Заведующая кафедрой «Аквакультуры» Дмитровского Филиала
advertisement
На правах рукописи АМПЛЕЕВА АНАСТАСИЯ ВЛАДИМИРОВНА ФОРМИРОВАНИЕ ОРГАНОВ КРОВЕТВОРЕНИЯ И ОСОБЕННОСТИ ГЕМОПОЭЗА В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ БЕЛОРЫБИЦЫ (STENODUS LEUCICHTHYS) Специальность 03.02.06 «Ихтиология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2013 2 Работа выполнена на кафедре гидробиологии и общей экологии ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет» Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ложниченко Ольга Владимировна Официальные оппоненты: Заведующая кафедрой «Аквакультуры» Дмитровского Филиала ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет», доктор биологических наук, профессор Головина Нина Александровна Ведущий сотрудник лаборатории гидробиологии ФГУП «Каспийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства», кандидат биологических наук Тихонова Элеонора Юрьевна Ведущая организация: Волгоградское отделение ФГНУ «Государственный научноисследовательский институт озерного и речного рыбного хозяйства» Защита состоится «27» марта 2013г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д.307.001.05 при Астраханском государственном техническом университете по адресу: 414025, г.Астрахань, ул.Татищева, 16. Факс: 8(512)54 91 03, e-mail: melyakina_el@mail.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного технического университета по адресу: 414025, г.Астрахань, ул.Татищева, 16 и на сайте www.astu.ru Автореферат разослан «___» _______________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент Мелякина Эльвира Ивановна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Все более возрастающая интенсификация рыболовства, увеличение негативного, антропогенного воздействия на природные водоемы, строительство ГЭС привело к сокращению большинства запасов рыб, и в ряде случаев к полному исчезновению некогда распространенных промысловых видов, в частности, к сокращению естественной популяции белорыбицы в ВолжскоКаспийском бассейне. Благодаря искусственному воспроизводству происходит поддержание численности этого ценного вида и поэтому биотехника заводского разведения белорыбицы нуждается в постоянном совершенствовании (Карпюк М.И., Кычанов В.М., 2006; Летичевский М.А., 1983; Любаев В.Я., 2002). Имеющиеся литературные сведения о развитии рыб, формировании основных органов и систем, как правило, посвящены вопросам биохимических преобразований в организме рыб в эмбриональном, личиночном и мальковом периодах (Галактионов В.Г., 2005; Головина Н.А., 1996; Житенева Л.Д., Макаров Э.В., Рудницкая О.А., 2004; Ложниченко О.В., 2008; Манькова Н.Ю., 2003 и др.). Проведены многочисленные исследования, устанавливающие отличия морфофизиологических показателей периферической крови на стадиях раннего онтогенеза и взрослых особей карповых, осетровых, акуловых и сиговых рыб (Бикташева Ф.X., 2010; Грушко М.П., 2010; Давыдов О.Н. Темниханов Ю.Д., Куровская Л.Я, 2006; Кейстер И.А., 2009; Конченко Д.С., 2010; Новожилов А.В., Катюхин Л.Н., 2008 и др.). Сведения о гемопоэзе белорыбицы на стадиях раннего онтогенеза отсутствуют, как и данные по качественному составу формирующихся элементов крови в органах кроветворения. Поэтому все более актуальными становятся исследования, направленные на изучение закономерностей гистогенеза кроветворных органов, особенностей развития клеток крови, динамику их качественного состава и становления иммунитета в целом у лососевых видов рыб в ранние периоды жизни. Также следует сказать, что целенаправленного, системного исследования закономерностей созревания клеток крови в онтогенезе, их удельном весе в процессе кроветворения у представителей лососевых рыб до сих пор не проводилось. Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение формирования органов кроветворения и особенностей гемопоэза в раннем онтогенезе белорыбицы (Stenodus leucichthys). Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Установить закономерности формирования органов кроветворения у белорыбицы; 2. Установить сроки начала формирования гемопоэтической функции в кроветворных органах белорыбицы; 3. Определить органную локализацию гемогистобластов и гемоцитобластов у белорыбицы; 4. Выявить возрастные особенности формирования и соотношения клеточных рядов форменных элементов крови в центральных и периферических органах кроветворения на разных стадиях онтогенеза; 5. Выяснить активность эритро- и лейкопоэза в периферической крови белорыбицы на стадиях раннего онтогенеза. 4 Научная новизна исследования. Проведено комплексное изучение кроветворных органов белорыбицы в эмбриональном, личиночном и мальковом периодах развития, которое позволяет получить целостное представление о качественном составе развивающихся форменных элементов крови этих органов, их развитии и становлении кроветворной функции. Выявлены возрастные особенности качественного состава форменных элементов крови в связи с дифференциацией центральных и периферических органов кроветворения. На основе приобретенных данных определены сроки начала продуцирования центральными и периферическими органами кроветворения белорыбицы клеток крови, особенности их топографии и созревания. Установлены сроки созревания клеточных рядов и кроветворной системы в целом. Описаны закономерности развития форменных элементов крови. Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований существенно расширены представления об особенностях формирования центральных и периферических органов кроветворения и закономерностях развития форменных элементов крови у лососевых рыб. Полученные данные могут использоваться при анализе результатов научных исследований по проблемам физиологической оценки резистентности предличинок, личинок и мальков белорыбицы в речной период жизни, а также при заводских наблюдениях в условиях заводского выращивания. Материалы по изучению возрастных особенностей форменных элементов крови и органов кроветворения у белорыбицы, в комплексе с другими физиологическими показателями необходимы для оценки ее запасов, для разработки прогнозов допустимого ее улова в Каспийском бассейне и в Волго-Каспийском районе и режима промысла; необходимы для оценки качества выпускаемой рыбоводной продукции. Основные фрагменты работы использованы при разработке и чтении таких дисциплин как «Общая гистология и эмбриология рыб» для II курса специальности «Водные биоресурсы и аквакультура» и «Биология размножения и развития» для студентов II курса специальности «Биоэкология», «Микробиология» в ФГБОУ ВПО «АГТУ». Методология и методы исследования. В работе использованы следующие методы исследования: гистологические, ихтиологические, гематологические и статистические. Результаты исследований обрабатывали статистически, достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (Плохинский Н.А. 1982; Лакин, Г.Ф. 1990), а также программного пакета анализа Microsoft Excel 2007. Положения, выносимые на защиту. 1. Первым универсальным кроветворным органом у белорыбицы является мезонефрос; 2. Процесс развития и дифференцировки клеток крови у белорыбицы имеет возрастные особенности; 3. Окончательная дифференцировка клеточных рядов в центральных и периферических кроветворных органах к концу малькового периода развития не закончилась. Степень достоверности результатов определяется применением современного сертифицированного аналитического оборудования, соблюдением 5 требований действующих стандартов, а также общепринятыми статистическими методами обработки данных. Апробация работы. Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались на научно-технических конференциях профессорскопреподавательского состава ФГБОУ ВПО «АГТУ» (2009-2012), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы экологии и сохранения биоразнообразия» (Владикавказ, 2009), международной научно-практической конференции «Экологические проблемы и социально-экономические аспекты обустройства и развития аридных территорий Российской Федерации» (Москва, 2009), международной конференции «Воспроизводство естественных популяций ценных видов рыб» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы экологии и сохранения биоразнообразия России и сопредельных стран» (Владикавказ, 2010), международной научно-практической конференции «Социально-экономические и природоохранные аспекты развития сельских муниципальных образований» (Москва, 2010), международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (ОАЭ, Дубай, 2010), международной научной конференции «Морфология XXI столетия» (Киев, 2010), III эмбриологическом симпозиуме всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011, закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийск, 2011); V международной научно-практической конференции «Научное творчество XXI века» (Красноярск, 2012), I международной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы природопользования в аридной зоне Северо-Западного Прикаспия» (Москва, 2012), IX конгрессе международной ассоциации морфологов (Самара, 2012); VI международной заочной конференции «Человек и животные» (Астрахань, 2012), Международной научной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов» (Астрахань, 2012). Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендуемых ВАК. Объем и структура работы. Общий объем диссертации 142 страницы. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, шести глав с описанием результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 228 источников, в том числе 36 зарубежных, и 42 приложений. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 2 таблицами. Глава 1. Обзор литературы В работе представлен анализ публикаций отечественных и зарубежных авторов по современному состоянию изученности проблемы, по соотношению форменных элементов крови и особенностям гемопоэза рыб (Головина Н.А., 1996; Грушко М.П. 2008, 2010; Житенева Л.Д., 2004; Иванова Н.Т. 1995 и другие). Глава 2. Материалы и методы исследования Диссертационное исследование проведено в ФГБОУ ВПО «Астраханском государственном техническом университете», кафедре «Гидробиологии и общей экологии» в период с 2008 по 2012гг. Объектом изучения являлись предличинки, 6 личинки и мальки белорыбицы (Stenodus leucichthys), полученные в искусственных условиях на Александровском рыбоводном заводе. Параметры пластических признаков и массы тела определялись согласно методам, рекомендуемым Т.С. Рассом, И.И. Казановой (1966). При помощи окулярмикрометра измеряли общую длину предличинок, личинок и мальков. Белорыбицу взвешивали на рычажных весах. При выполнении работы этапы постэмбрионального развития белорыбицы определяли по И.И. Смольянову (1957). Просмотр срезов и снимки производили при помощи микроскопа Микмед 6 с системой визуализации. Всего изготовлено 354 серии срезов предличинок, 108 серии срезов личинок и 228 серии срезов мальков белорыбицы. Серии препаратов окрашивали гематоксилин-эозином, азаном по Гейденгайну с докраской по Маллори. Гематологические показатели анализировались по описаниям, рекомендованным Л.Д. Житеневой с соавт. (1989), Н.Т. Ивановой, (1982). Форменные элементы крови идентифицировались согласно описаниям Н.Т. Ивановой (1982), изменения в форменных элементах – по рекомендациям Л.Д. Житеневой (1989). Глава 3. Результаты собственных исследований 3.1. Морфофункциональные особенности кроветворения в мезонефросе белорыбицы В эмбриональном периоде развития формирующийся мезонефрос имел большое значение в кроветворении. В течение эмбрионального периода развития из почечных везикул формировалась первая генерация мезонефральных телец и относительно короткие извитые канальца, открывавшиеся в мезонефральный проток. Анализ возрастных изменений состава кроветворной ткани мезонефроса показал, что кровяных островков у белорыбицы сразу после выклева предличинок не было отмечено. Родоначальные и бластные клетки крови располагались среди мезенхимных клеток хаотично. На 2-3 сутки в формирующейся межканальцевой ткани мезонефроса были найдены следующие клетки крови: гемогистобласты – 9,8±0,87% от числа всех клеток; гемоцитобласты – 6,0±1,08%; эритробласты – 37,1±2,93%; лимфобласты – 21,8±4,25%; миелобласты – 6,4±1,76%; монобласты – 9,3±1,23%. В межканальцевой ткани была выявлена происходившая дифференцировка клеток эритропоэтического ряда: пронормобластов было – 6,3±1,13%, базофильных нормобластов – 3,3±0,67%. На II и III этапе подпериода свободного эмбриона эмбрионального периода развития интенсивность гемопоэза оставалась довольно высокой. Количество родоначальных и унипотентных клеток-предшественниц на III этапе снизилось в два раза, составляя соответственно – 2,5±0,48% и 4,4±0,54%. Среди клеток бластного класса доминировали лимфобласты – 5,7±1,93%, эритробласты несколько им уступали и составили – 4,5±0,62%. Монобласты (P<0,001) и миелобласты составили незначительные количества – 1,3±0,47% и 4,0±0,66% соответственно. Количество созревающих клеток увеличилось, но превалировали, по-прежнему, клетки эритропоэтического класса. Количество пронормобластов снизилось и составило – 2,4±0,53%, доля базофильных нормобластов была равна – 4,1±0,57%. Численность полиоксифильных нормобластов составила 9,0±1,17%. Среди созревающих клеток эритропоэтического ряда были отмечены оксифильные нормобласты в количестве 22,9±2,89%. Из клеток лимфоцитопоэтического ряда (P<0,01) процент пролимфоцитов не изменился и составил – 7,9±1,04%. Следует отметить, что в этом 7 возрасте у предличинок белорыбицы началась дифференцировка гранулоцитов. Среди клеток кроветворной ткани в мезонефросе было отмечено незначительное количество эозинофилов (6,1±0,79%) и нейтрофилов (2,1±0,22%) на стадии миелоцита. Из VI класса зрелых клеток лимфоциты составили – 12,7±1,99%, эритроциты – 10,4±1,38% (рисунок 1). 3 2 1 Рис. 1. Мезонефрос белорыбицы в возрасте 11 дней. Азокармин. Ув. 1000. 1. Почечный каналец, 2. Эритробласт, 3. Лимфобласт. В самом начале личиночного периода происходило увеличение в размерах всех структурных компонентов мезонефронов. У личинок белорыбицы были обнаружены почечные тельца, в которых всю полость мочевого пространства занимали капиллярные клубочки. В головной части мезонефроса среди клеток межканальцевой ткани располагались и почечные тельца и канальца, что свидетельствует о том, что уже в конце личиночного периода развития мезонефрос белорыбицы не имеет сформированного головного отдела почки, состоящего только из гемопоэтической ткани. Головной, туловищный и хвостовой отделы почки у личинок белорыбицы выполняют и выделительную и кроветворную функции. Качественный состав развивающихся клеток крови в личиночном периоде развития приобрел качественно новые черты (рисунок 2). В течение личиночного периода развития в мезонефросе начали бурно развиваться гранулоциты – были отмечены эозинофилы и нейтрофилы на стадии миелоцита и метамиелоцита, но к концу личиночного периода развития свою дифференцировку они не завершили – дефинитивных клеток отмечено не было. Кроме того, среди клеток крови попрежнему превалировали клетки эритропоэтического ростка – 60,5±3,65% (P<0,05). На II-IV этапах личиночного периода развития процессы кроветворения происходили довольно активно, продолжал интенсивно развиваться миелоцитопоэтический ряд (P<0,001), но зрелых гранулоцитов не было. Наиболее интересным был мальковый период развития белорыбицы. В этом возрасте выделился головной отдел почки пронефрос, который был практически лишен мезонефронов, состоял исключительно из межканальцевой ткани. Пронефрос 8 участвовал в процессе кроветворения. В средней части мезонефроса вокруг почечных канальцев были обнаружены скопления гемопоэтической ткани. Рис. 2. Качественный состав клеток крови в мезонефросе личинок белорыбицы (%) Анализируя качественный состав кроветворной ткани, выявился небольшой процент гемогистобластов (1,6±0,29%) и гемоцитобластов (2,8±0,36%). 30,9±1,03% родоначальных клеток было в средней части почки. 26,7±2,07% гемогистобластов и гемоцитобластов были обнаружены в верхней трети медиальной части. В нижней 1/3 латеральной части почки гемоцитобластов было 18,6±0,99%. Из развивающихся форменных элементов крови доминировали формирующиеся лейкоциты, которые составляли 58,5±1,54% от числа всех клеток, доля клеток эритропоэтического ряда снизилась до 37,1 ±1,41%. Анализируя состав лейкопоэза, было установлено, что гранулоциты доминировали над агранулоцитами. Развитие гранулоцитов продолжилось, но не завершилось. Так, количество миелобластов возросло, по сравнению с личиночным периодом развития, и составило 3,4±0,66%. Скорость развития эозинофилов была выше, чем нейтрофилов. На I этапе в составе кроветворной ткани уже были отмечены палочкоядерные эозинофилы в количестве 2,1±0,89%. Удельный вес эозинофильных миелоцитов и эозинофильных метамиелоцитов также вырос и был равен 5,5±1,04% и 8,3±0,74% – соответственно. Процент нейтрофильных миелоцитов и нейтрофильных метамиелоцитов значительно не изменился, составляя 3,3±0,29% и 2,4±0,41% – соответственно. Среди клеток эритропоэтического ряда практически в два раза снизилось количество эритробластов (3,3±0,42%), пронормобластов (1,1±0,35%) и базофильных нормобластов (1,8±0,64%). Численность полиоксифильных нормобластов и оксифильных нормобластов была в практически равных долях (10,0±1,22%) и (10,6±0,84%) – соответственно. Удельный вес эритроцитов (10,3±2,47%) остался неизменным. Между клетками стромы головной почки находилось незначительное количество макрофагов. У этих клеток форма ядра могла меняться от овальной, бобовидной, до палочковидной. В структуре ядра были хорошо видны глыбки хроматина. Чаще всего макрофаги были расположены группами по 2-3 клетки, но и встречались поодиночке. 9 В пронефросе в результате качественного анализа было отмечена основная часть родоначальных клеток крови, что указывало на высокую активность гемопоэза в этой части почки. Процент этих клеток был следующим – 5,9±0,17% и 8,7±1,02% – соответственно. При анализе состава формирующихся клеток крови было выявлено, что доля класса бластных клеток, по сравнению с туловищной почкой, была выше 24,7±4,31%. Из них превалировали миелобласты – 8,7±0,33%, лимфобласты – 5,7±1,19%, монобласты – 4,6±0,58%, эритробласты – 5,7±0,43%. В созревающем классе клеток процент клеток эритропоэтического ряда составляет 34,4±1,66%. Нормобласты полиоксифильные и нормобласты оксифильные в количествах 11,6±0,96% и 13,7±2,74% составляли основу кровяного островка, при том, что численность пронормобластов была 3,4±0,67%. Среди клеток лейкопоэза доминировали гранулоциты: эозинофильны на стадии миелоцита (6,7±1,16%), метамиелоцита (9,9±2,87%), палочкоядерные формы (3,6±1,71%). Нейтрофилы были отмечены на стадии миелоцита (6,2±1,08%) и метамиелоцита (5,6±1,03%). На II этапе малькового периода (возраст 52 дня) в строении отделов мезонефроса и их качественном составе существенных изменений не отмечено. Таким образом, к концу малькового периода развития в мезонефросе завершилось развитие гранулоцитов (P<0,001) – были отмечены сегментноядерные эозинофилы. Также, завершено формирование эритропоэтического ряда (P<0,05) и лимфоцитопоэтического (P<0,001). В строении почки качественно новым явилось выделение головной части почки. Интенсивность гемопоэза в головной почке была выше. Среди формирующихся форменных элементов крови в пронефросе встречались макрофаги, которые зачастую располагались группами по несколько клеток, но сформированных мелано-макрофагальных центров не было. Глава 4. Морфофункциональные особенности кроветворения в желудочно-кишечном тракте белорыбицы Небольшие кроветворные островки в органах пищеварительной системы были отмечены в личиночном периоде развития белорыбицы в возрасте 45 суток. Следует отметить, что и в личиночном, и в мальковом периодах развития скопления кроветворной ткани встречались крайне редко и были небольших размеров. Основу островков в личиночном периоде развития составляли клетки эритропоэтического ряда. Из лейкоцитов происходило развитие лимфоцитов, гранулоциты представлены были бластными формами. В мальковом периоде развития основную массу развивающиеся клеток составляли агранулоциты, гранулоциты не закончили свое развитие – встречались нейтрофилы и эозинофилы на стадии метамиелоцита. Доля эритропоэтических клеток снизилась в два раза, а моноцитопоэтического ряда встречалась в незначительном количестве. Таким образом, в кроветворных островках органов пищеварительной системы происходило развитие всех клеточных рядов, причем с возрастом качественный состав их начал меняться в сторону продуцирования лейкоцитов. Глава 5. Морфофункциональные особенности кроветворения в тимусе белорыбицы Дифференцировка тимуса и его участие в кроветворении началось на III этапе личиночного периода развития. Личинки белорыбицы (в возрасте 38 суток) активно питались. Тимус представлял собой узкую, короткую полоску из ретикулярных клеток. Орган располагался со стороны жаберных крышек, за глоткой, напротив 10 жаберных дуг. Формирование коркового вещества только начиналось, деления органа на корковое и мозговое вещество еще не произошло. Тимус на этом этапе имел довольно рыхлую структуру, окруженную соединительнотканной капсулой. Клеточный анализ тимуса показал, что гемогистобласты и унипотентные клетки-предшественницы отсутствовали. В данном органе происходило развитие клеток лимфоцитопоэтического ряда, причем основу из этих клеток составляли лимфоциты 83,7±4,27%. Удельный вес лимфобластов и пролимфоцитов был небольшим 3,6±0,74% и 12,7±0,36% соответственно. Микроокружением для этих клеток были ретикулярные клетки. В возрасте 49 дней (I этап малькового периода развития) у молоди белорыбицы формирование стромы тимуса еще не было завершено, однако заметно увеличилась длина органа – до 2,28±0,11мм. Четкого деления на дольки не наблюдалось, хотя корковое и мозговое вещество стали различимы. Гистоструктура тимуса представлена ретикулярной тканью и развивающимися клетками крови, причем, 77,3±2,41% из них было дефинитивных лимфоцитов (рисунок 4). 1 2 Рис. 3. Тимус белорыбицы в возрасте 38 дней. Гематоксилин эозин. Ув. 100. 1. Строма органа, 2. Жаберная полость. Рис. 4. Качественный состав клеток крови в тимусе мальков белорыбицы (%) 11 В виду того, что основная масса органа представлена дефинитивными клетками, развивающиеся лимфобласты и пролимфоциты сосредотачивались, в основном, в мозговом веществе тимуса. У молоди белорыбицы в возрасте 52 суток в тимусе произошли следующие изменения. В строме тимуса намечаются будущие дольки. В формирующихся будущих дольках были хорошо различимы корковое и мозговое вещество. В соединительнотканной капсуле, покрывающей тимус со стороны жаберной полости, располагались в большом количестве пигментные клетки. Тельца Гассаля отмечены не были. Анализ состава развивающихся клеток лимфоцитопоэтического ряда показал, что превалировали лимфоциты – 74,7±3,41%. Удельный вес лимфобластов и пролимфоцитов значительно не изменился и составил 2,9±0,84% и 22,4±1,73% – соответственно. Ретикулярная ткань в тимусе выполняла функцию микроокружения. Следует отметить особенности топографии развивающихся лимфоцитов: лимфобласты и пролимфоциты располагались в мозговом веществе тимуса, тогда как зрелые лимфоциты совместно с ретикулярными клетками составляли основу коркового вещества. Следовательно, к концу малькового периода развития белорыбицы активно происходит процесс развития стромы тимуса, формировались будущие дольки, обособляется и увеличивается объем мозгового вещества. Тимус участвует исключительно в лимфоцитопоэзе (P<0,05), что указывает на присутствие чисто лимфоидной ткани. Глава 6. Морфофункциональные особенности кроветворения в жабрах белорыбицы К концу эмбрионального периода развития (в подпериоде свободного эмбриона) небольшие кроветворные образования, диаметром 203,5±18,52 мкм располагались у предличинок белорыбицы исключительно в основании жаберных филаментов. Проведенный анализ не выявил островков в основании жаберных ламелл. Отмеченные немногочисленные кровяные островки были бобовидной или округлой формы. Качественный анализ формирующихся клеток крови показал, что гемогистобласты и гемоцитобласты отсутствовали. Из развивающихся клеток крови обнаружены только бластные клетки: эритробласты – 45,4±3,59%, лимфобласты – 24,5±0,68%, миелобласты – 17,5±2,36%, монобласты – 12,6±1,98% (рисунок 5). Скопления гемопоэтической ткани, диаметром 312,2±16,42мкм, были отмечены в основании жаберных филаментов 20-и дневных личинок белорыбицы. Анализ состава кровяных островков по-прежнему не выявил родоначальных и унипотентных клеток-предшественниц. Среди клеток крови превалировали бластные формы, причем 31,6±1,48% составили эритробласты, доля лимфобластов была меньше 20,1±2,03%, процент миелобластов – 8,4±0,35%, численность монобластов оказалась меньше всех – 3,2±0,87%. Среди клеток созревающего класса доминировали молодые эритроциты, причем оксифильные нормобласты составили самый высокий процент – 10,1±0,32%, доля пронормобластов была невысокой 2,3±0,41%, базофильных нормобластов – 3,2±0,66%, полиоксифильных нормобластов – 6,6±3,41%. Процент эритроцитов был невысок – 3,1±0,63%. Из так называемой «белой» крови пролимфоциты составили – 5,5±1,07%, лимфоциты – 5,9±1,89%. На II и III этапах личиночного периода развития значительных качественных изменений в составе кроветворной ткани не произошло. 12 3 2 1 Рис. 5. Жабры 11-дневной белорыбицы. Окр. Гематоксилин эозин. Ув. 400. 1. Жаберный филамент, 2. Ламелла, 3. Клетки крови. На IV этапе в основании жаберных филаментов встречались скопления гемопоэтической ткани, диаметром 412,7±4,58мкм. Причем, основу островков составляли созревающие клетки крови и ретикулярная ткань. Доля бластных клеток сократилась вдвое и была равна 23,3±3,45%, причем, эритробласты и лимфобласты составили практически равные части – 9,8±1,56% и 8,6±0,48% – соответственно (рисунок 6). Рис. 6. Состав клеток крови в жабрах личинок белорыбицы (%) Количество миелобластов сократилось до 4,6±0,67% (P<0,001). Довольно редки были монобласты – 2,1±0,74% (P<0,001). В составе созревающего класса произошло увеличение доли более зрелых форм. Так, среди клеток эритропоэтического ряда (P<0,001) возросло количество оксифильных (15,3±2,47%) и полиоксифильных (11,6±1,68%) нормобластов. Процент пронормобластов (3,7±0,46%) и базофильных нормобластов (5,4±0,87%) мало изменился. Из 13 созревающих лейкоцитов встречались только клетки из лимфоцитопоэтического ряда (P<0,001) – пролимфоциты – 12,6±1,368%. Количество зрелых эритроцитов (8,2±0,61%) и лимфоцитов (18,1±1,46%) осталось практически на прежнем уровне. На I этапе малькового периода развития белорыбицы скопления ретикулярной ткани были отмечены в областях основания жаберных дуг. Гемогистобласты и унипотентные клетки-предшественницы в островках отсутствовали. Лимфобластов было 7,6±0,32%, монобластов (P<0,001) – 1,8±0,27%, миелобластов – 4,5±1,84%. Основу кроветворного образования составляли клетки эритропоэтического ряда (P<0,05), причем, зрелые эритроциты (12,7±1,19%) были в практически равных количествах с полихроматофильными нормобластами (12,4±1,06%) и оксифильными нормобластами (14,8±2,04%). В мальковый период у лейкоцитов наблюдалось созревание гранулоцитов (P<0,001), так, в составе кроветворных островков в небольшом количестве встречались нейтрофильные миелоциты (2,1±0,47%) и эозинофильные миелоциты (1,6±0,82%). Среди агранулоцитов (P<0,001) увеличилась доля зрелых лимфоцитов (16,0±2,47%). На втором этапе малькового периода развития в возрасте 52 дней в строении жабр, качественном составе и топографии кроветворных очагов значительных изменений не выявлено. На основании вышеперечисленного, к концу малькового периода произошло перераспределение развивающихся форменных элементов крови: стал доминировать лейкоцитопоэз. Глава 7. Морфофункциональные особенности кроветворения в селезенке белорыбицы Процессы гемопоэза в селезенке активно начали происходить в возрасте 20 дней активного питания. Строму органа образовывали ретикулярные клетки и родоначальные клетки крови. В строении селезенки обращало на себя внимание отсутствие разделения стромы органа на белую и красную пульпу. Из родоначальных клеток крови были обнаружены в достаточно большом количестве гемогистобласты – 40,1±3,72%, тогда как гемоцитобластов оказалось меньше – 16,4±2,03%. Следует отметить, что среди бластных клеток крови превалировали эритробласты – 19,8±0,74%, лимфобласты составили 8,7±0,68%, незначительную долю составили монобласты и миелобласты 2,1±0,45% и 3,4±0,71% – соответственно. Удельный вес клеток созревающего класса был незначителен и представлен, в основном, формирующимися клетками эритропоэтического ряда: пронормобласты составили 1,7±0,36%, базофильных нормобластов было чуть больше – 2,9±0,65%, полиоксифильных нормобластов – 3,1±0,47%. Скорость развития лейкоцитов была крайне мала, так встречались исключительно пролимфоциты (1,8±0,89%). В течение личиночного периода развития у белорыбицы отмечается активное формирование стромы селезенки, в которой уже происходят эритропоэз, агранулоцитопоэз и гранулоцитопоэз (рисунок 7). На I этапе малькового периода развития белорыбицы в составе развивающихся клеток крови произошли следующие возрастные изменения: так, удельный вес родоначальных и унипотентных клеток-предшественниц уменьшился и составил 14,4±1,52% и 7,9±2,14% – соответственно. В классе бластных клеток стали доминировать миелобласты, которые составили 7,4±0,56%; количество лимфобластов и эритробластов снизилось до 6,7±1,17% и 5,7±0,63% – соответственно. 14 4 2 3 1 5 Рис.7. Селезенка белорыбицы в возрасте 20 дней. Гематоксилин эозин. Ув. 1000. 1. Гемоцитобласт, 2. Эритробласт, 3. Лимфобласт, 4. Лимфоцит, 5. Пролимфоцит. Монобласты (P<0,001) встречались в незначительном количестве – 1,9±0,37%. В составе V класса созревающих клеток клетки миелоцитопоэтического и эритроцитопоэтического ряда составили практически равные доли по 23,7±1,04% и 19,7±0,56% – соответственно (рисунок 8). Рис. 8. Качественный состав клеток крови в селезенке мальков белорыбицы (%) Причем, среди клеток эритропоэтического ряда (P<0,001) заметно снизилась доля пронормобластов (1,1±0,57%) и нормобластов базофильных (2,1±0,77%), превалировали более зрелые формы – полиоксифильные нормобласты (8,9±1,14%) и оксифильные нормобласты (7,6±0,51%). В составе миелоцитопоэтического ряда (P<0,05) продолжилось развитие эозинофилов, были отмечены палочкоядерные эозинофилы (5,3±0,94%), притом, что процент эозинофильных миелоцитов и эозинофильных метамиелоцитов оставался значительным – 6,9±1,13% и 7,8±0,42% – соответственно. Продолжилось и созревание нейтрофилов, так, были отмечены нейтрофильные метамиелоциты в количестве 1,1±0,32%, притом, что доля 15 нейтрофильных миелоцитов осталась практически неизменной – 2,6±0,51%. Из класса зрелых клеток встречались лимфоциты (5,9±1,22%) (P<0,001) и эритроциты (6,7±0,79%). В возрасте 52 суток (II этап малькового периода развития) строение селезенки, качественный состав развивающихся клеток крови остались практически неизменными. Таким образом, к концу малькового периода развития формирование селезенки не завершилось. Происходит активное развитие стромы органа, формируется белая и красная пульпа, происходит территориальное разделение мест развития форменных элементов крови, развитие которых осталось еще не законченным. Глава 8. Развитие форменных элементов крови в периферическом русле белорыбицы На I этапе подпериода свободного эмбриона в эмбриональном периоде развития в периферической крови предличинок имелось небольшое количество унипотентных клеток-предшественниц – 4,6±0,62%. Основу эритрограммы составляли пронормобласты – 38,2±3,04%, четверть составляли эритробласты – 22,9±0,24%. Доля базофильных нормобластов и полиоксифильных нормобластов была практически одинаковой 19,3±2,41% и 19,6±0,52% – соответственно. Среди развивающихся лейкоцитов 75,4±3,22% были лимфобласты, миелобласты составили 15,3±1,74%; доля монобластов была небольшой – 9,3±0,52%. Считаем, что клетки эритропоэза на данном этапе и стадиях развития выполняли транспортную функцию. К концу подпериода свободного эмбриона эмбрионального периода развития в эритрограмме предличинок произошли следующие изменения. Численность эритробластов (15,5±0,23%), пронормобластов (18,3±2,87%), базофильных нормобластов (23,8±3,03%) и полиоксифильных нормобластов (33,6±2,04%) практически не изменилась. В составе лейкограммы значительных изменений также не произошло. Однако, обращает на себя внимание то, что в периферическом русле отмечено 9,6±0,14% пролимфоцитов. По-прежнему основу численности лейкоцитов составляли лимфобласты – 64,4±3,22%. Доля миелобластов и монобластов, по сравнению с предыдущим этапом, не изменилась, была равной 17,2±1,02% и 8,8±0,41% – соответственно. На I этапе личиночного периода развития завершено формирование эритропоэтического и лимфоцитопоэтического рядов. В периферическом русле отмечены дефинитивные лимфоциты (35,0±3,16%) и эритроциты (3,7±1,45%). Обращает на себя внимание то, что в периферической крови более не встречались унипотентные клетки-предшественницы – гемоцитобласты. Именно с этого возраста (20 суток) продолжилось развитие гранулоцитов – в кровяном русле в небольшом количестве находились эозинофильные миелоциты (0,8±0,44%). Из моноцитопоэтического ряда имелись только бластные формы. К IV этапу личиночного развития (возраст 45 суток) у личинок белорыбицы в периферическом русле продолжилось созревание гранулоцитов (P<0,001). Удельный вес миелобластов снизился до 5,0±1,06%, причем доля созревающих клеток возросла: нейтрофильных миелоцитов было уже 2,3±0,74%, нейтрофильных метамиелоцитов – 2,1±1,23%, эозинофильних миелоцитов – 12,1±1,01%, эозинофильных метамиелоцитов стало 1,3±0,14%. Более половины лейкоцитов 16 (P<0,001) были представлены развивающимися лимфоцитами (54,0±3,57%). Из моноцитопоэтического ряда (P<0,001) имелись только бластные формы. В эритрограмме (P<0,001) доля эритробластов сократилась и стала равна 6,3±1,74%. Доля созревающих клеток продолжает сокращаться: пронормобластов стало 12,4±0,98%, базофильных нормобластов – 16,0±2,51%, удельный вес полиоксифильных нормобластов был равен 16,8±1,62%, процент оксифильных нормобластов составил – 21,7±0,74%. Дефинитивные эритроциты составили 26,8±1,03%. На I этапе малькового периода развития белорыбицы в периферической крови наблюдалось активное созревание гранулоцитов. Лейкограмма 49 дневных мальков была следующей: процент бластных клеток оставался еще на довольно высоком уровне, в сумме составлял 10,6±2,31%, причем доминировали лимфобласты – 5,5±1,04%, несколько им уступали миелобласты – 3,5±0,77%, в незначительном количестве были монобласты (P<0,001) – 1,6±0,54%. Среди развивающихся гранулоцитов (P<0,05) скорость формирования эозинофилов была выше, чем нейтрофилов. Так, в периферической крови эозинофильные миелоциты составили – 6,8±1,21%, эозинофильные метамиелоциты – 5,3±0,95%, эозинофилы палочкоядерные – 2,4±0,31%. Тогда как нейтрофилы были отмечены только на стадиях миелоцита – 4,6±1,02% и метамиелоцита – 2,0±0,67%. Агранулоциты (P<0,001) составили более половины из всех лейкоцитов: пролимфоцитов было – 9,0±1,22% и зрелых лимфоцитов – 59,9±3,66%. Эритрограмма (P<0,001) имела следующие черты: доля эритробластов была низкой – 3,6±1,07%, в основном клетки эритропоэза были представлены зрелыми эритроцитами (49,0±2,07%). Доля созревающих клеток оставалась значительной, по сравнению с личиночным периодом развития, количество пронормобластов и базофильных нормобластов снизилось в два раза, было равным – 6,1±1,08% и 8,1±0,87% – соответственно. Количество полиоксифильных нормобластов и оксифильных не изменилось, и было равно 10,7±0,99% и 22,5±2,35% – соответственно. Качественный состав клеток крови мальков на II этапе развития значительно не отличался. Таким образом, в мальковый период развития форменные элементы периферической крови продолжают свое развитие. Заключение Мезонефрос. Исследование показало, что для белорыбицы характерен мезонефральный тип кроветворения, так как сразу после вылупления и до конца эмбрионального периода развития в подпериод свободного эмбриона в гемопоэзе участвовал только мезонефрос. Отличительной видовой особенностью является также то, что в формирующемся мезонефросе уже в возрасте 1 суток в составе кроветворной ткани происходила дифференцировка клеток эритропоэтического ряда. Пронефрос у осетровых рыб был сформирован в личиночном периоде развития, тогда как у белорыбицы только в мальковом (Лепилина И.Н., 2004; Боброва Л.П., Кузнецов С.Л., Сапрыкин В.П., 2003). Причем, именно в головной почке наблюдалось превалирование гемогистобластов и унипотентных клетокпредшественниц. У предличинок, личинок и мальков белорыбицы выявлены неспецифические изменения в структурных единицах почки, на которые и ранее указывали многие авторы (Боброва Л.П., 2003). По-видимому, эти изменения 17 связаны с низкой устойчивостью белорыбицы в раннем онтогенезе к неблагоприятным факторам среды условий содержания. Гемопоэтические скопления в слизистой оболочке органов пищеварения у лососевых начинают функционировать в личиночном периоде развития и к мальковому периоду оказываются полностью сформированными, причем в этих скоплениях основная доля развивающихся клеток принадлежит лейкоцитам. Кроветворные островки в слизистой оболочке пищеварительной системы были небольших размеров и встречались совсем редко. Следует отметить, что если в личиночном периоде развития в кроветворных образованиях основную массу развивающиеся клеток составляли эритроциты, то к концу малькового периода доля эритропоэтических клеток резко снизилась, и доминировали формирующиеся лейкоциты. Результаты исследования развития кроветворной функции тимуса белорыбицы установили начало его функционирования в конце личиночного периода развития, на III этапе в возрасте 38 суток. В этом органе происходил только лимфоцитопоэз. По литературным данным, тимус в раннем онтогенезе у осетровых не являлся чисто лимфоидным, в составе кроветворной ткани, помимо клеток лимфоцитопоэтического ряда, имелись молодые гранулоциты. Жабры. К концу эмбрионального периода развития (в подпериоде свободного эмбриона) белорыбицы кроветворные островки в жабрах были отмечены только в основании жаберных филаментов, тогда как, например, у осетровых рыб, жабры принимают участие в кроветворении только в личиночном периоде развития и островки гемопоэза у них встречались как в основании жаберных филаментов, так и в основании ламелл (Ложниченко О.В., 2007). В результате исследования установлено, что селезенка белорыбицы начинает участвовать в гемопоэзе в личиночном периоде. Видоспецифично для белорыбицы то, что в селезенке в раннем онтогенезе среди формирующихся клеток крови имеются родоначальные и унипотентные клетки-предшественницы, происходила пролиферация всех клеточных рядов, но доминировали клетки эритропоэза (первичные эритроциты). К возрасту 52 суток в селезенке не было четкого деления стромы на белую и красную пульпы. На основании полученных на сегодня данных по белорыбице можно утверждать, что период дефинитивного кроветворения к концу малькового периода развития еще полностью не наступил: не все кроветворные органы закончили свое развитие, и не все клеточные ряды сформированы. Анализ развития клеток крови выявил видовые и возрастные особенности: раньше всего происходит развитие клеток эритропоэтического ряда. Возможно, это связано с основными функциями эритроцитов – газообменом, хотя на стадиях раннего онтогенеза эритроциты выполняют и транспортную функцию. Развитие лейкоцитов значительно отстает от эритроцитов. Так, дефинитивные гранулоциты появляются к концу малькового периода развития, на основании чего можно предположить, что в эмбриональном и личиночном периоде белорыбица обладает низкой резистентностью, по сравнению с мальками, что и подтверждается значительным процентом отхода предличинок и личинок белорыбицы на критических этапах развития. Формирование клеточного фактора иммунитета происходит в более позднем возрасте – в мальковом периоде развития. 18 Выводы 1. Мезонефрос начинает развиваться сразу после выклева (1 сутки) – происходит формирование мезонефронов. Начиная с 20 суток развития постепенно увеличиваются (в 2-3 раза) в размерах все структурные компоненты мезонефронов. 2. Дифференцировка тимуса началась на III этапе личиночного периода развития (38 суток), хотя деления органа на корковое и мозговое вещество не произошло. К концу малькового периода развития (52 сутки) белорыбицы активно происходит процесс развития стромы тимуса, формируются будущие дольки, обособляется и увеличивается объем мозгового вещества. 3. В селезенке кроветворение начинается в возрасте 20 дней активного питания (I этап личиночного периода развития). К концу малькового периода развития активно происходит развитие стромы органа, формируется белая и красная пульпа. 4. Гемопоэтическая функция в кроветворных органах белорыбицы формируется на разных этапах развития: в кровеносных сосудах и мезонефросе – с I этапа эмбрионального периода развития (1 сутки), жаберном аппарате – со II этапа эмбрионального периода развития (5 суток), в селезенке – с I этапа личиночного периода развития (20 суток), в тимусе – с III этапа личиночного периода развития (38 суток), в органах желудочно-кишечного тракта – с IV этапа личиночного периода (45 суток). 5. Установлено, что гемогистобласты и гемоцитобласты имеют определенную органную локализацию – мезонефрос и селезенка. Вследствие миграции этих клеток из селезенки и мезонефроса в кровяное русло с возрастом наблюдалось понижение их количества: в селезенке с 56,5% (20 суток) до 21,3% (52 сутки); в мезонефросе с 15,8% (1 сутки) до 4,3% (52 сутки). 6. Первые клетки эритропоэтического, лимфоцитопоэтического, моноцитопоэтического и миелоцитопоэтического рядов встречаются в мезонефросе на I этапе эмбрионального периода развития (1 сутки), в жаберном аппарате – на II этапе эмбрионального периода развития (5 суток), в селезенке – на I этапе личиночного периода развития (20 суток), в кроветворных островках, расположенных в слизистой оболочке желудочно-кишечном тракта – на IV этапе личиночного периода (45 суток). В тимусе клетки лимфоцитопоэтического ряда начинают встречаться на III этапе личиночного периода развития (возраст 38 суток). 7. В мезонефросе и селезенке с начала функционирования кроветворения доминируют клетки эритропоэтического ряда – 53,3 и 29,3% – соответственно, с 2738 суток их количество начинает снижаться и в мальковом периоде превалируют развивающиеся лейкоциты: в мезонефросе – 57,8%, в селезенке – 47,3%. В тимусе белорыбицы в раннем онтогенезе происходит пролиферация только лимфоцитов. В кроветворных островках, расположенных в глотке и в жабрах, в течение всех этапов развития основу составляют клетки эритропоэтического ряда (максимальное количество их в глотке на 45 сутки – 67,9%; в жабрах – на 20 сутки 56,9%), к концу малькового периода (52 сутки) составляет 52,7% в глотке и 53,7% в жабрах. В кровяных островках остальных органов желудочно-кишечного тракта наблюдается значительное преобладание лейкоцитов: в гемопоэтических островках желудка до 82,1%, в средней кишке – до 92,7%, в спиральном клапане – до 81,7%. 8. Установлена гетерохронность в развитии форменных элементов периферической крови белорыбицы. Первыми заканчивают свое развитие клетки 19 эритроцитопоэтического ряда (I этап личиночного периода развития), позже созревают клетки лимфоцитопоэтического ряда (II этап личиночного периода развития). К концу малькового периода развития созревание моноцитопоэтического и гранулоцитопоэтического рядов осталось не завершенным. Практические рекомендации Результаты качественного и количественного анализа показателей форменных элементов крови возможно использовать для сравнительной оценки при проведении комплексных мониторинговых исследований физиологического состояния предличинок, личинок и молоди белорыбицы. Данные лейкограммы и эритрограммы могут быть использованы в рыбоводной практике для оценки качества выращиваемой молоди. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Кучкова, А.В. Морфофункциональные особенности полустволовых гемопоэтических клеток мальков белорыбицы / А.В. Кучкова, О.В. Ложниченко // Актуальные проблемы экологии и сохранения биоразнообразия: сборник статей Всероссийской научной конференции. – Владикавказ: ИПО СОИГСИ. – 2009 – С. 134-137. 2. Кучкова, А.В. Особенности развития клеток крови в мезонефросе мальков белорыбицы / А.В. Кучкова, О.В. Ложниченко // Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия рыбное хозяйство. – 2009. – №1. – С. 134-137. 3. Кучкова, А.В. Особенности развития полустволовых клеток крови в мезонефросе некоторых видов рыб в мальковом периоде / А.В. Кучкова, Р.Р. Шумеева, О.В. Ложниченко // Экологические проблемы и социально-экономические аспекты обустройства и развития аридных территорий Российской Федерации: материалы докладов Международной научно-практической конференции. – М.: Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2009. – С. 162-166. 4. Амплеева, А.В. Анализ гистологического строения мезонефроса мальков белорыбицы / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Актуальные проблемы экологии: материалы IV Всероссийской научной конференции. – Владикавказ: СОГУ. – 2010. – С. 148-152. 5. Кучкова, А.В. Особенности строения мезонефроса и жабр некоторых видов рыб в современных экологических условиях Волго-Каспийского бассейна / А.В. Кучкова, С.В. Хвостова, О.В. Ложниченко // Социально-экономические и природоохранные аспекты развития сельских муниципальных образований: сборник Международной научно-практической конференции. – М.: Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2010. – С. 235-238. 6. Амплеева, А.В. Гистологические особенности строения мезонефроса и жабр некоторых видов рыб в современных экологических условиях Волго-Каспийского бассейна / А.В. Амплеева, С.В. Хвостова, О.В. Ложниченко // Современные наукоемкие технологии: сборник Международной научной конференции. – М.: Академия Естествознания. – 2010. – №11. – С. 84-87. 7. Амплеева, А.В. Структурно-функциональные особенности мезонефроса в личиночный период развития белорыбицы / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Морфология 21 столетия: материалы Международной научной конференции. – Киев: Таймс. – 2010. – С. 164-171. 20 8. Амплеева, А.В. Физиологические аспекты кроветворения в мезонефросе у осетровых рыб / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко, С.В. Хвостова // Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия рыбное хозяйство. – 2010. – №2. – С. 106-111. 9. Амплеева, А.В. Патологические изменения почек и жабр белорыбицы ВолгоКаспийского бассейна / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия рыбное хозяйство. – 2010. – №2. – С. 116-118. 10. *Амплеева, А.В. Участие печени рыб в гемопоэзе / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Морфология. – 2011. – №5. – С. 33-34. 11. Амплеева, А.В. Морфофункциональные особенности мезонефроса молоди рыб / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Научное творчество XXI века: сборник статей по итогам V Международной научно-практической конференции. – Красноярск: Научно-инновационный центр. – 2012. – Т.3. – С. 393-396. 12. *Амплеева, А.В. Кроветворение у белорыбицы / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Морфология. – 2012. – №3. – С. 12-13. 13. *Амплеева, А.В. Морфофункциональные особенности кроветворных органов и клеток крови у сеголеток белорыбицы / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия рыбное хозяйство. – 2012. – №2. – С. 125-130. 14. Амплеева, А.В. Морфофункциональные особенности строения жабр белорыбицы в личиночном периоде развития в условиях искусственного воспроизводства / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Актуальные вопросы природопользования в аридной зоне Северо-Западного Прикаспия: материалы I Международной научно-практической конференции молодых ученых. – М.: Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2012. – С. 207-209. 15. Амплеева, А.В. К вопросу о влиянии экологических проблем ВолгоКаспийского бассейна на состояние популяции белорыбицы / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Актуальные вопросы природопользования в аридной зоне СевероЗападного Прикаспия: материалы I Международной научно-практической конференции молодых ученых. – М.: Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2012. – С. 210-212. 16. Амплеева, А.В. Дифференцировка гемопоэтических полустволовых клеток молоди белорыбицы / А.В. Амплеева, О.В. Ложниченко // Человек и животные: материалы IV Международной заочной конференции, посвященной 80-летию Астраханского государственного университета. – Астрахань: Астраханский университет. – 2012. – С. 78-81. Примечание: * отмечены работы, опубликованные в сборниках, рекомендуемых ВАК. _________________________________________________________ Подписано в печать _______ г. Тираж 100 экз. Заказ № ---Типография ФГБОУ ВПО «АГТУ», тел. 614-523 г. Астрахань, Татищева,16ж
