ГУСЕВА СВЕТЛАНА ИГОРЕВНА ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ, БЕЗОПАСНОСТИ И РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ
advertisement
На правах рукописи ГУСЕВА СВЕТЛАНА ИГОРЕВНА ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ, БЕЗОПАСНОСТИ И РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ НОВОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ШАЛФЕЯ И ЭХИНАЦЕИ 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010 2 Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Шиков Александр Николаевич Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Макарова Марина Николаевна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Хныченко Людмила Константиновна доктор медицинских наук, профессор Шабанов Петр Дмитриевич Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Институт токсикологии» Федерального Медико-Биологического Агентства России Защита состоится «__»________2010 г. в «__» часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.022.03 при учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12) Автореферат разослан «__» __________ 2010 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Пучкова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время терапия препаратами природного происхождения широко используется в мировой медицинской практике. Фитопрепараты находят применение для лечения и профилактики, а также в комплексной терапии различных заболеваний (Пастушенков, Лесиовская, 1995). Зачастую они используются без назначения врача, при этом пациенты рискуют превысить установленные терапевтические дозы вплоть до появления побочных эффектов. Поэтому изучение токсичности лекарственного препарата растительного происхождения является необходимым на этапе доклинической оценки. Согласно данным ВОЗ острые респираторные заболевания в настоящее время являются одними из наиболее распространенных и нередко приобретают характер эпидемического процесса. В России ежегодно регистрируется около 50 млн. случаев инфекционных заболеваний, из них до 90% приходится на ОРВИ и грипп (Учайкин, 2001). Подобные заболевания, как правило, имеют вирусную этиологию и опасны, прежде всего, развитием бактериальных осложнений на фоне ослабленного иммунитета. Синтетические противовоспалительные средства достаточно широко применяются для лечения данной группы заболеваний, однако имеют ряд побочных эффектов, самым опасным из которых является подавление иммунного ответа (Машковский, 2008). Назначение противовоспалительного фитопрепарата, обладающего иммуномодулирующими свойствами на ранней стадии болезни, позволяет избежать осложнений, связанных со снижением иммунного ответа организма, предотвратить присоединение вторичной инфекции и антибиотикотерапию. Противовоспалительная активность препаратов шалфея и эхинацеи изучена на моделях различных видов отеков: кротоновый отек ушной раковины мышей, формалиновый и каррагениновый отек лапы крыс и др. (Хайдукова и др., 2003; Tubaro et al., 1987; Baricevic et al., 2001; Hosseinzadeh et al., 2003). Однако данные модели являются неспецифичными для изучения патологии верхних дыхательных путей. Поэтому разработка и внедрение в практику экспериментальной модели, приближенной к острому тонзиллиту, является актуальной задачей фармакологии. Растительный препарат представляет собой сочетание различных групп биологически активных веществ. В силу комплексности фитопрепарата, сложно выявить компонент, обуславливающий его фармакологическую активность. Поиск и изучение биологически активных соединений препаратов природного происхождения важны для понимания его механизма действия. Комбинированный лекарственный препарат на основе шалфея лекарственного и эхинацеи узколистной в форме таблеток для рассасывания пока не представлен на Российском фармацевтическом рынке. В связи с этим многостороннее доклиническое изучение нового средства, фитохимический анализ экстрактов и стандартизация готовой лекарственной формы является актуальной задачей на этапе внедрения нового препарата в медицинскую практику. 4 Цель работы. Изучение эффективности, безопасности и разработка параметров стандартизации нового лекарственного препарата «Шалфей Иммунактив» на основе шалфея и эхинацеи для лечения и профилактики заболеваний верхних дыхательных путей. Задачи исследования: 1. Изучить общую токсичность и иммунотоксичность препарата «Шалфей Иммунактив». 2. Оценить влияние препарата «Шалфей Иммунактив» на неспецифический, клеточный и гуморальный иммунный ответ. 3. Разработать экспериментальную модель острого лимфаденита у крыс для исследования противовоспалительных свойств «Шалфей Иммунактив» и препарата сравнения «Шалфей Тайсс». 4. Изучить противовоспалительное действие препарата на модели острого лимфаденита, определить его эффективные дозы. 5. Для определения биологически активных веществ препарата изучить химический состав экстрактов шалфея лекарственного и эхинацеи узколистной. Разработать и валидировать методику определения комплекса фенольных соединений в готовой лекарственной форме. 6. Выбрать и разработать необходимые параметры стандартизации, подготовить проект нормативной документации на препарат. Научная новизна. Для нового лекарственного препарата растительного происхождения проведен комплекс доклинических исследований, в результате которого впервые установлены его противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства, а также параметры его безопасности. Впервые для определения класса токсичности препарата растительного происхождения использован метод установления диапазона доз, оказывающих биологическое влияние на организм – DRF (dose range finding) подход. Разработана модель острого воспаления лимфатического узла у крыс для оценки специфической фармакологической активности препарата. Проведен физико-химический анализ экстрактов шалфея лекарственного и эхинацеи узколистной. Разработана и валидирована методика количественного определения суммы фенольных кислот для стандартизации готовой лекарственной формы. Научно-практическая значимость. Данные настоящего исследования включены в регистрационное досье на новый лекарственный препарат, а также разработан проект нормативной документации, представленный на регистрацию в ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора. Экспериментально доказано, что «Шалфей Иммунактив» обладает противовоспалительным и иммуномодулирующим действием. Противовоспалительное действие препарата обусловлено наличием экстракта шалфея лекарственного, иммуномодулирующая активность связана с присутствием эхинацеи узколистной. 5 Материалы диссертации вошли в учебные программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр фармакологии и биохимии СПбГМА им. И.И. Мечникова. Разработанная модель острого лимфаденита у крыс внедрена на кафедрах биохимии и фармакологии СПбГМА им. И.И. Мечникова для изучения противовоспалительной активности новых препаратов. Основные положения, выносимые на защиту: 1. По результатам исследования токсичности препарат признан безопасным. Для определения класса токсичности и расчета доз при планировании хронического эксперимента рекомендован метод dose range finding (DRF). 2. Разработана и апробирована модель острого лимфаденита у крыс для изучения противовоспалительной активности препаратов, рекомендованных для лечения воспалительных заболеваниях верхних дыхательных путей. Установлено, что «Шалфей Иммунактив» обладает противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами. Противовоспалительные свойства препарата обусловлены наличием в нем ряда биологически активных веществ шалфея, в том числе флавоноидов. Выявленная иммуномодулирующая активность связана с присутствием комплекса фенолкарбоновых кислот эхинацеи, для которых характерны иммуностимулирующий, противомикробный и антиоксидантный эффекты. 3. Стандартизацию препарата предложено проводить по содержанию фенольных соединений: флавоноидов и производных гидроксикоричной кислоты, являющихся важной группой биологически активных веществ как шалфея, так и эхинацеи, и во многом обуславливающих их фармакологическую активность. Личный вклад соискателя заключается в самостоятельном проведении большинства экспериментальных исследований, включая работу с экспериментальными животными, проведение лабораторных тестов, статистическую обработку и анализ полученных результатов, а также в подготовке основных публикаций по теме работы. Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на 63-й итоговой научной конференции молодых ученых с международным участием (г. Ростов-на-Дону, 04.2009); Х международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 05.2009); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (г. Ярославль, 05.2009); XIII Международном съезде «Phytopharm-2009» (Bonn, Germany, 07.2009), «57th International congress & Annual meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research» (Geneva, Switzerland, 08.2009), 3-й ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (г. Екатеринбург, 02.2010) и ежегодной конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова (СПб, 04.2010). 6 Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 в центральных медицинских журналах, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы и трех приложений. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включает в себя 29 таблиц, 16 рисунков. Список литературы содержит 207 источников, из них 140 иностранных авторов. Приложения включают проект НД на препарат «Шалфей Иммунактив», таблицы данных исследования общей токсичности препарата, акт о подаче на регистрацию ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора, акт о внедрении в практику выпускающего контроля качества компании «Натур Продукт Европа Б.В.» и акт внедрения на кафедре биохимии СПбГМА им. И.И. Мечникова. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследования служил лекарственный препарат «Шалфей Иммунактив» (таблетки для рассасывания), разработанный компанией «Натур Продукт Европа Б.В.», Нидерланды. Активные компоненты: экстракт шалфея лекарственного – 12,5 мг, масло шалфея лекарственного – 2,5 мг, экстракт эхинацеи узколистной – 50,0 мг, аскорбиновая кислота – 50,0 мг. В качестве препарата сравнения использовали лекарственное средство «Доктор Тайсс экстракт шалфея с витамином С» (таблетки для рассасывания), производства Др. Тайсс Натурварен ГмбХ, Германия (далее «Шалфей Тайсс»), содержащий экстракт шалфея – 50,0 мг, масло шалфея – 6,0 мг, аскорбиновую кислоту – 20,0 мг. Доклинические исследования препарата проводили в соответствии с «Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)» (1992), «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005) и с международными требованиями к регистрации фармацевтических продуктов (Guidance for industry. M4S: The CTD – Safety. U.S., 2001). Для исследования общей токсичности использовали 120 крыс и 60 мышей обоих полов. Масса тела крыс к началу исследования составляла 180250 г, мышей - 18-21 г. Острую токсичность изучали при однократном внутрижелудочном введении препарата крысам в дозах от 9 до 21 г/кг и внутрибрюшинном введении мышам в дозах от 100 до 300 мг/кг (Guideline for industry. Single dose acute toxicity testing for pharmaceuticals, 1996). Дозирование осуществляли по Литчфилду-Уилкоксону (Litchfield and Wilcoxon, 1949). Расчет ЛД50 осуществляли по методу В.Б. Прозоровского. Исследование диапазона доз, оказывающих биологическое (токсическое) влияние на организм, проводили методом DRF (dose range finding) в соответствии с международными рекомендациями (Guideline for industry. 7 Toxicokinetics: The assessment of systemic exposure in toxicity studies. ICH-S3A, 1995; Guidance for industry. M4S: The CTD – Safety. U.S., 2001) Введение препарата проводили внутрижелудочно ежедневно в течение 10 дней в дозах от 6 до 18 г/кг. Для достижения максимальных доз (15 и 18 г/кг) применяли двукратное введение препарата с интервалом не менее 30 минут, при этом вводимый объем не превышал допустимых норм и составлял 5 мл на крысу весом 200 г. На протяжении времени введения препарата осуществляли ежедневный осмотр животных в клетке содержания, на руках и на открытой площадке, оценивали их общее состояние. Каждый день исследования проводили взвешивание животных. Влияние препарата на физиологические и зоосоциальные реакции крыс и мышей в обоих экспериментах оценивали в тесте «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» с учетом ориентировочноисследовательского эмоционального, стереотипного и двигательного компонентов по поведенческому атласу для грызунов (Пошивалов, 1978). Тесты проводили дважды: до введения и после введения препарата. Животные были подвергнуты полной некропсии с оценкой поверхности тела, мест инъекций, всех проходов, черепной, грудной, брюшной полостей и их содержимого. Для макроскопического исследования и расчета массовых коэффициентов были извлечены: сердце, легкие с трахеей, тимус, печень, селезенка, почки (две), надпочечники (два), яички (два) — самцы, яичники (два) — самки, головной мозг. При изучении иммуномодулирующего и иммунотоксического действия препарата использовали мышей-самцов линии BALB/c, полученных из питомника лабораторных животных НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН в количестве 50 шт., мышей-самцов линии F1 CBA и С57Bl/6 и аутбредных самцов, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» в количестве 220 шт. Для оценки иммуномодулирующего действия «Шалфей Иммунактив» тестировали в дозах 0,4; 1,3 и 3,8 г/кг, для оценки иммунотоксического действия - в дозе 12,8 г/кг. Определение пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов проводили при помощи метода бласттрансформации. Введение «Шалфей Иммунактив» мышам осуществляли в течение 4-х дней. По окончании введения препарата у мышей асептически забирали селезенки, готовили гомогенат. Стимуляцию спленоцитов проводили добавлением раствора Конканавалина А (КонА), (Sigma, USA) или раствора ЛПС (Sigma, USA) в конечной концентрации 0.4 мкг/мл и 0.1 мкг/мл, соответственно. Интенсивность включения метки 3Н-тимидина (Sigma, USA) определяли на жидкостном сцинтилляционном β-счетчике (Delta 300, Searle Analytic Inc., USA). Для оценки функциональной активности Т-хелперов спленоциты в концентрации 1x106/мл стимулировали раствором КонА (3 мкг/мл). Через 24 часа в культуральной жидкости определяли содержание IL-4 и интерферона гамма (IFNγ) с помощью твердофазного ИФА на основе реагентов EIA Expansion Kits (BD Biosciences Pharmingen, USA). Биологическую активность 8 IL-2 определяли с помощью биологического теста с IL-2-зависимой линией клеток CTLL-2. Оценка фагоцитарной активности макрофагов. Мышам внутрижелудочно 4-х кратно с интервалом в одни сутки вводили водный раствор препарата. На 5-ые сутки эксперимента мышам опытных и контрольной групп внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг вводили раствор ЛПС бактериальной стенки E-coli (Fluka, Германия). Через 2 часа мышей эвтаназировали, осуществляли забор перитонеального экссудата и отделение из него макрофагов путем адгезии в течение 2 ч на чашке Петри. Фагоцитарную активность макрофагов определяли по степени поглощения раствора нейтрального красного спектрофотометрически при 545 нм на приборе HTI, Immunochem-2100 (Михеенко и др., 1990). Результаты выражали в условных единицах, отражающих оптическую плотность, соотнесенную к количеству клеток макрофагов. Определение титра антител. В 1-ый день эксперимента мышей внутрибрюшинно иммунизировали суспензией эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 25×107 ЭБ/мышь. Начиная со 2-го дня эксперимента животным опытных групп 4-х кратно с интервалом 24 часа вводили исследуемый препарат. На 7-е сутки после иммунизации у животных собирали кровь, выделяли сыворотку и определяли в ней титр антител к ЭБ при помощи реакции гемагглютинации (Иммунологические методы…, 1987). Реакция гиперчувствительности «замедленного» типа. Мышей иммунизировали ЭБ подкожно в межлопаточную область в дозе 2×108/мышь массой 20 г. Одновременно со стадией сенсибилизации ЭБ половине опытных животных вводили препарат в исследуемых дозах. На 5-е сутки иммунизации всем экспериментальным животным вводили разрешающую инъекцию антигена в подушечку задней лапы («опытная лапа»). В контралатеральную лапу вводили стерильный физиологический раствор («контрольная лапа»). Одновременно со стадией разрешения второй половине экспериментальных животных вводили исследуемый препарат. Через 24 часа животных эвтаназировали и регистрировали результаты реакции путем определения массы «опытной» и «контрольной» лап. Индекс реакции для каждого животного определяли по формуле: Ир Моп Мк 100% , Мк где Моп и Мк – масса «опытной» и «контрольной» лап. Противовоспалительные свойства препарата «Шалфей Иммунактив» изучали на модели острого лимфаденита у крыс. С целью получения адекватной модели, сопоставимой с острым тонзиллитом у человека, 1% раствор каррагенина вводили непосредственно в верхний правый лимфатический узел (ЛУ) шеи крысы (Inn. Cervicales superficiales). Исследуемый препарат и препарат сравнения «Шалфей Тайсс» вводили методом орошения ротовой полости животных один раз в сутки, на протяжении 10-ти дней до индукции лимфаденита и 3 дня после: «Шалфей 9 Тайсс» - в дозе 1,2 мг/кг, «Шалфей Иммунактив» – в дозах 0,3; 0,6; 1,1 г/кг. Интактным и контрольным животным вводили дистиллированную воду. Через 72 часа после оперативного вмешательства животных эвтаназировали, определяли биометрические параметры и осуществляли морфологический анализ пораженных ЛУ. Содержание белков и лейкоцитов в крови оценивали в динамике через 24, 48 и 72 часа. Содержание TNF-α и INF-γ в крови из хвостовой вены крыс определяли через 4 и 16 час после оперативного вмешательства соответственно. Определение С-реактивного белка проводили иммунотурбидиметрическим методом в сыворотке крови при помощи наборов биохимических реагентов «Витал Диагностикс СПб» (Россия) на биохимическом фотометре Stat fax 1904® Plus (USA). Содержание лейкоцитов определяли с помощью автоматического гематологического анализатора Abacus junior (Diatron, Австрия) и путем подсчета клеток в камере Горяева. Концентрацию TNFα и IFN-γ измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора Rat TNFα BD Biosciences (USA) на иммуноферментном анализаторе HTI Immunochem (USA). Для оценки отека ЛУ замораживали в морозильной камере при температуре -250С в течение 72 час, затем сушили в лиофильной сушилке ALPHA 1-2 LDplus (Германия) и взвешивали на весах Ohaus Adventurer (Швейцария), точность 0,0001г. Для микроскопического и морфометрического исследования срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводили при помощи светооптического микроскопа Leica DM LS (Германия) при увеличении 200 и 400. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры Leica DC320 (Германия). Для гистологической и морфометрической оценки ЛУ изучали cтруктуру ЛУ, диаметр герминативных центров (ДГЦ) вторичных фолликулов и гистиоцитоз синусов, который оценивали полуколичественно: 1 балл – до 1/3 периметра синусов, 2 балла - от 1/3 до 2/3 периметра синусов, 3 балла - более 2/3 периметра синусов. Физико-химическую характеристику экстрактов и определение содержания в них основных групп действующих веществ выполняли в соответствии с фармакопейными требованиями и рекомендациями по фитохимическому анализу лекарственного растительного сырья (Государственная Фармакопея…, 1987; Фитохимический анализ лекарственного растительного сырья, 1998; Сборник государственных стандартов, 2002). Идентификацию туйона и цинеола проводили методом ТСХ. Анализ основных фенольных соединений, входящих в состав экстрактов, выполнен методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе высокого давления фирмы Shimadzu (Japan) с диодно-матричным детектором и колонкой Luna C18 4,6150 мм (размер частиц сорбента 5 мкм) (Phenomenex, USA) с предколонкой длиной 2,0 мм, заполненной тем же сорбентом (Phenomenex, USA). Использован режим 10 градиентного элюирования смесью ацетонитрил – 0,03% раствор трифторуксусной кислоты с линейным увеличением концентрации ацетонитрила от 10 до 100 %, скорость изменения концентрации ацетонитрила – 1 % в минуту. Длина волны детектирования 330 нм. Скорость потока элюента 1,0 мл/мин. Дозируемый объем 20 мкл. Валидацию методики определения фенольных соединений проводили в соответствии с «Руководством по валидации методик анализа лекарственных средств» (2007). Статистическую обработку данных доклинических исследований выполняли методом дисперсионного анализа и с помощью простого сравнения средних по двустороннему t-критерию Стьюдента. Различия определяли при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Статистика 6.0 (StatSoft Inc, USA). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование токсичности препарата «Шалфей Иммунактив» При изучении острой токсичности LD50 установить не удалось, поскольку исследуемый препарат при внутрижелудочном введении крысам и внутрибрюшинном введении мышам в максимально возможных дозах, не вызвал гибели экспериментальных животных. Это свидетельствует о безопасности «Шалфей Иммунактив» и позволяет отнести его к VI классу относительно безвредных веществ по классификации Hodge и Sterner (Hodge et al., 1975). Полученные результаты согласуются с литературными данными о низкой токсичности шалфея и эхинацеи (Lenk, 1989; Mengs et al., 1991; Mahmoud et al., 1992; Schimmer et al., 1994). Принимая во внимание невозможность определения летальных доз препарата для последующего планирования хронического эксперимента нами был предложен используемый в зарубежной практике подход DRF (dose range finding). Он основан на определении рангов биологического эффекта препарата и выявлении доз, оказывающих биологическое влияние на организм животных. Основным параметром оценки токсического действия препарата является динамика массы тела лабораторных животных. Метод позволяет сократить количество экспериментальных животных, время и стоимость подострого эксперимента. При 10-дневном внутрижелудочном введении во всех исследованных дозах «Шалфей Иммунактив» не оказывал биологического (токсического) действия на организм аутбредных крыс. Не было зафиксировано отклонений массы тела животных и изменения их поведенческих реакций. Материалы проведенных доклинических исследований вошли в регистрационное досье на препарат «Шалфей Иммунактив», которое было представлено для проведения регистрации в ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора. 11 Изучение специфической фармакологической активности препарата. На основании литературных данных (Растения для нас, 1996; Лекарственные растения государственной фармакопеи, 1999; Barrett B., 2003; Bauer R., 1999; Blumenthal et al., 1998; 2000, Foster S., 1999; Kintzios, 2000) и результатов наших предыдущих исследований (Крышень и др., 2009; Guseva et al., 2009) для изучения фармакологической активности «Шалфей Иммунактив» мы выбрали предположительный диапазон терапевтических доз препарата для человека. Исходя из массы таблетки и метаболических коэффициентов для мышей и крыс, определили дозы для дальнейших экспериментов. индекс фагоцитарной активности Иммуномодулирующие свойства и иммунотоксичность. Исследуемый препарат показал выраженную противовоспалительную и иммуностимулирующую активность. Иммуностимулирующее действие на неспецифический иммунный ответ проявилось в значительном увеличении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей (рис. 1) в дозах 1,3 г/кг и 3,8 г/кг (на 66% и 60% соответственно). Рисунок 1 Влияние препарата на фагоцитарную активность макрофагов 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 *# * * Контрольная 0,4 *# * 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Интактная 1,3 3,8 12,8 группа, доза, г/кг * - различие статистически значимо в сравнение с интактной группой по критерию Стъюдента, при p<0,05 #- различие статистически значимо в сравнение с контрольной группой по критерию Стъюдента, при p<0,05 В диапазоне исследованных доз «Шалфей Иммунактив» модулировал развитие клеточного иммунного ответа, что подтвердилось снижением уровня цитокина IL-4 во всех исследованных дозах и увеличением продукции IFNγ (на 45% в дозе 0,4 г/кг) при исследовании функциональной активности Т-хелперов (рис. 2). Ранее Morazzoni et al. (2005) в эксперименте in-vitro установили, что cпиртовой экстракт эхинацеи узколистной стимулировал продукцию IFNγ и дифференцировку Т-лимфоцитов, аналогичные результаты установлены в нашем исследовании (Kryshen et al., 2009). 12 Рисунок 2 Влияние препарата на продукцию IFNγ, IL-2, IL-4 спленоцитами мышей Уровни секреции цитокинов 300 250 * 200 150 * 100 * * * 50 0 IL-2 (ед/мл) IL-4 (пг/мл) Контрольная IFNγ (нг/мл) 0,4 1,3 3,8 * - различие статистически значимо в сравнение с контрольной группой по критерию Стъюдента, при p<0,05 Снижение продукции IL-2 (на 28% в дозе 3,8 г/кг) свидетельствует о том, что препарат «Шалфей Иммунактив» может снижать пролиферацию лимфоцитов при их взаимодействии с патогенным фактором. Этот факт обнаружен при введении препарата на стадии сенсибилизации в реакции ГЗТ, что отражает процесс образования клона Т-лимфоцитов (рис. 3). Снижение клональной экспансии Т-лимфоцитов также свидетельствует в пользу противовоспалительного действия исследуемого препарата. При постановке реакции ГЗТ введение препарата осуществляли на стадии сенсибилизации и разрешения. Введение «Шалфей Иммунактив» мышам влияло на стадию сенсибилизации только в дозе 3,8 г/кг. Воздействие препарата оказалось более выраженным на стадии разрешения, поскольку он снижал реакцию в дозах 0,4; 1,3 и 12,8 г/кг (рис. 3). Таким образом, при развитии Т-клеточного иммунного ответа «Шалфей Иммунактив» снижал продукцию провоспалительных цитокинов, уменьшая воспалительный процесс. Рисунок 3 Реакция ГЗТ у мышей при введении «Шалфей Иммунактив» индекс реакции, % 35 30 25 # # 20 # # 15 10 5 0 ст адия сенсибилизации Интактная Контрольная ст адия разрешения 0,4 1,3 3,8 12,8 #- различие статистически значимо в сравнение с контрольной группой по критерию Стъюдента, при p<0,05 13 Из данных, представленных Zhai et al. (2007), известно о наличии противовоспалительного потенциала эхинацеи узколистной, экстракт которой в опыте на мышах ингибировал высвобождение IL-1, основными функциями которого является стимуляция Т- и В-лимфоцитов. Кроме того, как было показано нами ранее, шалфей лекарственный в экспериментах in vivo значительно снижает концентрацию нейтрофилов и TNF-α в очаге воспаления (Крышень и др., 2009; Guseva et al., 2009), проявляя, таким образом, выраженную противовоспалительную активность. Исследование влияния препарата на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов показало отсутствие его воздействия на спонтанную, КонАиндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов и ЛПС-индуцированную пролиферацию В-лимфоцитов. Влияние «Шалфей Иммунактив» на гуморальный (В-клеточный) иммунный ответ исследовано нами в реакции гемагглютинации с эритроцитами барана. Исследуемый препарат увеличивал титр антител в сыворотке крови мышей в дозе 0,4 и 12,8 г/кг на 10% и 19% соответственно по сравнению с контрольной группой. Таким образом, в диапазоне исследованных доз препарат «Шалфей Иммунактив» проявил противовоспалительные и иммуностимулирующие свойства, выразившиеся в стимуляции неспецифического, гуморального и клеточного иммунного ответа. В то же время препарат не проявил иммунотоксического действия, так как ни в одном из тестов во всех изученных дозах он не вызывал негативной реакции на иммунные процессы. Противовоспалительные свойства препарата. Тонзиллит - заболевание, которое характеризуется воспалением одного или нескольких лимфоидных образований глоточного кольца, аналогами которого у крыс являются поверхностные шейные лимфатические узлы, в т.ч. исследованный нами ЛУ Inn. Cervicales superficiales. После индукции воспалительного процесса в лимфоидной ткани 1% раствором каррагенина выявлены выраженные патологические изменения в контрольной группе животных, отражающие развитие неспецифического лимфаденита в пораженных ЛУ. Анализ массы ЛУ показал наличие выраженного отека в поврежденных ЛУ: процент потери массы пораженного ЛУ контрольной группы составил 33,1%, что в 2,4 раза превосходило данный показатель у интактных животных (13,7%). Через 72 часа после индукции воспаления у животных контрольной группы наблюдалось увеличение СРБ на 60% (рис. 4). Общее количество лейкоцитов у животных интактной группы составляло 11,6×109/л, через 72 часа после оперативного вмешательства наблюдали увеличение этого показателя у крыс контрольной группы в 2 раза (рис.5). Индуцированная модельная патология характеризовалась резким увеличением провоспалительных медиаторов TNF-α и INF-γ в ответ на введение воспалительного агента. TNF-α у контрольных животных через 4 часа увеличился в 8,6 раза (табл. 1). 14 В ходе исследования оба изучаемых препарата продемонстрировали выраженный противовоспалительный и противоотечный эффекты. При введении «Шалфей Иммунактив» и «Шалфей Тайсс» % потери массы пораженного ЛУ после лиофильного высушивания составил в среднем 44%. При этом в группе «Шалфей Иммунактив» в дозе 0,6 г/кг он был наименьшим, что свидетельствует об антиэксудативном действии препарата. Снижение уровня С-реактивного белка на фоне применения препарата сравнения «Шафлей Тайсс» в дозе 1,2 г/кг достигло уровня интактных животных. В максимальной дозе 1,1 г/кг «Шалфей Иммунактив» статистически значимо снижал уровень СРБ через 48 (на 11%) и 72 (на 27%) часа после индукции острого лимфаденита. При этом в дозе 0,6 г/кг он оказывал наиболее выраженное противовоспалительное действие: снижение уровня СРБ через 72 часа составило 34%, что было сопоставимо с препаратом сравнения (рис. 4). Рисунок 4 Влияние исследуемых препаратов на уровень С-реактивного белка в динамике 43 41 Контрольная ШИ 0,3 г/кг 39 мг/л 37 35 33 31 ШИ 1,1 г/кг 29 ШИ 0,6 г/кг ШТ 1,2 г/кг Интактная 27 25 Исходный уровень 24 часа 48 часов 72 часа Оценка динамики лейкоцитов показала, что исследуемые препараты обладали сопоставимым эффектом. Во всех временных точках они снижали уровень лейкоцитов. Уже через 24 часа после индукции острого лимфаденита был достигнут уровень интактной группы, что свидетельствует о наличии у препаратов профилактического противовоспалительного действия. При этом наиболее выраженным профилактическим эффектом обладал «Шалфей Иммунактив» в дозе 0,6 г/кг (рис. 5). 15 Оценка уровня лейкоцитов в динамике Рисунок 5 26 24 Контрольная 22 ×10 9/л 20 ШИ, 1,1 г/кг 18 ШТ, 1,2 г/кг 16 ШИ, 0,6 г/кг 14 12 Интактная 10 Исходный уровень 24 часа 48 часов 72 часа На фоне применения «Шалфей Иммунактив» во всех дозах и препарата сравнения «Шалфей Тайсс» в терапевтической дозе 1,2 г/кг, было показано статистически значимое по сравнению с контрольной группой снижение уровня TNF-α в среднем в 1,8 раза. На уровень INF-γ исследуемый препарат оказал более выраженное действие, чем «Шалфей Тайсс», особенно в дозе 0,6 г/кг (табл. 1). Таблица 1 Оценка уровня провоспалительных цитокинов, (M±m), n=15 Группа Интактная Контрольная Шалфей Тайсс, 1,2 г/кг Шалфей Иммунактив, 1,1 г/кг Шалфей Иммунактив, 0,6 г/кг Шалфей Иммунактив, 0,3 г/кг Показатели иммунологического статуса животных TNF-α, пг/мл INF-γ, нг/мл 28,4 ± 1,4 0,0 ± 0,0 * 243,6 ± 5,1 51,9 ± 5,5* 131,9 ± 2,0*** 37,2 ± 3,4*** 140,0 ± 2,7*** 33,3 ± 2,3*** 135,9 ± 3,0*** 28,8 ± 2,0*** 136,7 ± 1,8*** 34,3 ± 2,1*** * - различия статистически значимы по сравнению с интактными животными по критерию Стьюдента, при р<0,05; ** - различия статистически значимы по сравнению с контрольными животными по критерию Стьюдента, при р<0,05 Проведенные патоморфологические исследования показали увеличение диаметра герминативных центров у животных контрольной группы на 21% в сравнении с интактной группой*. Поскольку каррагенин является митогеном для B-лимфоцитов (Shigeaki I. et al., 1980), повышенная пролиферация В- Автор выражает благодарность к.м.н. Самусенко И.А. за помощь в проведении гистологических исследований лимфатических узлов и интерпретации полученных данных * 16 лимфоцитов в контрольной группе явилась поступление в ткань каррагенина (табл. 2). адекватным ответом на Таблица 2 Патоморфологическое исследование ЛУ Диаметр герминативных центров, мкм Группа Пораженный ЛУ Интактный ЛУ Гистиоцитоз, балл Пораженный ЛУ Интактный ЛУ Интактная 178,0 ± 13,7 155,0 ± 8,9 0,40±0,24 0,00±0,00 Контрольная 215,0 ± 5,3и 170,0 ± 6,1и 2,60±0,24и 1,60±0,40и ШТ, 1,2 г/кг 255,0 ± 5,0и к 252,7 ± 7,1и к 3,00±0,00и 0,40±0,24и к ШИ, 1,1 г/кг 210,0 ± 5,3и 190,0 ± 8,7и 3,00±0,00 и 1,20±0,20 и ШИ, 0,6 г/кг 253,3 ± 9,1и к 213,3 ± 5,9и к 2,60±0,24и 1,60±0,24и ШИ, 0,3 г/кг 220,3 ± 6,8и 183,3 ± 9,3и 2,80±0,20 и 1,00±0,32 и - различие статистически значимо в сравнение с интактной группой при p<0,05; к - различие статистически значимо в сравнение с контрольной группой при p<0,05 При морфометрическом исследовании установлено, что под влиянием «Шалфей Иммунактив» во всех экспериментальных дозах диаметр герментативных центров (ДГЦ) лимфатических фолликулов пораженного ЛУ был статистически значимо выше, чем ДГЦ интактного ЛУ. Это свидетельствует о способности исследуемого препарата стимулировать пролиферацию В-лимфоцитов, что также было выявлено нами в реакции гемагглютинации с ЭБ. Оценка выраженности гистиоцитоза синусов показала, что препараты «Шалфей Иммунактив» и «Шалфей Тайсс» стимулируют неспецифический иммунный ответ (табл. 2). Таким образом, по результатам проведенных исследований наиболее выраженным противовоспалительным и противоотечным действием обладает «Шалфей Иммунактив». Наибольший эффект отмечен в дозе 0,6 г/кг для крыс, что для человека массой 70 кг составляет 100 мг/кг, или 6 таблеток в день. В отличие от препарата сравнения «Шалфей Иммунактив» также проявил иммуностимулирующее действие. Выявленные фармакологические эффекты и низкая токсичность исследуемого препарата позволяют рекомендовать его в качестве средства для лечения и профилактики тонзиллита. Разработка параметров стандартизации препарата «Шалфей Иммунактив». Известно, что фармакологические эффекты фитопрепаратов обусловлены присутствием в растениях тех или иных биологически активных веществ (БАВ). С целью выявления соединений, обуславливающих фармакологические свойства препарата, был проведен физико-химический анализ его активных компонентов - экстрактов шалфея лекарственного и эхинацеи узколистной. Полученные данные показали, что общей для двух растений группой БАВ является комплекс фенольных соединений – флавоноидов и производных гидроксикоричной кислоты. Эту группу БАВ мы исследовали более детально в сухих экстрактах и приняли ее за основу при разработке параметров 17 стандартизации готовой лекарственной формы (табл. 3). Согласно данным литературы, фенольные соединения в значительной степени обуславливает выраженную фармакологическую активность шалфея и эхинацеи (Chеminat et al., 1988; Lamaison et al., 1991; Hobbs, 1994; Lima et.al., 2007). Таблица 3 Содержание фенольных соединений в экстрактах шалфея лекарственного и эхинацеи узколистной, % масс Параметр Экстракт Экстракт ш.лекарственного э.узколистной Содержание гидроксикоричных кислот в 3,40±0,30/ 2,00±0,84 / пересчете на кофейную/розмариновую 5,79±0,51 кислоту (ВЭЖХ) Содержание индивидуальных соединений (ВЭЖХ) - кафтаровая кислота 1,07±0,44 - хлорогеновая кислота 0,08±0,02 - кофейная кислота 0,18±0,06 0,09±0,02 - цинарин/эхинакозид 0,15±0,04 - цикориевая кислота 1,90±0,85 - лютеолин-7-глюкозид 0,23±0,07 - гликозид лютеолина 1,69±0,14 - розмариновая кислота 2,86±0,15 суммарно 4,87±0,38 3,37±1,36 Сумма флавоноидов (СФМ по реакции с хлоридом алюминия) -в пересчете на лютеолин-7-глюкозид 2,9±0,1 Не -в пересчете на лютеолин 4,2±0,1 обнаружены При разработке параметров стандартизации для подтверждения подлинности препарата выбрали три теста, которые подтверждают присутствие основных действующих ингредиентов. Аскорбиновую кислоту определяли в фармакопейной качественной реакции обесцвечивания раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Для идентификации компонентов эфирного масла шалфея (туйона и цинеола) использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). Обнаружение компонентов экстрактов шалфея и эхинацеи предложили проводить методом ВЭЖХ (рис. 6). На хроматограмме уверенно детектируется пять пиков основных компонентов – кафтаровая кислота, кофейная кислота, гликозид лютеолина, цикориевая и розмариновая кислоты. Идентификацию выполняли в сравнении с временами удерживания и спектрами соответствующих веществ-свидетелей. Для серийного анализа предложили идентифицировать компоненты по совпадению относительных времен удерживания по отношению к кофейной кислоте, для количественной 18 стандартизации - определять суммарную площадь пиков в заданном интервале относительных времен удерживания в пересчете на кофейную кислоту. Рисунок 6 Типичная ВЭЖХ-хроматограмма препарата «Шалфей Иммунактив» 1 – кафтаровая кислота, 2 – кофейная кислота, 3 – гликозид лютеолина, 4 – цикориевая кислота, 5 – розмариновая кислота Метод был валидирован в соответствии с современными требованиями по параметрам специфичности - Specificity, прочности - Robustness, линейности - Linearity, прецизионности - Precision и точности – Accuracy. Количественное содержание аскорбиновой кислоты определяли методом титрования раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Специфичность используемой методики подтвердили при помощи раствора плацебо, ее точность оценили на модельных смесях плацебо и аскорбиновой кислоты в тесте «внесено-найдено». Разработанный проект нормативной документации на препарат «Шалфей Иммунактив» представлен на регистрацию в ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора. Полученные в результате исследования данные дают основание утверждать, что препараты на основе экстрактов шалфея и эхинацеи обладают выраженными противовоспалительными и иммуностимулирующими свойствами, что согласуется с литературными данными и связано с наличием в растениях различных БАВ, в том числе фенольных соединений (Растения для нас, 1996; Зилфикаров, 2007; Hobbs, 1994; Bauer, 1996; Sauge officinale. In: Médicaments à base de plantes, 1998; Lu, Foo, 1999; 2000; Barrett, 2003). В частности, эксперименты in vitro на эпителиальных клетках желудка показали, что водный экстракт шалфея проявляет ингибирующее действие по отношению к транскипционному фактору NF-kB (Kim et al., 2005). Содержащийся в экстракте шалфея флавоноид лютеолин проявляет противовоспалительные свойства, блокируя NF-kB – зависимый сигнальный путь (Kim and Jobin, 2005). Исследуемые препараты снижали уровень TNF-α, вырабатываемого в ответ на введение каррагенина. Вероятно, это связано с 19 наличием в экстрактах шалфея флавоноидов, которые способны ингибировать NF-kB киназу (Chen et al., 2004). Выявленное по результатам нашего эксперимента антиэксудативное действие препаратов (Makarova et al., 2009) коррелирует с данными литературы. На моделях различных отеков показано, что экстракт из разных частей растения проявляет выраженную антиэксудативную активность (Хайдукова и др., 2003; Baricevic et al., 2001), что также может быть обусловлено наличием в экстракте шалфея флавоноидов, обладающих капилляроукрепляющим, антиоксидантным и антигипоксическим действиями (Георгиевский и др., 1990; Головкин и др., 2001; Александрова, 2004). Выявленные иммуномодулирующие свойства препарата связаны с присутствием в нем экстракта эхинацеи узколистной. Извлечения из травы различных видов эхинацеи, как свидетельствуют литературные данные, повышали фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов; стимулировали продукцию макрофагами цитокинов: TNF-α, INF-γ, IL-1, IL-4, IL-10, увеличивали число естественных киллеров - NK-клеток (See et al., 1997; Bauer, 1999; Morazzoni, 2005; O'Neill et al., 2002; Senchina et al., 2006). В эксперименте in vitro извлечения из эхинацеи дозозависимо усиливали пролиферацию клеток селезенки и продукцию IgM лимфоцитами мышей (Classen, 2006), что свидетельствуют о способности препарата стимулировать пролиферацию В-лимфоцитов и коррелирует с нашими результатами, полученными на модели острого лимфаденита у крыс. Экстракты эхинацеи в экспериментах проявляли противовирусное действие, предположительно связанное с воздействием на различные звенья иммунной системы (Binns et al., 2002; Foster, 1991; McCann et al., 2007). В частности, производные фенолкарбоновых кислот (эхинакозид и цикориевая кислота) проявили активность в отношении вируса везикулярного стоматита (Chеminat et al., 1988). В эксперименте in vitro кофейная кислота и ряд ее производных увеличивали продукцию TNF-α, IL-6 и IFN-γ (Radtke et al., 2003). Таким образом, иммуномодулирующее действие препарата может быть связано с комплексом фенолкарбоновых кислот эхинацеи, для которых, согласно данным литературы, характерны иммуномодулирующий, противовирусный и антиоксидантный эффекты (Hobbs, 1994; Binns et al., 2002; Hudec et al., 2007; Masteikova et al., 2007). ВЫВОДЫ 1. По результатам исследования общей токсичности и иммунотоксического действия «Шалфей Иммунактив» признан безопасным. Для определения класса токсичности и расчета доз при планировании хронического эксперимента рекомендован метод dose range finding (DRF). 2. «Шалфей Иммунактив» обладает выраженным иммуностимулирующим действием, поскольку он повышал фагоцитарную активность макрофагов (стимулировал неспецифический иммунный ответ), увеличивал титр антител (стимулировал В-клеточный иммунный ответ). 20 3. «Шалфей Иммунактив» модулирует развитие клеточного иммунного ответа, что подтвердилось снижением уровня цитокина IL-4 и увеличением продукции IFNγ в исследовании функциональной активности Т-хелперов. 4. «Шалфей Иммунактив» проявляет противовоспалительный эффект, поскольку препарат уменьшал реакцию ГЗТ при изучении его влияния на Тклеточный иммунный ответ и снижал продукцию IL-2. 5. Разработана экспериментальная модель острого лимфаденита у крыс для изучения противовоспалительной активности препарата, заключающаяся во введении провоспалительного агента в лимфатический узел шеи крысы. 6. На модели острого лимфаденита у крыс выявлены выраженные противовоспалительные и противоотечные свойства «Шалфей Иммунактив» и препарата сравнения «Шалфей Тайсс». Наибольший эффект исследуемого препарата отмечен в дозе 0,6 г/кг. 7. Выявленные фармакологические эффекты и низкая токсичность «Шалфей Иммунактив» позволяют рекомендовать его для лечения и профилактики тонзиллита. 8. Определены основные группы биологически активных веществ экстрактов шалфея лекарственного и эхинацеи узколистной. Разработана и валидирована методика анализа суммы фенольных соединений шалфея и эхинацеи, с которыми предположительно связана фармакологическая активность препарата. Разработаны параметры стандартизации, составлен проект нормативной документации на препарат «Шалфей Иммунактив». Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Гусева С.И., Авдеева О.И., Карачинская И.В., Стефанов С.Ю. Изучение общей токсичности нового лекарственного препарата на основе шалфея и эхинацеи // Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки». - Ярославль: Изд-во ООО «ЯрМедиаГруп». 2009. – С. 113-114. 2. Гусева С.И., Авдеева О.И., Карачинская И.В., Стефанов С.Ю. Исследование биологического действия на организм растительного лекарственного препарата методом DRF (dose range finding). // 63-я итоговая научная конференция молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета с международным участием, посвященная 70-летию СНО (МНО). Аннотации докладов и материалов Дня науки молодых ученых Рост ГМУ (24 апреля 2009). – Ростов-на-Дону.: ГОУ ВПО Рост ГМУ Росздрава. – 2009. – С. 178 3. Авдеева О.И., Стефанов С.Ю., Карачинская И.В., Гусева С.И. Доклиническое исследование репродуктивной токсичности препарата на основе шалфея и эхинацеи на аутбредных крысах. // Науки о человеке: материалы Х конгресса молодых ученых и специалистов. – Томск: СибГМУ. – 2009. – С. 70-71 21 4. Гусева С.И., Макарова М.Н., Шиков А.Н., Пожарицкая О.Н., Авдеева О.И., Карачинская И.В., Дьячук Г.И. Применение метода DRF (dose range finding) для оценки общей токсичности лекарственного препарата на основе растительных экстрактов. // Токсикол. Вестник. – 2009. - № 5. – С. 26-30 5. Гусева С.И., Авдеева О.И., Макарова М.Н., Шиков А.Н., Пожарицкая О.Н., Карачинская И.В., Дьячук Г.И. Доклиническое изучение эмбрио-, фетотоксических свойств и влияния на генеративную функцию нового фитопрепарата // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. – 2009.– № 3-2009. – с. 143-148 6. Крышень К.Л., Гусева С.И., Тесакова С.В., Ацапкина А.А., Макарова М.Н., Шиков А.Н., Макаров В.Г, Дьячук Г.И. Оценка противовоспалительного действия лекарственных препаратов на основе шалфея // Цитокины и воспаление. – 2009. – Т.8. - № 4 – С. 67-72 7. Гусева С.И., Косман В.М., Буркина П.Н, Дьячук Г.И., Макаров В.Г., Шиков А.Н. Валидация методики определения содержания фенольных соединений в препарате на основе шалфея и эхинацеи. // «Фармация и общественное здоровье» Материалы ежегодной конференции (25 февраля 2010 г.) – Екатеринбург.: ГОУ ВПО Росздрава «Уральская государственная медицинская академия». – 2010. - с. 158-161 8. Гусева С.И., Макарова М.Н., Тесакова С.В., Крышень К.Л., Ацапкина А.А., Буркина П.Н. Разработка экспериментальной модели острого воспаления лимфатического узла у крыс // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины и биологии» (27-30 апреля 2010 г.) – Санкт-Петербург: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная Медицинская Академия им. И.И. Мечникова» – 2010. – в печати 9. Avdeeva O.I., Guseva S.I., Makarova M.N., Stefanov S.Yu., Abrashova T.V., Karachinskaya I.V. Evaluation for the safety of new herbal drug with sage and Echinacea extracts by method of dose range finding. // The 13 th International congress Phytopharm 2009 abstracts book. – 2009. – P. 78 10. Kosman V.M., Guseva S.I., Pozharitskaya O.N., Shikov A.N. Standardization of the tablets with Echinacea angustifolia and Salvia officinalis dry extracts. // The 13th International congress Phytopharm 2009 abstracts book. – 2009. – P. 64 11. Kryshen K.L., Acapkina A.A., Guseva S.I., Makarova M.N., Makarov V.G. Immunotoxic and immunomodulator effects of comlex herbal preparation. // The 13th International congress Phytopharm 2009 abstracts book. – 2009. – P. 79 12. Makarova M.N., Tesakova S.V., Guseva S.I., Kryshen K.L., Abrashova T.V., Makarov V.G. Efficacy of phyto preparations in experimental model of cervical lymphadenitis in rats // The 13 th International congress Phytopharm 2009 abstracts book. – 2009. – P. 75 13. Guseva S.I., Shikov A.N., Makarova M.N., Pozharitskaya O.N., Krysen K.L., Makarov V.G. Anti-inflammatory effect of tablets with Salvia extract using carrageenan air pouch model // 57th International congress & Annual meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research. Book of abstracts Addendum. – Geneva, Switzerland. – 2009. – P. A7 22 Список сокращений ШИ – «Шалфей Иммунактив» ШТ - «Доктор Тайсс экстракт шалфея с витамином С» («Доктор Тайсс») ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ТСХ – тонкослойная хроматография СФМ – спектрофотометрия НД – нормативный документ GLP – good laboratory practice (правильная лабораторная практика) DRF – dose range finding (поиск диапазона доз) LD50 – lethal dose, 50% (доза вещества, вызывающая гибель половины экспериментальных животных) ТД – терапевтическая доза ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа ЛУ – лимфатический узел КонА - конканавалина А ЛПС - липополисахарид INFγ – интерферон-γ TNFα – фактор некроза опухоли-α IL-1,2,4 – интерлейкин-1, 2, 4 СРБ – С-реактивный белок ДЦГ – диаметр герментативных центров БАВ – биологически активное вещество Ig M– иммуноглобулин M
