Т.Д. МУКАШЕВА ВЫДЕЛЕНИЕ И ОТБОР ОЛИГОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАСТУЩИХ НА НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТАХ
advertisement
Т.Д. МУКАШЕВА ВЫДЕЛЕНИЕ И ОТБОР ОЛИГОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАСТУЩИХ НА НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТАХ (Казахский национальный университет имени аль-Фараби) Из почв загрязненных нефтью выделены факультативные олиготрофные микроорганизмы. Интенсивный рост олиготрофных бактерий наблюдался при 0,05% и 0,1 % концентрациях сырой нефти и в парах дизельного топлива и бензина Проблема очистки почв от загрязнения нефтью является важной задачей биотехнологии защиты окружающей среды. Одним из наиболее перспективных методов очистки нефтезагрязненных почв является использование микроорганизмов-деструкторов углеводородов внесение, которых приводит как правило к ускорению очистки почвы от нефти. Сейчас уже имеются примеры использования на практике микроорганизмов /1, 2/. Использование отдельных штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов малоэффективны и поэтому проводятся работы по созданию препаратов, состоящие из нескольких видов микроорганизмов. Поэтому основные усилия в биотехнологии направлены на поиск микроорганизмов - деструкторов, способных деградировать поллютанты, устойчивых к неблагоприятным условиям окружающей среды и стабильно сохраняющих свой биодеградируемый потенциал. Известно, что олиготрофные микроорганизмы могут использовать только низкомолекулярные и побочные вещества, возникающие при окислении высокомолекурных соединений /3, 4 ,5/ и отличаются значительной "трофической гибкостью" в использовании органических субстратов по сравнению с копиотрофами. Цель настоящей работы - выделение из нефтезагрязненных почв олиготрофных микроорганизмов, растущих на нефти и нефтепродуктах. Материал и методы исследовании Использовали 16 почвенных проб, взятых на месторождениях Доссор, Забурунье, Балбике и Тенгиз. Пробы отбирались на участках с интенсивным нефтяным загрязнением (1,2,5,6,9,10,13014) и в местах визуально не загрязненных (3,4,7,8,11,12,15,16). О численности олиготрофных микроорганизмов судили по числу колонийобразующих (КОЕ/г) на плотной среде - голодный агар (ГА). Для учета численности углеводородокислящих олиготрофных микроорганизмов в расплавленную питательную среду (ГА) вносили 0,05% антрацена и на фильтровальную бумагу, помещенную на крышку чашки Петри, пропитывали 0,1мл дизельного топлива. Выросшие колонии пересевали на ГА, среду Чапека и МПА. Описание отобранных культур проводили общепринятыми методами /6/. Выделенные углеводородокисляющие микроорганизмы, выращивали в жидкой среде ГА с добавлением 0,05%, 0,1% и 1% Тенгизкой нефти. О росте культур судили визуально по изменению нефтяной пленки и помутнению питательной среды. Рост нефтеокисляющих микроорганизмов на нефтепродуктах изучали на твердой среде ГА. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли в расплавленные среды нигрол и моторное масло, бензином, керосином и дизельным топливом пропитывали фильтровальную бумагу помещенную на крышку чашки Петри. Нефтепродукты использовали в концентрации 0,05, 0,1 и 1%. Результаты и обсуждение По данным литературы /3, 4/ группу олиготрофных микроорганизмов традиционно принято связывать с природным местообитанием, для которых характерно низкое содержание органического вещества. Кроме того, показано что олиготрофные бактерий являются нормальной микрофлорой почв - местообитаний с достаточно высоким содержанием органического вещества. Из таблицы 1 видно, что во всех пробах количество олиготрофных микроорганизмов различно и их численность зависит от степени загрязненности почвенных проб. Независимо от места взятия и почвенного слоя численность олиготрофных микроорганизмов в почвенных образцах сильнозагрязненных нефтью на порядок меньше, чем в слабозагрязненных пробах. Так, в почвенных пробах взятых с участков с интенсивным загрязнением количество олиготрофов составило 102-103, а в пробах слабозагрязненных варьировало от 102 до 105. Из таблицы 1 видно, что численность нефтеокисляющих микроорганизмов различно и также зависит от степени загрязненности почвенных образцов. Во всех образцах слабозагрязненных почвах численность нефтеокисляющих микроорганизмов на порядок меньше, чем в сильнозагрязненных почвах. В почвенных образцах месторождений Тенгиз и Забурунье количество нефтеокисляющих микроорганизмов, растущих в парах дизельного топлива на порядок больше (104), чем в других почвенных пробах (102 и 103). Из всех почвенных образцах проводили выделение углеводородокисляющих микроорганизмов. Выросшие колонии микроорганизмов на голодном агаре первоначально отсевали на косяки с этой же средой. Колонии микроорганизмов различались между собой морфологическими признаками. Из всех почвенных пробах выделялись в большом количестве: бесцветные, небольшого размера, прозрачные колонии; округлые, оранжевые, шероховатые, блестящие; округлые белые или бело-розовые, матовые. Меньше росли белые или бежевые, гладкие или морщинистые блестящие колонии. Из каждого почвенного образца выделялись в небольшом количестве серые матовые колонии, некоторые выделяли в питательную среду синий пигмент. По данным литературы олиготрофные микроорганизмы не являются таксономически однородной группой и многие из них могут расти только при первом посеве пробы, не выдерживают пересевов /3, 5/. Многочисленная группа факультативных олиготрофных микроорганизмов при первом посеве растут на бедных средах, но в последующих пересевах растут на богатых. Из 128 культур 36 при вторичном пересеве росли также и на богатых средах. Остальные культуры слабо росли на органических средах и они не выдерживали дальнейших пересевах. Таким образом, отобрано 36 штаммов факультативных олиготрофных микроорганизмов. Таблица 1. Численность олиготрофных микроорганизмов в нефтезагрязненной почве Все отобранные штаммы испытывались к росту на средах, содержащие 0,05%, 0,1% и 1,0% Тенгизской нефти. Из 36 культур хорошо росли на средах с нефтью только 13 штаммов и лучше росли на среде .содержащей 0,05% нефти. Интенсивный рост наблюдался только на 10-14 сутки культивирования и в эти же сутки отмечалось заметное уменьшение нефтяной пленки на поверхности среды. Таким образом, отобранные факультативные олиготрофные микроорганизмы обладали способностью к росту на средах, содержащие небольшие концентрации сырой нефти. Из 13 культур 9 штаммов отнесены к роду Streptomyces, остальные -грамотрицательные бактерии. Олиготрофные микроорганизмы обладают лабильным метаболизмом, могут использовать разнообразные органические субстраты, включая летучие соединения /5/. В таблице 2 представлены данные по росту 13 культур на различных нефтепродуктах. Почти все исследуемые культуры хорошо росли в парах дизельного топлива, бензина и керосина и слабо при добавлении в питательную среду моторного масла и нигрола. Наиболее интенсивный рост наблюдался в парах дизельного топлива и бензина у бактериальных культур при низких концентрациях нефтепродуктов. Таблица 2. Рост олиготрофных культур на нефтепродуктах. Штаммы 13ОБ 15ОС 16ОБ 18ОБ 21ОС 23ОС 25ОС 26ОС 27ОС 31ОС 32ОС 33ОС 36ОБ Дизельное Бензин, Керосин,% топливо,% % 1 2 3 1 2 3 1 2 3 +++ ++ + ++++ ++ + ++ +- + + + + + - + + ++ ++ + ++ ++ + ++ + +++ ++ + ++ ++ + ++ + ++ + ++ + +- + +- + + + + + +- + + + + ++ +- +- + +- + + ++ +- +- + +- + + ++ +- +- + +- + + ++ +- +- + + + + ++ + +- + +- + + + + + +- + +- ++ + + ++ + + + + +- Моторное масло,% 1 2 3 + +++ + + + ++ + + + + ++ + ++ + ++ +++ +++ +++ + ++ + ++ + +- Нигрол ,% 1 2 3 + - + - +- - +- - + - +- - +- - +- - +- - +- - + - +- - +- - - Примечание: 1- 0,05% , 2 - 0,1% , 3 - 1,0 % -концентрация нефтепродуктов. ++ - интенсивный рост , + - хороший рост, +- - слабый рост , - - нет роста Таким образом, отобранные олиготрофные бактериальные культуры не способны к росту при высоких концентрациях нефти и могут использовать летучие соединения. Весьма вероятно эти бактериальные культуры максимально могут проявить свои метаболические свойства в микробных консорциумах и их можно будет рекомендовать как компоненты биологических препаратов для очистки среды от углеводородов. ЛИТЕРАТУРА 1. Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загряняющих почву и воду. // Биотехнология, -1998, -31, -С.85-92 2.Стабникова Е.В., Селезнезова М,В., Дульчеров А.Н., Иванов В.Н. Применение биопрепарата "Лестан" для очистки почвы от углеводородов нефти // Прик. биох. и микр. 1996, -т.32 -№ 2.,- С. 219 -223. 3. Сахаровский В.В., Никитина Д.И., Сахаровский В.Г. Физиологические особенности выживания некоторых грамотрицательных бактерий в условий углеродного голодания // Прик. биох. и микр., -1999, -т.35. -№4, -С. 422-431. 4. Никитин Д.И. Биология олиготрофных бактерий: авторефер. Дисс. докт. Биол. Наук. М.: ИНМИ РАН, -1995. -35 с. 5. Васильева Л.В., Заварзин Г.А. Диссипотрофы в микробном сообществе. // Микробиология. 1995. -т. 64, -№ 2 , -С. 239-244. 6. Звягинцев Д.Г.Методы почвенной микробиологии и биохимии.-М.:-МГУ.-1991.304с. SUMMARY The oligotrophic microorganisms were ditinguishing from of powerful oil soil. The oligotrophic microorganisms well growth in crude oil in 0.05% and 0.1%, in gas disel oil and benzin.
