Начало формы УДК 636: 611-013.7: 57.086.13 ТОЙШИБЕКОВ Е

УДК 636: 611-013.7: 57.086.13
ТОЙШИБЕКОВ Е.М.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА НА МОРФОЛОГИЮ И
ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ ЗАМОРОЖЕННО-ОТТАЯННЫХ ЭМБРИОНОВ ОВЕЦ
(ЗАО Институт экспериментальной биологии им. Ф.Мухамедгалиева)
Применялась методика криоконсервации эмбрионов овец с применением в качестве
криопротектора диметилсульфоксида. Изучено влияние ДМСО на морфологию и
приживляемость заморожено-оттаянных эмбрионов овец. Полученные данные помогут
расширить научные знания о влиянии ДМСО на морфо-функциональное состояние и
жизнеспособность заморожено-оттаянных эмбрионов овец. Эти исследования помогут в
дальнейшем решить проблему сохранения ценных и исчезающих пород овец Казахстана.
Криоконсервация эмбрионов является одним из методов сохранения биоразнообразия животных, так как влияние различных факторов привело к исчезновению как диких видов, так
сельскохозяйственных пород животных [1]. Данная проблема является актуальной не только
на территории Казахстана, но и во всем мире [2]. Для успешной криоконсервации необходимо изучить влияние пенетрирующих криопроекторов на морфологию и приживляемость эмбрионов. Изучение морфологии замороженно-оттаянных эмбрионов необходимо, так как замороженно-оттаянные эмбрионы, имеющие различные повреждения не способны к дальнейшему развитию и имплантации. Таким образом, морфология эмбрионов имеет прямое влияние на приживляемость эмбрионов. Научной основой применения пенетрирующих
криопротекторов является их способность проникать внутрь эмбриона и защищать их от
повреждающих факторов криоконсервации. К пенетрирующим криопротекторам относятся
диметил-сульфоксид (ДМСО), глицерин, этиленгликоль и др. Целью настоящей работы было
изучить влияние ДМСО на морфологию и приживляемость эмбрионов овец.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Индукция суперовуляции и извлечение эмбрионов овец. В исследованиях использовали 2,5
годовалых маток казахской полутонкорунной породы овец с кроссбредной шерстью в
количестве 7 голов. Суперовуляцию индуцировали инъекциями гонадотропного гормона
Folligon (Intervet International, Netherland) в на 12 день эстрального цикла в дозе 1200 ИЕ.
Затем вводили через 48 часов 125 мг эстрофана (Чехия) и в день оплодотворения вводили
1000 ИЕ хорионического гонадотропина (ХГч, Россия). Эмбрионы извлекали методом
хирургической лапаротомии на 5-7 сутки после оплодотворения [3].
Морфологичекая оценка эмбрионов. Морфологическую оценку эмбрионов проводили по
общепринятой методике с использованием фазово-контрастный микроскоп Axiostarplus с
объективами Achrostigmat LD 20x и 40x (Zeiss, Germany) и фазово-контрастный микроскоп
Nikon Alphaphot 2 YS2 с цифровым фотоаппаратом Nikon Coolpix 4500 с разрешающей
способностью 4 Mега пкс [4].
Криоконсервация и оттаивание эмбрионов. Криоконсервацию эмбрионов проводили с
использованием диметилсульфоксида (DMSO, Sigma, USA) [5]. Растворы криопроектора были
приготовлены на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко (DPBS, Sigma, USA) в различных
концентрациях: 1) 0,25 М ДМСО, эмбрионы эквилибрировали в течение 5 мин.; 2) 0,5 М ДМСО
(5 мин.); 3) 1,0 М ДМСО (10 мин.); 4) 1,5 М ДМСО (20 мин.). Для криоконсер-вации
использовали переносной программируемый замораживатель DB1 EmbryoFreeze (Biotronics
ltd, UK). Замораживание эмбрионов с криопротектором, помещенных в соломинки, проводили
по следующему температурному режиму охлаждения (Рис. 1).
Рисунок 1. График температурного режима замораживания.
1. Стабилизация температуры соломинок с эмбрионами в криопротекторе +200С, которая
длится 5 мин;
2. Охлаждение соломинок с эмбрионами в криопротекторе до температуры –70С со
скоростью охлаждения 50С/мин.
3. Точка кристаллизации достигается, когда соломинки охладятся до температуры –70С, происходит касание рамки замораживателя тех областей соломинок, где расположены
эмбрионы.
4. Замораживание соломинок до температуры –300С при скорости охлаждения 0,30С/мин.
5. Замораживание соломинок до температуры –1500С, происходило при скорости охлаждения
350С/мин, после чего соломинки с замороженными эмбрионами переносятся в жидкий азот и
хранятся в сосудах Дьюара до размораживания.
Эмбрионы оттаивали на водяной бане от – 196оС до 20оС со скоростью 12оС/мин. Раствор
криопротектора (ДМСО) удаляли в шесть этапов: вначале эмбрионы выдерживали 10 мин. В
1,5 М растворе ДМСО, а затем проводили эмбрионы по растворам с более низкими
концентрациями 1,0М; 0,75М; 0,5М и 0,25М. Отмытые эмбрионы суспендировали 20 мин. в
фосфатно-солевом буфере Дюльбекко при комнатной температуре.
Затем эмбрионы были поделены на две группы:
1–я группа эмбрионов была подвергнута криоконсервации с применением в качестве
криопроектора ДМСО, после оттаивания эти эмбрионы были оцене-ны по морфологическим
признакам и кратковременно культивированы in vivo до 12 часов в организмах двух
промежуточных реципиентов (маток той же породы, что и матки доноры, синхронные по
эстральному циклу). После кратковременного культивирования была проведена
морфологическая оценка замороженно-оттаянных культивированных эмбрионов и эмбрионы,
признанные годными были трансплантированы реципиентам [6];
2-я группа эмбрионов также была подвергнута криоконсервации с применением в качестве
криопроектора ДМСО, после оттаивания эти эмбрионы были оценены по морфологическим
признакам и трансплантированы реципиентам.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Индукция суперовуляции и извлечение эмбрионов овец. В ходе эксперимента были получены
следующие данные: у 7 подопытных маток-доноров была индуцирована суперовуляторная
реакция, в результате которой путем хирургической лапаратомии было извлечено 63
зародыша на различных стадиях развития (Табл. 1).
Таблица 1.Влияние гонадотропинов на количество и качество эмбрионов (Folligon (Intervet
Из общего количества вымытых зародышей, были признаны пригодными для криоконсервации и дальнейшей трансплантации 42 эмбриона, находящихся на стадии развития – морула, что составило 66,6% от общего количества вымытых зародышей. Затем, эмбрионы были
поде-лены на две группы, 1-я группа эмбрионов составила 22 эмбриона, 2-я группа 20
эмбрионов.
Криоконсервация и оттаивание эмбрионов. Криоконсервацию обеих групп эмбрионов
проводили по вышеописанной методике. В результате замораживания-оттаивания были
получены следующие результаты. В 1-ой группе были заморожены 22 эмбриона, после
оттаивания (через 10-15 суток после замораживания) и морфологической оценки были
признаны годными для дальнейшего кратковременного культивирования in vivo 14 эмбрионов,
что составило 63,6% от общего количества замороженных эмбрионов в 1-ой группе, потери
составили 8 эмбрионов (36,4%). Во 2-ой группе из 20 эмбрионов были признаны годными 13
эмбрионов (65%) и признаны непригодными для дальнейшей трансплантации 7 эмбрионов
(35%) (Табл.2).
Таблица 2. Морфологическая оценка количества и качества замороженно-оттаянных
эмбрионов из различных групп
Эти показатели достаточно близки и позволяют сделать заключение о том, что применение
1,5М ДМСО в качестве криопротектора, примененный температурный режим охлаждения и
оттаивания, а также удаления ДМСО из эмбрионов позволили получить достаточно высокий
выход жизнеспособных эмбрионов для трансплантации.
Тринадцать эмбрионов 2-ой группы, признанные годными были трансплантированы по
одному реципиентам, для изучения приживляемости.
Четырнадцать эмбрионов 1-ой группы, признанные пригодными для дальнейшей трансплантации, были кратковременно культивированы in vivo, до 12 часов в промежуточных
реципиентах. Промежуточные реципиенты в количестве 2 овцематок были той же породы, что
и овцематки-доноры эмбрионов. Реципиенты были подобраны по соответствию их половых
циклов срокам развития эмбрионов. Эмбрионы подсаживали хирургическим путем в рога
матки со стороны овуляции. Таким образом, гормональный фон рога матки соответ-ствовал
стадии развития эмбриона и создавал наиболее благоприятные условия для дальней-шего
развития и имплантации эмбрионов. Затем эмбрионы были извлечены, и нами была
проведена морфологическая оценка замороженно-оттаянных культивированных эмбрионов.
В результате этих исследований нами было выявлено, что из 14 эмбрионов, подвергшихся
кратковременному культивированию, были признаны годными для дальнейшей трансплантации 9 эмбрионов, что составило 40,1% от общего количества замороженных 22 эмбрионов 1ой группы. Также нами были признаны непригодными 5 эмбрионов (22,7%) от общего количества замороженных 22 эмбрионов. Девять эмбрионов были трансплантированы реципиентам.
Исходя из изложенного, нами были проведены исследования, позволившие уменьшить риски
по трансплантации замороженно-оттаянных эмбрионов, так как проведенные нами изучение
морфологии эмбрионов и кратковременное культивирование позволило избежать
трансплантации заведомо нежизнеспособных эмбрионов.
Изучение приживляемости замороженно-оттаянных эмбрионов. Приживляемость эмбрионов
из различных групп проводилось на основе проверки суягности овцематок-реципиентов по
наличию эструса в следующих половых циклах, т.е. отсутствие эструса в следующих половых
циклах свидетельствовало о суягности овцематок-реципиентов и имплантации
трансплантированных эмбрионов.
Из общего количества реципиентов, которым были трансплантированы замороженнооттаянные культивированные эмбрионы 1-ой группы, у 8 голов реципиентов не было
выявлено стадии эструса в следующих двух половых циклах, что свидетельствует о
нормальной суягности и имплантации трансплантированных эмбрионов, а во 2-ой группе - у 6
голов. Таким образом, был выявлен процент приживляемости, на основе проверки суягности
по группам: 1-я группа – 36,4% от общего количества 22 замороженных эмбрионов, 2-я группа
– 30,0% от общего количества замороженных 20 эмбрионов (Табл. 3).
Таблица 3. Изучение приживляемости замороженно-оттаянных
эмбрионов
Таким образом, исходя из проведенных исследований, нами была выявлена закономер-ность,
которая заключается в том, что кратковременное культивирование in vivo заморожен-нооттаянных эмбрионов позволяет увеличить приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов при их дальнейшей трансплантации за счет отсева нежизнеспособных эмбрионов. А
также появилась необходимость разработки и совершенствования методов культивирования
эмбрионов in vivo и in vitro для использования в исследованиях по криоконсервации
эмбрионов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Morand-Fehr P., Boyazoglu J. Present state and future outlook of the small ruminant sector //
Small Ruminant Research. 1999. V.34. P.175-188.
2. Solti L., Crichton E.G., Loskutoff N.M., Cseh S. Economical and ecological importance on
indigenous livestock and the application of assisted reproduction to their preservation //
heriogenology 2000. V.53. P.149-162.
3. МухамедгалиевФ.М., ТойшибековМ.М. и др. Трансплантация эмбрионов в племенном
овцеводстве. Алматы, Изд-во «Наука». 1981. 169с.
4. ТойшибековМ.М., Даминов Б. Трансплантация эмбрионов каракульских овец. // В кн.
Генетика и биотехнология животных. Алматы. 1998. C.19-23.
5. Kaidi S., Donnay I., Lambert P. Osmotic behavior of in vitro produced bovine blastocysts in
cryoprotectant solutions predictive test of survival // Cryobiology. 2000. V.41. P.106-115.
6. ДаминовБ. Повышение приживляемости ранних эмбрионов овец при трансплантации путем
отбора их жизнеспособности методом культивирования // Извест.АН КазССР, сер. биол. 1990.
№2. С.81-87.
***
Автор диметилсульфоксид криопротекторын пайдалана отырып, ºой эмбриондарын
криоконсер-вация т¸сілін пайдаланды. М½здатылып ерітілген ºой эмбриондарыны» ¼сіп
¼німділік ж¸не морфо-логиялыº ºалыптасты¹ына диметилсульфоксидті» тигізетін ¸серлері
зерттелді. ²азаºстанда¹ы ба¹алы ºой т½ºымдарын жоймай, оларды саºтап ºалуда¹ы ¹ылыми
зерттеулерді ке»ейте т¾седі.
***
The author applied a technique of sheep embryos cryopreservation with application
dymethilsulphxide. Influence DMSO on morphology is investigated and development frozen-thawed
sheep embryos. The received data will help to expand scientific knowledge of influence DMSO on
the morphological condition and viability frozen -thawed sheep embryos. These researches will help
with further to solve a problem of preservation of valuable and disappearing sheep breeds of the
Kazakhstan.