На правах рукописи КУТИНА Анна Вячеславовна
advertisement
На правах рукописи КУТИНА Анна Вячеславовна СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСКРЕЦИИ БЕЛКА ПОЧКОЙ 03.00.13 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2009 2 Работа выполнена в лаборатории физиологии почки и водно-солевого обмена Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН Научный руководитель академик РАН Юрий Викторович Наточин Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор Николай Павлович Ерофеев доктор медицинских наук, профессор Алексей Владимирович Смирнов Ведущее учреждение Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН Защита диссертации состоится 13 октября 2009 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.127.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук в Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44, конференц-зал. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ИЭФБ РАН (Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44). Автореферат разослан ____ сентября 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова 3 Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Одно из основных положений физиологии почки заключается в том, что в клубочках происходит ультрафильтрация плазмы крови, благодаря чему конечная моча представляет собой безбелковую жидкость (Smith, 1951; Наточин, 1993; Шейман, 2001). Проницаемость гломерулярного фильтра для белков очень мала (Deen, 2004; Haraldsson, Sörensson, 2004), а возможности их реабсорбции в проксимальном канальце велики (Christensen, Gburek, 2004), поэтому почка здорового человека и животных практически не выделяет белок - суточная экскреция у человека не превышает 150 мг (Rennke, Denker, 2007). Появление белка в моче, в частности, альбумина относится к числу важных диагностических признаков патологии почек и сердечно-сосудистой системы (Титов, Тарасов, 1988; Bakris, 2001; Аракелянтс и др., 2003; Хирманов, 2004; Наточин, Мухин, 2007). Тем не менее, ряд фактов говорит о возможности протеинурии при некоторых физиологических состояниях, таких как интенсивная физическая нагрузка, ортостаз, лихорадка, эмоциональный стресс (Poortmans et al., 1989; Храйчик и др., 2001). Есть отдельные наблюдения, свидетельствующие об увеличении экскреции некоторых белков почкой при изменении скорости мочеотделения (Guarnieri et al., 1979; Viberti et al., 1982; Houser, 1986; Jespersen et al., 1986; Jung et al., 1988; Wiegmann et al., 1989). Факторы регуляции уровня экскреции белка почкой не описаны. Остается открытым вопрос о пределах вариабельности и механизмах влияния процессов, лежащих в основе мочеобразования, на уровень экскреции белка в норме. Выяснение условий развития физиологической протеинурии представляет безусловный интерес как для нормальной физиологии, так и для практической медицины. Цель исследования: выявление факторов, оказывающих влияние на уровень экскреции белка почкой в норме. 4 Задачи исследования: 1. Сравнительное исследование экскреции белка почкой при осмотическом, водном диурезе и салурезе. 2. Сопоставление экскреции белка у человека и некоторых видов животных (крыса, травяная лягушка). 3. Исследование влияния ренин-ангиотензиновой системы на экскрецию белка при полиурии. 4. Сравнительное исследование влияния гормонов нейрогипофиза (аргинин- вазотоцин (AVT), аргинин-вазопрессин (AVP) и их аналоги) на экскрецию белка почкой крысы. 5. Исследование влияния оксида азота (NO) на выведение белка почкой крысы. Научная новизна. Впервые показано, что у крыс полиурия различного генеза приводит к значимому повышению экскреции общего белка, в том числе альбумина. Аналогичные изменения экскреции белка выявлены при водном диурезе у здоровых обследованных и при глюкозурии у пациентов с сахарным диабетом I типа без нефропатии. Впервые показано, что у крыс ряд аналогов гормонов нейрогипофиза (1-дезамино-8-аргинин-вазотоцин (1d-AVT), 1-дезамино-8-гомоаргинин-вазотоцин (1d-hAVT), 1-дезамино-4-треонин-8-аргинин-вазотоцин (1d-4Thr-AVT)) в дозах 0.51.0 мкг/кг обратимо увеличивает экскрецию белка почкой, этот эффект в значительной степени снимается введением антагонистов V1-рецепторов. Впервые показано, что метиловые эфиры Nω-нитро-L-аргинина и Nω-нитро-Dаргинина (L-NAME и D-NAME) при парентеральном введении вызывают развитие массивной протеинурии (альбуминурии) у крыс за счёт увеличения проницаемости гломерулярного фильтра для белков. На этой экспериментальной модели впервые 5 показано влияние гиперволемии и лигандов вазопрессиновых рецепторов на экскрецию белка почкой крыс. Научно-практическая значимость работы. Полученные данные указывают на необходимость учёта уровня диуреза и тщательной оценки состояния почки для дифференциальной диагностики физиологической протеинурии и повышенной экскреции белков, свидетельствующей о патологии почек. Результаты диссертации используются в курсах лекций «Физиология почки и водно-солевого обмена», читаемых на медицинском факультете Санкт- Петербургского государственного университета. Положения, выносимые на защиту. 1. Водная нагрузка у крыс и человека, осмотический диурез у пациентов с сахарным диабетом I типа, полиурия у крыс, вызванная введением осмотических диуретиков, фуросемида и 1d-AVT, приводят к повышению экскреции белка почкой. Угнетение активности ангиотензин-превращающего фермента не препятствует развитию данной формы физиологической протеинурии у крыс. 2. Ряд аналогов гормонов нейрогипофиза (1d-AVT, 1d-hAVT, 1d-4Thr-AVT) увеличивают экскрецию общего белка, в том числе альбумина, и этот эффект в значительной степени снимается введением антагонистов V1-рецепторов. 3. Парентеральное введение L-NAME и D-NAME вызывает развитие массивной протеинурии у крыс, вероятно, за счёт увеличения проницаемости гломерулярного фильтра. Водная нагрузка, введение лигандов вазопрессиновых рецепторов и угнетение синтеза NO усиливают NAME-зависимую протеинурию. Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на 11-й и 12-й Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (СанктПетербург, 2008 г. и 2009 г.), Всероссийской конференции «Научное наследие 6 академика Л.А. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний» (Санкт-Петербург, 2008 г.), VI Всероссийской конференции висцеральных с международным систем», участием посвящённой «Механизмы 50-летию открытия функционирования А.М. Уголевым мембранного пищеварения (Санкт-Петербург, 2008 г.), Международной конференции «Ehrlich II conference, 2nd World Conference on Magic Bullets», посвящённой 100-летию вручения Нобелевской премии П. Эрлиху (Нюрнберг, Германия, 2008 г.). Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи в реферируемых журналах и тезисы 5 докладов. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 4 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 40 отечественных и 214 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 46 рисунками. Материалы и методы исследования Объектами исследования служили здоровые добровольцы, пациенты с сахарным диабетом I типа, крысы (Rattus norvegicus var. albino) и травяные лягушки (Rana temporaria). Основная часть экспериментов выполнена на самках крыс линии Вистар в возрасте 4-6 месяцев, весом 150-220 г. Пробы мочи собирали при произвольных мочеиспусканиях, забор крови проводили под эфирным наркозом из общей сонной артерии. Часть экспериментов выполнена в марте-апреле на самцах травяных лягушек весом 25-35 г. Пробы мочи собирали из мочевого пузыря однократно через 1 ч после перевязки клоаки, кровь забирали из полости сердца у обездвиженных лягушек. Опыты выполнены в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными. Обследованы 15 практически здоровых добровольцев 16-27 лет, у которых 7 утром собирали ночную пробу мочи, а затем все пробы в течение 2.5 часов после пероральной водной нагрузки (20 мл/кг). Совместно с к.м.н. Ж.В. Шуцкой обследованы больные сахарным диабетом I типа без диабетической нефропатии (21 пациент 11-19 лет), наблюдающиеся в городском диабетологическом центре для детей и подростков №44. У них собирали ночные пробы мочи, утром натощак брали пробу крови из локтевой вены. Все обследованные дали информированное согласие на проведение исследований. В работе использованы: AVP, AVT, L-NAME, D-NAME, аргинин, глицерин, лизин, оксадиазоло-хиноксалин (ODQ), пептидные антагонисты вазопрессиновых и окситоциновых рецепторов (Sigma-Aldrich, Inc., США), полиэтиленгликоль-400 (PEG) (Shuchardt, Германия), фуросемид (Aventis Pharma Ltd., Индия), 1d-AVT (ЗАО «Синтез пептидов», Россия), ОРС-31260 (Otsuka Pharmaceutical Co, Ltd., Япония), эналаприлат (KRKA, Словения), новые синтетические аналоги AVT - 1d-hAVT, 1d-4Thr-AVT, 1-дезамино-4-треонин-8-D-аргинин-вазотоцин (1d-4Thr-DAVT), 1-дезамино-7-глицин-8-аргинин-вазотоцин (1d-7Gly-AVT), 1-дезамино-7-глицин-8-Dаргинин-вазотоцин (1d-7Gly-DAVT), 1-дезамино-8-D-аргинин-деглицин-вазотоцин (1d-dеGly-DAVT) (химический факультет СПбГУ, Россия). В пробах мочи и сыворотки крови осмоляльность определяли на микроосмометре Micro-Osmometer Model 3300 (Advanced Instruments, США) криоскопическим методом, концентрацию ионов натрия, калия - на пламенном фотометре Corning 410 (Ciba Corning, Великобритания), креатинина - кинетическим методом по реакции Яффе, общего белка мочи - пирогаллоловым методом, альбумина мочи у человека - иммунотурбидиметрически, общего белка сыворотки крови - при помощи биуретового реактива, а альбумина сыворотки крови бромкрезоловым зелёным на автоматическом биохимическом анализаторе EOS Bravo W (Hospitex, Италия) с использованием реактивов, стандартных и контрольных 8 сывороток фирмы Randox (Великобритания). Альбумин мочи у крыс определяли иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы Bethyl Laboratories (США) на автоматическом ридере Elx800 (BIO-TEK Instruments, США). Совместно с к.б.н. В.В. Захаровым проводили электрофорез белков мочи в денатурирующих условиях по стандартной методике (Laemmli, 1970) в 8% или 12%-ном полиакриламидном геле. Гели окрашивали коллоидным раствором Кумасси G250. Наличие глюкозы в моче и микроальбуминурии у пациентов с сахарным диабетом выявляли с помощью тест-полосок, уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) определяли на анализаторе DCA 2000тм (Siemens, США). Статистическую обработку проводили с использованием программ Microsoft Excell 2003 и Statistica 6.0. Данные в тексте представлены в виде M ± σ, на графиках - М ± 95% доверительный интервал. Использовали однофакторный дисперсионный анализ, критерии для множественного сравнения групп, корреляционный анализ. Результаты исследования Экскреция белка почкой при разных типах диуреза у крыс. Осмотический диурез у крыс вызывали пероральным введением 50% глицерина (6.4 мл/кг) или в/в инфузией 40% PEG (7.5 мл/кг); водный диурез - введением воды (50 мл/кг) через зонд в желудок; салурез – в/м введением фуросемида (10 мг/кг) или 1d-AVT (0.5 мкг/кг). После введения водной нагрузки увеличение диуреза было обусловлено экскрецией осмотически свободной воды, при инфузии PEG – экскрецией осмотически активных веществ, а при введении фуросемида и 1d-AVT – экскрецией ионов натрия с осмотически связанной с ними водой (рис. 1). Несмотря на различные механизмы развития полиурии, во всех изученных вариантах увеличения мочеобразования параллельно с усилением диуреза происходило повышение выведения общего белка, наблюдалась прямая зависимость между объёмом выделяемой мочи и экскрецией белков почкой в пределах каждой из групп (рис. 2А). 9 По оси ординат – диурез (V), клиренс осмотически активных веществ (COsm), натрия (CNa) и осмотически свободной воды (CH2O, мкл/мин на 100 г массы тела). ВН – водная нагрузка. Рис. 1. Диурез, клиренсы осмотически свободной воды, осмотически активных веществ и ионов натрия при разных типах диуреза. Рис. 2. Зависимость между выведением белка почкой и скоростью мочеобразования. По оси абсцисс – диурез (V, мкл/мин на 100 г массы тела), по оси ординат – экскреция белка с мочой (UPrV, мкг/мин на 100 г массы тела). 1 – водная нагрузка, 2 - 1d-AVT, 3 – фуросемид, 4 – PEG, 5 – глицерин, 6 - контроль. При разных типах диуреза экскреция белка достигала примерно одних и тех же максимальных значений, несмотря на существенные различия в объёмах 10 выделяющейся мочи. Близкие средние значения за 2 ч эксперимента, как мочеотделения, так и выведения белка, наблюдались с одной стороны при осмотическом диурезе и 1d-AVT-зависимом салурезе, а с другой стороны – при водном диурезе и фуросемид-зависимом салурезе (рис. 2Б). Полученные данные указывают на то, что скорость выведения белка зависит не от величины диуреза как таковой, а от интенсивности действия фактора, приводящего к полиурии. Электрофоретическое исследование белков мочи при разных типах диуреза показало, что при всех вариантах увеличения мочеобразования у крыс выделялись низкомолекулярные белки (14-31 кДа) и альбумин (67 кДа), существенных межгрупповых отличий в спектре экскретируемых белков выявлено не было (рис. 3). По данным иммуноферментного анализа экскреция альбумина при полиурии возрастала в 2-8 раз – наиболее выраженный рост выведения альбумина отмечался при салурезе, вызванном введением 1d-AVT, минимальный – при действии фуросемида. Рис. 3. Электрофорез белков мочи крыс при разных типах диуреза. 1 – водная нагрузка, 2 – фуросемид, 3 – глицерин, 4 – PEG, 5 –контроль, 6 – 1d-AVT, 7 - маркеры молекулярной массы. 11 Увеличение выделения белков при разных типах диуреза могло определяться возрастанием фильтрации белков в почечных клубочках. Выявлена достаточно тесная корреляционная связь между экскрецией белка и скоростью клубочковой фильтрации при действии 1d-AVT (рис. 4Б) и связь слабой силы – при действии фуросемида и водной нагрузки (рис. 4А). Рис. 4. Зависимость экскреции белка от скорости клубочковой фильтрации при водном диурезе и салурезе. По оси абсцисс – экскреция белка почкой (UPrV, мг/мин на 100 г массы тела), по оси ординат – клиренс креатинина (CCr, мл/мин на 100 г массы тела). 1 – 1d-AVT, 2 – водная нагрузка, 3 - фуросемид. Поскольку экскреция белка, фильтруемого в клубочках, зависит от степени его реабсорбции, было рассчитано отношение скорости экскреции белка к скорости клубочковой фильтрации, то есть величина, характеризующая количество выделившегося с мочой белка на единицу объёма фильтрата. При всех типах диуреза экскреция белка на мл клубочкового фильтрата росла. Найдена тесная корреляция между увеличением отношения выведения белков к экскреции креатинина и ростом мочеотделения (r = 0.97, p < 0.05). Таким образом, в основе 12 повышенной экскреции белка при полиурии может лежать изменение гемодинамических условий в клубочке, что приводит к усилению проникновения макромолекул через гломерулярный фильтр и затруднению их реабсорбции из-за ускорения тока жидкости в проксимальном канальце. Влияние водной нагрузки на экскрецию белков почкой человека. В контрольном периоде у всех обследуемых выведение белка находилось в пределах нормальных значений – скорость экскреции общего белка составила 69 ± 18 мкг/мин, а альбумина 3.7 ± 2.7 мкг/мин. После питья воды в объёме 20 мл/кг у них возросло мочеотделение - диурез увеличился в 13.3 раза, достигнув максимума через 2 ч. Наряду с ростом диуреза происходило значимое повышение экскреции белков с мочой (рис. 5), выведение общего белка повысилось в 8.3 раза, а альбумина - в 2.8 раза. Обращает на себя внимание то, что, несмотря на рост выведения альбумина, практически у всех обследованных скорость его экскреции осталась в пределах нормальных значений – до 20 мкг/мин (American Diabetes Association, 2002). По сравнению с исходным периодом изменилось соотношение экскретируемых белков в моче, доля альбуминов снизилась с 4.4% до 1.5%. В отличие от проб, собранных в контрольном периоде обследования, практически во всех пробах после водной нагрузки резко возросло отношение белок/креатинин, превысив границу нормы (0.2 мг/мг). При этом величина отношения белок/креатинин нарастала с повышением диуреза (рис. 6). Считается, что соотношение белок/креатинин адекватно отражает суточную экскрецию белка и является методом оценки потери белка по произвольной пробе мочи (Ginsberg et al., 1983). Но протеинурия, наблюдаемая после водной нагрузки, была кратковременной, она прошла после нормализации диуреза, и повышенное отношение белок/креатинин в моче у обследованных не свидетельствовало о существенном повышении суточной потери белка. 13 Рис. 5. Экскреция общего белка и Рис. 6. Зависимость между диурезом и альбумина отношением белок/креатинин от после почкой человека при водном диурезе. водной По оси абсцисс – время (мин), по оси обследованных. ординат: слева – экскреция альбумина По оси абсцисс – диурез (V, мл/мин на на 1.73 м2 у здоровых площади 1.73 м2 площади поверхности тела), по оси поверхности тела), справа - экскреция ординат – отношение содержания белка общего белка (UPrV, мг/мин на 1.73 м2 (мг) к креатинину (мг) в пробах мочи. площади поверхности тела). Пунктир – граница нормы. (UAlbV, мкг/мин нагрузки Выведение белка при полиурии у пациентов с сахарным диабетом I типа. В основе полиурии при сахарном диабете лежит снижение реабсорбции веществ в проксимальном сегменте нефрона, вызванное увеличением содержания глюкозы в канальцевой жидкости. Таким образом, глюкозурия при сахарном диабете является естественной моделью осмотического диуреза у человека. У обследуемых собирали ночные пробы мочи, что позволяло избежать влияния приёмов пищи и воды на уровень диуреза и экскреции различных веществ. Предварительно пациенты с сахарным диабетом по уровню HbA1c были разделены на 2 группы: с компенсированным (HbA1c < 7%) и декомпенсированным (HbA1c > 7.5%) сахарным 14 диабетом. Пациенты в группах не различались по уровню скорости клубочковой фильтрации (p > 0.05). После сбора мочи и определения в ней глюкозы среди пациентов с декомпенсированным сахарным диабетом была выделена группа детей с глюкозурией. У детей с ночной глюкозурией наблюдался осмотический диурез, у них выявлена более высокая скорость мочеобразования (в 4 раза по сравнению с контролем), экскреция осмотически активных веществ и реабсорбция осмотически свободной воды. Именно в этой группе пациентов была обнаружена повышенная экскреция белка с мочой – 105 ± 88 мг/6ч (в контроле – 22 ± 10, при компенсированном сахарном диабете – 38 ± 18, при декомпенсированном сахарном диабете без глюкозурии – 44 ± 17 мг/6ч, p < 0.05). Уровень экскреции белка коррелировал с величиной осмотического диуреза (r = 0.85, p < 0.05). Экскреция белка почкой лягушек. Сбор мочи у лягушек осуществляли в конце периода гибернации после их помещения в воду комнатной температуры. Экскреция общего белка с мочой у лягушки составила 0.81 ± 0.54 мг/ч на 100 г массы тела. Мочеотделение у амфибий, находящихся в водной среде, аналогично водному диурезу у млекопитающих, поэтому мы сопоставили значения экскреции веществ у лягушек и крыс после водной нагрузки. Мочеотделение, экскреция воды и осмотически активных веществ (при расчёте на 100 г массы тела) у лягушек оказались сопоставимыми с аналогичными показателями у крыс после водной нагрузки, а экскреция белка была выше в 2.9 раза. По данным электрофореза у лягушек с мочой в основном выделялись белки с молекулярной массой около 70 кДа, низкомолекулярные белки практически отсутствовали (рис. 7). Полученные данные свидетельствуют о том, что как у крыс, так и у лягушек гломерулярный фильтр практически не пропускает белки с молекулярной массой выше 70 кДа. Меньшее выведение низкомолекулярных белков у лягушки может быть следствием 15 их низкой концентрации в плазме крови или интенсивной реабсорбции в проксимальном канальце. 1 – моча крысы, 2 – моча лягушки, 3 – маркеры молекулярной массы. Рис. 7. Электрофорез белков мочи крыс и лягушек. Влияние блокады ренин-ангиотензиновой системы на экскрецию белка при разных типах диуреза. В клинической нефрологии устранение внутриклубочковой гипертензии с применением ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента служит основным приёмом снижения протеинурии при нефропротективной терапии (Brenner et al., 1996; Мухин и др., 2008). Для анализа возможных механизмов увеличения экскреции белков почкой при качественно различных формах повышения мочеобразования были проведены эксперименты на здоровых крысах, у которых временное фармакологическое угнетение активности ангиотензин- превращающего фермента было использовано для предотвращения повышения внутригломерулярного давления. Для устранения возможного действия ангиотензина II крысам вводили 1.0 или 2.0 мг/кг эналаприлата в/бр за 30 мин до водной нагрузки, инъекции 1d-AVT или фуросемида. Введение эналаприлата не снизило величину протеинурии (рис. 8А) при всех типах диуреза и не уменьшило альбуминурию при водном диурезе и 1d-AVT-зависимом салурезе у крыс (рис. 8Б). Полученные данные показывают, что фармакологическое угнетение синтеза ангиотензина II в структурах почки не сказывается на скорости потери белков при 16 исследованных формах протеинурии, что свидетельствует о существовании многокомпонентной системы стабилизации давления в гломерулярном аппарате. Рис. 8. Влияние эналаприлата на экскрецию общего белка (А) и альбумина (Б) почкой при водном диурезе и салурезе. По оси ординат – экскреция общего белка или альбумина с мочой за 2 ч эксперимента (UPrV2ч, UAlbV2ч мкг на 100 г массы тела). 1 – без эналаприлата, 2 –эналаприлат (1 мг/кг, в/бр). * - значимость различий (p < 0.05) с группой контроля. ВН – водная нагрузка. Экскреция белка почкой крыс при действии аналогов гормонов нейрогипофиза и антагонистов вазопрессиновых рецепторов. Поскольку наиболее выраженный рост экскреции белка наблюдался при 1d-AVT-зависимом салурезе, было изучено влияние на выведение белка ряда новых аналогов AVT с заменами аминокислотных остатков в 4, 7, 8 и 9-м положениях молекулы AVT и различным соотношением антидиуретических и натрийуретических свойств. Увеличение диуреза при в/м введении 0.5-1.0 мкг/кг AVT и его аналогов (1d-AVT, 1d-hAVT и 1d-4Thr-AVT), обладающих натрийуретическим действием, сопровождалось ростом экскреции белков почкой, причём количество выделяемого белка напрямую зависело от диуретического эффекта применяемого препарата (рис. 9). 17 1 – AVT, 2 – 1d-AVT, 3 - 1d-dеGly-DAVT, 4 - 1d-7Gly-DAVT, 5 - 1d-hAVT, 6 - 1d-4Thr-DAVT, 7 - 1d-7Gly-AVT, 8 - 1d-4Thr-AVT, 9 – контроль, 10 – водная нагрузка (ВН). Рис. 9. Зависимость между диурезом и экскрецией белка при действии AVT и его аналогов. По оси абсцисс – объём мочи за 2 ч (V2ч, мл на 100 г массы тела), по оси ординат – суммарная экскреция белка с мочой за 2 ч эксперимента (UPrV2ч, мкг на 100 г массы тела). Предварительное (за 5 мин) введение V1- или V1a-антагониста в значительной степени устраняло повышение экскреции белка при инъекции 1d-AVT (рис. 10), в то время как V2-антагонист и антагонист окситоциновых рецепторов не препятствовали действию аналога. 1 –V1-антагонист, 2 - V1а-антагонист, 3 – 0.9% NaCl. Сплошная стрелка V-антагонистов – введение (10 мкг/кг, в/м), пунктирная –1d-AVT (0.5 мкг/кг, в/м). Рис. 10. Влияние V1-антагонистов на экскрецию белка почкой при действии 1d-AVT. По оси абсцисс – время (мин), по оси ординат – экскреция белка с мочой (UPrV, мг/мин). 18 Для оценки антидиуретической активности аналогов AVT их вводили в дозах 0.01-0.001 мкг/кг одновременно с пероральной водной нагрузкой (50 мл/кг). Все изученные аналоги в данном диапазоне доз не влияли на выведение ионов. Препараты со слабой антидиуретической активностью (1d-dеGly-DAVT, 1d-7Gly-DAVT, 1d-7Gly-AVT) не препятствовали развитию водного диуреза и повышению экскреции белка с мочой после водной нагрузки. Аналоги с выраженной антидиуретической активностью (1d-hAVT, 1d-4Thr-AVT и 1d-4Thr-DAVT) значительно снижали диурез и замедляли выведение избытка воды из организма, при этом экскреция белков почкой понижалась до значений, наблюдающихся в контрольной группе. Отмечена прямая зависимость между антидиуретической активностью аналогов AVT и их способностью препятствовать повышению экскреции белка почкой в ответ на водную нагрузку (рис. 9). Пероральное введение непептидного антагониста V2-рецепторов – ОРС-31260 (15 мг/кг) – привело к развитию у крыс водного диуреза – повысилось мочеотделение, упала осмоляльность мочи, реабсорбция осмотически свободной воды сменилась ее экскрецией. Но уровень экскреции белка при действии V2-антагониста значимо не отличался от контрольного уровня (p > 0.05). Таким образом, водный диурез при действии V2-антагониста в отличие от увеличения мочеобразования после водной нагрузки не сопровождался значимым повышением экскреции белка у крыс. Влияние NO на экскрецию белка почкой крыс. Введение крысам ингибитора NO-синтазы L-NAME (50 мг/кг) привело к двухкратному увеличению мочеотделения, небольшому росту экскреции натрия с мочой и развитию массивной протеинурии выведение белка увеличилось с 0.13 ± 0.04 до 1.67 ± 0.73 мг/2ч/100 г массы тела. По данным иммуноферментного анализа практически весь экскретируемый белок был представлен альбумином. Высокая протеинурия наблюдалась в течение первых 2 ч 19 после инъекции L-NAME, а затем начинала снижаться. Через день после введения L-NAME экскреция общего белка с мочой ещё в 2 раза (альбумина - в 3 раза) превышала контрольные значения, на 7 день показатели выведения белка вернулись к исходному уровню. Для оценки вклада угнетения синтеза NO в развитие данной протеинурии эффект L-NAME сопоставили с действием 1) D-NAME, оптическим изомером L-NAME, не являющимся ингибитором NO-синтазы, и 2) ODQ, ингибитором растворимой гуанилатциклазы, препятствующим внутриклеточному действию NO. ODQ (2 мг/кг, в/бр) не оказал влияния на экскрецию общего белка и альбумина, в то время как D-NAME (50 мг/кг, в/бр) привёл к двухкратному росту экскреции белка (до 0.28 ± 0.17 мг/2ч/100 г массы тела) и резкому повышению выведения альбумина по сравнению с контролем (186 ± 69 и 5 ± 4 мкг/2ч/100 г массы тела, соответственно, p < 0.05). По данным электрофореза при действии L-NAME резко возросло выведение белков с молекулярной массой 65-70 кДа, в частности альбумина, а также в моче появились белки с молекулярной массой 150 кДа (рис. 11). Более крупные белки плазмы крови в моче выявлены не были (рис. 11). Подобная протеинурия описана при увеличении проницаемости гломерулярного фильтра после введения поликатионов (Hunsicker et al., 1981; Bridges et al., 1991). 1 – проба мочи, L-NAME (50 мг/кг, в/бр) 2 - проба мочи, L-NAME (50 мг/кг, в/бр) + 1d-AVT (0.5 мкг/кг, в/м) 3 – проба сыворотки крови, контроль. Слева - маркеры молекулярной массы. Рис. 11. Электрофорез в 8% полиакриламидном геле белков контрольной сыворотки крови и мочи после введения крысам L-NAME и 1d-AVT. 20 В совокупности эти данные указывают на то, что NAME обладают специфическим действием на проницаемость гломерулярного фильтра для белков, не связанным с блокадой NO-синтазы. Угнетение образования NO не является провоцирующим фактором развития NAME-зависимой протеинурии, но влияет на её интенсивность – при введении в равных дозах L-NAME в большей степени менял экскрецию белка почкой, чем D-NAME. При интактном гломерулярном фильтре угнетение действия NO не влияет на экскрецию белка почкой. Выраженность L-NAME-зависимой протеинурии и альбуминурии у крыс весьма существенно менялась на фоне роста диуреза и при действии лигандов вазопрессиновых рецепторов (AVP, 1d-AVT). Водная нагрузка способствовала повышению уровня протеинурии в 2 раза, инъекция 1d-AVT (0.5 мкг/кг) – в 8 раз, а AVP (0.5 мкг/кг) – в 5 раз. В то же время рост мочеотделения при действии фуросемида не изменил протеинурию. На фоне действия 1d-AVT и водной нагрузки в моче появились белки с молекулярной массой до 250 кДа (рис. 11). D-NAMEзависимая протеинурия также существенно возросла при введении 1d-AVT – экскреция альбумина увеличилась на порядок. Вероятно, изменение уровня NAMEзависимой протеинурии при действии водной нагрузки и 1d-AVT связано с повышением внутриклубочкового давления, что и способствует проникновению большего количества белков через гломерулярный фильтр. Полученные данные свидетельствуют о том, что резкие изменения мочеотделения и действие ряда биологически активных веществ могут приводить к развитию протеинурии у здорового человека и животных. Это указывает на необходимость различать функциональное повышение экскреции белка и протеинурию как признак развивающейся патологии почек. Выводы 1. Экскреция белков, в том числе альбумина, почкой крыс возрастает при 21 полиурии на фоне водной нагрузки, введения высоких доз осмотических диуретиков, фуросемида и 1d-AVT. 2. Полиурия при водной нагрузке у здорового человека и осмотическом диурезе у пациентов с сахарным диабетом I типа сопровождается ростом выведения белка. 3. Электрофоретическое исследование проб мочи травяной лягушки (Rana temporaria) и крысы при полиурии (Rattus norvegicus var. albino) свидетельствует об экскреции белков с молекулярной массой не более 70 кДа. 4. Экскреция белков, в том числе альбумина, почкой крыс возрастает при салурезе после инъекции аналогов гормонов нейрогипофиза (1d-AVT, 1d-hAVT, 1d-4Thr-AVT). Этот эффект устраняется при блокаде V1-рецепторов пептидными антагонистами. 5. Парентеральное протеинурию введение (альбуминурию) у L-NAME крыс, и D-NAME вероятно, вызывает увеличивая массивную проницаемость гломерулярного фильтра. Оптический изомер (L-NAME), ингибирующий NO-синтазу, в большей степени изменяет экскрецию белка. Угнетение действия NO введением ODQ не сказывается на экскреции белков почкой крысы. 6. Водная нагрузка, AVP или 1d-AVT усиливают NAME-зависимую протеинурию и приводят к появлению в моче белков с молекулярной массой до 250 кДа. 7. Предварительное введение эналаприлата, ингибитора ангиотензин- превращающего фермента, не устраняет физиологическую протеинурию у крыс при действии водной нагрузки, высоких доз фуросемида и 1d-AVT. 8. Сравнительное исследование экскреции белка почкой при разных типах диуреза у животных (Rattus norvegicus var. albino, Rana temporaria) и человека свидетельствует, что полиурия сопровождается физиологической протеинурией, которая, вероятно, зависит от участия V1-рецепторов, изменения продукции NO, но не ангиотензина II. 22 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Кутина А.В., Захаров В.В., Наточин Ю.В. Экскреция белка почкой крыс при разных типах диуреза // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2008. - Т. 146. - № 12. - C. 613-616. 2. Кутина А.В., Наточин Ю.В. Аналоги вазотоцина усиливают экскрецию белков почкой крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 2008. - Т. 94. - № 11. C. 1325-1334. 3. Kutina A.V., Natochin Ju.V. Extremely High Natriuretic Effect of 1-Desamino-8homoarginine Vasotocin in Rats // Abstract Book of Ehrlich II conference, 2nd World Conference on Magic Bullets. - Nurnberg (Germany), 2008. - P. A-171. 4. Кутина А.В. Влияние 1-дезамино-аргинин-вазотоцина на экскрецию белка почкой крысы // Тезисы VI Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвящённой 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения. – СПб., 2008. - C. 110-111. 5. Кутина А.В. Влияние осмотического диуреза на реабсорбцию белка в проксимальном канальце почки крысы // Тезисы 11-й Всероссийской медикобиологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина». – СПб., 2008. - C. 190-191. 6. Кутина А.В. Сравнительное исследование экскреции белка почкой крыс и лягушек // Тезисы Всероссийской конференции «Научное наследие академика Л.А. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний». – СПб., 2008. C. 90-91. 7. Васильев П.В., Кутина А.В. Влияние водной нагрузки на выведение белка почкой у человека // Тезисы 12-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина». – СПб., 2009. - C. 66-67.
