1 На правах рукописи Кирьякова Виктория Олеговна
advertisement
На правах рукописи Кирьякова Виктория Олеговна ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА URTICA, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ АЛТАЙСКОГО КРАЯ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2013 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Барнаул) Научный руководитель: Федосеева Людмила Михайловна, доктор фармацевтических наук, профессор Официальные оппоненты: Белоногова Валентина Дмитриевна, доктор фармацевтических наук, профессор, Пермская государственная фармацевтическая академия, заведующая кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники Бубенчикова Валентина Николаевна, доктор фармацевтических наук, профессор, Курский государственный медицинский университет, заведующая кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники Ведущая организация: Пятигорский филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Волгоградского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится «24» сентября 2013 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2. Тел./факс (342) 233-55-01. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России (614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46). Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «___» 2013 г. и на сайте ПГФА http://www.pfa.ru «___» 2013 г. Автореферат разослан « » 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.068.01 кандидат фармацевтических наук, доцент Н.В. Слепова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение флоры Алтая является традиционным направлением научной работы профильных кафедр фармацевтического факультета Алтайского государственного медицинского университета. Всесторонние исследования дают возможность расширить номенклатуру растений, используемых в качестве лекарственного сырья и способствуют экологически бережному подходу к заготовке и эффективному, рациональному, комплексному использованию лекарственных растений. В официнальной медицине России из растений рода Urtica применяются крапивы двудомной листья в виде настоя и экстракта жидкого как кровоостанавливающее средство при различных кровотечениях (маточных, легочных, почечных, кишечных, геморроидальных), как витаминное, противовоспалительное средство (Государственный реестр лекарственных средств, 2009). В народной медицине наряду с крапивой двудомной широко применяются крапива коноплевая (Urtica cannabina L.) и жгучая (Urtica urens L.), семейство крапивные (Urticaceae). Из данных литературы известно, что отвар корней и сок крапивы жгучей травы рекомендуют при кровотечениях, простуде, туберкулезе легких. Отвар корней и настой листьев используют при нарушениях пищеварения, добавляют в ванны при язвах, ранах, ушибах, опрелостях и отеках, а также как раздражающее и отвлекающее средство для лечения радикулита и различных заболеваний суставов (Телятьев В.В., 1995). Настой, экстракт жидкий, порошок и сок крапивы коноплёвой листьев применяют при острых и хронических энтероколитах, при кишечных, маточных кровотечениях и в качестве поливитаминного и мочегонного средства (Артемова А.А., 2001). Несмотря на разнообразие целебных свойств, крапива коноплевая и жгучая не нашли применения в научной медицине в силу недостаточной изученности. Следует отметить, что сырьевые запасы достаточны для заготовки и промышленной переработки лекарственного растительного сырья. Всестороннее изучение крапивы двудомной, коноплевой, жгучей полезно для расширения спектра фармакологических свойств и получения новых эффективных фитопрепаратов. В Алтайском крае в ЗАО «Эвалар» активно внедряются лекарственные препараты на основе лекарственных растений, произрастающих в нашем регионе. Возникла необходимость изучения трех видов крапивы, которые произрастают совместно, поэтому возможен сбор, как отдельных видов, так и смеси крапивы двудомной, коноплевой и жгучей травы. По разработанной сотрудниками кафедры фармацевтической химии АГМУ технологии получены экстракты травы крапивы сухие для изучения перспектив использования в качестве лекарственных препаратов. Экстрактам травы крапивы двудомной, коноплевой, жгучей сухим 4 присвоены условные названия «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун» соответственно. Цель и задачи исследования. Цель работы – фитохимическое изучение крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы, установление показателей качества, специфической активности и перспектив использования в качестве лекарственного растительного сырья, экстрактов – в качестве лекарственных препаратов. Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 1. Изучить фитохимический состав биологически активных соединений крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы и крапивы травы. 2. Модифицировать методики выделения, идентификации и количественного определения биологически активных соединений в растительном сырье и экстрактах (флавоноидов, фенолокислот, дубильных веществ, полисахаридов, органических кислот, аминокислот, липофильной фракции). 3. Провести анализ элементного состава, дать экологическую оценку крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы. 4. Изучить острую токсичность и специфическую активность экстрактов травы крапивы сухих. 5. Провести морфолого–анатомическое изучение крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы, выявить диагностические признаки. 6. Установить показатели доброкачественности крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы. Провести анализ сырья, собранного в разные сроки и из разных мест произрастания. 7. Разработать проекты ФСП «Крапивы трава Urtica herba цельная и измельченная «ангро», «Крапивы двудомной трава Urtica dioica L. цельная и измельченная «ангро», «Крапивы жгучей трава Urtica urens L. цельная и измельченная «ангро», «Крапивы коноплевой трава Urtica cannabina L. цельная и измельченная «ангро». Научная новизна. Проведено комплексное фармакогностическое и фармакологическое исследование крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы, произрастающих на территории Алтайского края. Изучен фитохимический состав крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы и экстрактов «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун». Установлено, что комплекс БАС включает флавоноиды, фенолокислоты, дубильные вещества, сапонины, полисахариды, органические кислоты и аскорбиновую кислоту, аминокислоты (аспарагин, метионин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, аланин, лейцин, цистеин), липофильные вещества (хлорофиллы, каротиноиды, витамины А, Е, К). Методами ТСХ, ВЭЖХ идентифицированы в лекарственном сырье флавоноиды: кемпферол, гиперозид, кверцитрин, робинин, шафтозид, флавоноид апигениновой структуры; производные фенолкарбоновых 5 кислот: дигидроксибензойная, кумаровая, метоксикумаровая, фенилпропановая, коричная; резорцин. Установлено, что составной частью дубильных веществ является танин. В экстрактах «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун» идентифицированы рутин, кверцитрин, шафтозид, робинин, флавоноид апигениновой структуры, кислота хлорогеновая. Установлено количественное содержание в крапивы двудомной, коноплевой, жгучей траве, крапивы траве и экстрактах: флавоноидов (в пересчете на кверцитрин), дубильных веществ, полисахаридов, аскорбиновой кислоты, органических кислот, аминокислот, хлорофиллов, каротиноидов, витамина К. Проведены исследования по определению острой токсичности, установлена мочегонная и противовоспалительная активность экстрактов. Установлены показатели подлинности и доброкачественности лекарственного растительного сырья. Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований показана возможность расширения ассортимента лекарственного растительного сырья за счет использования крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы и применения в качестве мочегонного и противовоспалительного средств. Разработаны проекты ФСП: «Крапивы трава Urtica herba цельная и измельченная «ангро», «Крапивы двудомной трава Urtica dioica L. цельная и измельченная «ангро», «Крапивы жгучей трава Urtica urens L. цельная и измельченная «ангро», «Крапивы коноплевой трава Urtica cannabina L. цельная и измельченная «ангро». Степень внедрения. Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований используются в учебном процессе кафедры фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии, кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Алтайского государственного медицинского университета; в учебном процессе кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Пермской государственной фармацевтической академии; на фармацевтическом предприятии ЗАО «Эвалар» для входного контроля растительного сырья в рамках разработки лекарственного препарата. Подготовлены к рассмотрению проекты ФСП: «Крапивы трава Urtica herba цельная и измельченная «ангро», «Крапивы двудомной трава Urtica dioica L. цельная и измельченная «ангро», «Крапивы жгучей трава Urtica urens L. цельная и измельченная «ангро», «Крапивы коноплевой трава Urtica cannabina L. цельная и измельченная «ангро». Акт внедрения в работу ЗАО «Эвалар» 08.04.2013 г. Апробация полученных результатов. Основные материалы диссертации апробированы и представлены на научно–практических конференциях «Актуальные проблемы фармации» (г. Барнаул, 2011, 2012); «Молодежь – Барнаулу» (г. Барнаул, 2010, 2011); «Молодые ученые и 6 студенты АГМУ» (г. Барнаул, 2011, 2012); на 76-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Молодежная наука и современность» (г. Курск, 2011); на II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири развитие отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств» (г. Новосибирск, 2011); на Всеукраинской научнопрактической конференции с международным участием «Актуальные вопросы строения новых лекарственных средств» (г. Харьков, 2012). Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК. Личное участие автора в получении результатов. Автор является основным исполнителем исследований, публикаций по теме диссертации и всех глав диссертации. При выполнении работы автор освоил и самостоятельно выполнил все методики исследования, провел обработку данных с использованием современных статистических методов. Связь задач исследований с проблемным планом. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России (номер государственной регистрации 01200600351) как фрагмент комплексной НИР фармацевтического факультета «Изучение природных ресурсов Алтая, пути их рационального использования и совершенствование лекарственного обеспечения населения» (научный руководитель комплексной НИР д-р мед. наук, профессор В.М. Брюханов). Тема утверждена на заседании научно-координационного совета ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Росздрава (протокол № 2 от 8. 10. 2010 г.). Основные положения, выносимые на защиту: – результаты фармакогностического, фитохимического исследования крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы; – результаты фитохимического и фармакологического исследования экстрактов «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун». Соответствие диссертации паспорту научной специальности: Научные положения диссертации соответствуют формулам специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3 и 6 паспорта «фармацевтическая химия, фармакогнозия». Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 253 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 таблицами, 62 рисунками, содержит приложение и список литературы, включающий 134 литературных источника, в том числе 31 зарубежный. Во введении обоснована актуальность темы, определены основные цели и задачи, показана научная новизна и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту. Первая глава содержит обзор отечественной и зарубежной литературы, 7 отражающий современное состояние исследований в области фитохимического изучения, фармакологических свойств и применения в медицинской практике растений рода Urtica. Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования. В третьей главе приведены результаты фитохимических исследований флавоноидов, фенолокислот, дубильных веществ, сапонинов, полисахаридов, органических кислот, аминокислот, липофильных веществ (хлорофиллов, каротиноидов, витаминов А, Е, К), методики стандартизации крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы по содержанию БАС, внесенные в проекты ФСП на данные виды сырья. В четвертой главе изложены результаты изучения острой токсичности и специфической активности экстрактов (мочегонной, противовоспалительной). В пятой главе приведены результаты морфологического, микроскопического анализа, установлены показатели подлинности и доброкачественности сырья, использованные для разработки проектов ФСП на сырье. В приложении представлены данные результатов изучения сроков годности сырья, проекты ФСП, основные документы, подтверждающие внедрение результатов диссертационной работы. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования В качестве объектов исследования использовали воздушно-сухое сырье (крапивы двудомной, коноплевой, жгучей трава, крапивы трава смесь равных частей крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы), экстракты cухие «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун». Растительное сырье заготавливали в различающихся по климатическим условиям и уровню техногенной нагрузки районах Алтайского края – в городе Барнауле, Калманском, Алтайском районах в период с 2010 по 2012 г.г. Экстракты сухие: «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун» получены по технологии разработанной ранее на кафедре фармацевтической химии АГМУ. В основу технологии положен метод ремацерации, с использованием в качестве экстрагента воды очищенной, для высушивания применяли распылительную сушку. Микроскопический анализ ЛРС проводили с помощью с микроскопов Биолам Р1 и Микромед, с увеличением окуляра 10х, объективов 4х, 10х, 40х, лупы (10х), стереомикроскопа МБС–9 (28х). Фотографирование объектов проводили фотоаппаратом «Canon». Снимки редактировали с помощью программы Adobe Photoshop CS 8.0. 8 Идентификацию основных групп биологически активных соединений осуществляли химическими реакциями, хроматографическими методами исследования: ТСХ («Sorbfil ПТСХ-П-В»), ВЭЖХ («Милихром–А–02»). Исследования проводили в сравнении со стандартными образцами (СО) флавоноидов: кемпферола, гиперозида, кверцетрина, робинина, шафтозида, рутина («SIGMA Aldrich», США) и производные фенолкарбоновых кислот: дигидроксибензойной, кумаровой, метоксикумаровой, фенилпропановой, коричной, хлорогеновой («SIGMA Aldrich», США). Количественное определение основных групп биологически активных соединений проводили титриметрическими и физико-химическими методами (ТСХ, ВЭЖХ, СФМ). Микроэлементный состав крапивы травы и содержание особо токсичных элементов оценивали методом атомно-абсорбционной спектроскопии (КВАНТ–АФА, С–115–М–1) и инверсионной вольтамперометрии. Изучение острой токсичности, мочегонного и противовоспалительного действия экстрактов сухих проводили на кафедре фармакологии Алтайского государственного медицинского университета. Острую токсичность определяли на белых мышах обоего пола путем однократного перорального введения водных растворов экстрактов в дозах 5000 мг/кг, 10000 мг/кг. Мочегонную активность экстрактов изучали на белых лабораторных крысах путем перорального введения водных растворов экстрактов в дозе 50 мг/кг при однократном и многодневном введении (четырнадцать дней). Оценивали основные показатели функции почек: объем суточного диуреза, экскрецию с мочой натрия, калия, креатинина. Противовоспалительную активность изучали на модели острого воспаления после двухнедельного применения экстрактов крапивы в виде водного раствора внутрь в дозе 50 мг/кг и 100 мг/кг. Острое экссудативное воспаление индуцировали субплантарным введением 0,1 мл раствора каррагенина 1%. Проведена статистическая обработка полученных результатов согласно ГФ XI: проверка выборок на однородность, расчет среднего значения выборки, стандартного отклонения среднего, граничного значения доверительного интервала среднего, относительной ошибки среднего результата. Использовали компьютерные программы: BIOSTAT, MS Excel. Фитохимическое исследование крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы и экстрактов Для изучения химического состава лекарственного растительного сырья и экстрактов проводили качественные реакции. В результате исследований установили наличие флавоноидов, дубильных веществ, сапонинов, полисахаридов, органических кислот и аскорбиновой кислоты, аминокислот, липофильных веществ. 9 Дальнейшую идентификацию основных групп БАС изучаемого растительного сырья и экстрактов проводили методом ТСХ. Для каждой группы БАС экспериментально подобраны оптимальные хроматографические системы и детектирующие реактивы. Идентифицировали БАС по значению Rf и характеру интенсивности окраски в сравнении со стандартными образцами: кверцетрин, кемпферол, аскорбиновую кислоту, органические кислоты (муравьиную, молочную, янтарную, яблочную, щавелевую), аминокислоты (аспарагин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, аланин, лейцин, цистеин), липофильные вещества (витамины А, Е и К). Кроме того в экстрактах обнаружили – рутин, в крапиве двудомной траве, крапиве траве и «Уртидине» аминокислоту – метионин. Для выделения флавоноидов из растительного сырья использовали экстракцию спиртом этиловым 70%, извлечение упаривали, растворяли в горячей воде, с последующей очисткой гексаном, далее флавоноиды из водной фазы извлекали последовательно, диэтиловым эфиром, этилацетатом, н – бутанолом и кислотой серной 10%. Схема выделения флавоноидов представлена на рис. 1. Измельченное сырьё крапивы травы спиртовое извлечение упаривают, спирт этиловый 70% к время сухому остатку экстракции 2ч добавляют горячую воду часа,выпаривание шрот Спиртовое извлечение Водное извлечение экстракция липофильных веществ гексаном (очистка) Очищенная водная фракция флавоноидов диэтиловый эфир Н2SO4 10%, кислотный гидролиз Водная фракция н-бутанол Бутанольная фракция Эфирная фракция этилацетат Этилацетатная фракция Рис. 1. Схема выделения флавоноидов крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы 10 Для анализа флавоноидов экстракты растворяли в спирте этиловом 70% в соотношении 1:5. Исследования проводили на хроматографе Милихром А–02. Неподвижная фаза – хроматографическая колонка ProntoSIL 120–5–С18 AQ размером 2,0×75 мм. Подвижная фаза – А: трифторуксусной кислоты раствор 0,01%, Б: ацетонитрил 100%. Температура колонки – 35° С, скорость подачи элюента – 100 мкл/мин, объем пробы – 2 мкл, градиентное элюирование – изменение концентрации элюента Б от 5% до 55% при расходе 3000 мкл элюента А. Идентификацию соединений осуществляли по временам удерживания, спектральным отношениям и характеру УФ – спектров в сравнении со стандартными образцами. Далее для изучения фенольных соединений проводили ВЭЖХ. В результате хроматографирования извлечений крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы получили схожие хроматограммы, которые ниже представлены на примере исследования различных фракций крапивы двудомной травы. При исследовании бутанольной фракции на хроматограммах обнаружены 4 пика флавоноидов группы флавона шафтозид (время удерживания τ = 12,0 мин), робинин (τ = 14,7 мин), кверцетрин (τ = 17,0 мин), флавоноид группы апигенина (τ = 18,4 мин) (рис. 2, 3). Кроме того, идентифицированы: резорцин (τ = 8,4 мин), дигидроксибензойная кислота (τ = 11,0 мин), метоксикумаровая кислота (τ = 29,5 мин). Рис. 2. Хроматограмма бутанольной фракции крапивы двудомной травы 11 0.8 0.024 0.7 0.018 О.Е. О.Е. 0.6 0.5 0.012 0.006 0.4 0.000 0.3 -0.006 190 210 230 250 270 290 310 330 350 Длина волны, нм 190 210 230 250 270 290 310 330 350 Длина волны, нм 14,7 мин - робинин 12,0 мин - шафтозид 0.12 0.030 0.10 О.Е. О.Е. 0.024 0.08 0.018 0.06 0.012 0.04 0.02 0.006 190 210 230 250 270 290 310 330 350 Длина волны, нм 17,0 мин - кверцетрин 190 210 230 250 270 290 310 330 350 Длина волны, нм 18,4 мин – флавоноид группы апигенина Рис. 3. Спектры абсорбции флавоноидов бутанольной фракции крапивы двудомной травы При исследовании эфирной фракции крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы обнаружены: резорцин (τ = 8,4 мин), эфир коричной кислоты (τ = 13 мин), эфир галловой кислоты (τ = 14,5 мин), кислота фенилпропановая (τ = 22,8 мин), метоксикумаровая кислота (τ = 26,5 мин) (рис. 4). Рис. 4. Хроматограмма эфирной фракции крапивы двудомной травы 12 В этилацетатной фракции на хроматограммах обнаружены гиперозид (τ = 15 мин), кверцетрин (τ =17 мин), флавоноид апигениновой структуры (τ = 23 мин) (рис. 5). Рис. 5. Хроматограмма этилацетатной фракции крапивы двудомной травы Для изучения флавоноидов – гликозидов в водной фракции проводили кислотный гидролиз (рис. 6). В результате идентифицированы дигидроксибензойная кислота и шафтозид. Рис. 6. Хроматограмма водной фракции после кислотного гидролиза крапивы двудомной травы В экстрактах «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун» обнаружено 6 соединений фенольной природы. Идентифицированы: хлорогеновая кислота (τ = 10,3 мин), шафтозид (τ = 12,0 мин), рутин (τ = 13,5 мин), робинин (τ = 14,7 мин), кверцетрин (τ =16,0 мин), флавоноид апигениновой структуры (τ = 17,4 мин) (рис. 7, 8). 13 Рис. 7. Хроматограмма спиртового извлечения экстракта «Уртидин» 13,5 мин – рутин 10,3 мин – хлорогеновая кислота Рис. 8. Спектры абсорбции рутина и хлорогеновой кислоты Таким образом, в результате проведения исследования ВЭЖХ выделены и идентифицированы в крапивы двудомной, коноплевой, жгучей траве, крапивы траве флавоноиды: гиперозид, кверцетрин, робинин, шафтозид, флавоноид апигениновой структуры и производные фенолкарбоновых кислот: дигидроксибензойная, кумаровая, метоксикумаровая, фенилпропановая, коричная, а так же танин и резорцин. В экстрактах «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун» идентифицированы рутин, кверцетрин, шафтозид, робинин, флавоноид апигениновой структуры, хлорогеновая кислота. В результате фитохимического изучения установлено, что крапивы двудомной, коноплевой, жгучей трава, крапивы трава, экстракты «Уртидин», 14 «Уртикан», «Уртарун» содержат идентичный комплекс БАС, который отличается по количественному содержанию веществ (табл. 1). Элементный состав Методом атомно – абсорбционной спектрофотометрии установлено содержание в крапивы двудомной траве: кальция – 14,04%, железа – 122,6 мк/кг, цинка – 10,7 мк/кг, никеля – 1,47 мк/кг, меди – 10,9 мк/кг, кобальта – 1,66 мк/кг; в крапивы коноплевой траве: кальция – 13,96%, железа – 131,0 мк/кг, цинка – 9,9 мк/кг, никеля – 1,55 мк/кг, меди – 10,6 мк/кг, кобальта – 1,71 мк/кг; в крапивы жгучей траве: кальция – 14,11%, железа – 127,4 мк/кг, цинка – 10,1 мк/кг, никеля – 1,52 мк/кг, меди – 11,0 мк/кг, кобальта – 1,83 мк/кг. Доказано, что содержание особо токсичных элементов (свинца, кадмия, мышьяка, ртути) в изучаемых видах сырья не превышает допустимого уровня установленного СанПин 2.3.2.1078-01. Изучение острой токсичности и специфической активности экстрактов «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун» Изучение острой токсичности осуществлялось на белых мышах при введении экстрактов в дозе 5000 мг/кг, 10000 мг/кг. При внутрижелудочном введении экстрактов не вызывали гибели животных в дозе 10000 мг/кг, что свидетельствует о безвредности исследуемых экстрактов. В результате проведенных исследований установили, что экстракты обладают диуретическим действием, проявляют примерно одинаковую диуретическую активность и увеличивают уровень диуреза 2,2 раза. Уртидин и Уртикан увеличивали уровень диуреза в первый день после введения в среднем на 60% и сохранялся на протяжении всего опыта. При введении Уртаруна наблюдалось плавное увеличение диуреза и максимум достигнут (60%) к концу эксперимента. Предположили, что в основе диуретического действия лежит механизм увеличения клубочковой фильтрации (о чем свидетельствует повышение уровня креатинина, выделяемого с мочой). Доказано, что экстракты Уртидин, Уртикан, Уртарун в дозе 100 мкг/кг ослабляют формирование каррагенинового отека и оказывают угнетающее действие на эксудативную фазу воспаления. Лидирующее положение среди изучаемых экстрактов по степени выражения противовоспалительного действия занимает Уртидин 100 мкг/кг – 40,06%; Уртикан – 38,46%; Уртарун – 39,42%. 15 Таблица 1 Результаты количественного содержания БАС в крапивы траве и экстрактах Объект исследования БАС Флавоноиды, % Дубильные вещества, % Аскорбиновая кислота, мг/% Органические кислоты, % Аминокислоты, % Полисахариды, % Сумма липофильных веществ, % Хлорофиллы, % Каротиноиды, мг/% Витамин К, мг/% Метод определения Крапивы двудомной трава Крапивы коноплевой трава Крапивы жгучей трава Крапивы трава дифференциальная СФМ СФМ 1,20± 0,03 0,35± 0,01 290± 0,18 1,95± 0,04 1,11± 0,06 0,20± 0,06 1,17± 0,02 0,64± 0,01 320± 0,16 2,00± 0,11 1,01± 0,06 0,17± 0,01 0,99± 0,02 0,47± 0,01 280± 0,16 1,92± 0,08 0,23± 0,01 0,19± 0,05 гравиметрический 1,45± 0,05 1,75± 0,15 СФМ 0,70± 0,02 5,68± 0,15 434,55± 0,47 1,12± 0,03 5,71± 0,13 464,04± 0,37 титриметрический титриметрический СФМ гравиметрический СФМ хроматоспектрофотометрический Уртидин Уртикан Уртарун 1,15 ± 0,11 0,52± 0,07 305± 0,15 1,91± 0,05 0,85± 0,03 0,23± 0,04 2,41± 0,07 0,89± 0,02 480± 0,04 - 2,05± 0,04 0,92± 0,04 620± 0,08 - 1,75± 0,04 0,62± 0,01 511± 0,07 - - - - - - - 1,53± 0,12 1,63± 0,10 - - - 0,93± 0,03 5,28± 0,11 448,18± 0,54 0,85± 0,05 5,65± 0,10 460,28± 0,11 - - - - - - - - - 16 Установление показателей подлинности и доброкачественности С целью разработки проектов ФСП на ЛРС устанавливали показатели подлинности и доброкачественности. Морфолого – диагностические признаки крапивы двудомной травы: трава представляет собой олиственные стебли длиной 30 – 40 см, четырёхгранные, неветвистые с супротивными яйцевидными черешковыми листьями, покрытыми, как и стебли, жгучими волосками. Длина листьев 10 – 12 см, ширина 5 – 7 см. Листья имеют длинную заострённую верхушку и сердцевидное округлое основание. Цвет листьев тёмно-зелёный, стебля и черешков – зелёный. Цветки мелкие, невзрачные, собраны в сережковидные тирсы в пазухах верхних листьев. Запах слабый. Вкус горьковатый. Морфолого – диагностические признаки крапивы коноплевой травы: трава представляет собой олиственные четырёхгранные стебли длиной 30 – 40 см с супротивно расположенными черешковыми листьями. Листья длиной 8 – 12 см, глубоко 3-5-рассечённые, с перистозубчатыми надрезами. На стебле и листьях имеются жгучие волоски. Запах слабый. Вкус горьковатый. Морфолого – диагностические признаки крапивы жгучей травы: трава – олиственные четырёхгранные, бороздчатые стебли длиной 15 – 20 см с супротивно расположенными черешковыми листьями. Листья яйцевидные или эллиптические длиной до 4 – 5 см. Надрезано – пильчатые. Верхний зубчик не отличается по длине от боковых. Стебель и листья покрыты жгучими волосками. Цветки мелкие, собраны в колосовидные соцветия в пазухах листьев. Запах слабый. Вкус горьковатый. Морфолого – диагностические признаки крапивы травы: смесь равных частей крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы состоящей из олиственных четырёхгранных, бороздчатых стеблей длиной от 15 до 40 см с супротивно расположенными черешковыми листьями. Листья трех видов: яйцевидной или эллиптической формы длиной до 4 – 5 см, надрезано – пильчатые, верхний зубчик не отличается по длине от боковых; яйцевидной формы длиной 5–7 см, с длинной заостренной верхушкой и сердцевидным заостренном основанием; глубоко 3–5–расченные длиной 9–12 см, с перистозубчатыми надрезами. Стебель и листья покрыты жгучими волосками. Цветки мелкие, собраны в колосовидные соцветия в пазухах листьев. Запах слабый. Вкус горьковатый. В результате изучения анатомического строения, установлены отличительные анатомо – диагностические признаки сырья (табл. 2): Крапивы двудомной трава: на нижнем эпидермисе листа – многочисленные цистолиты; на эпидермисе лепестка – многочисленные ретортовидные волоски, в мезофилле лепестка – цистолиты; на эпидермисе стебля – ретортовидные, жгучие, головчатые волоски. 17 Таблица 2 Отличительные анатомо – диагностические признаки крапивы травы Объект исследования Крапивы двудомной трава Крапивы коноплевой трава Крапивы жгучей трава Лист Клетки верхнего эпидермиса слабоизвилистые, нижнего сильноизвилистые. На нижнем эпидермисе находятся устьица аномоцитного типа и многочисленные цистолиты. Волоски с обеих сторон листа: ретортовидные, жгучие и головчатые. Клетки верхнего эпидермиса слабоизвилистые, нижнего сильноизвилистые. На нижнем эпидермисе находятся устьица аномоцитного типа. На верхнем и нижнем эпидермисе многочисленные цистолиты Волоски с обеих сторон листа: ретортовидные, жгучие и головчатые. Клетки верхнего эпидермиса слабоизвилистые, нижнего сильноизвилистые. На нижнем эпидермисе находятся устьица аномоцитного типа. На верхнем и нижнем эпидермисе многочисленные цистолиты. Волоски с обеих сторон листа: ретортовидные, жгучие и головчатые. На главной жилке листа расположены цепочки друз кальция оксалата. Цветок Стебель Клетки эпидермы лепестка имеют вытянутую форму и ровные стенки с некоторой извилистостью. На эпидерме лепестка многочисленные ретортовидные волоски. В мезофилле лепестка - цистолиты. Вторичное пучковое строение с открытыми коллатеральными пучками. На эпидерме стебля - волоски ретортовидные, жгучие, головчатые. Клетки эпидермы лепестка имеют вытянутую форму и ровные стенки с некоторой извилистостью. На эпидерме лепестка головчатые волоски и многочисленные ретортовидные. В мезофилле лепестка многочисленные друзы. Вторичное пучковое строение с открытыми коллатеральными пучками. На эпидерме стебля – многочисленные жгучие волоски. Клетки эпидермы лепестка имеют вытянутую форму и ровные стенки с некоторой извилистостью. На эпидерме лепестка – головчатые и многочисленные ретортовидные. В мезофилле лепестка - цистолиты. Переходный тип строения, на эпидерме – волоски ретортовидные, жгучие, головчатые. 18 Крапивы коноплевой трава: на верхнем и нижнем эпидермисе листа – цистолиты; на эпидермисе лепестка – головчатые и многочисленные ретортовидные волоски; в мезофилле лепестка –друзы; на эпидермисе стебля – многочисленные жгучие волоски. Крапивы жгучей трава: на верхнем и нижнем эпидермисе листа – многочисленные цистолиты, по главной жилке – цепочка друз; на эпидермисе лепестка – головчатые и ретортовидные волоски; в мезофилле лепестка – цистолиты; на эпидермисе стебля – ретортовидные, жгучие, головчатые волоски. Для определения доброкачественности сырья установлены числовые показатели. Крапивы двудомной трава: потеря в массе при высушивании не более 12%; зола общая не более 13%; зола, не растворимая в растворе хлористоводородной кислоте 10% не более 3%; органическая примесь не более 2%; минеральная примесь не более 1%; экстрактивных веществ, извлекаемых водой очищенной, не менее 25%; флавоноидов в пересчете на кверцетрин, не менее 1,20%. Крапивы коноплевой трава: потеря в массе при высушивании не более 12%; зола общая не более 13%; зола, не растворимая в растворе хлористоводородной кислоте 10% не более 3%; органическая примесь не более 2%; минеральная примесь не более 1%; экстрактивных веществ, извлекаемых водой очищенной, не менее 25%; флавоноидов в пересчете на кверцетрин, не менее 1,20%. Крапивы жгучей трава: потеря в массе при высушивании не более 12%; зола общая не более 13%; зола, не растворимая в растворе хлористоводородной кислоте 10% не более 3%; органическая примесь не более 2%; минеральная примесь не более 1%; экстрактивных веществ, извлекаемых водой очищенной, не менее 22%; флавоноидов в пересчете на кверцетрин, не менее 1,10%. Крапивы трава: потеря в массе при высушивании не более 11%; зола общая не более 15%; зола, не растворимая в хлористоводородной кислоте растворе 10% не более 3%; органическая примесь не более 2%; минеральная примесь не более 1%; экстрактивных веществ, извлекаемых водой очищенной, не менее 25%; флавоноидов не менее 1,15%. Определены показатели доброкачественности в зависимости от сроков сбора растительного сырья. Установлены оптимальные сроки заготовки крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы – фаза цветения (июнь). Определен срок годности сырья – 2,5 года (срок наблюдения). На основании полученных результатов разработаны проекты ФСП. Общие выводы 1. Проведено комплексное изучение крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы и экстрактов сухих. 19 Установлено наличие в растительном сырье: флавоноидов, фенолокислот, дубильных веществ гидролизуемой и конденсированной группы, сапонинов, полисахаридов, аскорбиновой кислоты, органических кислот, аминокислот, липофильных веществ (хлорофиллов, каротиноидов, витаминов А, Е, К). 2. Определен качественный состав флавоноидов и фенолокислот. Крапивы двудомной, коноплевой, жгучей трава, крапивы трава содержит флавоноиды: кемпферол, гиперозид, кверцитрин, робинин, шафтозид, флавоноид апигениновой структуры и производные фенолкарбоновых кислот: дигидроксибензойная, кумаровая, метоксикумаровая, фенилпропановая, коричная. В экстрактах идентифицированы рутин, кверцитрин, шафтозид, робинин, флавоноид апигениновой структуры, кислота хлорогеновая. 3. Установлено количественное содержание биологически активных соединений. Крапивы двудомной трава: флавоноиды в пересчете на кверцитрин – 1,20%; дубильные вещества – 0,35%; аскорбиновая кислота – 290 мг/%; сумма органических кислот – 1,95%; аминокислоты в пересчете на аланин – 1,11%; сумма липофильных веществ – 1,45%; витамин К – 434,55 мг/%; хлорофиллы – 0,70%; каротиноиды – 5,68 мг/%; полисахариды – 0,20%. Крапивы коноплевой трава: флавоноиды в пересчете на кверцитрин – 1,17%; дубильные вещества – 0,64%; аскорбиновая кислота – 320 мг/%; сумма органических кислот – 2,0%; аминокислоты в пересчете на аланин – 1,01%; сумма липофильных веществ – 1,75%; витамин К – 464,04 мг/%; хлорофиллы – 1,12%; каротиноиды – 5,71 мг/%; полисахариды – 0,17%. Крапивы жгучей трава: флавоноиды в пересчете на кверцитрин – 0,99%; дубильные вещества – 0,47%; аскорбиновая кислота – 280 мг/%; сумма органических кислот – 1,92%; аминокислоты в пересчете на аланин – 0,23%; сумма липофильных веществ – 1,53%; витамин К – 448,18 мг/%; хлорофиллы – 0,93%; каротиноиды – 5,28 мг/%; полисахариды – 0,19%. Крапивы трава: флавоноиды в пересчете на кверцитрин – 1,15%; дубильные вещества – 0,52%; аскорбиновая кислота – 305 мг/%; сумма органических кислот – 1,91%; аминокислоты в пересчете на аланин – 0,85%; сумма липофильных веществ – 1,63%; витамин К – 460,27 мг/%; хлорофиллы – 0,85%; каротиноиды – 5,65 мг/%; полисахариды – 0,23%. Уртидин: флавоноиды в пересчете на кверцитрин – 2,41%; дубильные вещества – 0,89%; аскорбиновая кислота – 480 мг/%. Уртикан: флавоноиды в пересчете на кверцитрин – 2,05%; дубильные вещества – 0,92%; аскорбиновая кислота – 620 мг/%. 20 4. 5. 6. 7. Уртарун: флавоноиды в пересчете на кверцитрин – 1,75%; дубильные вещества – 0,62%; аскорбиновая кислота – 511 мг/%. Установлен элементный состав и доказано, что содержание особо токсичных элементов (свинца, кадмия, мышьяка, ртути) крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы не превышает допустимого уровня, установленного нормативной документацией. Доказано, что экстракты Уртидин, Уртикан, Уртарун не обладают токсичностью, оказывают мочегонное и противовоспалительное действие. Установлены морфолого – анатомические признаки, предложены показатели качества для стандартизации изучаемых видов сырья. Разработаны проекты ФСП ««Крапивы трава Urtica herba цельная и измельченная «ангро», «Крапивы двудомной трава Urtica dioica L. цельная и измельченная «ангро», «Крапивы жгучей трава Urtica urens L. цельная и измельченная «ангро», «Крапивы коноплевой трава Urtica cannabina L. цельная и измельченная «ангро». Акт внедрения в работу ЗАО «Эвалар» от 08.04.2013 г. Список публикаций 1. Актуальность фармакогностического изучения растений рода Urticaceae / Федосеева Л.М., Квятковская М.А., Кирьякова В.О., Миллер Т.И. // Сборник 35 лет ФФ АГМУ: итоги и перспективы. Барнаул, 2010. – С. 108 – 111. 2. Перспективы использования растений рода Urtica в качестве лекарственного растительного сырья / Федосеева Л.М., Кирьякова В.О. // Материалы ХII научно-практической конференции «Молодежь – Барнаулу». – Барнаул, 2010. – С. 21 – 22. 3. Изучение органических кислот крапивы двудомной, коноплевой и жгучей в листьях и траве / Федосеева Л.М., Квятковкая М.А, Кудрикова Л.Е., Кирьякова В.О., Миллер Т.А. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сборник научных трудов. – Вып. 66.– Пятигорск, 2011. – С. 201 – 202. 4. Изучение витамина К в листьях и траве крапивы двудомной, коноплевой и жгучей / Федосеева Л.М., Кирьякова В.О., Куперман Е.П. // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по фармации № 3/1.– Екатеринбург, 2011.– 62 с. 5. Анатомическое изучение крапивы коноплевой травы и листа / Федосеева Л.М., Кирьякова В.О. // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по фармации № 3/1.– Екатеринбург, 2011.– 77 с. 21 6. Сравнительная оценка содержания дубильных веществ надземной части растений рода крапива / Федосеева Л.М., Кирьякова В.О., Куперман Е.П. // Актуальные проблемы фармации. Ежегодный сборник работ преподавателей, молодых ученых и студентов. – Барнаул, 2011.–Вып. 8 – С. 89–92. 7. Сравнительный анализ содержения БАС в растениях рода Urtica / Федосеева Л.М., Кирьякова В.О. // Материалы ХIII научно– практической конференции «Молодежь – Барнаулу».– Барнаул, 2011.– С. 40–41. 8. Идентификация флавоноидов крапивы коноплёвой травы, произрастающей на территории Алтайского края / Квятковкая М.А., Кудрикова Л.Е., Кирьякова В.О., Миллер Т.А. // Актуальные проблемы фармации. Ежегодный сборник работ преподавателей, молодых ученых и студентов. – Барнаул, 2011.– Вып. 8 – С. 141–144. 9. Анатомическое изучение крапивы жгучей травы / Кирьякова В.О., Гербер Т.В., Давыдова И.В. // Актуальные проблемы фармации. Ежегодный сборник работ преподавателей, молодых ученых и студентов. – Барнаул, 2011.– Вып. 8 – С. 41 – 48. 10. Идентификация органических кислот надземной части некоторых видов рода Urtica, произрастающих в Алтайском крае / Федосеева Л.М., Кирьякова В.О. // Материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» – Часть II. – Курск, 2011. – С. 288 – 289. 11. Изучение и сравнительная оценка липофильных веществ растений рода Urtica, произрастающих в Алтайском крае / Федосеева Л.М., Кирьякова В.О. // Материалы Всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы вопросы строения новых лекарственных средств». –Том I.– Харьков, 2012. – 119 с. 12. Сравнительная оценка противовоспалительной активности экстрактов травы крапивы сухих / Кирьякова В.О., Ногина М.Ю., Жариков А.Ю., Кудинов А.В. // Актуальные проблемы фармакологии и фармации. Ежегодный сборник работ преподавателей, молодых ученых и студентов. – Вып. 9. – Барнаул, 2012. – С. 94 – 98. 13. Изучение некоторых фенольных соединений крапивы коноплевой травы, произрастающей на территории Алтайского края / Федосеева Л.М., Кирьякова В.О. // Химия растительного сырья. – Барнаул, 2012. - №2. - С. 133 – 138. 22 Кирьякова Виктория Олеговна (Россия) Фармакогностическое изучение некоторых произрастающих на территории Алтайского края видов рода Urtica, Проведено комплексное фармакогностическое и фармакологическое исследование крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы, крапивы травы произрастающей на территории Алтайского края. В результате фитохимических исследований установлено, что состав крапивы двудомной, коноплевой, жгучей травы и экстрактов «Уртидин», «Уртикан», «Уртарун» включает флавоноиды, фенолокислоты, дубильные вещества, сапонины, полисахариды, органические кислоты и аскорбиновую кислоту, аминокислоты (аспарагин, метионин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, аланин, лейцин, цистеин), липофильные вещества (хлорофиллы, каротиноиды, витамины А, Е, К). Проведены исследования по определению острой токсичности, установлена мочегонная и противовоспалительная активность экстрактов. Установлены показатели подлинности и доброкачественности крапивы травы. На основании полученных данных разработаны проекты ФСП «Крапива двудомная трава», «Крапива коноплевая трава», «Крапива жгучая трава». Kiryakova Victoria (Russia) Farmakognostichesky studying of some types of the sort Urtica, growing in the territory of the Altai Complex farmakognostichesky and pharmacological research of a urtica dioica, cannabina, urens herbs, urtica herbs growing in the territory of the Altai is conducted. As a result of phytochemical researches it is established that the urtica dioica, cannabina, urens herbs and extracts "Urtidin", "Urtikan", "Urtarun" includes flavonoids, fenoloacid, tannins, saponins, polysaccharides, organic acids and ascorbic acid, amino acids (asparagin, methionine, fenilalanin, glutaminovy acid, alanin, leucine, cysteine), lipophilic substances (a chlorophylls, carotinoids, vitamins A, E, K). Researches on determination of acute toxicity are conducted, diuretic and antiinflammatory activity of extracts is established. Indicators of authenticity and high quality a urtica the herbs are established. On the basis of the obtained projects FSP "Urtica Dioica Herbs", "Urtica Cannabina Herbs ", "Urtica Urens Herbs " are developed. _______________________________________________________ Подписано в печать 13.06.2013 г. Формат 60х90/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Гарнитура Таймс Нью Роман. Тираж 100 экз. Объем 1,0 п. л. Заказ № 51 Алтайский государственный медицинский университет г. Барнаул, пр. Ленина, 40
