. 11-12. 3. Барыгин О.И. Эффект ловушки при блокаде ионных каналов NMDA рецепторов трициклическими соединениями// Тезисы 11-й Всероссийской медико- биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» - Санкт-Петербург – 2008 – С. 27-28. 21 4. Барыгин О.И., Ким К.Х., Гмиро В.Е., Магазаник Л.Г., Тихонов Д.Б. Блокада NMDA рецепторов 9-аминоакридином и его производными// Тезисы 12-й международной Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» – Пущино – 2008 – С. 167. 5. Барыгин О.И., Лучкина Н.В. Различные механизмы блокады NMDA и AMPA рецепторов трициклическими соединениями// Тезисы 12-й Всероссийской медико-биологической конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» – Санкт-Петербург – 2009 – С. 38-39. 6. Барыгин О.И., Лучкина Н.В., Тихонов Д.Б. Трициклические моно- и дикатионы – блокаторы каналов AMPA и NMDA рецепторов// Материалы научной конференции «Ионные каналы: структура и функции». Биол. Мембраны – 2009 – Т. 26 – N. 4 – С. 306. 22
