УДК 616.36-092.9:577.113.3:613.632 ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ НИКОТИНАМИДНЫХ НУКЛЕОТИДОВ

УДК 616.36-092.9:577.113.3:613.632
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ НИКОТИНАМИДНЫХ НУКЛЕОТИДОВ
В ПЕЧЕНИ КРЫС ПОД ВЛИЯНИЕМ ЛЕТУЧИХ КОМПОНЕНТОВ
ЭПОКСИДНОЙ СМОЛЫ ЭД-20
И.Ю. Высоцкий, канд. мед наук., доц.
Сумский государственный университет
Опыты проведены на белых крысах-самцах линии Wistar массой 180-230 г. Показано, что при острой
динамической интоксикации летучими компонентами эпоксидной смолы (ЭС) ЭД-20 (120-140 мг/м3 по
эпихлоргидрину) происходит снижение пула никотинамидных коферментов (НАД+НАДН+НАДФ+НАДФН)
в печени преимущественно за счет окисленных форм (НАД+НАДФ) и уменьшение соотношения окисленных
форм к восстановленным формам (НАД+НАДФ/НАДН+НАДФН). Сделано предположение о торможении
под влиянием летучих компонентов ЭС ЭД-20 транспорта электронов и протонов в дыхательной цепи
митохондрий на уровне флавопротеидов как основного, так и бокового путей окисления субстратов.
Важная роль в изменении соотношения никотинамидных коферментов отводится нарушению
структурной целостности митохондриальных мембран.
ВВЕДЕНИЕ
В ранее проведенных нами исследованиях изучено состояние окислительно-антиоксидантного
гомеостаза организма при острой интоксикации летучими компонентами эпоксидной смолы (ЭС) ЭД-20 [1,
2, 3]. В то же время известно, что никотинамидные нуклеотиды в присутствии глутатиона и других SHсодержащих соединений способны стимулировать разложение гидроперекисей липидов и усиливать
антиоксидантный статус организма. Доказана также тесная взаимосвязь между реакциями перекисного
окисления липидов и компонентами НАДФН-специфической цепи переноса электронов [4]. Кроме этого,
эти соединения играют важную роль в метаболизме ксенобиотиков, являются коферментами целого ряда
дегидрогеназ, участвуют в энергетическом и пластическом обменах. Так, инактивирование и связывание
ксенобиотиков осуществляются при участии НАДФ в системе микросомальных ферментов путем реакций
ацетилирования, декарбоксилирования, гидроксилирования, образования глюкуронидов и др. Переходы
НАД <=> НАДН, НАДФ <=> НАДФН существенны для редокс-свойств клеток и регулируют основные
внутриклеточные метаболические процессы [5]. При различных заболеваниях, интоксикациях, отравлениях
химическими соединениями, других патологических процессах происходят значительные нарушения в
системе именно никотинамидных нуклеотидов, что не может не отразиться на тех многочисленных
процессах в организме, в регуляции которых участвуют эти коферменты [5, 6]. Роль никотинамидных
коферментов в токсикологии и механизме действия ЭС до настоящего времени не изучена.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Целью настоящей работы явилось изучение влияния летучих компонентов ЭС ЭД-20 на содержание в
печени животных окисленных и восстановленных форм никотинамидадениндинуклеотидов (НАД+НАДН и
НАДФ+НАДФН).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводились на белых крысах – самцах линии Вистар массой 180-230 г. Острое токсическое
поражение печени вызывали путем однократного 4 часового ингаляционного динамического воздействия
летучими компонентами ЭС ЭД-20 в концентрации, составляющей 1/3 LC50 по ЭХГ (120-140 мг/м3).
Ингаляционная затравка осуществлялась в смонтированной по методу А.П. Яворовского [7] в нашей
модификации установке, включавшей компрессор, паронасыщающую камеру, затравочную камеру,
воздуховоды, терморегулятор, реометры, поглотители с пористой пластинкой и другое вспомогательное
оборудование. Перед подачей в паронасыщающую камеру воздух предварительно очищался за счет
прохождения через патрон, заполненный активированным углем. Паронасыщающая камера представляла
собой колбу из термостойкого стекла или бутыль, частично заполнявшуюся ЭС ЭД-20 и закрывавшуюся
резиновой пробкой с отверстиями, через которые проходили 2 патрубка (длинный – для подачи воздуха в
толщу слоя ЭС; короткий – для вывода воздуха из верхней части паронасыщающей камеры в затравочную
камеру). При этом оголовок длинного патрубка, погружавшийся в ЭС, залитую в паронасыщающую камеру,
снабжался воронкой с микропористой стеклянной пластинкой [7] либо вибрирующим пористым элементом
[8], дробившим струю подаваемого воздуха на части и обеспечивавшим более интенсивный барботаж. Для
усиления насыщения воздуха парами ЭС применялось также разработанное нами распыляющее устройство
[9], а также испаритель компонентов ЭС с непрерывной подачей вещества [10].
Насыщенный летучими веществами воздух подавался в течение 4 часов в верхнюю часть 14-литровой
затравочной камеры, смонтированной из двух эксикаторов, и, проходя через зону дыхания животных,
удалялся из нижней ее части при помощи вытяжной вентиляционной установки.
Режим воздухообмена подбирался таким образом, чтобы в затравочной камере создавалось
незначительное разрежение, фиксируемое при помощи вмонтированного в нее водяного манометра.
Навески ЭС ЭД-20, создававшие в камере эффективные концентрации летучих композиций, подбирали
опытным путем и нагревали в паронасыщающей камере до температуры 90-1000С. В качестве ведущего и
характерного компонента летучих комплексов ЭС ЭД-20 был принят эпихлоргидрин (ЭХГ). Это соединение
является постоянным, наиболее токсичным компонентом летучих комплексов ЭС ЭД-20, выделяется в
воздушную среду пропорционально другим сопутствующим веществам и специфически характеризует ЭС
[11]. Все затравки проводились натощак, в одно и то же время суток – в 10 часов утра.
Суммарное содержание окисленных (НАД+НАДФ) и восстановленных (НАДН+НАДФН) форм
никотинамидных коферментов определяли в гомогенате печени флюориметрическим методом [12] и
выражали в мкмоль/кг влажной ткани, а их отношение выражали коэффициентом. Метод основан на
свойстве N-метилникотинамида, а также НАД и НАДФ образовывать при обработке ацетоном стабильные
флуорисцирующие соединения, количество которых определяется флюориметрически. Стандартом служил
раствор N-метилникотинамида в концентрации 5 мкг/мл. Пробы печени для исследования забирали через
12, 24, 72 и 120 часов после окончания ингаляционного воздействия летучими компонентами ЭС ЭД-20.
Полученные в эксперименте результаты обрабатывали статистически общеизвестным методом (t
критерий Стьюдента) с помощью программы Microsoft Excel-97 для Windows [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты исследований по определению содержания никотинамидных коферментов в печени крыс в
динамике после острой ингаляционной интоксикации ЭС ЭД-20 представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Содержание никотинамидных коферментов в печени животных в условиях острой
динамической ингаляционной интоксикации летучими компонентами ЭС ЭД-20 (n=6-8)
Изучаемый
показатель
Стат.
показате
ль
Интактные
животные
Сроки исследования
(в часах после воздействия повреждающих
факторов)
12
24
72
120
НАД+НАДФ,
мкмоль/кг
М
m
P
464,33
11,64
371,62
16,77
<0,001
355,17
8,70
<0,001
306,12
16,06
<0,001
367,86
16,03
<0,001
НАДН+НАДФН,
мкмоль/кг
М
m
P
352,33
9,50
359,50
17,43
>0,5
341,00
21,32
>0,5
323,37
7,72
<0,05
342,00
19,35
>0,5
НАД+НАДФ+
НАДН+НАДФН,
мкмоль/кг
М
m
P
816,67
14,47
731,12
27,84
<0,05
696,17
20,27
<0,001
629,50
16,73
<0,001
709,86
22,36
<0,01
1,32
1,04
1,07
М
0,05
0,05
0,08
m
<0,01
<0,05
P
Примечание Р - дано по сравнению с интактными животными
0,95
0,05
<0,001
1,10
0,08
<0,05
НАД+НАДФ
НАДН+НАДФН
Установлено, что при острой динамической ингаляционной интоксикации ЭС ЭД-20 происходит
существенное снижение уровня окисленных форм никотинамидных коферментов в печени во все изучаемые
сроки эксперимента (р<0,001). При этом уже через 12 часов после затравки животных уровень НАД+НАДФ
в сравнении с группой интактных крыс снижается на 20%. В дальнейшем можно проследить монотонное
снижение данного показателя, который к концу третьих суток составляет лишь 65% от исходных величин. К
концу пятых суток эксперимента уровень окисленных форм никотинамидных коферментов имеет
тенденцию к увеличению, хотя и остается достоверно ниже, чем у интактных крыс, на 21%.
Иная картина отмечается при изучении в печени крыс в условиях острой ингаляционной интоксикации
летучими компонентами ЭС ЭД-20 содержания никотинамидных коферментов в восстановленной форме.
Обнаружено, что в первые 12 часов наблюдения уровень НАДН+НАДФН в изучаемых условиях
эксперимента не претерпевает каких-либо значимых изменений, и только лишь к концу третьих суток
исследования выявляется достоверное снижение содержания никотинамидных коферментов в
восстановленной форме. Однако уже к пятым суткам исследования изучаемый показатель возвращается к
величинам, регистрируемым у интактных крыс.
Полученные в этом фрагменте результаты свидетельствуют о том, что окисленная форма НАД теряется,
по-видимому, значительно легче, чем восстановленная. Это обусловлено, скорее всего, наличием более
прочной связи между НАДН и дегидрогеназами или флавопротеидами, играющими роль промежуточных
звеньев в цепи окисления, сопряженного с фосфорилированием [5].
Весьма информативные данные получены при определении суммарного количества никотинамидных
нуклеотидов в изучаемых условиях эксперимента. Как следует из таблицы, суммарное содержание
коферментов (НАД+НАДФ+НАДН+НАДФН) в печени отравленных ЭС животных изменяется
пропорционально и однонаправленно с вышеописанными изменениями уровня их окисленных форм. Об
этом могут свидетельствовать цифры, указывающие, что данный показатель достоверно меньше величин,
регистрируемых у интактных крыс через 12 и 24 часа, на 11 и 15%, а через 72 и 120 часов, – на 23 и 13%
соответственно. Максимальное снижение суммы нуклеотидов регистрируется через 72 часа наблюдения и
составляет 77% от показателей в интактной группе крыс. И хотя к концу пятых суток наблюдения
имеющиеся различия с исходными величинами и сохраняют достоверный характер, все же отмечается
тенденция к восстановлению суммарного количества никотинамидных нуклеотидов в печени отравленных
животных.
Исходя из этого, представляется возможным предположить наличие существенных сдвигов в
дыхательной цепи и определенное напряжение в состоянии и поддержании энергетического гомеостаза в
гепатоцитах у животных при отравлении летучими компонентами ЭС.
Учитывая энергетическое состояние гепатоцитов у животных в условиях острой динамической
ингаляционной интоксикации ЭС ЭД-20, особый интерес представляло определение соотношения
(НАД+НАДФ)/(НАДН+НАДФН),
характеризующего
суммарное
окислительно-восстановительное
состояние пула никотинамидных коферментов в клетках печени. Показано, что в условиях острой
интоксикации крыс ЭС величина этого соотношения достоверно снижается на 17-28% во все сроки
наблюдения по сравнению с интактными животными. Минимальные значения изучаемого интегрального
показателя, составляющие 72% от исходных величин, зафиксированы на 72-м часу эксперимента.
Оценка соотношения (НАД+НАДФ)/(НАДН+НАДФН), которое является весьма чувствительным
индикатором метаболического состояния клеток печени, позволяет сделать заключение о том, что при
остром отравлении летучими компонентами ЭС существенно нарушается функционирование прежде всего
митохондриальной электрон-транспортной цепи гепатоцитов, что требует соответствующей
фармакологической коррекции. В то же время, учитывая роль никотинамидных коферментов как
компонентов микросомальной электронтранспортной цепи, можно высказать предположение о возможном
нарушении при данном патологическом состоянии процессов детоксикации.
Уменьшение коэффициента, характеризующего отношение окисленных форм к восстановленным при
острой динамической интоксикации летучими компонентами ЭС ЭД-20, вероятно связано с нарушением
транспорта электронов и протонов в дыхательной цепи. По аналогии с другими патологическими
процессами возможно происходит дискорреляция редокс-соотношения с преобладающим падением уровня
окисленных форм, отражающих нарушения в цепи тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования и
окислительно-восстановительного потенциала клетки [5].
По-видимому, уменьшение под влиянием летучих компонентов ЭС ЭД-20 соотношения
(НАД+НАДФ)/(НАДН+НАДФН) при мало изменяющейся концентрации в печени НАДН+НАДФН и ранее
доказанной высокой эффективности флавината, но низкой – никотинамида в условиях острой смертельной
интоксикации одним из наиболее опасных летучих компонентов ЭС – ЭХГ [14] свидетельствует о том, что
один из участков торможения находится, как и в случае с барбамилом, в «низко» расположенных звеньях
цепи переноса электронов на уровне флавопротеидов, переносящих электроны от НАДН на КоQ [15].
Однако в отличие от барбамила, избирательно ингибирующего окисление тех субстратов, которые
взаимодействуют с дыхательной цепью через НАД-зависимые дегидрогеназы, и не влияющего на окисление
таких субстратов, как сукцинат, алифатический ацил КоА и -глицерофосфат, которые отдают свои
электроны непосредственно флавопротеидам [15], летучие компоненты ЭС ЭД-20, на наш взгляд, особенно
ЭХГ, вероятно, тормозят на уровне флавопротеидов, помимо основного, и боковой путь окисления
субстратов, о чем свидетельствует высокая эффективность флавината. И наконец, следует сказать, что в
нарушении обмена никотинамидных коферментов в печени при токсическом действии летучих компонентов
ЭС ЭД-20 важное значение имеет изменение ультраструктуры митохондрий, которое характеризуется
признаками явной деструкции, сильно набухшим матриксом, деградацией крист, нарушением целостности
наружной мембраны [16] и может приводить к вымыванию никотинамидных ферментов из митохондрий.
ВЫВОДЫ
Таким образом, результаты выполненных исследований свидетельствуют о том, что в механизме
развития острой интоксикации летучими компонентами ЭС важная роль принадлежит снижению пула
никотинамидных коферментов преимущественно за счет окисленных форм и уменьшению соотношения
окисленных к восстановленным формам. Это, по-видимому, связано с функциональными нарушениями в
дыхательной и детоксицирующей электронтранспортных цепях, системе акцептирования и передачи
водорода и ведет к замедлению скорости протекания окислительно-восстановительных реакций.
SUMMARY
The experiments were made on the white rat-males line Wistar weight 180-230g. Showed, that under acute dynamic intoxication by the flying
compounds of epoxide resin (ER) ED-20 (120-140 mg\m3 by epichlorhydrine) take place a decreasing of nicotinamide coenzyme’s level
(NAD+NADH+NADP+NADPH) in liver especially because of oxide forms (NAD+NADP) and decreasing of correlation oxide forms to restored
(NAD+NADP\NADH+NADPH). We made a supposition about braking the transport of electrons and protons in the mitochondrial oxidative
chain on flavoproteides’ stage as basic so lateral ways of substrate oxidation under influence of flying compounds of ER ED-20. An important
role of change the correlation of nicotinamide coenzymes belong to breach of structure intactness of mitochondrial membranes.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Высоцкий И.Ю., Качанова А.А., Высоцкий В.И. Перекисное окисление липидов при острой интоксикации летучими
компонентами эпоксидных смол и его фармакологическая коррекция // Вісник СумДУ. – 2003. - №7(53). – С. 32-40.
Высоцкий И.Ю. Функциональная активность антиоксидантной системы организма в условиях острой токсической гепатопатии
индуцированной эпоксидами, на фоне применения фармакотерапевтических средств // Український медичний альманах. – 2003. –
Т. 6, №6 (додаток). – С. 17-21.
Высоцкий И.Ю., Гребеник Л.И. Лекарственная регуляция тиол-дисульфидного обмена в печени животных при сотрой токсической
гепатопатии // Український медичний альманах. – 2003. – Т. 6, №5. – С. 36-41.
Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. – М.: Наука, 1972. – 252 с.
Чекман И.С. Биохимическая фармакодинамика. – К.: Здоровье, 1991. – 200 с.
Чекман И.С., Потемкина Н.Н., Туманов В.А. Никотинамидные коферменты как объект воздействия лекарств и ядов // Фармакол. и
токсикол. – 1977. – Т. 40, №1. – С. 113-122.
Яворовский А.П. Гигиена труда при получении и переработке эпоксидных смол и пластических масс: Дисс. д-ра мед. наук:
14.00.07. – К., 1990. – 494 с.
Высоцкий И.Ю. Каликин К.Г. Способ насыщения воздуха парами компонентов эпоксидных смол и других слаболетучих
жидкостей с помощью пористой пластинки //Аннотированный перечень изобретений и рационализаторских предложений ученых
– медиков к 35-летию Луганского медицинского института: Луганск. – 1991. – Вып. 3. – С. 19.
Высоцкий И.Ю., Каликин К.Г. Способ насыщения воздуха парами компонентов эпоксидных смол с помощью распыляющего
устройства: Удостов. на рац. предложение №2611, выд. 07.02.1991 г. Луганским медицинским институтом.
Высоцкий И.Ю., Каликин К.Г. Испаритель компонентов эпоксидных смол с непрерывной подачей вещества //Аннотированный
перечень изобретений и рационализаторских предложений ученых – медиков к 35-летию Луганского медицинского института:
Луганск. – 1991. – Вып. 3. – С. 18-19.
Шумская Н.И., Толгская М.С. Токсикологические и морфологические исследования при воздействии эпоксидных смол и их
исходных продуктов// Токсикология новых промышленных химических веществ. – М.: Медицина, 1965. – Вып. 7. – С. 76-90.
Huff W., Perlsweig W.A. The fluorescent consenderation product of N-methylnicotinamide and acetone. Asensitive method for the
determination of N-methylnicotinamide in urine //J. Biol. Chem. – 1947. – V. 167, №1. – Р. 157-167.
Додж М., Кината К., Стинсон К. Эффективная работа с Microsoft Excel 97. – СПб.: ЗАО «Издательство Питер», 1999. – 1072 с.
Высоцкий И.Ю. Изыскание антидотно-лечебных средств при острой интоксикации эпоксидными соединениями // Вісник СумДУ.
– 1999. - №1(12). – С. 115-124.
Мак-Мюрей У. Обмен веществ у человека: Пер. с англ. - М.: Мир, 1980. – 386 с.
Высоцкий И.Ю. Изменения ультраструктуры клеток печени при острой интоксикации летучими компонентами эпоксидных смол и
лекарственная коррекция возникших нарушений // Вісник СумДУ. – 1999. - №3(14). – С. 19-27.
Поступила в редакцию 20 февраля 2006 г.