ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ - Институт биохимической
advertisement
На правах рукописи БЕЛОВ Василий Викторович МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН α-ТОКОФЕРОЛОМ В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ Специальность 03.00.02 – биофизика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 2 Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук Научный руководитель: доктор биологических наук Пальмина Надежда Павловна Официальные оппоненты: доктор биологических наук Гендель Леонид Яковлевич доктор физико-математических наук, профессор Тихонов Александр Николаевич Ведущая организация: Защита состоится « Институт биофизики клетки РАН » мая 2007 г. в 11 часов на заседании Диссерта- ционного Совета Д 002.039.01 в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, 4 С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН Автореферат разослан « » апреля 2007 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 002.039.01 кандидат химических наук М.А. Смотряева 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Одним из самых поразительных открытий последних двух десятилетий является обнаружение действия биологически активных веществ (БАВ) - гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антиоксидантов (АО) и других агентов, в сверхмалых дозах (СМД, <10-13 М) на живые системы различной степени сложности (от ферментов и мембран до целостных организмов и популяций) (Бурлакова, 1986, Ашмарин, 1992, Зайцев, 1993, Bonavida, 1991, Doutremepuich, 1991, Benveniste, 1988, Ямсков, 1999). Несмотря на лавинообразное увеличение количества фактов разнообразного характера о действии БАВ в СМД, механизм этого явления до конца не установлен. Тем не менее, анализ имеющихся данных позволил выделить ряд общих особенностей, наблюдающихся при действии БАВ в СМД, которые оказались инвариантными по отношению как к природе самого вещества и особенностям его метаболизма, так и к характеристикам его специфической мишени (Бурлакова, 1999, 2003). Среди них можно выделить следующие: немонотонная, нелинейная полимодальная зависимость “доза-эффект”, изменение чувствительности биообъекта к действию разнообразных агентов, как эндогенных, так и экзогенных, проявление различных кинетических парадоксов, зависимость “знака” эффекта от начальных характеристик объекта, “расслоение” свойств БАВ по мере уменьшения его концентрации, при котором еще сохраняется активность, но исчезают побочные эффекты. Природа таких общих закономерностей действия БАВ в СМД может быть связана с общностью критических мишеней. На основании ряда работ (Пальмина, 1992, 2004, Мальцева, 1992, 2003, Жерновков, 2003, 2005, Полезина, 1999) можно полагать, что в качестве таких мишеней могут выступать клеточные и субклеточные мембраны. Именно в биологических мембранах локализованы важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки и организма: системы вторичных посредников и пероксидного окисления липидов (ПОЛ) (Владимиров, 1972, Бурлакова, 1967, Nishizuka, 1984), которые находятся в тесном взаимодействии и оказывают влияние друг на друга (Пальмина, 1992, 1995, 1999, Мальцева, 1998). Существенную роль в регуляции ПОЛ играют природные АО, среди которых одним из наиболее известных и эффективных является α-токоферол (α-ТФ). Этот АО принадлежит к группе витамина Е и является его наиболее физиологически активной формой (Machlin, 1984), недостаток которой в организме приводит к тяжелым биохимическим нарушениям (Pentyuk, 1989, Keaney, 1999). Благодаря своей липофильности и строению, -ТФ сосредоточен в липидном бислое мембраны и поэтому способен непосредственно влиять на ее структурные и динамические свойства (Quinn, 2004, Wassall, 1991), в частности, образуя домены с определенной стехиометрией и фосфолипидным составом (Quinn, 1995), а также связываясь с продуктами гидролиза липидов, оказывающих детергентно-подобное действие на мембрану (Kagan, 1989). При этом состав и структурнодинамическое состояние липидного бислоя занимают центральное место в це- 4 пи регуляции ПОЛ и являются одними из наиболее важных факторов для клеточного метаболизма. Это во многом обусловлено тем, что изменение этих параметров влияет на активность и чувствительность мембранно-связанных и липид-зависимых регуляторных белков, ферментов и рецепторов. До недавнего времени действие α-ТФ как на химических, так и биологических моделях, исследовалось в интервале относительно высоких концентраций 10-6-10-3М. Однако в последние годы появились биохимические исследования, в которых достоверно установлено влияние α-ТФ на ПОЛ (Пальмина, 2003, 2004) и на активность одного из ключевых ферментов фосфоинозитидного цикла, являющегося одновременно пероксилипид-зависимым, протеинкиназы С (пк-С), в ультранизких концентрациях ( вплоть до 10 -18 М) (Пальмина, 1994, 1999, Maltseva, 1998). В связи с вышесказанным, изучение взаимодействия -ТФ с различными регионами липидного бислоя биологических мембран, отличающихся по своим биохимическим и регуляторным свойствам, может приблизить нас к решению весьма актуального и важного вопроса о механизме действия БАВ в сверхнизких концентрациях. Цель данной работы заключалась в изучении влияния природного АО α-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-4-10-25 М) на структурные характеристики различных регионов липидного бислоя биологических мембран клеток печени мышей in vitro. В качестве объектов исследования были выбраны: а) мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭР), которые являются традиционной моделью для исследования процессов ПОЛ и влияния на него анти- и прооксидантов; б) плазматические мембраны (ПМ), в которых локализованы регуляторные системы вторичных посредников. Основными задачами исследования являлись: 1. Исследование методом спиновых ЭПР-зондов влияния α-ТФ в интервале концентраций (10-4-10-25М) на жесткость поверхностных (~8Å) и микровязкость глубоколежащих (~20Å) областей липидного бислоя мембран ЭР и ПМ клеток печени мышей при температуре 293 К. Получение зависимостей доза-эффект. 2. Изучение методом спиновых ЭПР-зондов влияния концентраций α-ТФ, соответствующих экстремумам на дозовых зависимостях и не влияющих на определяемые параметры, на термоиндуцированные структурные переходы в различных областях липидного бислоя, а также эффективную энергию их активации в глубоколежащих областях липидов мембран ЭР и ПМ. 3. Конкретизация механизмов действия различных концентраций α-ТФ на исследуемые структурно-динамические параметры мембран ЭР и ПМ. 4. Выяснение роли полярности растворителя α-ТФ в механизме действия его так называемых «мнимых» концентраций (10-18-10-25 М) путем сравнительного изучения влияния α-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) и неполярном (вазелиновое масло) растворителях, на вязкостные 5 свойства глубоколежащих (~ 20 Å) и поверхностных (~ 8 Å) областей ЭР in vitro. 5. Выяснение роли динамических характеристик воды в механизме полученных ранее эффектов «мнимых» (10-18-10-25 М) и сверхмалых (10-9–10-18М) концентраций α-ТФ на структуру биологических мембран путем изучения различия на основе многомерного критерия Махаланобиса флуктуаций показателей пропускания тонких слоев воды в 9 областях ИК-спектра: 35003200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см-1 в водно-спиртовых растворах α-ТФ в широком спектре концентраций (10-4–10-25 М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистиллированной деионизованной воде, взятыми в качестве эталонов. 1. 2. 3. 4. Основные положения, выносимые на защиту Действие α-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-4-10-25 М) при температуре 293 К на вязкостные характеристики различных по глубине регионов липидного бислоя в мембранах ЭР и ПМ носит во многом аналогичный нелинейный, полимодальный характер, связанный с наличием статистически достоверных эффектов в трех областях концентраций: «физиологических» - 10-4-10-9 М; СМД – 10-9-10-18 М и «мнимых» - 10-18-10-25 М. Основной вклад в механизм действия α-ТФ в каждой из трех областей его концентраций вносят различные процессы: а. в области традиционных «физиологических» концентраций (10-4–10-9 М) – ограничения при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы α-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов; б. в области СМД (10-9–10-18 М) – специфического связывания α-ТФ с лигандами на мембране (в частности, получена высокая корреляция изменения жесткости поверхностных областей липидов мембран ЭР и ПМ и степени ингибирования активности мембранно-связанного фермента пк-С (рецептора α-ТФ)); инициирования α-ТФ’ом образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся; в. в области «мнимых» концентраций (10-18–10-25 М) – изменения структурно-динамических характеристик воды, выступающей в роли полярного растворителя α-ТФ и среды окружающей мембраны. Концентрации α-ТФ, которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях, полученных при температуре 293 К, по сравнению с контролем вызывают появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода в липидном бислое в области физиологических температур 307-314 К (34-41 ˚С). Полярность растворителя (воды) α-ТФ имеет принципиальное значение для эффекта его «мнимых» концентраций (10-18-10-25 М). 6 5. В присутствии сверхмалой (10-15 М) и «мнимой» (10-20 М) концентраций αТФ происходят значительные статистически достоверные изменения структурно-динамического состояния водной основы растворителя. Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института в рамках программы фундаментальных исследований Отделения химии и наук о материалах РАН «Биомолекулярная и медицинская химия». Научная новизна. Впервые показано, что природный АО α-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-4-10-25М), включающем сверхмалые (10-9-10-18 М) и даже так называемые «мнимые» концентрации (<10-18 М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных регионов биологических мембран, выделенных из печени мышей. При этом зависимость эффекта от дозы водимого вещества имеет нелинейный полимодальный характер с максимумами в каждой из указанных областей и разделяющими их «мертвыми зонами», где эффект отсутствует. Впервые обнаружено, что α-ТФ в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липидной компоненты, индуцирует появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода липидов в области физиологических температур (307314 К, 34-41 С). Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим особым механизмом взаимодействия α-ТФ с биомембранами: в области «физиологических» концентраций (10 -4-10-7М) ограничением при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы α-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов; в области СМД (10-9-10-18М) – высокоэффективным специфическим взаимодействием со связывающими центрами на мембране (в частности, с пк-С), инициированием α-ТФ образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификацией уже имеющихся; в области «мнимых» концентраций α-ТФ (<10-18 М) - опосредованным влиянием на мембрану через изменение структурно-динамических характеристик воды. В связи с этим впервые экспериментально установлено, что именно полярные свойства растворителя (воды) играют основную роль в механизме действия «мнимых» концентраций БАВ вообще и α-ТФ в частности. Научно-практическое значение. Изменение структурно-динамических характеристик биологических мембран может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях. Обнаружение эффекта α-ТФ в СМД на структурное состояние липидной компоненты биологических мембран, являющейся одним из важнейших параметров системы регуляции ПОЛ, весьма существенно для возможного сниже- 7 ния терапевтической дозы α-ТФ при использовании его для коррекции ряда заболеваний, сопровождающихся нарушениями или изменениями функционирования данной системы. Личный вклад соискателя. Все результаты, представленные в работе, получены диссертантом лично, либо в соавторстве при его непосредственном участии в постановке и проведении экспериментов, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. Апробация работы. Материалы работы докладывались на ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН – ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2002, 2004, 2005), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), VI и VII Международных конференциях «Биоантиоксидант» (Москва, 2002, 2006), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва-Долгопрудный, 2004), First Dijon International Workshop on Lipids “Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders” (Dijon, France, 2005), 46-th International Conference on the Bioscience of Lipids (Ajaccio, Corsica, France, 2005), Всероссийской конференции молодых ученых и II школе им. академика Н.М. Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006), IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СанктПетербург, 2006), 4th Euro Fed Lipid Congress «Oils, Fats and Lipids for a Healthier Future» (Madrid, Spain, 2006). Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 19 печатных работах (6 журнальных статьях и 13 тезисах докладов), и 2 статьи поданы в печать. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 193 страницах, иллюстрирована 4 схемами, 50 рисунками и 6 таблицами. Библиография включает список из 288 работ. СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Во введении обоснована актуальность и научная новизна предлагаемого исследования, приводятся цель и основные задачи работы, а также ее научноприкладное значение. Первая глава содержит обзор современной литературы по теме данного исследования, в котором приводятся основные данные о структуре и номенклатуре витамина Е, транспорте α-ТФ в биологические мембраны и его локализации в них. Подробно рассмотрены современные представления о роли α-ТФ в обеспечении структурно-функциональной целостности мембран, как за счет его антиокислительных способностей и участия в регуляции ПОЛ в мембране, 8 так и путем непосредственного влияния на вязкостные характеристики липидного бислоя при встраивании в него и образования комплексов с веществами, оказывающими деструктивное действие на мембрану. Большое внимание уделено также рассмотрению основных закономерностей действия БАВ в СМД и имеющимся на данный момент представлениям о механизмах таких сверхслабых взаимодействий, так или иначе объясняющих эти закономерности. При этом отдельно обсуждается действие БАВ в СМД на клеточные и субклеточные мембраны. Объекты, материалы и методы исследования Приводятся во второй главе диссертации. В качестве объектов изучения были взяты мембраны ЭР и ПМ, которые выделялись из клеток печени мышей линии F1(C57xDBA2) методом последовательного центрифугирования (Hostetler, 1976, Loten, 1986). Содержание белка в мембранах определяли по методу Лоури (Lowry, 1951). В результате содержание белка в мембранах ЭР составило 4 мг/мл, а в ПМ – 2,5 мг/мл. Спирто-водные (полярные) растворы αТФ были получены методом последовательного разведения в кварцевой посуде через один порядок по концентрации исходного 10-1 М раствора α-ТФ спиртом высокой очистки фирмы “Merck” (Германия) до концентрации 10-3 М, а затем дистиллированной водой. Для приготовления неполярных растворов α-ТФ использовалось вазелиновое масло, которое является побочным продуктом перегонки нефти и представляет собой смесь минеральных масел с твердыми парафиновыми углеводородами. Структурное динамическое состояние мембран ЭР и ПМ изучалось на ЭПР-спектрометрах “Bruker 200D” и “Bruker EMX” (Германия) методом спинового зонда (Кузнецов, 1976, Гриффит, 1979). В качестве зондов были взяты стабильные нитроксильные радикалы 5- и 16-доксилстеариновые кислоты (зонды С5 и С16), локализующиеся на различных глубинах в липидном бислое (8 и 20 Å, соответственно) (рис. 1). Конечная концентрация зондов в мембранах не превышала 6*10-5М. Спектральные характеристики зондов С5 и С16 (параметр упорядоченности S или 2Амакс, который пропорционален S, и время вращательной корреляции τс) использовали в качестве формальных показателей жесткости поверхностных и микровязкости глубоколежащих областей мембраны при заданной температуре. Термостатирование образцов в резонаторе спектрометра ЭПР осуществляли с помощью термоприставки Bruker ER 4131 VT с точностью ±0,05 ˚С. Измерение параметров спектров ЭПР, входящих в формулы для S и с (рис. 1), осуществляли в автоматическом режиме с помощью оригинальных программ в вычислительной среде Origin 6.1 с использованием стандартных алгоритмов поиска экстремумов при заданном шаге дискретизации 0,06 Гс. Так, погрешность измерения расстояния между внутренним и внешними экстремумами в хорошо разрешенном спектре ЭПР зонда С5 составляла 0,2 Гс, а суммарная ошибка вычисления отдельных значений с и S по экспериментальным спектрам ЭПР зондов С16 и С5, полученным в результате 3-х накоплений, не превышала 0,04 нсек. и 0,002, соответственно. 9 5-доксилстеариновая кислота (зонд С5) 16-доксилстеариновая кислота (зонд С16) OH O N O O O N O OH O S 1,66 Амакс Амин Амакс 2 Амин с 6,5 Н 0 ( I0 1) 10 10 , сек I Рис. 1. Структурные формулы и спектры ЭПР зондов С5 и С16 в ПМ, иллюстрирующие методику расчета искомых параметров S (или 2Амакс) и τc. Время Схема, иллюстрирующая работу с образцами мембран, приведена на рис. 2, а на рис. 3 в качестве иллюстрации Исходная замороженная суспензия мембран изображены типичные графики, опиРазмораживание до сывающие изменение во времени пакомнатной температуры раметров S и с. Средние контрольные +1,3 мкл значения с в мембранах ЭР и ПМ со+1,3 мкл зонда зонда ставляли (1,50±0,03)нс и (1,71±0,03)нс, 200 мкл Проба 2 Проба 1 200 мкл соответственно, и находились в диапазоне быстрых вращений радикала С16 +3,3 мкл (Кузнецов, 1976). Среднее контроль- α-ТФ растворителя Контроль Инкубация при ное значение S в мембранах ЭР равняИнкубация при комнатной температуре лось 0,61±0,01, а в ПМ – 0,64±0,01. И комнатной температуре 15 минут S, и с по порядку величины совпадали с немногочисленными данными дру+3,3 мкл гих авторов (Рууге, 1986, Curtis, 1984, раствора α-ТФ Опыт Whetton, 1983, Гендель, 2002). Для Инкубация при комнатной температуре каждой концентрации -ТФ было про15 минут изведено от 3 до 5 параллельных измерений на мембранах, выделенных независимо друг от друга в различные времена года, а эффект выражался в Рис. 2. Методика экспериментов с мемпроцентах по отношению к контролю. бранами при постоянной температуре. 10 В качестве еще одной характеристики изменений, происходящих в мембране, использовалось представление о термоиндуцированных структурных перестройках («переходах») в липидном бислое, которые отображались точками излома между линеаризованными участками температурных зависимостей τс зонда С16 и S зонда С5, представленных в Аррениусовых координатах – Lgτc или –LgS от 1/Т (Chapman, 1975) (рис. 4). Точками излома считали те точки, добавление которых к спрямленному участку графика выводило коэффициент корреляции за пределы норм, определяемых числом степеней свободы и статистической надежностью 95%. Эффективная энергия активации перехода эфф E акт вычислялась на основе тангенса угла наклона спрямленного участка температурной зависимости в Аррениусовых координатах (Shinitzky, 1976). 0.66 10 -16 М -ТФ S 0.65 9,10 9,05 0.64 9,00 -Lg(c) 0.63 0.62 20 30 40 50 60 70 80 8,95 8,90 8,85 время (мин.) 8,80 2.0 10 -7 М -ТФ 8,75 с(нсек.) 1.9 3,10 3,15 3,20 3,25 3,30 3,35 3,40 3,45 3,50 3,55 3 1.8 1/T(*10 ) 1.7 1.6 35 45 55 65 75 85 95 105 115 эфф tgα=-b, E акт =2,3bR, где R = 8,31 Дж·моль-1К-1 время (мин.) Рис. 3. Типичные графики, описывающие изменение во времени параметров S (для 10-16 М α-ТФ) и с (для 10-7 М) в ПМ. Рис. 4. Характерная температурная зависимость τс зонда С16 в Аррениусовых координатах на примере действия контрольной пробы. Для измерения флуктуаций показателей пропускания тонких слоев водных растворов в девяти диапазонах ИК-спектра: 3500-3200, 3085-2832, 21201880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см-1 использовался новый тип ИК-спектрометра – аппаратно-программный комплекс ИКАР, разработанный на кафедре общей и биоорганической химии ТГМА. Устройство спектрометра позволяло повторять измерения в каждой полосе через 0,1 с. Для каждой пробы делалось 50 измерений в кюветах из KRS-стекол с толщиной водного слоя 20 мкм. Эксперимент повторяли 3 раза. Анализируемые образцы готовились непосредственно перед снятием показателей пропускания. В качестве формальной характеристики и целостного показателя изменений состояния воды в присутствии различных количеств α-ТФ использо- 11 вался критерий Махаланобиса, позволяющий учесть корреляционные связи между инфракрасными показателями эталона и образца и являющийся весьма чувствительным к дисперсиям показателей пропускания. Статистическая обработка данных осуществлялась методами параметрической и непараметрической статистики с использованием пакетов компьютерных программ Microsoft® Office Excel и Origin® 6.1 при статистической надежности 95%. Результаты исследований и их обсуждение Приводятся в третьей главе диссертации. Влияние α-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-4-10-25 М) на вязкостные характеристики различных по глубине регионов мембран ЭР и ПМ при постоянной температуре 293 К. Известно, что функциональное состояние биологических мембран зависит от их текучести, которая меняется в зависимости от глубины погружения в липидный бислой. Следовательно, характер воздействия БАВ на вязкостные характеристики мембраны может отличаться в различных по глубине областях липидного бислоя. Кроме того, биологические мембраны являются важным объектом исследования действия БАВ в СМД, поскольку предполагается, что они при этом могут выступать в роли критических мишеней. Поэтому представляло интерес изучить in vitro влияние различных концентраций α-ТФ, в том числе и сверхмалых, на вязкостные характеристики различных регионов липидов мембран ЭР и ПМ, имеющих биохимические и функциональные отличия. Мембраны ЭР являются распространенным объектом изучения процессов ПОЛ и антиокислительных свойств БАВ, а ПМ интересны с точки зрения взаимодействия различных регуляторных систем, таких как ПОЛ и циклов вторичных посредников. Нами установлено, что зависимости эффектов α-ТФ от его концентраций в широком диапазоне (10-4–10-25 М) на микровязкость глубоколежащих (рис.5а) и жесткость поверхностных (рис.5б) областей мембран ЭР и ПМ при температуре 293 К имеют в значительной степени аналогичный нелинейный, полимодальный характер, типичный для действия БАВ в широком диапазоне концентраций, включающем СМД. Полимодальность дозовых зависимостей связана с наличием достоверных изменений в трех областях концентраций: области «физиологических» концентраций α-ТФ (10-4–10-9 М), в которых он обычно действует в организме, его СМД (10-9–10-18 М) и даже «мнимых» концентраций (10-18–10-25 М), при которых вероятность нахождения хотя бы одной молекулы α-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю. Необходимо отметить при этом, что значения эффектов в каждой из приведенных областей вполне сравнимы между собой по величине. Максимумы и минимумы разделены так называемыми «молчащими» или «мертвыми» зонами, где эффект αТФ на исследуемые структурно-динамические характеристики мембран отсутствовал. Таким образом, α-ТФ по характеру своего воздействия на мем- 12 браны может быть отнесен к типу БАВ, проявляющих эффект в ультранизких концентрациях (< 10-13 М). ПМ 8 ЭР эффект, % 6 4 2 0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 -2 а -4 -Lg[альфа-токоферол] 4 ПМ эффект, % ЭР 2 0 3 б -2 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 -Lg[альфа-токоферол] Рис. 5. Концентрационные зависимости эффектов -ТФ на микровязкость глубоколежащих (20Å, а) и жесткость поверхностных (8Å, б) областей липидного бислоя мембран ЭР и ПМ при температуре 293 К. 13 Влияние отдельных концентраций α-ТФ на термоиндуцированные структурные переходы в различных по глубине регионах липидного бислоя, а также эффективную энергию активации переходов в глубоколежащих областях липидов мембран ЭР и ПМ Биологические мембранные структуры являются гетерогенными системами, характеризующимися наличием субмезофаз, поэтому помимо изменений вязкостных характеристик мембраны при постоянной температуре очень важными параметрами, описывающими происходящие изменения в структуре ее липидного бислоя, являются количество и качество термоиндуцированных структурных переходов в нем, а также эффективная энергия их активации эфф E акт в глубоколежащих областях липидов. Поэтому на очередном этапе для концентраций α-ТФ, соответствующих экстремумам и «мертвым зонам» на дозовых зависимостях на рис. 5, в обоих типах мембран были изучены температурные зависимости параметра упорядоченности S (характеристики жесткости поверхностных областей липидов) и времени вращательной корреляции τс (характеристики микровязкости глубоколежащих областей липидов) в диапазоне 285-319 К. Для выявления термоиндуцированных структурных переходов липидов (табл. 1 и 2) и определения эффективной энергии их активации полученные кривые были представлены в Аррениусовых координатах –Lgτc или – LgS от 1/Т (рис. 6-9). контроль 5e-5M 1e-6M 9.1 1e-14M 9.0 -Lg[ с] -Lg[ с] 9.0 контроль 1e-7M 9.1 8.9 8.9 8.8 8.8 8.7 3.12 3.17 3.22 3.27 3.32 3.37 3.42 3.47 3.52 8.7 3.11 3.16 3.21 3.26 3.31 3.36 3.41 3.46 3.51 1/T*10 3 (K-1) 1/T*10 3 (K-1) 9.2 -Lg[ с] 9.1 контроль 1e-15M 1e-18M 9.0 контроль 1e-20M 9.1 1e-22M -Lg[ с] 9.2 9.0 8.9 8.9 8.8 3.11 3.16 3.21 3.26 3.31 3.36 3.41 3.46 3.51 8.8 3.11 3.16 3.21 3.26 3.31 3.36 3.41 3.46 3.51 1/T*10 3 (K-1) 1/T*10 3 (K-1) Рис. 6. Температурные зависимости τс в диапазоне 285–320 К в контроле и при действии различных концентраций -ТФ in vitro в мембранах ЭР. 14 контроль 1е-4М 1е-8М 1e-13M 0.35 0.35 -LgS -LgS 0.30 0.25 контроль 1е-19М 1е-20М 1e-17M 0.40 0.30 0.25 0.20 0.20 0.15 3.12 0.15 3.12 3.22 3.32 3.42 3.52 3.22 3.32 3.42 3.52 1/T*10 3 (К-1) 1/T*10 3 (К-1) Рис. 7. Температурные зависимости S в диапазоне 285–319 К в контроле и при действии различных концентраций -ТФ in vitro в мембранах ЭР. контроль 8.9 1е-4М 8.9 1е-7М 8.8 1e-18M 1e-22M -Lg[ с] 1e-10M -Lg[ с] контроль 1e-14M tg =-b Eакт=b*R 8.8 8.7 8.7 8.6 8.5 3.12 3.17 3.22 3.27 3.32 3.37 3.42 3.47 3.52 8.6 3.12 3.17 3.22 3.27 3.32 3.37 1/T*10 3 (K-1) 3.42 3.47 3.52 1/T*10 3 (K-1) Рис. 8. Температурные зависимости τс в диапазоне 285–319 К в контроле и при действии различных концентраций -ТФ in vitro в ПМ. контроль контроль 0.35 1е-15М 1е-4М 0.35 1е-9М 1е-21М 0.30 -LgS -LgS 0.30 0.25 0.20 0.20 0.15 3.12 0.25 3.22 3.32 3.42 3.52 0.15 3.12 3.22 3.32 3.42 3.52 1/T*10 3 (К-1) 1/T*10 3 (К-1) Рис. 9. Температурные зависимости S в диапазоне 285–319 К в контроле и при действии различных концентраций -ТФ in vitro в ПМ. Как видно из данных табл. 1-2, те концентрации α-ТФ, которые соответствуют максимумам и минимумам на дозовых кривых на рис. 5, в обоих типах мембран вызывают появление дополнительных (а в глубоколежащих областях эфф липидов микросом также более высококооперативных с пониженной E акт ) по сравнению с контролем термоиндуцированных структурных переходов липидного бислоя, что может быть связано, по нашему мнению, с образованием мик- 15 родоменных структур в мембране. Важно отметить, что большинство таких дополнительных перестроек в липидном бислое (в табл. 1 и 2 – заштрихованы) обнаруживается в области физиологических температур 307-314 К (34-41С). Учитывая большое значение в жизнедеятельности клетки (в изменении проницаемости мембраны, образовании пор, слиянии мембран, возбудимости нервных тканей и проведении нервного импульса по аксону, терморегуляции, синаптическом экзоцитозе и т.д.) фазовых переходов в липидах биологических мембран (Антонов, 1992, Харакоз, 2001), этот факт может иметь важное регуляторное значение при действии не только «физиологических», но и сверхнизких и даже «мнимых» концентраций α-ТФ. Т,К контроль 5*10-5М 10-6М 10-7M 10-14M 10-15M 10-18M 10-20М 10-22М 285 288 А 8±1.2 291 7,7±1.1 5,1±0.5 6,1±0.6 4,6±0.5 5,8±0.5 293 16 294 5,1±0.4 6,5±0.4 297 9,3±0.9 13,1±1.9 10,9±1.6 15,6±1.5 7,5±0.6 299 300 8,8±0.9 6,9±0.1 302 17 11,7±1.1 303 6,1±0.6 304 305 306 6,8±0.5 9,2±0.5 6,8±0.6 308 11±0.8 6,8±0.4 310 18 7,1±0.2 312 9,8±0.7 314 13,2±1.2 316 14,7±1.4 318 320 19 Т,К контроль 10-4М 10-7М 10-10М 10-14M 10-18M 10-22М 285 287 Б 289 291 9.2±0.6 20 293 295 6.5±0.3 7.6±0.4 6.2±0.2 297 6.3±0.3 299 5.8±0.1 301 8.4±0.9 7.3±0.2 7.2±0.4 303 8.8±0.6 7.0±0.8 305 5.8±0.5 307 21 6.7±0.7 309 311 8.0±0.5 6.0±0.7 6.3±0.6 6.3±0.5 313 6.0±0.2 315 317 319 Табл. 1. Положения термоиндуцированных структурных переходов и эффективная энергия их активации (кДж/моль) в глубоколежащих областях (20Å) липидного бислоя мембран ЭР (А) и ПМ (Б) в контроле и при действии различных концентраций -ТФ in vitro. 22 Т,К контроль 10-4М 10-8М 10-13М 10-17M 10-19M 10-20М Т,К контроль 10-4М 10-9М 10-15М 10-21М 285 285 287 287 289 289 291 291 293 293 295 295 297 23 299 296 301 297 303 299 305 301 303 307 309 311 305 24 312 307 313 309 315 317 311 319 313 315 317 25 319 А Б Табл. 2. Положения термоиндуцированных структурных переходов в поверхностных областях (8Å) липидного бислоя мембран ЭР (а) и ПМ (б) в контроле и при действии различных концентраций -ТФ in vitro. Возможные механизмы действия α-ТФ на структуру микросомальных и плазматических мембран в трех областях концентраций Представленный экспериментальный материал позволяет заключить, что для обоих типов используемых мембран обнаруживаются одинаковые особенности действия различных концентраций α-ТФ на структуру их липидного бислоя, ключом для понимания которых могут являться общие механизмы наблюдаемых эффектов. При этом в зависимости от концентрации α-ТФ преобладающий вклад могут давать различные процессы, чем и обусловлен, повидимому, полимодальный характер зависимостей доза-эффект (рис. 5), одинаковый для мембран ЭР и ПМ. Неспецифическое встраивание α-ТФ в мембрану как механизм его действия в «физиологических» концентрациях (10-4–10-9 М) Упорядочивание поверхностных и глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран при введении в них -ТФ в «физиологических» концентрациях (10-4–10-9 М) обусловлено, прежде всего, ограничениями при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы -ТФ, что снижает их конформационную подвижность. Во многом эти процессы могут быть связаны с взаимодействием α-ТФ с молекулами фосфолипидов, приводящим к образованию комплексов с определенной стехиометрией (Gomez-Fernandez, 1989). Их распределение в плоскости мембраны может иметь произвольный характер, а также они могут образовывать домены и вызывать фазовое разделение, что проявляется в виде дополнительных термоиндуцированных структурных переходов в различных областях липидного 26 бислоя микросомальных и плазматических мембран печени (табл. 1 и 2). Увеличение вязкости или снижение текучести мембраны при встраивании в нее ТФ в «физиологических» концентрациях было не раз показано различными физическими методами в опытах на биологических и модельных мембранах, в том числе и методом спиновых зондов ЭПР (Wassall, 1991), и наши данные согласуются с их результатами. Специфическое взаимодействие α-ТФ со связывающими центрами на мембране и инициирование образования микродоменных структур в ней в качестве возможных механизмов действия α-ТФ в СМД (10-9–10-18 М) Одним из возможных объяснений эффектов СМД α-ТФ (10-9–10-18 М) на вязкостные свойства поверхностных и глубоколежащих областей микросомальных и плазматических мембран может являться его специфичное, высокоэффективное взаимодействие со связывающими центрами на мембране, изменяющее их конформационное состояние. В качестве такого связывающего центра в данном случае мы предполагаем поверхностный мембранно-связанный фермент пк-С, поскольку ранее в работах Мальцевой Е.Л. и соавторов (Пальмина, 1994) показано ингибирование его активности α-ТФ в СМД. В пользу высказанного предположения говорит и высокая степень корреляции, полученная при сопоставлении этих данных с изменением жесткости поверхностных областей, как микросомальных (Р<0,0001, r=0,95, рис. 10а), так и плазматических (Р=0,0047, r=0,87, рис. 10б) мембран. В этой связи стоит отметить, что содержание активной формы пк-С в микросомальных мембранах печени значительно ниже, чем в плазматических, при этом и эффект α-ТФ в СМД на вязкостные характеристики поверхностных областей микросом в 3 раза меньше по величине, чем в плазматических мембранах (рис. 5б). По-видимому, индуцированные в области локализации зонда С5 изменения, затем передаются в глубоколежащие области липидов мембран, что проявляется в виде максимумов в интервале концентраций 10-11-10-16М на рис. 5а. 1,4 70 1,2 60 1,0 0,8 50 0,6 40 0,4 30 0,2 0,0 20 -0,2 10 4 6 8 10 12 -Lg[-токоферол] 14 16 Б 80 70 3 60 50 2 40 30 1 20 10 0 0 4 6 8 10 12 14 -Lg[-токоферол] 16 18 Ингибирование активности PK-C, % 80 Изменение жесткости мембраны, % А Ингибирование активности ПК-C, % Изменение жесткости мембраны, % B Рис. 10. Изменение жесткости поверхностных областей мембран ЭР (а) и ПМ (б) и ингибирование активности пк-С in vitro в зависимости от концентрации α-ТФ. 27 Другим вероятным объяснением упорядочивания липидного бислоя мембран ЭР и ПМ при действии α-ТФ в СМД, по нашему мнению, может являться инициирование им образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране или модификация уже имеющихся. В ПМ в их роли могут выступать рафты, которые представляют собой особые области в мембране, значительно более упорядоченные по сравнению со своим микроокружением. Высказанное предположение основывается на том, что многие белки, участвующие в передаче сигналов в клетке, способны локализоваться в рафтах, в том числе и пк-С (Pike, 2003). Время жизни таких комплексов невелико (меньше 1 мс), однако действие внешних сигналов (в роли которых могут выступать лиганды), вызывающих конформационные изменения в белковых молекулах, может его значительно увеличить (вплоть до нескольких минут) и, кроме того, привести к объединению отдельных рафтов в более крупный домен. Поэтому мы предполагаем, что подобные процессы сопровождают взаимодействие α-ТФ в СМД с пк-С в процессе ингибирования ее активности. Присутствие α-ТФ в мембране, как в «физиологических», так и в сверхнизких концентрациях может влиять и на сам процесс формирования рафтов. Так, в качестве одного из механизмов их образования в литературе рассматривается пространственная несовместимость в жидко-кристаллической фазе между твердой стерольной структурой молекулы холестерина и жестким изгибом ненасыщенной углеводородной цепи соседней молекулы фософлипида, имеющей цис-двойную связь в положении С9-С10 (Subczynski, 2003). Такая затрудненность во взаимной упаковке молекул приводит к выталкиванию холестерина из областей с ненасыщенными фосфлипидами, с последующей его концентрацией и стабилизацией в областях с преимущественно насыщенным характером жирнокислотных цепей фосфолипидов. В этой связи стоит отметить, что α-ТФ, в свою очередь, с большим предпочтением взаимодействует с полиненасыщенными фосфолипидами, способствуя, таким образом, вытеснению холестерина и облегчая образование рафтов при действии α-ТФ как в «физиологических» концентрациях, так и в СМД. Предложенные механизмы с участием рафтов могут быть рассмотрены с определенной долей вероятности и в микросомах печени, если принять во внимание, что существуют работы, в которых высказываются обоснованные предположения об их существовании там (Muniz, 2001, Mayor, 1998). Роль полярных свойств растворителя (воды) в механизме действия «мнимых» концентраций α-ТФ (10-18-10-25 М) В диапазоне «мнимых» концентраций α-ТФ (10-18-10-25 М) вероятность нахождения хотя бы одной его молекулы в мембранной суспензии близка к нулю. В связи с этим для объяснения механизмов действия α-ТФ в этой области, по нашему мнению, имеет смысл обратиться к свойствам растворителя. Для выяснения, насколько важна при этом его полярность, мы провели сравнительное изучение действия α-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) и неполярном (вазелиновое масло) растворителях, на вязкос- 28 Эффект, % Эффект, % тные свойства глубоколежащих (~20Å) и поверхностных (~8Å) областей мембран ЭР in vitro. В результате 1 для обоих растворителей были получены полимодальные дозовые зависимости, имеющие фазовый характер, противоположный в 2 глубоколежащих (рис. 11а) и поверхностных (рис. 11б) областях липидного бислоя. 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Эффекты, не превышающие а -Lg[альфа-токоферол] по величине 2%, для зонда С16 принято считать нахо4 дящимися в пределах ошибки метода (заштрихованная 2 3 область на рис. 11а). Оказалось, что если в 2 1 областях «физиологических» 1 (10-4–10-9 М) и сверхмалых (10-9–10-18 М) концентраций 0 статистически достоверными -1 (p<0.05) эффектами обладают растворы α-ТФ в обоих -2 растворителях, то в области «мнимых» (10-18–10-25 М) 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 концентраций достоверный б -Lg[альфа-токоферол] эффект на вязкостные свойства поверхностных и глубоРис. 11. Действие α-ТФ в полярном (1) и неполярном колежащих областей липи(2) растворителях на микровязкость глубоколежащих (а) и жесткость поверхностных областей (б) мембран дов имеют только растворы ЭР при температуре 293 К. α-ТФ в полярном растворителе, в данном случае водном, что говорит о существенной роли полярности растворителя в механизме передачи «информации» о веществе в том или ином виде в процессе приготовления растворов. Полярные свойства воды связывают, прежде всего, со способностью ее молекул образовывать водородные связи друг с другом, что приводит в итоге к формированию короткоживущих водных ассоциатов (кластеров) небольшого размера (Saykally, 1993, Liu, 1996). Мы предположили, что их динамические характеристики (например, параметры флуктуаций, а также взаимодействия между ними) могут играть особую роль в процессе хранения и передачи информации о веществе, причем изменение их будет сказываться на целостной динамической структуре полярной среды. В качестве показателей, характеризующих структуру и динамику, а, следова14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 -8 29 Расстояние Махаланобиса тельно, состояние воды в определенных условиях и при различных воздействиях, в частности БАВ, могут использоваться флуктуации показателей пропускания воды в ИК-области спектра (Фесенко, 1999, Каргаполов, 2006). В связи с вышесказанным с целью выяснения роли динамических характеристик воды в механизме полученных нами ранее эффектов «мнимых» и сверхмалых концентраций α-ТФ на структуру биологических мембран мы совместно с сотрудниками кафедры общей и биоорганической химии Тверской государственной медицинской академии изучили различие флуктуаций показателей пропускания тонких слоев воды (20 мкм) в девяти диапазонах ИКспектра: 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см-1 в водно-спиртовых растворах α-ТФ в широком спектре концентраций (10-4–10-25 М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистиллированной деионизованной воде, взятыми в качестве эталонов. В качестве формальной характеристики изменений структурно-динамического состояния воды при отсутствии и в присутствии различных количеств α-ТФ использовался многомерный дискриминантный анализ на основе критерия Махаланобиса, который учитывает корреляции и дисперсии инфракрасных показателей эталона и образца, что позволило использовать его в качестве целостного показателя. В результате изучения влияния различных концентраций α-ТФ (10-4 – 1025 М) на структурное ди350 намическое состояние водного растворителя, оценен300 ное по критерию Махала250 нобиса, была получена полимодальная дозовая зави200 симость (рис. 12) с наибольшими отклоне150 ниями при действии α-ТФ в 100 СМД 10-15 и «мнимой» концентрации 10-20 М. 50 Дальнейший анализ позволил выявить две узкие 0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 области ИК-спектра (21201880 см-1 и 1710-1610 см-1), -Lg[токоферол] в которых α-ТФ не погло- Рис. 12. Влияние различных концентраций α-ТФ (10-4–10щает, соответствующие 25 М) на структурное состояние водного растворителя, оцененное по критерию Махаланобиса. Процентная точка деформационным и деформационноχ2-распределения составляет 16,9 (Р=95%, f=9). либрационным колебаниям молекулы воды, в которых дисперсии показателей пропускания 10-15 (рис. 13) и 10-20 М (рис. 14) растворов α-ТФ по отношению к эталону и 10-9 М раствору были гораздо выше, чем в остальной области спектра. 30 9 9 8 8 7 7 Номер канала Номер канала Учитывая, что в окрестности указанных концентраций α-ТФ происходили изменения вязкостных параметров поверхностных и глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных мембран, которые при смене растворителя α-ТФ с полярного на неполярный в области СМД модифицировались, а в области «мнимых» концентраций пропадали вовсе, мы предполагаем и разделяем мнение других авторов (Зубарева, 2003, Каргаполов, 2006), что изменения структурного динамического состояния воды играют основную роль в механизме действия «мнимых» концентраций α-ТФ и могут вносить определенный вклад при влиянии его СМД. 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 0.0 а 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 б Отношение дисперсий 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Отношение дисперсий 9 9 8 8 7 7 Номер канала Номер канала Рис. 13. Результаты сравнения дисперсий показателей пропускания 10-15 М раствора α-ТФ по отношению к эталону (а) и 10-9 М раствору α-ТФ (б) в 9 диапазонах ИК-области спектра. 6 5 4 3 2 а 5 4 3 2 1 1 0.0 6 0.5 1.0 1.5 2.0 Отношение дисперсий 0.0 2.5 б 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Отношение дисперсий Рис. 14. Результаты сравнения дисперсий показателей пропускания 10-20 М раствора α-ТФ по отношению к эталону (а) и 10-9 М раствору α-ТФ (б) в 9 диапазонах ИК-области спектра. 31 Заключение Приведено в четвертой главе диссертации, где кратко суммированы основные результаты предлагаемого исследования. В данной работе изучалось действие природного антиоксиданта α-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-4-10-25 М) на структуру различных по глубине областей биологических мембран с целью понимания общих механизмов действия БАВ в СМД, поскольку предполагается, что в роли критических мишеней при такого рода взаимодействиях могут выступать клеточные и субклеточные мембраны. Именно в них сосредоточены важнейшие регуляторные системы клетки – ПОЛ и циклы вторичных посредников, – эффективная работа которых во многом определяется структурно-динамическим состоянием мембран, зависящим от глубины погружения в липидный бислой. В качестве объектов исследования были выбраны мембраны ЭР и ПМ, имеющие различные липидный состав и функциональные особенности. Мембраны ЭР являются распространенным объектом изучения процессов ПОЛ и антиокислительных свойств БАВ, а ПМ интересны с точки зрения взаимодействия различных регуляторных систем, таких как ПОЛ и циклы вторичных посредников. Несмотря на имеющиеся биохимические и функциональные отличия для обоих типов мембран обнаружены одинаковые особенности влияния α-ТФ на их структурно-динамическое состояние. В частности, зависимости изменений жесткости поверхностных (~8Å) и микровязкости глубоколежащих (~20Å) областей липидного бислоя от концентрации вводимого α-ТФ при температуре 293 К в обоих типах мембран имеют в значительной степени аналогичный немонотонный, полимодальный характер, связанный с наличием эффектов в трех областях доз: области «физиологических» концентраций α-ТФ (10-4–10-9 М), в которых он обычно действует в организме, его СМД (10 -9–10-18 М) и даже «мнимых» концентраций (10-18–10-25 М), при которых вероятность нахождения хотя бы одной молекулы α-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю. При изучении температурных зависимостей характеристик микровязкости глубоколежащих и жесткости поверхностных областей липидов как микросомальных, так и плазматических мембран оказалось, что концентрации αТФ, соответствующие максимумам и минимумам на дозовых кривых, вызывают появление дополнительных (а в глубоколежащих областях липидов микросом также более высококооперативных) по сравнению с контролем термоиндуцированных структурных переходов липидного бислоя, большинство которых обнаруживается в области физиологических температур 307-314 К (3441 С). Учитывая большое значение в жизнедеятельности клетки фазовых переходов в липидах биологических мембран, этот факт может иметь важное регуляторное значение при действии не только «физиологических», но и сверхнизких и даже «мнимых» концентраций α-ТФ. Объяснение таким общим закономерностям, по-видимому, кроется в общих для обоих типов мембран механизмах наблюдаемых эффектов, зависящих от области действующих концентраций α-ТФ. В области «физиологических» концентраций α-ТФ (10-4–10-9 М) 32 наибольшее значение имеют ограничения при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы α-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов с образованием комплексов с определенной стехиометрией, способствующих фазовому разделению в мембране. В области СМД α-ТФ (10-9–10-18 М) на первый план выступает специфическое взаимодействие его молекул со связывающими центрами на поверхности мембраны (в частности, получена высокая корреляция изменения жесткости поверхностных областей липидов мембран ЭР и ПМ и степени ингибирования активности мембрано-связанного фермента пк-С (рецептора α-ТФ)), либо инициирования α-ТФ’ом образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся. В области «мнимых» концентраций α-ТФ (1018 –10-25 М), как нами впервые было экспериментально показано, основную роль играет полярность растворителя α-ТФ, в данном случае воды. Полярные свойства воды связывают, прежде всего, со способностью ее молекул образовывать водородные связи друг с другом, что приводит в итоге к формированию короткоживущих водных ассоциатов (кластеров) небольшого размера. Как нами в дальнейшем было показано, в присутствии сверхмалой 10 -15 М и «мнимой» 1020 М концентраций α-ТФ происходят значительные изменения структурнодинамического состояния водной основы растворов. Таким образом, судя по полученным нами результатам, с большой долей уверенности можно утверждать, что ведущую роль в процессах хранения и передачи «информации» о растворенном веществе, лежащих в основе механизма действия СМД и в первую очередь «мнимых» концентраций БАВ вообще и α-ТФ в частности, играют структурно-динамические характеристики воды, а сама вода представляет собой не только некую среду, в которой могут находиться молекулы действующего вещества, но и является активным участником происходящих в ней процессов взаимодействия на пути БАВ к своей мишени. Учитывая, что живые организмы состоят в основном из воды (по массе), полученные в данной работе сведения могут существенно дополнить имеющиеся представления о механизмах функционирования многих БАВ in vivo. ВЫВОДЫ 1. Изучено действие природного АО α-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-4-10-25 М) на структурные характеристики мембран ЭР и ПМ клеток печени мышей in vitro. Установлено, что для мембран ЭР и ПМ, несмотря на их биохимические и функциональные отличия, характерны полимодальные дозовые зависимости эффектов α-ТФ на жесткость поверхностных (~8 Å) и микровязкость глубоколежащих (~20 Å) областей липидного бислоя, имеющие во многом аналогичный характер и типичные для БАВ, проявляющих активность в широком диапазоне концентраций, включающем СМД. 2. Показано, что полимодальность полученных дозовых зависимостей связана с наличием статистически достоверных эффектов α-ТФ в трех областях кон- 33 3. 4. 5. 6. центраций, каждый из которых обусловлен преобладающим вкладом одного из возможных механизмов действия α-ТФ. А именно: а) в области традиционных «физиологических» концентраций (10 -4–10-9 М) – ограничения при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы α-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов; б) в области СМД (10-9–10-18 М) – специфического связывания α-ТФ с лигандами на мембране (в частности, получена высокая корреляция изменения жесткости поверхностных областей липидов мембран ЭР и ПМ и степени ингибирования активности мембранно-связанного фермента пк-С (рецептора α-ТФ)); инициирования α-ТФ’ом образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся; в) в области «мнимых» концентраций (10-18–10-25 М) – изменения структурно-динамических характеристик воды, выступающей в роли полярного растворителя α-ТФ и среды, окружающей мембраны. Изучены температурные зависимости вязкостных характеристик различных по глубине областей липидов и обнаружено, что те концентрации α-ТФ, в том числе и СМД, которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях при температуре 293 К, по сравнению с контролем вызывают появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода в липидном бислое в области физиологических температур 307–314 К (34-41 ˚С). Установлена принципиальная роль полярности растворителя (воды) α-ТФ в механизме действия его «мнимых» концентраций (10-18-10-25 М) путем сравнительного изучения эффектов полярных (спирто-водных) и неполярных (в вазелиновом масле) растворов α-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-4-10-25 М) на вязкостные характеристики различных регионов мембран ЭР. С помощью нового типа ИК-спектрометра – аппаратно-программного комплекса ИКАР – на основе критерия Махаланобиса обнаружены значительные изменения в структурном динамическом состоянии водного растворителя при введении как «мнимой» (10-20 М), так и СМД (10-15 М) α-ТФ, в окрестностях которых ранее наблюдались изменения структурных характеристик микросомальных и плазматических мембран; Выявлены две узкие области в ИК-спектре, в которых дисперсии показателей пропускания 10-15 М и 10-20 М растворов α-ТФ по отношению к эталону и 10-9 М раствору были гораздо выше, чем в остальной области спектра. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 34 1. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Влияние α-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей in vitro // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. №3. С.306-309. 2. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина, Е.Б. Бурлакова. Роль полярности растворителя в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах // Доклады Академии Наук. 2004. Т.399. №4. С.1-3. 3. Н.П. Пальмина, Л.В. Кледова, Т.В. Панкова, Е.Л. Мальцева, В.В. Белов, В.Е. Жерновков. Действие биологически активных веществ в сверхнизких концентрациях на физико-химические свойства мембран in vitro // Вопросы биохимической, медицинской и фармакологической химии. 2004. №4. С.3137. 4. N.P. Palmina, V.V. Belov, E.L. Maltseva. Modification of microsomal lipid domains by α-tocopherol in a wide concentration range in vitro // Chem. Phys. Lipids. 2005. V.136. №2. P.141-142. 5. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Действие α-токоферола в широком спектре концентраций на структуру микросомальных мембран // Биофизика. 2007. Т.52. вып.1. С.75-83. 6. V.V. Belov, E.L. Mal’tseva, N.P. Pal’mina, E.B. Burlakova. The role of solvent polarity in the mechanism of action of biologically active compounds at ultra low concentrations // In: «New Aspects of Biochemical Physics». Ed: S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov, G.E. Zaikov. Nova Science Publishers, New York. 2007. P.11-18. 7. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Влияние α-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики гидрофобных областей липидного бислоя мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей in vitro // Тезисы докл. II Ежегодной молодежной конференции ИБХФ РАН–ВУЗЫ «Биохимическая физика», 13-14 июня 2002г, Москва, с.26-27. 8. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Влияние α-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики гидрофобных областей липидного бислоя мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей in vitro // Тезисы докл. XIV зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 11-15 февраля 2002г, Москва, с.70-71. 9. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Влияние α-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики гидрофобных областей липидного бислоя мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей in vitro // Тезисы докл. VI Международной конференции «Биоантиоксидант», 16-19 апреля 2002г, Москва, с.658-659. 10.В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Влияние α-токоферола в широком спектре концентраций на структурные характеристики липидного бислоя мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени мышей in vitro 35 // Тезисы докл. III Международного симпозиума «Механизмы действия сверхмалых доз», 3-6 декабря 2002г, Москва, с.7. 11.В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Роль полярности растворителя в обеспечении эффекта сверхмалых доз биологически активных веществ // Тезисы докл. III Съезда биофизиков России, 24-29 июня 2004г., Воронеж, с.620-621. 12.В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Роль полярности растворителя в проявлении эффекта сверхмалых доз биологически активных веществ // Труды IV молодежной конференции ИБХФ РАН–ВУЗЫ «Биохимическая физика», 25–26 октября 2004г, Москва, с.24-25. 13.В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Влияние полярности растворителя на действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах // Тезисы докл. XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», 26–27 ноября 2004г., Москва–Долгопрудный, с.4. 14.V.V. Belov, E.L. Mal’tseva, N.P. Pal’mina. The effect of α-tocopherol in a wide range of concentrations on the structure of microsomal membranes // Abstract book of First Dijon International Workshop on Lipids “Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders”, June 21-24th, 2005, Dijon, France, p.50. 15.В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Модификация структуры плазматических мембран печени под действием α-токоферола in vitro // Труды V Международной молодежной конференции ИБХФ РАН – ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14–16 декабря 2005г, Москва, с.22-30. 16.В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Природный антиоксидант αтокоферол – модификатор плазматических мембран печени в широком спектре концентраций // Тезисы докл. Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. академика Н.М. Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты», 1-3 июня 2006 г., Москва, с.162-164. 17.Белов В.В., Рощина И.А., Шматов Г.П., Зубарева Г.М., Пальмина Н.П. Роль динамических характеристик воды в механизме действия α-токоферола в сверхмалых дозах // Тезисы докл. IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», 3-7 июля 2006г., Санкт-Петербург, с.223. 18.N.P. Pal’mina, V.V. Belov, E.L. Maltseva. Modification of lipid domains in liver plasmatic membranes by α-tocopherol in a wide concentration range in vitro // Abstract book of the 4th Euro Fed Lipid Congress «Oils, Fats and Lipids for a Healthier Future», 1-4 October 2006, Madrid, Spain, p.209. 19.В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина. Природный антиоксидант αтокоферол–модификатор плазматических мембран печени в широком спектре концентраций // Тезисы докл. VII Международной конференции «Биоантиоксидант», 25-26 октября 2006г, Москва, стр.73-74.
