Основные положения, выносимые на защиту:

На правах рукописи
СИМОНОВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРИЗНАКОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ
МОРФОЛОГИЮ КОЛОСА И СТРУКТУРУ ЭНДОСПЕРМА ЗЕРНОВКИ
ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM L.), ИНТРОГРЕССИРОВАННЫХ ОТ
AEGILOPS SPELTOIDES TAUSСH.
Генетика – 03.02.07
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Новосибирск 2010
Работа выполнена в лаборатории хромосомной инженерии злаков
Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики
СО РАН, г. Новосибирск
Научный руководитель:
кандидат биологических наук, доцент
Пшеничникова Т. А.
Институт цитологии и генетики
СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Цильке Р. А.
Новосибирский государственный аграрный
университет, г. Новосибирск
доктор сельскохозяйственных наук
Стёпочкин П. И.
Сибирский НИИ растениеводства и селекции,
г. Новосибирск
Ведущее учреждение:
ГНЦ РФ Всероссийский научноисследовательский институт
растениеводства имени Н.И. Вавилова,
г. Санкт-Петербург
Защита диссертации состоится "__24__" __ноября__ 2010 г. на
утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на
соискание учёной степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте
цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:
Проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090.
Тел/факс: (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института
цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан "_____" ______________ 2010 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
Хлебодарова Т. М.
Актуальность проблемы.
Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) является аллогексаплоидным
видом, сочетающим в себе три генома диких диплоидных злаков
(AABBDD). Подобно мягкой пшенице такой же сложный геном имеют
спельта (T. spelta L.), шарозёрная пшеница (T. sphaerococcum Perciv.) и
пшеница компактум (T. compactum Host). Они являются ближайшими
родственниками. Эти пшеницы были разделены на виды Карлом Линнеем
благодаря некоторым признакам колоса (Гончаров, 2002). Современные
исследования показали, что признаки, выбранные им для классификации,
контролируются небольшим числом генов. В Каталоге генных символов
пшеницы данные гены приведены в разделе «большой морфологии»
(McIntosh et al., 2003). У шарозёрной пшеницы локализована полная серия
ортологичных генов шарозёрности S в хромосомах третьей
гомеологической группы (Maystrenko et al., 1998), картированных в
прицентромерных районах (Salina et al., 2000). Ген C, вызывающий
компактность колоса и низкорослость растения, локализован у различных
образцов пшеницы компактум в хромосоме 2DL (McIntosh et al., 2003).
Спельта характеризуется удлинённым рыхлым колосом с жёсткими
колосковыми чешуями, плотно прилегающими к колосовому стержню, она
трудно обмолачивается. У T. spelta известен лишь один локус Q в
хромосоме 5AL, вызывающий образование характерного колоса. Таким
образом, для признаков компактоидности и спельтоидности ещё предстоит
найти недостающие ортологичные гены в гомеологичных хромосомах.
Благодаря лёгкому обмолоту колоса мягкая пшеница получила
широчайшее распространение. Таким образом, ген, определяющий лёгкий
обмолот, приобрёл доместикационное значение. Эту важную роль многие
исследователи приписывают аллелю гена Q, который, помимо характера
обмолота, плейотропно контролирует ряд других признаков: плотность и
длину колоса, время колошения и цветения, высоту растения. Из недавних
молекулярных работ известно, что ген Q относится к семейству генов
APETALA2, найденных у большого числа растений и контролирующих
развитие цветка (DeFaris et al., 2003).
В качестве метода обогащения генофонда мягкой пшеницы,
например, по устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам,
можно использовать отдалённую гибридизацию. Для передачи новых
ценных признаков мягкой пшенице, а также для установления
эволюционных взаимосвязей её с другими видами создаются линии с
генетическим материалом других видов. Это могут быть линии с
замещёнными или добавочными хромосомами, интрогрессивные линии с
фрагментарными вставками участков хромосом разного размера.
Источником ценных признаков может служить Aegilops speltoides Tausch –
диплоидный злак, вероятный донор геномов B и G полиплоидных пшениц.
С использованием этого донора создана серия интрогрессивных линий
мягкой пшеницы «Арсенал» на основе сорта Родина (Лапочкина, Волкова,
1
1994). Образцы этой коллекции обладают устойчивостью к фитопатогенам,
характеризуются новыми морфологическими и физиологическими
чертами. В частности, у образцов данной коллекции найдены новые гены
опушения листовой пластины Hl2, безвосковости колоса W2I, новые аллели
окраски колоса Rg1 и запасных белков Gli-B1 (Пшеничникова и др., 2005).
Мягкую пшеницу в основном выращивают для продовольственных
целей.
Хлебопекарные
свойства
муки
являются
основными
характеристиками, на основании которых сорта делятся на сильные,
ценные, сорта-филлеры с посредственными свойствами, а также слабые. Из
муки сильных и ценных сортов получается качественный дрожжевой хлеб.
Перенося гены родственных видов, можно повысить содержание белка в
зерне и передать другие ценные хлебопекарные свойства пшенице.
Целью работы стала характеристика генов, интрогрессированных
в мягкую пшеницу от дикого диплоидного злака Ae. speltoides Tausch.,
определяющих морфологию колоса, тип развития и структуру эндосперма
зерновки, а также выявление их взаимодействия с известными
аналогичными генами мягкой пшеницы.
Для её достижения были поставлены следующие задачи:
 установить характер генетического контроля спельтоидности и
остистости колоса, а также озимости у интрогрессивной линии 84/98 w в
новой генотипической среде, используя гибридизацию с образцами мягкой
пшеницы;
 определить хромосомную локализацию интрогрессированных генов,
контролирующих морфологию колоса и тип развития растения, в пределах
генома мягкой пшеницы с помощью моносомного анализа;
 изучить характер взаимодействия интрогрессированного гена,
определяющего спельтоидную форму колоса, с известными аллелями гена
Q, детерминирующего морфологию колоса мягкой пшеницы и T. spelta;
 исследовать особенности конъюгации хромосом в мейозе у гибридов
между линиями, имеющими интрогрессию от Ae. speltoides, образцами T.
spelta, сортами и моносомными линиями мягкой пшеницы;
 исследовать влияние интрогрессии от Ae. speltoides на структуру
эндосперма зерновки мягкой пшеницы.
Научная новизна. В настоящей работе:
 впервые найдены и охарактеризованы новые гомеоаллельные гены
S
Q и Ha-Sp, интрогрессированные от Ae. speltoides, один из которых
относится к «генам большой морфологии» злаков, а другой определяет
структуру эндосперма зерновки пшеницы;
 впервые обнаружено аддитивное действие генов гомеоаллельной
серии Q (спельтоидности), отвечающих за морфологию колоса;
 показана избирательность передачи рекомбинантных хромосом при
образовании гамет в мейозе у гибридов F1, полученных от скрещивания
интрогрессивной линиии 84/98w с образцами мягкой пшеницы и спельты;
2
 охарактеризовано взаимодействие нового доминантного аллеля
интрогрессивного гена мягкозёрности с известным рецессивным аллелем
локуса Ha мягкой пшеницы, влияющего на структуру эндосперма.
Практическая значимость работы. Пополнение семейства
ортологичных генов пшеницы позволяет создавать формы с более широкой
градацией проявления признаков колоса и структуры эндосперма зерновки.
Это позволяет увеличить генетическое разнообразие мягкой пшеницы по
хозяйственно-ценным признакам и удовлетворить запросы селекционеров
при отборе адекватно меняющимся условиям среды и требованиям
сельскохозяйственного производства.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.
Гену Q, плейотропно влияющему на форму колоса, время цветения,
длину колосоножки и характер обмолота, и относящемуся к генам
«большой морфологии», свойственен множественный аллелизм. Это
доказывается обнаружением гена QS, определяющего спельтоидную форму
колоса, интрогрессированного от Ae. speltoides в мягкую пшеницу. Он
эффективен в гетеро- и гемизиготном состоянии.
2.
Гены Q от T.spelta и QS от Ae. speltoides взаимодействуют по типу
сверхдоминирования, проявляющегося в формировании у гетерозиготных
растений суперспельтоидных колосьев с увеличенной длиной и числом
колосков.
3.
Новый ген мягкозёрности Ha-Sp, интрогрессированный от Ae.
speltoides в мягкую пшеницу, изменяет структуру эндосперма у
твердозёрных сортов и позволяет создавать формы с промежуточным
проявлением признака твердозёрности.
Апробация работы. Основные результаты исследований были
представлены постерным докладом на Международном совещании
Европейского общесва по изучению генетики злаков (EWAC) (май 2007,
Стамбул, Турция); постерным докладом на отчётной сессии ИЦиГ
(февраль 2008, Новосибирск); устным докладом на Международной
конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова – фундамент развития
отечественного и мирового сельского хозяйства» (ноябрь 2008, Москва);
устным и постерным докладами на Германо-Российском форуме по
биотехнологии (июнь 2009, Новосибирск), постерным докладом на
Международной конференции «Генетика, геномика и биотехнология
растений» (июнь 2010, Новосибирск).
Структура и объём работы. Диссертация содержит следующие
разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты,
обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на
115 страницах, содержит 26 рисунков и 26 таблиц, список используемой
литературы включает 83 ссылки, из них 22 на русскоязычные источники и
61 на зарубежные.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ,
из них 2 статьи – в научных журналах, в которых по требованию ВАК
3
Минобразнауки России должны быть опубликованы основные научные
результаты диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата
по биологическим наукам.
Вклад автора. Основные результаты получены автором
самостоятельно.
Цитологический
анализ
моносомных
гибридов
проводился совместно с к.б.н. Пшеничниковой Т.А. и при научной
поддержке к.б.н. Галиевой Э.Р. Микрофотографии получены в ЦКП
микроскопического анализа биологических объектов при помощи
Алёшиной Т.Е. Анализ мукомольных свойств зерна был выполнен в
технологической группе ИЦиГ.
Благодарности. Выражаю благодарность Ермаковой М.Ф.,
Чистяковой А.К., Щукиной Л.В. и Морозовой Е.В. за активное содействие
и обсуждение полученных данных, к.б.н. Галиевой Э.Р. за консультацию и
обсуждение цитологических данных и Алёшиной Т.Е. за помощь в
фотографировании цитологических препаратов. Выражаю признательность
д.б.н. Цильке Р.А. к.б.н. Смирновой О.Г., к.б.н. Адониной И.Г. и к.б.н.
Левитесу Е.В. за рецензирование данной работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальная работа была выполнена в лаборатории
хромосомной инженерии злаков ИЦиГ СО РАН.
Материал выращивался в условиях гидропонной теплицы ИЦиГ
СО РАН (г. Новосибирск) в осеннюю и весеннюю вегетации 2005 - 2009
годов с соблюдением необходимого режима яровизации, а также при
озимом посеве в НИИСХ ЦРНЗ (Немчиновка, Московская область) в 2005
и 2006 годах.
Линии мягкой пшеницы из коллекции «Арсенал» с интрогрессиями
от Ae. speltoides были предоставлены их создателем – Лапочкиной Инной
Фёдоровной (НИИСХ ЦРНЗ, Немчиновка). Объектом исследования
послужила интрогрессивная линия 84/98w из коллекции «Арсенал». От
реципиентного сорта Родина она отличается озимым типом развития,
спельтоидным остистым колосом и полустекловидным эндоспермом
зерновки. В качестве тестеров были использованы яровые (73/00i и 76/00i)
и озимые (32/98w и 75/98w) линии из этой коллекции, а также образцы
спельты, сорта мягкой пшеницы и их моносомные линии. Образец T. spelta
k-24724 получен из коллекции ВИР. Образцы T. spelta 1220029 и Grey, а
также замещённая линия CS/T.spelta 5A были предоставлены Энтони
Ворландом из Центра Джона Иннеса (Норидж, Великобритания).
Моносомные линии сортов Саратовская 29 и Диамант 2 (далее С29 и Дм2)
поддерживаются в секторе генетики качества зерна ИЦиГ СО РАН.
Предметом исследования стали такие признаки, как форма колоса,
остистость, тип развития и структура эндосперма, интрогрессированные в
мягкую пшеницу от Ae. speltoides. У созревших колосьев определялись
число колосков, длина колоса, длина самого длинного членика колоса (мм),
4
а также вычислялся индекс плотности (отношение числа колосков к длине
колоса, умноженное на 10). Фиксировались остистость/безостость
растения, а также дата цветения, если таковое наступало в течение
вегетации, иначе растение считалось озимым.
Для оценки результатов генетического анализа были
использованы следующие статистические методы: оценка соответствия
фактического расщепления на фенотипические классы теоретическому в F2
по критерию 2, двухфакторный дисперсионный анализ популяций F 1 и
достоверность корреляционных взаимодействий в F2 по Пирсону. Также
изучено распределение фенотипов в F2. Для оценок использовался
статистический пакет StatGraphics 5.0 и MS Excel.
Популяции гибридов изучались цитологически на временных
давленых ацетокарминовых препаратах в метафазе I мейоза.
Для
определения
технологических
качеств
зерна,
унаследованных от Ae. speltoides, были использованы цитологически
проанализированные потомки F3 гибридов моносомных линий по
хромосоме 5А твердозёрных сортов С29 и Дм2 с линией 84/98 w.
Мукомольные показатели изучали в соответствии с методиками,
принятыми в России для сортоиспытания сельскохозяйственных культур
(1988). Изучали следующие параметры: массу 1000 зёрен (г), общую
стекловидность (%), удельную поверхность частиц муки (см2/г) и диаметр
частиц муки (мк). Для образца Ae. speltoides два последних параметра не
определяли в связи с нехваткой нужного количестве зерна.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Генетический анализ признаков, интрогрессированных от
Aegilops speltoides Tausch в мягкую пшеницу и детерминируемых
генами хромосомы 5А
Характерной особенностью линии 84/98w, отличающей её от сорта
Родина, является спельтоидная форма колоса, а также остистость и озимый
тип развития (рис. 1). Известно, что на хромосоме 5A мягкой пшеницы
расположены гены, контролирующие эти признаки. Они картированы в
длинном плече в следующем порядке от центромеры: ген яровости Vrn-A1,
формы колоса Q и ингибитор остистости B1 (Kato et al, 1998). Есть
примеры, когда замещение этой хромосомы привело к изменению
фенотипа растения. Так, замещение хромосомы 5A у сорта Chinese Spring
на гомологичную хромосому образца T.spelta Grey (Law et al., 1976)
привело к появлению раннеспелой спельтоидной линии (рис. 1).
Сорт Родина имеет только один доминантный ген яровости Vrn-A1,
но линия 84/98w унаследовала озимый аллель от Ae. speltoides. Это
подтверждается расщеплением на яровые и озимые растения популяций F2
изучаемой озимой линии 84/98w с яровыми образцами. Так, расщепление F2
73/00i  84/98w по этому признаку составило 98 : 34 (3 : 1; χ2=0,17; P>0,5).
5
Гибриды F1 спельтоидной линии 84/98w с сортом С29 и
неспельтоидными линиями из коллекции «Арсенал» имели спельтоидную
форму колоса. В таблице 1 представлены результаты расщепления по
форме колоса в популяциях F2 при скрещивании её с неспельтоидными
образцами пшеницы. Во всех случаях данные свидетельствуют о том, что
спельтоидная форма определяется одним доминантным геном,
интрогрессированным от Ae. speltoides.
В случае с другим маркёрным геном, ингибитором остистости B1,
расположенным в теломерном районе на длинном плече хромосомы 5А,
наблюдалась несколько другая картина. При скрещивании линии 84/98 w с
безостым сортом С29, носителем ингибитора остистсти B1, в опытах без
яровизации, в популяции F2 наблюдалось существенное отклонение от
теоретически ожидаемого моногенного расщепления, при этом
наблюдалась нехватка остистых форм (таб. 2). В другой популяции F2,
полученной от скрещивания яровой безостой линии 76/00 i с линией 84/98w,
выращенной без яровизации растений, остистых форм не было (таб. 2).
Однако при яровизации данной популяции соотношение при расщеплении
на безостые и остистые соответствовало ожидаемому моногенному (таб. 2).
Это указывает на ограничение рекомбинации между генами Vrn-A1 и B1.
Таким образом, линия 84/98w унаследовала рецессивные аллели гена
типа развития Vrn-A1 и ингибитора остистости B1. Интрогрессированная
спельтоидность доминирует над обычной формой колоса мягкой пшеницы
и наследуется моногенно. Ранее было показано (Филипченко, 1979), что у
гибридов спельты с мягкой пшеницей также доминирует спельтоидная
форма колоса. Новый ген спельтоидности обозначен нами QS. Действие
этого гена состоит в увеличении длины колоса и числа колосков.
Таблица 1. Расщепление потомства F2 по признаку спельтоидности в
различных комбинациях скрещиваний с линией 84/98w.
Фенотип колоса
2
Гибридные комбинации F2
P
Спельтоид Неспельтоид (3 : 1)
174
72
2,15 0,25-0,10
С29  84/98w
i
w
65
28
1,45 0,25-0,10
73/00  84/98
78
22
0,48 0,50-0,25
76/00i  84/98w
Таблица 2. Расщепление потомства F2 на остистые и безостые растения от
скрещивания линии 84/98w с различными генотипами в различных условиях
выращивания.
Варианты
Фенотип колоса
P
2
безостый остистый (3 : 1)
68
10
6,72
<0,05
С29  84/98w, без яровизации
i
w
50
76/00  84/98 ,без яровизации
51
14
0,33 0,50-0,75
76/00i  84/98w, с яровизацией
6
Взаимодействие интрогрессивного гена QS с известным геном
спельтоидности Q вида Triticum spelta L
Поскольку было показано, что линия 84/98w несёт новый ген
спельтоидности QS, который доминирует над формой колоса T. aestivum,
было решено изучить его взаимоотношение с геном Q вида T. spelta,
расположенным в хромосоме 5А. Ген Q определяет характерную
спельтоидную форму колоса данного вида. Было проведено несколько
скрещиваний изучаемой линии 84/98w с разными образцами T. spelta и с
замещённой линией Chinese Spring / T.spelta 5A, имеющей характерную
спельтам форму колоса. Популяция F1 T. spelta k-24724  84/98w изучалась в
двух повторностях – в течение осенней и весенней вегетации в гидропонной
теплице. В обоих случаях длина колоса и число колосков в колосе у
гибридных растений F1 достоверно превышали таковые параметры у
родительских форм. Родительские формы – линия 84/98w и T. spelta k-24724
– имели колосья длиной около 11 см и в среднем по 15 колосков в колосе. У
гибридов F1 средняя длина колоса составила 16,4 см, а число колосков в
колосе более 22. Такие растения с достоверно увеличенной длиной колоса
были названы суперспельтоидами (рис. 2). Согласно данным
двухфакторного дисперсионного анализа (таб. 3), именно различия по
генотипам между родительскими образцами и гибридом F1 вносили 84 и
71% вклада в различия между средними значениями длины колоса и числа
колосков, соответственно. Длина членика колоса и индекс плотности
достоверно не различались у родителей и их гибрида. Аналогичные
результаты были получены при скрещивании с другими образцами спельты
(Данные не представлены).
При изучении поколения F2 T. spelta k-24724  84/98w по фенотипу
колоса вновь были выявлены растения, имеющие все признаки, описанные
у суперспельтоида F1.
Таблица 3. Морфометрические параметры колоса образца T. spelta k-24724,
линии 84/98w и их гибрида F1 (средние данные за две вегетации)
Признаки колоса
Генотипы
Длина
Число
Длина
Индекс
колоса, колосков, членика
плотности
см
шт.
колоса, мм
T. spelta k-24724
11,6
15,1
6,7
13,2
w
Линия 84/98
10,7
14,9
6,4
14,0
w
16,4**
22,4**
6,4
13,7
F1 T. spelta L. k-24724  84/98
Fтабл.
5,02
Fфактич.
163,9
130,1
0,93
3,0
НСР0,01
1,5
2,4
0,95
1,4
Вклад генотипа, %
84
71
** - P < 0,05
7
Рис. 1. Морфология колоса у
мягкой пшеницы сорта
Родина (а), Ae. speltoides k389 (б), интрогрессированной
линии 84/98w (в), образца
T.spelta Grey (г), замещённой
линии Chinese Spring / T.spelta
5A (д), сорта Chinese Spring (е).
а
б
в
г
а
б
в
Рис. 2. Морфология колоса у
линии 84/98w (а),
T. spelta k-24724 (в) и
F1 T. spelta k-24724  84/98w (б).
д
е
а
б
в
г
Рис. 3. Форма колоса у сорта С29 (а), у
гибридов F1 моно 5A С29  84/98w –
позднеспелого остистого (20”+1’) (б) и
раннеспелого безостого (20”+2’) (в), а
также у линии моно 5A С29 (г).
а
б
в
г
Рис. 4. Некоторые фазы мейоза гибридов F1 моно 5B Дм2  84/98w:
метафаза I (а), ранняя телофаза I (б), ранняя телофаза II (в), поздняя
телофаза II (г). Стрелками указаны отстающие униваленты и микроядра.
8
Рис. 5. Структура эндосперма
зерновки мягкой пшеницы:
стекловидная (а),
полустекловидная (б),
мучнистая (в).
а
б
в
Они имели длинный колос с увеличенным числом колосков. Во втором
поколении F2 наблюдается двусторонняя трансгрессия относительно
среднего значения F1 по всем параметрам колоса (таб. 4). Размах этой
трансгрессии не зависит существенно от условий среды.
Из проведённых экспериментов следует, что суперспельтоидность
проявляется в случае взаимодействия генов Q и QS. Суперспельтоидность
не закреплялась в поколениях, поскольку суперспельтоидные растения
всегда были гетерозиготны. У суперспельтоидов в метафазе I мейоза
наблюдались два унивалента. Униваленты хромосомы 5A от T. spelta и
интрогрессированной хромосомы линии 84/98w являются гомеологичными,
а не гомологичными, и потому рано расходятся после конъюгации.
Таблица 4. Размах изменчивости по признакам колоса в поколении F2
T.spelta k-24724  84/98w по сравнению с F1 в зависимости от условий
выращивания
Признаки колоса
Поколения скрещивания, место выращивания
Осень
Весна
2005
2006
F1
F2
F1
F2
F2
F2
(s±ms)
(lim)
(s±ms)
(lim)
(lim)
(lim)
Теплица, Новосибирск
Поле, Немчиновка
Длина колоса, см 16,9±0,92 7,5-20 15,8±1,2 6-17,5 8-20,5 5,5-20
Число колосков
21,5±1,3 13-27 23,2±1,3 15-30
14-30
11-22
Длина членика, мм 6,7±0,7
3-7
6,1±0,6
3-8
3-9
4-10
Индекс плотности 12,6±0,5 11,6-27,8 14,7±0,6 11,6-31,4 10,7-27,5 10,0-21,7
s±ms –
для F1 указано среднее значение и ошибка среднего
lim –
для F2 указаны пределы изменчивости
Доля гетерозиготных суперспельтоидов в этом случае теоретически
должна составлять около 50%. Однако при изучении гибридных популяций
F2 было установлено, что доля суперспельтоидных гетерозигот составляла
около 1/3 от общего числа растений, что не соответствует теоретическому
расщеплению. Изучение семей F3 и F4, полученных от растенийсуперспельтоидов, показало, что они вновь расщепляются на
суперспельтоидные и спельтоидные формы. Кроме того, в этих популяциях
9
присутствовали единичные плотноколосые растения. В очередных
поколениях доля суперспельтоидов от общего числа растений также
составляла примерно треть. Так, в F3 T. spelta k-24724  84/98w было
изучено 192 растения из 4 семей в полевых и тепличных условиях , среди
которых 64 оказались суперспельтоидами. Из 78 растений от двух семей F4
того же фенотипа 23 растения также были суперспельтоидами.
Таким образом, два гомеаллельных гена Q и QS, определяющих
спельтоидную форму колоса, действуют аддитивно, что приводит к
образованию суперспельтоидов – растений с достоверно более длинным
рыхлым колосом и с большим числом колосков, чем у родительских форм.
Это показано на четырёх различных гибридных комбинациях. Расщепление
суперспельтоидов прослежено до четвёртого поколения, при этом выявлено
отклонение в расщеплении от теоретического на два фенотипических
класса, выражающееся в нехватке суперспельтоидов.
Определение методом моносомного анализа хромосомы,
несущей интрогрессированные гены, детерминирующие маркерные
признаки.
Для хромосомной локализации генов, ответственных за
интрогрессированые признаки, были получены гибриды моносомных линий
по пятой гомеологической группе сортов Саратовская 29 (С29) и Диамант 2
(Дм2) с линией 84/98w. Сорта С29 и Дм2, как и Родина, характеризуются
неспельтоидной формой колоса, контролируемой одним локусом Q, и
отсутствием остей, подавляемых одним сильным ингибитором B1. Данные
сорта по типу развития являются яровыми, что обусловлено действием гена
Vrn-A1. Однако от сорта Родина сорта С29 и Дм2 отличаются наличием
яровых аллелей гена Vrn-B1 в хромосоме 5B, действие которого
проявляется значительно позже, а потому маскируется гомеаллельным
геном Vrn-A1.
Моносомные линии зацвели незначительно позже сортов, лишь
линия моно 5A С29 отстала от родительского сорта на 15-20 дней (таб. 5).
Здесь и далее данные по каждой паре гомологичных моносомиков С29 и
Дм2 приведены суммарно, поскольку эти сорта имеют одинаковый генотип
по изучаемым генам Q, B1, Vrn-A1 и Vrn-B1. Популяции гибридов F1 моно
5B (С29 и Дм2)  84/98w и F1 моно 5D (С29 и Дм2)  84/98w зацвели в те же
сроки, что и моносомные линии, примерно через 45 дней. Гибриды F1 моно
5A (С29 и Дм2)  84/98w разделились на позднеспелые, которые зацвели
лишь спустя 3 месяца, и раннеспелые. Кроме того, все раннеспелые
растения F1 моно 5А (С29 и Дм2)  84/98w были безостыми, тогда как все
позднеспелые имели хорошо развитые ости (рис. 3). Эти маркерные
признаки позволили нам предварительно отличить моносомное и дисомное
потомство по фенотипу, а также предсказать характер их наследования во
втором поколении. Окончательный вывод о цитотипе делался на основе
цитологического анализа.
10
Все растения F1 имели спельтоидную форму колоса (рис. 3),
достоверно превышающего по длине колосья моносомных родителей и
сопоставимых с интрогрессивной линией 84/98w. Если моносомики С29
имели длину колоса в среднем около 7 см, а моносомики Дм2 около 8 см, то
длина колоса гибридов F1 составила в среднем от 9,4 до 10,9 см, то есть как
у линии 84/98w. Несмотря на межсортовые различия по числу колосков в
колосе, у всех гибридных растений оно было близким с интрогрессивной
линией 84/98w. Это особенно ярко демонстрируют гибридные популяции с
С29, когда число колосков у гибридов в полтора раза превышает таковое у
моносомной линии (15,2 – 16,9 против 10,3 – 12,1).
Моносомные и дисомные растения популяции F1 моно 5А (С29 и
Дм2)  84/98w хорошо различалась по фенотипу (рис. 3). Поэтому
моносомное потомство F2 от поздних остистых растений и дисомное
потомство F2 от ранних безостых растений было высеяно отдельно.
Таблица 5. Период развития до цветения моносомных линий С29 и Дм2 и
их гибридов F1 с интрогрессивной линией 84/98w
Генотип
Число Генотип
Число
дней до
дней до
цветения
цветения
С29
37-40
Дм2
35-38
моно 5А С29
55-60
моно 5А Дм2
45-46
w
w
90-92
81-89
моно 5А C29  84/98 ,
моно 5А Дм2  84/98 ,
20"+1'
20"+1'
-//- 20"+2’ 42-48
-//- 20"+2’
45
моно 5B С29
47-51
моно 5B Дм2
42-46
w
w
45-53
44-46
моно 5B С29  84/98
моно 5B Дм2  84/98
моно 5D С29
47-52
моно 5D Дм2
45-48
w
w
47-52
44-46
моно 5D С29  84/98
моно 5D Дм2  84/98
По типу развития моносомные гибриды F2 моно 5А (С29 и Дм2) 
84/98 от поздеспелых F1 образовали два фенотипических класса – поздние
яровые и озимые растения в соотношении 24 : 8 (3 : 1; χ 2=0; P=1).
Моногибридное расщепление произошло благодаря присутствию гена VrnB1 в хромосоме 5B. Дисомные гибриды F2 моно 5А (С29 и Дм2)  84/98w от
раннеспелых F1 расщепились по дигибридной схеме 25 : 3 (15 : 1; χ2=0,54;
P>0,75) благодаря взаимодействию двух генов яровости Vrn-A1 и Vrn-B1.
Расщепление на яровые и озимые формы 126 : 8 среди гибридов F2 моно 5D
(С29 и Дм2)  84/98w соответствует дигибридному (15 : 1; χ2=0,01; P>0,9),
поскольку хромосома 5D сортов С29 и Дм2 не несёт генов, ответственных
за тип развития. Расщепление популяции F2 Моно 5B (С29 и Дм2)  84/98w
составило 79 : 19, что соответствует моногибридному (3 : 1; χ2=1,38; P>0,1),
так как большинство растений (75%) не несут гена яровости Vrn-B1, а
w
11
дисомные формы (около 25%) не вносят существенного вклада в
расщепление всей популяции.
Популяция F2 моно 5А (С29 и Дм2)  84/98w от поздних гибридов F1
не расщеплялась по форме колоса, все растения оказались спельтоидами.
Расщепление популяции F2 моно 5А (С29 и Дм2)  84/98w от ранних
гибридов F1 соответствует моногибридному (таб. 6). Расщепление F2 моно
5B (С29 и Дм2)  84/98w соответствует моногибридному. Расщепление F2
моно 5D (С29 и Дм2)  84/98w также соответствует моногибридному при
уровне значимости P>0,05. Все потомки F2 от поздних гибридов F1 моно 5А
(С29 и Дм2)  84/98w имели остистый колос, поскольку они не несли
реципиентную хромосому 5A с ингибитором остистости B1. Потомство
ранних дисомных гибридов F1 моно 5А Дм2  84/98w достоверно
разделилось на безостые и остистые формы в соотношении 3 : 1 (χ2=0,01;
P>0,9), как при обычном моногибридном скрещивании. Однако
расщепление на безостые и остистые формы гибридов F2 моносомиков по
хромосомам 5B и 5D с линией 84/98w не соответствует моногибридному 3 :
1, при этом наблюдается нехватка остистых форм (χ2=8,38 и 22,63
соответственно; P<0,05).
Таблица 6. Расщепление гибридов F2 между моносомиками по пятой
гомеологической группе сортов С29 и Дм2 с линией 84/98w на спельтоиды и
неспельтоиды
Гибридные комбинации F2
Фенотип
P
2
Спельтоид Неспельтоид
w
24
моно 5A  84/98 20"+1'
моно 5A  84/98w
моно 5B  84/98w
моно 5D  84/98w
21"
18
59
86
7
18
40
0,22 (3 : 1)
> 0,50
0,07 (3 : 1)
> 0,75
3,46 (3 : 1) 0,05-0,10
Данные цитологических наблюдений гибридов моносомных
растений с линией 84/98w говорят о многочисленных нарушениях мейоза в
моносомных комбинациях по хромосомам 5B и 5D. В метафазе I
наблюдалось по 3 или 5, а иногда и по 7 унивалентов (рис. 4а). В анафазе I
они расходились к полюсам с большим опозданием и оставались сильно
конденсированными к телофазе I (рис. 4б). В клетках тетрад они
обнаруживались в виде микроядер (рис 4в, г). Перечисленные явления
отличали данные моносомные популяции от популяций моно 5A (С29 и
Дм2)  84/98w, в которой мейоз проходит типично для моносомиков,
поскольку
интрогрессированная
хромосома
представлена
одним
унивалентом. В случае же моносомных популяций по хромосомам 5B и 5D
интрогрессивная хромосома, проявляет неполное сродство к гомеологам 5A
и 5D или 5A и 5B соответственно, нарушая тем самым ход мейоза.
12
Таким образом, с помощью моносомного анализа F1 и F2
установлено, что при создании линии 84/98w произошла гомеологичная
интрогрессия материала хромосомы 5S Ae. speltoides в хромосому 5A.
Интрогрессивный ген спельтоидности QS эффективен как в геми-, так и в
гетерозиготном состоянии.
Цитологические и генетические особенности расщепления в
поколении F2 гибридов 76/00i  84/98w и 32/98w  84/98w
Для объяснения отклонений в наследовании признаков остистости и
суперспельтоидности у гибридов с линией 84/98w были изучены
цитогенетически две независимые гибридные комбинации F2 исследуемой
линии 84/98w с линиями 76/00i и 32/98w из коллекции «Арсенал». Линия
76/00i, как и сорт Родина, является яровой, безостой и неспельтоидной.
Линия 32/98w тоже безостая и неспельтоидная, но, в отличие от
реципиентного сорта, озимая. Это указывает на ограниченную
интрогрессию в области гена Vrn-A1 хромосомы 5A сорта Родина.
Популяция гибридов F2 76/00i  84/98w изучалась без яровизации и
после 2-х месячной яровизации. Без яровизации данная популяция
расщеплялась на яровые и озимые формы моногенно в отношении 35 : 13
(χ2 = 0,11, P > 0,5). Яровые же формы расщеплялись на спельтоидные и
неспельтоидные растения 24 : 7 (χ2 = 0, P = 1), то есть тоже моногенно.
Среди яровых форм снова обнаружилось отсутствие остистых растений,
что вызвано, по-видимому, ограниченной рекомбинацией генов Vrn-A1 и
B1 на хромосоме 5A с их гомеаллелями на хромосоме с интрогрессией. Для
проведения цитологического анализа популяция из 80 растений
подверглась яровизации, чтобы нивелировать действие озимого аллеля
интрогрессированного гена типа развития vrn-A1 и получить правильное
расщепление на остистые и безостые формы.
Согласно данным цитологического анализа среди растений F2 76/00i
 84/98w образуются моносомная и дисомная популяции в почти равных
долях (таб. 7). Цитологически было изучено 53 растения, из них 27
оказались дисомиками и 24 моносомиками. Было отмечено отставание
отдельных унивалентов при расхождении и образование из них микроядер,
распределяющихся, по-видимому, случайно. Среди растений гибридов F2
32/98w  84/98w также образовались моносомная и дисомная популяции в
том же соотношении (данные не представлены)
При генетическом изучении дисомной популяции потомства F2
i
76/00  84/98w наблюдались различия в соотношении классов при
расщеплении по признакам безостости и спельтоидности (таб. 8).
Расщепление на безостые и остистые формы составило 21 : 6, что
соответствует расщеплению 3 : 1 (2 = 0,11; P>0,5). Расщепление на
спельтоидные и неспельтоидные растения составило 17 : 10, что
13
соответствует теоретическому расщеплению 3 : 1 на уровне значимости
P>0,05 (2 = 3,42).
Фактическое расщепление моносомной популяции на безостые и
остистые растения 16 : 8 соответствует моногибридному 3 : 1 (2 = 0,89,
P > 0,25). Расщепление на 14 спельтоидных и 10 неспельтоидных растений
соответствует моногибридному на пределе (2 = 3,56, P > 0,05).
Таблица 7. Соотношение цитотипов среди потомства F2 76/00i  84/98w
Цитотип
Число
Доля от общего
растений
числа
Дисомики 21”, 20”+2’ или 19”+4’
27
50,9%
Моносомики 20”+1’ или 19”+3’
24
45,3%
Двойные моносомики 19”+2’
1
1,9%
Моно-нуллисомики 19”+1’
1
1,9%
Всего просмотрено
53
100%
Таблица 8. Расщепление цитологически исследованных популяций по
признакам колоса гибридов F2 76/00i  84/98w
Фенотип
Дисомики Моносомики Вся популяция
Спельтоиды остистые
6
8
25
Спельтоиды безостые
11
6
27
Неспельтоиды остистые
0
0
0
Неспельтоиды безостые
10
10
23
Фенотип безостых спельтоидных моносомиков определяется
единственной из пары рекомбинантной хромосомой с генами QS и B1.
Среди моносомиков популяции F2 76/00i  84/98w не обнаружено остистых
неспельтоидных растений с рекомбинантной хромосомой с генами Q и b1.
Класса неспельтоидных остистых растений не было выявлено и в дисомной
популяции. Эти данные говорят о том, что между хромосомой 5A мягкой
пшеницы и интрогрессированной хромосомой линии 84/98w происходит
рекомбинация, но один из двух типов рекомбинантных хромосом
элиминируется. Аналогичные результаты были получены в комбинации
F2 32/98w  84/98w.
Изучение влияния интрогрессии от Aegilops speltoides Tausch на
структуру эндосперма зерновки
Сорт мягкой пшеницы Родина является твердозёрным с высокой
стекловидностью эндосперма зерновок (рис. 5). У отцовской формы Ae.
speltoides стекловидность существенно, почти в 3 раза ниже, эндосперм его
мучнистый. Мягкая структура эндосперма говорит о том, что в зерновках
Ae. speltoides происходит синтез пуроиндолинов дикого типа в
функциональном состоянии (Lillemo et al., 2002). У линии 84/98w
14
стекловидность составила только 50%, у неё в 2 раза по сравнению с сортом
Родина уменьшен диаметр и увеличена удельная поверхность частиц муки.
Таким образом, она имеет мягкий тип эндосперма, что может указывать на
биосинтез в данной линии пуроиндолинов от Ae. speltoides.
Как известно, экспрессирующиеся гены, определяющие синтез
пуроиндолинов у мягкой пшеницы, находятся в теломерной области
короткого плеча хромосомы 5D (Mattern et al., 1973, Sourdille et al., 1996).
Изменение структуры эндосперма в линии 84/98w говорит о том, что
произошло гомеологичное замещение в коротком плече хромосомы 5А.
Для того чтобы экспериментально показать, что именно
интрогрессия хромосомы 5S изменяет структуру эндосперма пшеницы, по
этому признаку были изучены семьи F3, полученные в результате
моносомного анализа маркерных признаков, определяемых генами
хромосомы 5А. Как видно из таблицы 10, у гибридных растений F3, как в
варианте с сортом С29, так и с сортом Дм2, значительно изменяются все
мукомольные показатели. У них в два раза увеличивается удельная
поверхность частиц муки, уменьшается диаметр частиц муки. Также у них
снижается стекловидность до значения линии 84/98w (до 51-52%). Таким
образом, в данных генотипах также экспрессируются пуроиндолины дикого
типа от Ae. speltoides, определяя образование мягкого типа эндосперма.
Было обнаружено, что моносомное или дисомное состояние хромосомы с
интрогрессией не влияет на структуру эндосперма. Он остаётся
мягкозёрным. Следовательно, ген мягкозёрности, интрогрессированный от
Ae. speltoides, аналогичен по своему действию гену Ha, расположенному в
хромосоме 5DS, и гомеоаллелен ему. Он был обозначен символом Ha-Sp.
Таблица 10. Мукомольные показатели у растений F3, несущих
хромосому 5A с интрогрессией, в сравнении с родительскими формами
Генотип
Удельная поверхность Диаметр частиц
частиц муки, см2/г
муки, мкм
w
Интрогрессивная линия 84/98
3367 ± 45
12,0 ± 0,2
w
F3 моно С29 5А × 84/98 , 20"+5S 3524 ± 24**
11,4 ± 0,1**
w
F3 моно Дм2 5А × 84/98 , 20"+5S 3741 ± 66**
10,8 ± 0,2*
Саратовская 29
1874 ± 23
21,5 ± 0,3
Диамант 2
2422 ± 64
16,5 ± 0,5
Родина
1813 ± 71
22,3 ± 0,9
*, ** - P<0,05, P<0,01, соответственно, по сравнению с сортомреципиентом
15
ВЫВОДЫ
1. С помощью генетического анализа выявлен ген «большой
морфологии», интрогрессированный в мягкую пшеницу от Ae. speltoides.
Действие гена проявляется в образовании длинного рыхлого колоса,
подобного по форме колосу T. spelta. Новый признак спельтоидности
интрогрессивной линии 84/98w доминирует над формой колоса мягкой
пшеницы и наследуется моногенно. Этот ген обозначен символом QS.
2. Моносомным анализом установлено, что при создании линии 84/98 w в
хромосому 5A мягкой пшеницы произошла гомеологичная интрогрессия
генов, определяющих озимый образ жизни, спельтоидную форму колоса,
наличие остей и мягкий тип эндосперма. В гемизиготном состоянии данная
интрогрессия не влияет на течение мейоза. Однако образование
гетероморфной пары на генетическом фоне моносомных гибридов по
хромосомам 5B и 5D приводит к нарушениям в мейозе.
3. При гибридизации линии 84/98w с различными образцами T. spelta
установлено аддитивное действие гомеоаллельных генов Q и QS. Впервые
показано образование суперспельтоидных гетерозиготных растений с
существенно увеличенной длиной колоса и числом колосков.
4. У гибридов линии 84/98w с образцами мягкой пшеницы и спельты в
ходе мейоза наблюдаются нарушения, приводящие к образованию
моносомиков. Это вызывает нехватку суперспельтоидных растений в
расщепляющихся поколениях.
5. Между хромосомой 5A мягкой пшеницы и интрогрессированной
хромосомой 5Aintr происходит нормальная рекомбинация на участке между
генами, определяющими форму колоса и тип развития. Однако
рекомбинация на участке между генами, определяющими тип развития и
наличие остей, затруднена вследствие возможной перестройки в
хромосоме 5Aintr линии 84/98w.
6. У гибридов с линией 84/98w при конъюгации хромосомы 5A с
интрогрессированной хромосомой образуется два типа рекомбинантных
хромосом с разной судьбой. Хромосома с маркерными генами b1 и Q
элиминируется, тогда как хромосома с генами B1 и QS передаётся
потомству. Это объясняет нехватку фенотипического класса остистых
неспельтоидных растений.
7. В
интрогрессированной хромосоме
5Aintr обнаружен ген,
определяющий структуру эндосперма, гомеологичный локусу Ha в
хромосоме 5DS мягкой пшеницы. Он обозначен символом Ha-Sp. Аллель
мягкозёрности гена Ha-Sp взаимодействует с твердозёрным аллелем локуса
ha хромосомы 5D мягкой пшеницы, снижая твердозёрность, в результате
чего зерно становится полустекловидным.
16
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Симонов А.В., Пшеничникова Т.А., Лапочкина И.Ф. Генетический
анализ признаков, интрогрессированных от Aegilops speltoides
Tausch. в мягкую пшеницу и определяемых генами хромосомы 5А//
Генетика, 2009. Том 45, №7, с 913-919 (перечень ВАК)
Pshenichnikova T.A., Simonov A.V., Ermakova M.F., Chistyakova
A.K., Shchukina L.V., Morozova E.V. The effects on endosperm structure
of the grain of an introgression from Aegilops speltoides Tausch. into
chromosome 5А of bread wheat // Euphytica, 2010. DOI:
10.1007/s10681-010-0168-1 (перечень ВАК)
Khlestkina E.K., Röder M.S., Pshenichnikova T.A., Simonov A.V.,
Salina E.A., Börner A. Genes for Anthocyanin Pigmentation in Wheat:
Review and Microsatellite-Based Mapping // Chromosome Mapping
Research Developments 2008, p. 155 – 175
Simonov A.V., Pshenichnikova T.A. // Phenotypic peculiarities of spike
in hybrids F1 and F2 between Triticum spelta L. and wheat line with
introgression from Aegilops speltoides Tausch // EWAC Newsletter 2008,
Proceedings of the 14th International EWAC Conference, 6-10 May 2007,
Istanbul, Turkey, p. 145-148
Симонов А.В., Пшеничникова Т.А. Генетическое изучение
спельтоидности у пшеницы с интрогрессией от Aegilops speltoides
Tausch // Международная конференция «Научное наследие Н.И.
Вавилова – фундамент развития отечественного и мирового
сельского хозяйства» 27-28 ноября 2007 г. // ТСХА
Simonov A.V., Mazurova A.A., Pshenichnikova T.A. Genetic and
monosomic analysis of spike speltoidy introgressed into bread wheat from
Aegilops speltoides Tausch // Proceedings of the 11th International Wheat
Genetics Symposium (2008). Sydney: Sydney University Press. P036. P.
273-275.
Симонов А.В. Генетическое изучение признака спельтоидности,
интрогрессированного в мягкую пшеницу от Ae. speltoides. //
Достижения и перспективы студенческой науки в АПК // Материалы
региональной научной студенческой конференции (20-21 апреля
2006 г.) // ФГОУ ВПО ОмГАУ ч. 1 с. 89-91 Омск.
Подписано к печати
2010 г.
Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7
Тираж 110, Заказ №
Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН
630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева,10.