МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени ШАКАРИМА г. СЕМЕЙ
Документ СМК 3
УМКД
УМКД 042–18-9.1.25/02 -2013
уровня
Учебно-методические Редакция № 1 от
материалы по
«__»____ 20__г.
дисциплине
«Биотехнология
микроорганизмов»
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ
КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ
«Биотехнология микроорганизмов»
для специальности 6М070100 - «Биотехнология»
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
Семей
2013
УМК 042-18-9.1.22/03-2013
Ред. N1 «__»____ 2013 г
Содержание
1. Лекции
2. Лабораторные занятия
3. Самостоятельная работа магистрантов
Страница 2 из 100
УМК 042-14.1.04.01.20.53-2008
Ред. N2 от 26.09.2008
Страница 3из
Лекция № 1
Тема: Ведение.
Биотехнология – это наука об использовании биологических процессов в технике и
промышленном производстве. Название ее происходит от греческих слов bios – жизнь,
teken – искусство, logos – слово, учение, наука.
В соответствии с определением Европейской федерации биотехнологов (ЕФБ,
1984) биотехнология базируется на интегральном использовании биохимии,
микробиологии и инженерных наук в целях промышленной реализации способностей
микроорганизмов, культур клеток тканей и их частей. Уже в самом определении предмета
отражено его местоположение как пограничного, благодаря чему результаты
фундаментальных исследований в области биологических, химических и технических
дисциплин приобретают выраженное прикладное значение.
Биотехнология непосредственно связана с общей биологией, микробиологией,
ботаникой, зоологией, анатомией и физиологией, биологической, органической,
физической и коллоидной химией, иммунологией, биоинженерией, электроникой,
технологией лекарств, генетикой и другими научными дисциплинами.
Возникновение, становление и развитие биотехнологии можно условно разделить
на четыре периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехнический.
Эмпирический (от греч. Empirikos – опытный) период – самый длительный,
охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лет – до нашей эры и около
2000 лет – нашей эры. Древние народы того времени интуитивно использовали приемы и
способы изготовления хлеба, пива и некоторых других продуктов, которые теперь мы
относим к разряду биотехнологических. Так, египтяне выпекали хлеб из кислого теста с
4000 годов до н. э., на востоке вино было известно с 2000 годов до н. э. В течение
нескольких тысячелетий известен уксус, издревле приготавливавшийся в домашних
условиях, хотя о микробах-индукторах этого процесса мир узнал в 1868 г. благодаря
работам Луи Пастера, несмотря на существование с XIV в. «орлеанского способа»
приготовления уксуса; первая дистилляция вина осуществлена в XII в.; водку из хлебных
злаков впервые получили в XVI в.; шампанское известно с XVIII века, но получение
абсолютного этанола впервые удалось в XIV в. испанцу Раймунду Луллию благодаря
перегонке вина с негашеной известью.
К тому же эмпирическому периоду относятся получение кисломолочных
продуктов и сыра, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, восточных
продуктов (соевого соуса и темпеха), силосованиекормов; мочка лубоволокнистых
растений; культивирование грибов.
Таким образом, народы исстари пользовались на практике микробиологическими
процессами, ничего не зная о микробах; эмпиризм также был характерен и в практике
использования полезных растений и животных.
Второй, этиологический (от греч. aitia – причина), период в развитии
биотехнологии охватывает вторую половину XIX в. и первую треть XX в. Он связан с
выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822 – 1895)
– основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин.
Пастер вскрыл микробную природу брожений, доказал возможность жизни в
бескислородных
условиях,
экспериментально
опроверг
представление
о
самопроизвольном
зарождении
живых
существ,
создал
научные
основы
вакцинопрофилактики и вакцинотерапии; предложил метод стерилизации, называемый по
его имени пастеризацией и т. д.
Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать индивидуальность
микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен
на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответствующих
процессов (бродильных, окислительных и др.). Например: масляно-кислые бактерии и
вызываемое ими масляно-кислое брожение, лактобактерии и молочнокислое брожение,
дрожжи – сахаромицеты и спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление
этанола до уксусной кислоты и т. д. В этот период было начато изготовление
прессованных пищевых дрожжей, а также некоторых продуктов обмена (метаболизма) –
ацетона, бутанола, лимонной и молочной кислот; во Франции приступили к созданию
биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.
Знание причин биологических процессов еще не исключало нестерильные
операции, хотя и стремились к использованию чистых культур микроорганизмов.
Для всестороннего изучения морфолого-физиологических свойств и продуктов
обмена микробов все ранее предложенные способы их выращивания оказались
малопригодными. Более того, накопление однородной по возрасту большой массы клеток
оставалось исключительно трудоемким процессом. Вот почему требовался
принципиально иной подход для решения многих задач в области биотехнологии. В 1933
г.
А. Клюйвер и Л. Х. Ц. Перкин опубликовали работу «Методы изучения обмена
веществ у плесневых грибов», в которой изложили основные технические приемы, а
также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном
культивировании грибов. С этого времени начинается третий период в развитии
биологической технологии – биотехнический. Началось внедрение в биотехнологию
крупно- масштабного герметизированного оборудования, обеспечившего проведение
процессов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного
биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития
производства антибиотиков – время Второй мировой войны (1939–1945 гг.), когда
возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с
инфицированными ранами. Все прогрессивное в области биологических и технических
дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое отражение в биотехнологии. Следует
отметить, что уже в 1969 г. Ф. Мишер получил «нуклеин» (ДНК) из лейкоцитов; В.
Оствальд в 1893 г. установил каталитическую функцию ферментов; Г. Хаберланд в 1902 г.
показал возможность культивирования клеток различных тканей растений в простых
питательных растворах; Ц. Нейберг в 1912 г. Раскрыл механизм процессов брожения; Л.
Михаэлис и М. Л. Ментен в 1913 г. разработали кинетику ферментативных реакций; Г. А.
Надсон и Г. С. Филиппов в 1925 г. доказали мутагенное действие рентгеновских лучей на
дрожжи и т. д. Следовательно, накопленные научные факты стали побудительным
мотивом для разработки способов крупномасштабного культивирования клеток
различного происхождения. Это необходимо было для получения различных клеточных
продуктов и самих клеток для нужд человека, и прежде всего в качестве (или в составе)
лечебных и профилактических средств: пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов,
декстрана, ряда аминокислот и многих других веществ. К 1950 г. Ж. Моно (Франция)
разработал теоретические основы непрерывного управляемого культивирования
микробов.
Примерно за 40 лет третьего периода были решены основные задачи по
конструированию, созданию и внедрению в практику необходимого оборудования, в том
числе главного из них – биореакторов. Это оборудование используют и в настоящее
время.
Четвертый период в биотехнологии – генотехнический (от греч. genesis –
происхождение, возникновение, рождение) – начался с 1972 г. В этом году П. Берг со
своими сотрудниками в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК.
Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953) по
установлению структуры ДНК было невозможно достигнуть современных результатов в
области биотехнологии. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК,
выделение и изучение специфических ферментов привело к формированию строго
научного подхода к разработке биотехнологических процессов на основе генноинженерных работ. В этом суть генотехнического периода.
Для генотехнического периода характерны: разработка интенсивных процессов
(вместо экстенсивных) на основе направленных фундаментальных исследований (с
продуцентами антибиотиков, ферментов, аминокислот, витаминов); получение
суперпродуцентов; создание продуцентов, несущих в себе бессмысленную генетическую
информацию (например, генов интерферона человека в клетках Pseudomonas aeruginosa);
создание необычных организмов, ранее не существовавших в природе (например,
создание неклубеньковых организмов, несущих гены азотобактерий, ответственных за
способность фиксировать молекулярный азот из воздуха); разработка и внедрение
экологически чистых и по возможности безотходных технологий; разработка и внедрение
в практику специальной аппаратуры блочного (сменного) типа для различных
биотехнологических схем; автоматизация и компьютеризация биотехнологических
процессов; создание экономически оптимальных производственных процессов при
максимальном использовании сырья и минимальном потреблении энергии.
В настоящее время биотехнология представляет собой биоиндустрию, которая
включает в себя, с одной стороны, отрасли, в которых биотехнологические методы могут
с успехом заменить широко используемые традиционные методы, а с другой – отрасли, в
которых биотехнология играет ведущую роль. Среди первых в области химической
промышленности относятся синтез искусственных приправ, полимеров и сырья для
текстильной промышленности, в области энергетики – получение метанола, биогаза и
водорода, в области биометаллургии – извлечение некоторых металлов из бедных руд. Во
второй группе отраслей биотехнология охватывает производство продовольствия
(широкомасштабное выращивание дрожжей, водорослей и бактерий для получения
белков, аминокислот, витаминов и ферментов); увеличение продуктивности сельского
хозяйства (клонирование и селекцию сортов растений, исходя из тканевых и клеточных
культур, производство биопестицидов и биоинсектицидов); фармацевтическую
промышленность (разработку вакцин, синтез гормонов, интерферонов и антибиотиков);
защиту окружающей среды и уменьшение ее загрязнения (очистку сточных вод,
переработку хозяйственных отходов, изготовление компоста, производство соединений,
поддающихся расщеплению микроорганизмами).
Контрольные вопросы:
1. Дайте определение понятию биотехнология.
2. Каковы основные этапы развития биотехнологии?
3. Взаимосвязь биотехнологии с различными отраслями науки.
Использованная литература:
1.
Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. Основы микробиологии и биотехнологии.
2.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
3.
Жвирблянская А.Ю., О.А. Бакушинская Микробиология в пищевой
промышленности.
Лекция № 2
Тема: Метаболизм микроорганизмов
1.
2.
План:
Анаболизм и катаболизм микробной клетки, их взаимосвязь.
Влияние физико-химических факторов среды на метаболические процессы.
1. Анаболизм и катаболизм микробной клетки, их взаимосвязь.
Метаболизм микробной клетки определяется суммой всех реакций распада
поступающих веществ (катаболизм) и синтеза структурных компонентов клетки и
метаболитов
(анаболизм)
катализируемых
ферментами
клетки.
Метаболизм
микроорганизмов имеет ряд особенностей:
 Микроорганизмы используют большое количество разнообразных
источников углерода и энергии;
 Метаболизм микроорганизмов характеризуется высокой эффективностью,
что объясняется большим значением отношения поверхности к объему;
 Главные внутриклеточные функции у микробов контролируются
ферментами;
 Микроорганизмы способны выделять во внешнюю среду как клеточные, так
и промежуточные продукты обмена;
 Микробная клетка нуждается в источниках внешней энергии для
поддержания процессов метаболизма, такими источниками являются богатые энергией
органические и неорганические соединения или свет;
 В зависимости от используемых источников энергии и углерода, конечных
продуктов у микроорганизмов выделяют 4 типа метаболизма – бродильный, дыхательный,
метаногенный и фототрофный.
Общая схема процессов катаболизма включает три стадии:
1) Расщепление макромолекул под действием гидролитических ферментов на
простые субъединиц (аминокислоты, моносахара, жирные кислоты,глицерин);
2) Распад простых субъединиц до ПВК, сопровождающийся образованием
насыщенных энергией (макроэргических) соединений;
3) Окисление или восстановление ПВК с образованием продуктов метаболизма,
сопровождающееся накоплением большого количества энергии.
Анаболические процессы включают биосинтез микробной клеткой полисахаридов,
белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот, липидов.
Для биосинтеза полимеров клетки необходимо получение субъединиц
макромолекул в результате катаболических процессов; накопление макроэргических
соединений и активирование субъединиц полимеров за счет энергии макроэргических
связей; образование специфических макромолекул путем полимеризации активированных
субъединиц.
Для построения макромолекул необходимы субъединицы с числом атомов углерода
от 1 до 6. Поставщиками этих соединений служат следующие процессы катаболизма:
- С1 (СО2): окисление субстратов, гетероферментативное брожение;
- С2 (ацетил-СоА); гликолиз;
- С3 : гликолиз, пентозофосфатный цикл;
- С4: ЦТК, пентозофосфатный цикл;
- С5: ЦТК, пентозофосфатный цикл;
- С6: гидролиз полисахаридов и олигосахаридов до моносахаров.
Исходя из этого клеточный метаболизм может быть поделен на 3 стадии:
1. Окислительные реакции, направленные на расщепление субстрата и ведущие к
образованию промежуточных продуктов (ацетил-СоА, ПВК, α-кетогоутаровой кислоты),
восстановленных кофакторов (НАДН2, ФАДН2) и АТФ;
2. Реакции регенерации (реокисления) кофакторов;
3. Биосинтетические реакции образования макромолекул, протекающие счет
энергии АТФ.
Первые 2 части –катаболизм; 3-я – анаболизм.
1
биосинтез
2
окисление субстрата
синтез
продуктов
О2
АТФ
3
регенерация кофакторора
НАД
дыхание
НАДН2
[H]
Синтез промежуточных
продуктов
Промежуточные
продукты
Н2О,N2
H2S и др
окислители
(O2,NO2
SO42-и
др.)
Брожение Восстанов- проленные
дукты
продукты броже
ния
2. Влияние физико-химических факторов среды на метаболические процессы.
Существенное влияние на рост культуры и метаболические процессы оказывают
факторы внешней среды, активизирующие или ингибирующие действие клеточных
ферментов.
1). Состав и концентрация компонентов питательной среды обеспечивает
метаболические
реакции
необходимыми
субстратами.
Недостаток
вызывает
лимитирование ферментов клетки субстратом. Избыток - субстратное насыщение и
ингибирование роста в результате повышения осмотического давления.
2). Концентрация продуктов метаболизма – замедляет протекание биохимических
реакций.
3). рН среды – важным условием нормальной жизнедеятельности микроорганизмов
является поддержание постоянного значения внутриклеточного рН (для ацидофилов 6,07,0; алкалофилов 9,0-10,0; нейтралофилов 7,5). Значение рН оказывает существенное
влияние на синтез того или иного метаболита. В ряде случаев оптимум для роста
культуры и образования продукта неодинаков. С увеличением температуры
культивирования диапозон переносимых значений рН сужается.
4). Температура – оказывает влияние на эффективность конверсии субстрата в
клеточную массу, скорость роста, состав внутри- и внеклеточных метаболитов.
Температурный режим предопределяет выбор микроорганизмом того или иного
метаболического пути (Bacillus cereus: 30-320C – гликолиз; 7-10оС – пентозофосфатный
путь). Снижение температуры менее оптимальной для роста культуры приводит к
замедлению диффузии растворенных веществ через мембрану и понижению
энзиматической активности. Температуры, превышающие оптимум роста, как правило,
стимулируют продукцию метаболитов.
5). Осмотическое давление и активность воды. Увеличение концентрации
растворенных веществ приводит к повышению осмотического давления. Метаболическая
реакция микроорганизма на повышение осмотического давления может быть двух типов:
- транспорт соли через мембрану в цитоплазму;
- синтез в клетке органических веществ, повышающих осмотическое давление в
цитоплазме.
Осморегуляторные механизмы могут вовлекать 5 групп веществ: неорганические
ионы, аминокислоты, дисахариды, полиолы, бетаины.
Со значением осмотического давления связан показатель активности воды
(отношение давления водяного пара раствора к давлению водяного пара чистого
растворителя). Для большинства микроорганизмов границы жизнедеятельности
определяются значениями аw = 0,6-1,0/
6). Содержание растворенного кислорода – обеспечивает метаболические
процессы аэробов, являясь акцептором ионов Н+; замедляет или полностью подавляет
развитие анаэробов.
7). Содержание растворенного диоксида углерода – необходимо для метаболизма
автотрофов, для гетеротрофов может как стимулировать, так и подавлять метаболические
процессы.
8). Вязкость среды – определяет диффузию питательных веществ из объема среды к
поверхности клетки.
Вопросы для самоконтроля:
1. Каковы особенности процессов метаболизма микроорганизмов?
2. Какие стадии включает процесс катаболизма микроорганизмов?
3. Перечислите основные физико-химических факторы среды, влияющие
метаболические процессы
на
Использованная литература:
1.
Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. Основы микробиологии и биотехнологии.
2.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
3.
Жвирблянская А.Ю., О.А. Бакушинская Микробиология в пищевой
промышленности.
Лекция № 3
Тема: Механизмы регуляции роста микроорганизмов и биосинтеза продуктов
метаболизма.
План:
1. Классификация механизмов регуляции метаболизма.
2. Ферментная регуляция метаболизма.
3. Генная регуляция метаболизма.
1. Классификация механизмов регуляции метаболизма.
В микробных клетках функционируют различные системы регуляции метаболизма.
Одни из них направлены на регуляцию синтеза ферментов клетки, другие – на регуляцию
их активности. Посредниками в осуществлении этих механизмов являются
низкомолекулярные соединения, синтезируемые клеткой или поступающие из
питательной среды.
По механизму синтеза все ферменты клетки можно разделить на две группы:
1). Конститутивные – начинают синтезироваться как только клетка попадает в
оптимальную для действия данных ферментов среду, к ним относятся ферменты
гликолиза, и других путей распада сахаров, ЦТК и др.;
2). Индуцируемые – образуются только при наличии специфических веществ
(индукторов); примерами таких ферментов являются целлюлазы, амилазы, липазы и др.
В настоящее время принято выделять три вида внутриклеточной регуляции
метаболизма микроорганизмов:
1). Регуляция метаболитами. Осуществляется изменениями концентраций
метаболитов (промежуточных продуктов обмена) без изменения количества ферментов и
их активности. Примером этого типа является регуляция дыхания. Поток электронов через
дыхательные цепи связан со скоростью образования АТФ. Т.к. интенсивность
образования АТФ лимитируется количеством АДФ, то последнее ограничивает и
интенсивность реакции переноса электронов по дыхательной цепи.
2). Ферментная регуляция – связана с изменением активности ферментов без
изменения их количеств, при воздействии на ферменты регулирующих (активирующих
или ингибирующих факторов). На ферментном уровне выявлено несколько механизмов
регуляции. Для анаболических путей метаболизма преобладающим является механизм
регуляции конечным продуктом – конечный продукт ингибирует один из первых
ферментов последовательности реакций биосинтеза.
3). Генная регуляция – основана на изменении количества ферментов вследствие
влияния регулирующего фактора на биосинтез или разрушение ферментов. Данный тип
оказывает наиболее глубокое и эффективное воздействие на процессы метаболизма
клетки, т.к. генная регуляция определяет количество и активность синтезируемого
фермента, в то время как другие механизмы регуляции лишь непосредственно или
косвенно воздействуют на активность ферментов (по выражению М.Е.Бекер
«обеспечивают их тонкую настройку»).
2. Ферментная регуляция метаболизма.
В настоящее время расшифрованы следующие механизмы регуляции метаболизма
микроорганизмов:
- регуляция конечным продуктом;
- регуляция путем обратимого фосфорилирования;
- регуляция посредством ковалентной модификации;
- регуляция аллостерических ферментов;
- регуляция в результате ограниченного протеолиза;
- регуляция белками – ингибиторами ферментной активности.
Регуляция конечным продуктом. Общий механизм биохимической активности у
микроорганизмов заключается в ингибировании фермента, катализирующего новую
стадию метаболического пути конечным продуктом этого пути по типу обратной связи.
Механизм регуляции по принципу обратной связи раскрыт для многих вторичных
метаболитов. В частности,для пенициллина регулирующим агентом является аминоцил-Lлизин.
Регуляция путем обратимого фосфорилирования. Основана на циклическом
переходе ферментов. Катализирующих ключевые реакции катаболизма и анаболизма из
фосфорилированных форм в дефосфорилированные. Присутствие фосфат ионов
необходимо в среде для осуществления каталитических реакций распада
углеводов,биосинтеза фосфолипидов, полифосфатов, нуклеиновых кислот. Во всех этих
случаях ферменты, способные образовывать фосфорилированные формы, выполняют
функции транспорта фосфата.
Регуляция посредством ковалентной модификации.
При ковалентной модификации происходит взаимопревращение двух форм
ферментов путем ковалентного присоединения или удаления определенной
функциональной группы: ацетила, адениловой или фосфорильной группы. Например,
активность глутанатсинтетазы у многих бактерий регулируется через обратимое
аденилирование и деаденирование.
Регуляция путем ограниченного протеолиза. Ограниченный протеолиз является
одним из распространенных методов перевода неактивной формы белковой молекулы в
форму, проявляющую каталитическую активность. При протеолитическом отщепления
определенного участка молекулы высвобождается активный центр, изменяется его
строение и т.д. Такой механизм широко распространен для клеточный протеаз. В ряде
случаев ограниченный протеолиз обеспечивает подавление биологической активности
ферментов.
Регуляция аллостерических ферментов. Основана на изменениях конформации
фермента, ведущей к изменению его активности. Свойства аллостерических белков
изменяются в результате присоединения специфической низкомолекулярной молекулы –
эффектора. Аллостерические ферменты имеют, как правило, четвертичную структуру.
Каждая субъединица имеет два разобщенных связывающих участка: каталитический и
регуляторный (аллостерический), присоединение к которому эффектора изменяет
конформацию каталитического центра, активируя или инактивируя его. У
микроорганизмов широко распространен механизм регуляции, при котором метаболит
действует как аллостерический эффектор, катализирующий либо его собственное
превращение, либо образование продукта, находящегося далее в цепи.
Белки-ингибирты – являются одной из универсальных систем контроля
метаболизма микробной клетки. Многие известные ингибиторы белковой природы имеют
высокий уровень специфичности. В настоящее время наиболее изучены ингибиторы
гидролаз. Это белки с небольшой молекулярной массой (около 10000 ед.), не содержат
простетической группы. Белки – ингибиторы характеризуются высокой устойчивостью к
протеолизу. Локализация их может быть как внутри-, так и внеклеточной.
3. Генная регуляция метаболизма.
Индуцируемый ферменты синтезируются клеткой в ответ на воздействие
определенного фактора внешней среды, в качестве которого выступает, как правило,
какой-либо компонент внешней среды – эффектор.
Под эффекторами понимают вещества, вызывающие изменение скорости синтеза
белков при их попадании в микробную клетку. При этом вещества. Индуцирующие синтез
клеткой определенного фермента называют индукторами, а вещества, подавляющие
синтез – репрессорами. Регуляция метаболизма микроорганизмов на генном уровне
основана на использовании механизмов индукции и репрессии синтеза клеточных
ферментов.
Индукция. Впервые механизм индукции был изучен Жакобом и Моно на примере
синтеза индуцируемого фермента β-галактозидазы E.coli. Гены, определяющие структуру
ферментов с близкими функциями, сгруппированы в хромосоме в единичный оперон.
Например, в состав lag-оперона E.coli входят три гена: ген z –кодирующий
аминокислотную последовательность β-галактозидазы, ген у – структурный ген пермеазы
(транспорт лактозы в клетку), ген а – структурный ген ацилазы. Оперон находится под
контролем регуляторного участка молекулы ДНК - промотора.
Функции промотора заключаются в связывании РНК-полимеразы, ответственной за
синтез и-РНК, которая переносит информацию о аминокислотной последовательности
определенного фермента или группы ферментов. Последовательность пуриновых и
пиримидиновых оснований в промоторе определяет, с какой частотой РНК-полимераза
будет присоединяться к нему, т.е. задает максимальную скорость транскрипции гена и,
как следствие, количество синтезируемого фермента.
На участке ДНК между промотором и опероном к молекуле присоединяется
репрессор – аллостерический белок, каждая субъединица которого имеет сродство к
нуклеоидной последовательности молекулы ДНК в месте присоединения; второй
способен присоединять молекулу эффектора (индуктора или репрессора).
Жакоб и Моно предложили следующую модель деятельности lag-оперона E.coli. В
отсутствии индуктора белок-репрессор связан с молекулой ДНК, блокируя структурные
гены, т.е. синтез β-галактозидазы подавлен. При присоединении к аллостерическому
центру индуктора (аллолактоза β-Д-гал(1-6) Д-глю) изменяется конформация белкарепрессора и его сродство с молекулой ДНК. В результате высвобождаются структурные
гены и активируется синтез ферментов. Данный механизм получил название негативной
регуляции индукции синтеза ферментов. В ряде случаев имеет место позитивная
регуляция индукции. Например, ферменты метаболизма арабинозы у E.coli синтезируются
под контролем белка-репрессора, способного осуществлять позитивную регуляцию. В
отсутствии арабинозы ферменты, участвующие в ее расщеплении (изомераза, киназа,
эпимераза), синтезируются клеткой E.coli в малых количествах, т.к. репрессор блокирует
транскрипцию соответствующего оперона.
Аутогенная регуляция. В данном случае в качестве репрессора выступает фермент,
информация о синтезе которого зашифрована на контролируемом участке ДНК.
Индуктором, как правило, является продукт катаболизма, образующийся под действием
фермента.
(+)
Х1 – нуклеотидные предшественники;
(-)
Х1
Х2
Х2 – специфическая и-РНК;
Х3 – аминокислотные предшественники
Х3
Х4
Х4 – фермент катаболизма;
Х5 – субстрат;
Х5
Х6 Х6 – продукт-индуктор.
ЛАКТОЗА
АРАБИНОЗА
Репрессор
промотор
ген в
ген а
ген d
Р ген с ДНК
lag-оперон
z
y
a
РНК
эпимераза изоме- киназа
раза
репрессор
арабиноза
Аутоиндукция. Сущность этого явления заключается в перестройке метаболизма
клетки в направлении синтеза за счет внутриклеточных компонентов. Так, культура гриба
Asp.niger, культивируемая в условиях дефицита источников азота, вырабатывает
индуктор, ускоряющий синтез протеаз.
Репрессия. При регуляции метаболизма по механизму репрессии белок-репрессор в
отсутствии эффектора находится в неактивном состоянии, т.е. транскрипция генов и
синтез фермента не ограничены. При достижении определенной концентрации продукта
катаболизма, образующегося при участии фермента, репрессор переходит в активную
форму, блокируя транскрипцию. Таким образом, продукт метаболизма в данном случае
выступает в роли специфического эффектора (корепрессора), ингибирующего синтез
фермента.
Частным случаем данного механизма является катаболическая репрессия, тесно
связанная с глюкозным эффектом. Катаболическая репрессия заключается в блокировании
синтеза ферментов, отвечающих за расщепление лактозы, галактозы, мальтозы и др.
сахаров, продуктами расщепления глюкозы. Синтез ферментов, ответственных за
включение углеводов в процесс гликолиза индуцируется циклическим аденозинмонофосфатом (ц АМФ), который взаимодействует со специфическим белкомактиватором катаболизма (БАК; сар-белок). В результате образуется активированный
комплекс, связывающийся с промотором и тем самым инициирующий транскрипцию
соответствующих генов. Образование продуктов катаболизма глюкозы ингибирует синтез
ц-АМФ и в результате блокирует транскрипцию генов, несущих информацию о синтезе
ферментов катаболизма лактозы, мальтозы и др. сахаров.
Вопросы для самоконтроля
1. На какие группы можно разделить все ферменты клетки по механизму синтеза?
2. Назовите основные виды внутриклеточной регуляции метаболизма микроорганизмов.
3. Опишите генную регуляцию метаболизма микроорганизмов.
4. Охарактеризуйте аутогенную регуляцию, аутоиндукцию и репрессию.
Использованная литература:
1. Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. Основы микробиологии и биотехнологии.
2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
3. Жвирблянская А.Ю., О.А. Бакушинская Микробиология в пищевой
промышленности.
Лекция № 4
Тема: Рост и культивирование микроорганизмов.
План:
1. Рост микроорганизмов (фазы)
2. Способы культивирования микроорганизмов
1. Рост представляет собой увеличение количества химических компонентов
микробной клетки. Для характеристики роста микроорганизмов используется понятие
бактериальной массы, которое выражается плотностью бактерий (сухая масса на 1 мл).
Размножение микробов описывается числом бактерий, отражающим концентрацию
клеток в 1 мл. Строгой пропорциональности между увеличением числа бактерий и
бактериальной массы нет. Это объясняется тем, что в популяции бактерий не все клетки
являются жизнеспособными - часть из них мертвые, некоторые находятся на разных
этапах деструкции. Участвуя в создании бактериальной массы, такие клетки не участвуют
в дальнейшем размножении бактерий.
Размножение бактерий происходит путем прямого деления. При этом образуется
перетяжка или начинается врастание цитоплазматической мембраны внутрь,
перпендикулярно продольной оси клетки с образованием диска - клеточной пластины. Эта
пластина иногда может быть неполной и имеет отверстие, в центре которой соединяет обе
сестринские клетки. В дальнейшем в клеточную пластину врастает боковая стенка,
которая образует поперечную перегородку, делящую клеточную пластину на две части,
каждая из которых отходит к одной из образовавшихся клеток. Центральное отверстие, не
разделенное поперечной перегородкой или пластиной, получило название плазмодесмоса.
Плазмодесмос играет роль в соединении клеток некоторых бактерий в длинные цепочки
или группы. Помимо отмеченного, процесс деления бактериальных клеток может
происходить путем перешнуровывания. Число бактериальных клеток в процессе
размножения увеличивается в геометрической прогрессии. Для большинства бактерий
время генерации составляет 20 - 30 минут.
Рост и размножение бактерий проявляются по-разному в зависимости от условий
культивирования. На плотных питательных средах проявлением роста и размножения
бактерий является появление колоний, представляющих собой визуально различимые
скопления бактериальных клеток. Колонии характеризуются набором определенных
признаков, на основании которых можно идентифицировать чистые культуры бактерий. К
этим признакам относятся: размеры (крупные, средние, мелкие, микроскопические);
форма (круглые, распластанные и др.); окраска, зависящая от образования бактериями
пигментов; поверхность (выпуклая, плоская, матовая, блестящая и др.); характер краев
(ровный, шероховатый и др.); консистенция (однородная, пастообразная, слизистая и др.);
прозрачность (прозрачные, мутные).
При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока
содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигнет
минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не
добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим так
называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном
пространстве). Рост в такой «закрытой системе» подчиняется закономерностям,
действительным не только для одноклеточных, но и для многоклеточных
организмов. Периодическая культура ведет себя как многоклеточный организм с
генетически ограниченным ростом.
Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени,
называется кривой роста. Типичная кривая роста (рис. 6.6) имеет S-образную форму и
позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной
последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную (или лаг-)
фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу
отмирания.
Рост микроорганизмов на твердых питательных средах протекает в основном так
же, хотя при этом достигаются значительно более высокие плотности клеток.
Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и
достижением максимальной скорости деления. Продолжительность этой фазы зависит
главным образом от предшествовавших условий культивирования и возраста инокулята, а
также от того, насколько пригодна для роста данная среда. Если инокулят взят из старой
культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к
новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если
источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в
предшествующей культуре, то приспособление (адаптация) к новым условиям может быть
связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не
синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом.
Хорошим примером влияния субстрата на синтез ферментов служит так
называемая диауксия (рис. 6.7). Это явление двухфазного роста или двойного цикла роста
наблюдается на средах, содержащих смесь питательных веществ. Из смеси глюкозы и
сорбитола Escherichia coli, например, поглощает в первую очередь глюкозу. Глюкоза
индуцирует сначала в клетках синтез ферментов, которые нужны для ее использования.
И одновременно подавляет (репрессирует) синтез ферментов, необходимых для
использования сорбитола. Эти последние ферменты образуются лишь после того, как вся
глюкоза будет израсходована. Такие регуляторные процессы достаточно хорошо
объясняют наличие двух начальных фаз.
Количественное изменение состава бактериальной клетки во время начальной фазы
роста сильнее всего затрагивает рибонуклеиновую кислоту: содержание РНК повышается
в 8-12 раз. Это указывает на участие РНК и рибосом в синтезе ферментных белков.
Экспоненциальная фаза. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста
характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во
время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды.
Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин, Escherichia coli при 37°С-примерно
каждые 20 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у Nitrosomonas иNitrobacter-даже 5-10 ч.
Величина клеток и содержание в них белка у многих бактерий тоже остаются в
экспоненциальной фазе постоянными. В известном смысле можно сказать, что
бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток». Если точно
установлено, что число клеток, содержание в них белка и их сухая биомасса
увеличиваются с одинаковой скоростью, то за ростом культуры можно следить, пользуясь
каким-нибудь одним из этих показателей.
Нередко, однако, и в экспоненциальной фазе роста клетки периодической культуры
претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается
концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются
продукты обмена. В связи с тем что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток
относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и
скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, окислительно-восстановительного
потенциала, температуры, аэрации и т. д.), а также пригодность различных субстратов,
следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии
во время экспоненциального роста.
Стационарная фаза. Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток
перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата-при
уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает
снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит
постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но
также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального
давления 02 или накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают
переход к стационарной фазе. И в стационарной фазе могут еще происходить такие
процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез
ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост.
Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют
жизнеспособность-до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого
энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков.
Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или
урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а
также от условий культивирования.
Фаза отмирания. Фаза отмирания и причины гибели бактериальных клеток в
нормальных питательных средах изучены недостаточно. Сравнительно легко понять
случаи, когда в среде накапливаются кислоты (при росте Escherichia, Lactobacillus). Число
живых клеток может снижаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под
действием собственных ферментов (автолиз).
2. Культивирование микроорганизмов может происходить периодическим и
непрерывным методами. Когда применяют периодический метод культивирования
микроорганизмов, то весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу,
добавляют посевной материал и при оптимальных условиях ведут процесс до тех пор,
пока не накопится нужное количество биомассы микроорганизмов или метаболитов —
продуктов их жизнедеятельности. При периодическом культивировании изменяется
состав среды: уменьшается концентрация питательных веществ и увеличивается
содержание метаболитов. Так, в экспоненциальной фазе роста микроорганизмов
питательные вещества среды быстро истощаются и происходит накопление продуктов
метаболизма, в результате чего культура переходит в стационарную фазу. Таким образом,
при периодическом методе изменяются темп роста, морфология и физиология
культивируемого микроорганизма. К тому же возникают технологические трудности —
циклический ход операций, сменные технологические режимы, что затрудняет контроль и
регулирование процесса.
Указанные трудности можно устранить применением проточных, постоянно
обновляемых сред, т. е. при непрерывном культивировании, методы которого разработаны
С.В. Лебедевым, А.А. Андреевым, Н.Д. Иерусалимским и другими учеными. Из
непрерывных методов лучше всего разработан так называемый метод глубинной
ферментации. Характерным для этого метода является то, что клетки микроорганизмов
суспендированы в питательной среде и находятся во взвешенном состоянии. При этом
методе в ферментатор с культурой микроорганизма — продуцента непрерывным потоком
поступает свежая питательная среда и постоянно вытекает готовая культуральная
жидкость вместе с клетками введенной культуры микроорганизма.
При непрерывном культивировании можно задержать культуру на любой стадии
развития и заставить клетки размножаться с соответствующей скоростью по
экспоненциальному закону.
Процесс непрерывного культивирования может быть гомо- и гетерогеннонепрерывным. Способ проточного культивирования, при котором во всех точках
ферментатора благодаря интенсивному перемешиванию сохраняются одинаковые
параметры среды и содержание микробной биомассы в единице объема жидкости остается
все время постоянным, называют гомогенно-непрерывным. Применение такого способа
обеспечивает постоянство состава среды в ферментаторе.
Когда культивирование проводят в одном ферментаторе, непрерывность процесса
создается благодаря подвижному равновесию между приростом микробной биомассы и
уменьшению
ее
за
счет
разбавления
культуры
свежей
средой.
В бродильном производстве распространен гетерогенно-непрерывный метод, при котором
процесс ведется в батарее последовательно соединенных ферментаторов. Состав
жидкости, протекающей через аппараты, постепенно изменяется согласно некоторому
градиенту. Поэтому этот способ известен так же, как градиентно-непрерывный.
Питательная среда поступает в первый ферментатор, а готовая культуральная жидкость
вытекает из последнего ферментатора. Градиентно-непрерывный способ брожения
широко применяют в производстве этанола, пива и шампанского. За время прохождения
через батарею бродильных аппаратов среда постепенно изменяется, а взвешенные в ней
дрожжевые клетки стареют и даже отмирают.
При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо так
отрегулировать скорость притока питательной среды и вытекания культуральной
жидкости, чтобы вымывания культуры из системы не происходило, т. е. концентрация
клеток была бы постоянной.
Для осуществления непрерывного процесса брожения наиболее целесообразно
использовать многоступенчатые батареи, т. е. градиентно-непрерывный метод. С
помощью этого метода культивирование микроорганизма проводят до конца, включая
этап отмирания, таким образом добиваясь полной переработки субстрата и максимального
выхода продукта.
Непрерывный метод обеспечивает однородность и стандартность получаемого
продукта.
Продуктивность
микроорганизма
непрерывно
поддерживается
на
максимальном уровне. Процесс идет все время с равномерной скоростью, что открывает
большие возможности для автоматизации.
Для непрерывного культивирования применяют два типа аппаратов: турбидостат и
хемостат. Для поддержания культуры в состоянии максимальной скорости роста
используют турбидостат.
Рост в хемостате. Хемостат состоит из сосуда, в который вводят с постоянной
скоростью питательный раствор. По мере поступления питательного раствора из него
вытекает суспензия микроорганизмов с той же скоростью. При культивировании в
условиях хемостата поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов
среды (например, углерода). Благодаря этому в условиях хемостата поддерживается
постоянная скорость роста культуры. Культура микроорганизма находится в условиях
динамического равновесия.
Рост в турбидостате. Работа турбидостата основана на поддержании постоянной
концентрации живых клеток. В сосуде для культивирования все питательные вещества
содержатся в избытке, а скорость роста бактерий приближается к максимальной.
Если же целью культивирования является получение метаболита (например,
этилового спирта), выход которого в среду обитания не соответствует логарифмической
фазе роста, применяется способ непрерывного выращивания в двух или нескольких
последовательно соединенных аппаратах, что позволяет как бы расчленить процесс на
несколько стадий.
Характерная особенность непрерывного метода культивирования — постоянство
благоприятных условий для жизнедеятельности микроорганизмов при установившемся
режиме, когда технологический процесс протекает при оптимальных параметрах, без
изменения состава среды и свойств самих микроорганизмов.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что представляет собой рост микроорганизмов?
2. Дайте определение явлению плазмодесмоса.
3.Охарактеризуйте кривую роста микроорганизмов.
4. Что представляет собой явление диауксии?
5. Как поддерживают условия хемостата при росте непрерывной культуры?
6. Как поддерживают условия турбидостата при росте непрерывной культуры?
7. Чем отличается периодическое культивирование от непрерывного?
8. Каким образом осуществляется культивирование микроорганизмов глубинным
способом?
Использованная литература:
1. Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. Основы микробиологии и биотехнологии.
2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
3. Жвирблянская А.Ю., О.А. Бакушинская Микробиология в пищевой
промышленности.
Лекция № 5
Тема: Производства, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов.
План:
1. Производство продуктов микробного синтеза первой фазы
2. Производство продуктов микробного синтеза второй фазы
1.
Производство продуктов микробного синтеза первой фазы. К наиболее
известным промышленным продуктам микробного синтеза относятся: ацетон, спирты
(этанол, бутанол, изопропанол, глицерин), органические кислоты (лимонная, уксусная,
молочная, глюконовая, итаконовая, пропионовая), ароматизаторы и вещества,
усиливающие запахи (глутамат натрия). Спрос на последние постоянно увеличивается изза тенденции к употреблению малокалорийной и растительной пищи, для придания вкусу
и запаху пищи разнообразия. Ароматические вещества растительного происхождения
можно производить путём экспрессии генов растений в клетках микроорганизмов.
Методом генной инженерии в клетки Е. coli введён ген, кодирующий синтез аантитрипсина человека, ингибирующсго активность эластазы. Его образование
бактериями достигает 15% синтеза всех клеточных белков. Таким образом получают
препарат эглин, применяемый для компенсации врождённого отсутствия а-антитрипсина,
приводящего к тяжёлой форме эмфиземы лёгких. Иммуномодулятор бестатин, ингибитор
поверхностных
пептидаз
лимфоцитов,
продуцирует
Streptococcusolivoretuculi.
Микроорганизмы — продуценты ингибиторов других важных в медицине ферментов.
Например, ингибитор амилазы, синтезируемый Streptococcustendae, блокирует гидролиз
крахмала и снижает содержание сахара в крови; назначается больным диабетом.
Каптоприл из культуральной жидкости стрептококков препятствует образованию
ангиотензина II и снижает артериальное давление (АД) у гипертоников.
2.
Производство продуктов микробного синтеза второй фазы. С
использованием микроорганизмов получают витамины В1, В2 (продуценты— бактерии,
грибы родов Candida, Pichia, Ashbya); фолиевую, пантотеновую кислоты, пиридоксаль,
витамин В12 (продуценты — Propionibacteriumshermanii, Pseudomonasdenitrificam или
метаногенные бактерии). Витамин С производят путём химического синтеза, однако этап
высокоселективного дегидрирования D-сорбита в L-сорбозу осуществляют с помощью
уксуснокислых бактерий.
Получение продуктов брожения. Брожение — это одна из разновидностей
биологического окисления субстрата у гетеротрофных микробов в целях получения
энергии, когда акцептором электронов или атомов водорода является органическое
вещество.
Биотехнологические бродильные процессы изучены давно в сравнении, например,
с биотехнологией антибиотиков, аминокислот и других продуктов. Однако некоторые
брожения реализованы на практике относительно недавно, например, брожения с
участием Zymomonas spp.
В основе многих бродильных процессов лежит универсальная реакция
превращения глюкозы (источник углерода) в ключевой промежуточный продукт
(интермедиат) — пировиноградную кислоту, или пируват, из которого синтезируются
различные конечные продукты. По метаболиту, образующемуся в наибольшем
количестве, называют соответствующее брожение: спиртовое, масляно кислое,
молочнокислое, и т. д.
Спиртовое брожение. Оно лежит в основе получения этилового спирта, кормовых и
пищевых дрожжей, пивоварения и виноделия. Возбудителями спиртового брожения могут
быть дрожжи — сахаромицеты, некоторые мицелиальные грибы (Aspergillus oryzae) и
бактерии (Erwinia amylovora, Sarcina ventricula, Zymomonas mobilis, Z. anaerobia). Среди
названных организмов дрожжи занимают ведущее место, а получение с их помощью
этанола относят к разряду наикрупнейших в мире. Этанол используют в различных
отраслях народного хозяйства: то как растворитель, то как сырье для химического
синтеза, широко используют в медицине, и т. д.
Специальные штаммы Saccharomyces cerevisiae рекомендованы как биообъекты в
производстве этанола (на африканском континете чаще применяют Schizosaccharomyces
pombe и S. octosporus).
Штаммы подразделяют в свою очередь на расы верхового и низового брожений, а
по способности к флокуляции — на хлопьевидные и пылевидные. Расами верхового
брожения являются спиртовые, хлебопекарные и некоторые пивные дрожжи, расами
низового брожения — большинство винных и пивных дрожжей.
Клетки обеих рас могут быть подвержены флокуляции. При этом следует помнить,
что пылевидные дрожжи находятся в диспергированном состоянии в течение бродильного
процесса. Они менее стойки к автолизу, но более полно сбраживают сусло; хлопьевидные
— оседают на дно или всплывают на поверхность, они более выраженные ароматизаторы.
В отличие от S. cerevisiae аэротолерантные бактерии Z. Mobilis меньше
чувствительны к этанолу, у них отсутствует катаболитная репрессия, а удельная скорость
потребления глюкозы и образования этанола в 2—3 раза выше.
Катаболизм глюкозы протекает по Энтнеру-Дудорову. Однако скорость
размножения этой бактерии низка и продуктивность по спирту не столь высока. Здесь
остается резерв надежд на позитивные результаты генетико-селекционной работы с
продуцентом.
Значительный интерес представляет S. rosei. Эти дрожжи способны образовывать
этанол при использовании топинамбура (земляная груша), в котором из углеводов
содержится преимущественно инулин, сбраживаемый после гидролиза до этанола.
Топинамбур хорошо растет даже в северных регионах (Архангельская, Ленинградская и
другие области) на бедных супесчаных почвах.
Ацетонобутиловое брожение. Углеводные источники (крахмал, патока,
гидролизаты целлюлозы различного происхождения и др.), применяемые для дрожжей
при спиртовом брожении, могут быть использованы при ацетонобутиловом брожении,
протекающем в анаэробных условиях в процессе жизнедеятельности спорообразующих
бактерий — Clostridium acetobutylicum. В результате образуются такие нейтральные
продукты, как ацетон и бутанол, а также уксусная и масляные кислоты, диоксид углерода,
водород. Нейтральные продукты представляют большой интерес для промышленного
органического синтеза (эфиров для лакокрасочной промышленности), как экстрагенты и
растворители, и т. д. Несмотря на то, что синтетические и биотехнологические процессы
получения ацетона и бутанола являются конкурирующими, на практике реализуют оба
вида производств, так как все зависит, главным образом, от стоимости сырья
(экономические проблемы). Очевидно "сосуществование" синтетических и биологических
технологий получения одних и тех же продуктов оправдано временем и жизнью общества.
Биосинтез ацетона и бутанола (в ФДФ-пути по Эмбдену-Мейергофу-Парнасу)
существенно зависит от рН сред — при низких значениях активируются ферменты,
участвующие в трансформации ацето-АцКоА в ацетон и, соответственно, больше
расходуется НАД • Н для восстановления бутирил-КоА в бутанол. Уксусная и масляная
кислоты выступают здесь в роли минорных компонентов, причем, первая из них может
подвергаться конденсации до бутирата, который, в свою очередь, через бутирил-КоА
превращается в бутанол (в незначительном количестве может образовываться этанол).
Таким образом, бутанол и ацетон являются основными продуктами ацетонобутилового
брожения.
Получение органических кислот. Прежде чем рассмотреть конкретные
биотехнологические процессы получения органических кислот, необходимо оговориться,
что под рубрику "брожения" должно быть отнесено образование в анаэробных условиях
только молочной и пропионовой кислот с помощью соответствующих бактерий, тогда как
биосинтез лимонной, глюконовой, итаконовой и некоторых других органических кислот
определенными микромицетами представляет собой разновидность того или иного
окислительного (аэробного) процесса и поэтому отнесение их к брожениям является
условным.
Бродильные процессы получения органических кислот. Получение молочной
кислоты. Образование молочной кислоты (СН3СНОНСООН) лактобактриями происходит
в естественных условиях при скисании молока и молочных продуктов, а также при ее
целенаправленном получении в производственных условиях.
Молочнокислые бактерии относят к 4 родам: Lactobacillus, Leuconostoc,
Streptococcus и Pedicoccus. Род Lactobacillus включает 3 подрода — Thermobacterium,
Streptobacterium и Betabacterium. Представители первого из них не растут при 15оС, но
могут выдерживать температуры выше 50оС. Стрептобактерии не являются термофилами.
Бетабактерии образуют DL-молочную кислоту из глюкозы. Одни из них (термобактерии,
стрептобактерии, стрептококки и педикокки) являются гомоферментативными,
образующими при сбраживании гексоз преимущественно молочную кислоту, другие
(бетабактерии и лейконостоки) — гетероферментативными, образующими молочную и
уксусную кислоты, диоксид углерода, возможно — этанол; молочнокислые бактерии
могут использовать мальтозу, глюкозу, лактозу, осахаренный крахмал и пр. В целом,
лактобактерии — требовательны к питательным средам — многие из них нуждаются в
ряде витаминов из группы
В, некоторых аминокислотах, пуринах и пиримидинах, отдельных органических
кислотах алифатического ряда (уксусной, лимонной, олеиновой). Для сбраживания
глюкозы и гидролизатов крахмала на практике применяют обычно Lactobacillus
delbrueckii, L.bulgaricus, L. leichmanii (одни или в смеси между собой или со Streptococcus
lactis), для сбраживания мальтозы иногда используют L. casei.
В промышленном производстве молочной кислоты обычно используют
термофильные гомоферментативные виды, активно синтезирующие целевой продукт,
например, при 50оС. Таким видом яляется L. delbrueckii штамм Л-3, отличающийся
высокими стабильностью и активностью кислотообразования (выход молочной кислоты
составляет 95—98% от потребленной сахарозы). Этот вид внедрен в промышленность еще
в 1923 г. под руководством В. Н. Шапошникова.
Принципиальная технологическая схема получения L( + )-молочной кислоты
состоит в следующем: мелассную среду, содержащую 5—20% сахара, вытяжку солодовых
ростков, дрожжевой экстракт, витамины, аммония фосфат, засевают L. delbrueckii.
Брожение протекает при 49—50оС при исходном рН 6,3—6,5. По мере образования
молочной кислоты ее периодически нейтрализуют мелом. Весь цикл ферментации
завершается за 5—10 дней; при этом в культуральной жидкости содержатся 11—14%
лактата кальция и 0,1—0,5% сахарозы (80—90 г лактата образуются из 100 г сахарозы).
Клетки бактерий и мел отделяют фильтрованием (отход), фильтрат упаривают до
концентрации 30%, охлаждают до 25оС и подают на кристаллизацию, которая длится
1,5—2 суток.
Кристаллы лактата кальция обрабатывают серной кислотой при 60—70оС, гипс
выпадает в осадок, а к надосадочной жидкости добавляют желтую кровяную соль при
65оС для удаления ионов железа, затем натрия сульфат для освобождения от тяжелых
металлов. Красящие вещества удаляют с помощью активированного угля. После этого
раствор молочной кислоты подвергают вакуум-упариванию (при остаточном давлении
800—920 кПа) до 50% или 80%. Оставшийся не до конца очищенный раствор молочной
кислоты используют для технических целей. Более очищенную кислоту можно получать
при перегонке ее сложных метиловых эфиров, при экстракции простым изопропиловым
эфиром в противоточных насадочных колоннах.
Получение антимикробных веществ. К антимикробным средствам относят
антисептики, дезинфектанты и химиотерапевтические вещества.
Антисептики — это химические вещества, неизбирательно и губительно
действующие на микроорганизмы (в том числе — патогенные), находящиеся на
поверхности тела и слизистых оболочек открытых полостей.
Дезинфектанты — это, в основном, антисептики, действие которых направлено на
патогенные микроорганизмы, находящиеся на (в) объектах внешней среды.
Химиотерапевтические средства — это вещества синтетическогои природного
происхождения, избирательно и губительно действующие на патогенные микробы, клетки
злокачественных опухолей и гельминты.
Антисептики,
дезинфектанты,
неорганические
и
синтетические
химиотерапевтические средства не имеют непосредственного отношения к
биотехнологии. В то же время подавляющее большинство антибиотиков получают при
ферментации
микробов-продуцентов,
или,
в
других
случаях,
применяют
"антибиотическое ядро" для синтеза целевого продукта — полусинтетического
антибиотика.
Известны единичные антибиотики (ранее получаемые с помощью биосинтеза или
получаемые таким путем и ныне), которые в настоящее время производят на
предприятиях органического синтеза (левомицетин и некоторые другие).
Таким образом, определение понятия "антибиотики" теперь относят к веществам
природного, полусинтетического и, реже, синтетического происхождения, которые в
малых концентрациях ингибируют рост (размножение) каких-либо микроорганизмов.
Продуцентами одних антибиотиков (например, бацитрацина, по- лимиксина и др.),
являются бациллы, других — актиномицеты (например, актиномицинов, гентамицинов,
канамицинов), третьих — нитчатые грибы (например, гризеофульвина, пенициллинов,
цефалоспоринов), четвертых—неспорообразующие бактерии (например, монобактамов).
Получение аминокислот. Аминокислоты играют большую
роль в
здравоохранении, животноводстве и легкой промышленности.
По значению для макроорганизма аминокислоты подразделяют на заменимые и
незаменимые. К незаменимым относят те аминокислоты, которые не синтезируются в
человеческом и/или животном организме, они должны быть привнесены с пищей или
кормом для животных.
Заменимые синтезируются in vivo из аммиака и различных источников углерода.
Микроорганизмы сами синтезируют все необходимые им аминокислоты из аммиака и
нитратов, а углеродные "скелеты" — из соответствующих интермедиатов.
Исходя из такой оценки аминокислот, ученые давно стремятся использовать
способности микроорганизмов продуцировать заменимые и незаменимые аминокислоты в
ощутимых количествах.
Потребность людей в аминокислотах достаточно велика и эти определяется
уровень их производства в мире (порядка 500 тыс. тонн в год).
Специфические ферменты, регулирующие биосинтез аминокислот, широко
распространены у бактерий; они с определенной глубиной изучены у Escherichia coli,
Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis и пр. У грибов, в ответ на аминокислотное
лимитирование, отмечается некоординированное, параллельное возрастание уровня
ферментов, катализирующих реакции биосинтеза различных аминокислот. Этот "общий
контроль биосинтеза аминокислот" был также назван "метаболическим интерблоком", или
"перекрестнопутевой регуляцией", впервые выявленной у Neurospora crassa в 1965 г. М.
Карсиотисом и сотрудниками, а позднее — у Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans
и других грибов.
В гиперпродукции отдельных аминокислот культурами E.coli, Serratia marcescens и
др. важную роль играют Feedback-ингибиция и Feedback-репрессия, например, при
биосинтезе ароматических аминокислот на последних стадиях. Штаммы —
суперпродуценты, эксплуатируемые в производстве, как правило, получены с
использованием методов генетики и селекции.
Технология получения аминокислот базируется на принципах ферментации
продуцентов и выделении вторичных метаболитов, то есть размножают маточную
культуру вначале на агаризованной среде в пробирках, затем — на жидкой среде в колбах,
инокуляторах и посевных аппаратах, а затем в головных (основных) ферментаторах.
Отработку культуральных жидкостей и выделение аминокислот проводят по схеме,
аналогичной схеме получения антибиотиков (см.). Изолированные чистые кристаллы
целевого продукта обычно высушивают под вакуумом и упаковывают.
Если аминокислота предусмотрена в качестве добавки к кормам, то
биотехнологический процесс кормового продукта включает следующие стадии:
ферментацию, стабилизацию аминокислоты в культуральной жидкости перед
упариванием, вакуум-упаривание, стандартизацию упаренного раствора при добавлении
наполнителя, высушивание и упаковку готового продукта, в котором должно содержаться
не более 10% основного вещества. Например, в промышленности изготавливают сухой
кормовой и жидкий кормовой концентраты лизина наряду с кристаллическим лизином.
Известны два способа получения аминокислот: одноступенчатый и
двухступенчатый. Согласно первому способу, например, мутантный полиауксотрофный
штамм — продуцент аминокислоты культивируют на оптимальной для биосинтеза среде.
В двухступенчатом способе микроб-продуцент культивируют в среде, где он
получает и синтезирует все необходимые ингредиенты для последующего синтеза (в
идиофазу) целевого продукта.
Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются внутриклеточно, то
после 1-й ступени клетки сепарируют, дезинтегрируют и применяют клеточный сок. В
других случаях для целей биосинтеза целевых продуктов применяют непосредственно
клетки.
Экономически целесообразными являются способы получения аминокислот с
помощью иммобилизованных ферментов и клеток.
Получение витаминов. Витамины поставляются в организм с пищей или их
назначают в форме лекарственных препаратов при определенных патологических
процессах. Среди липидо- и водорастворимых витаминов известны реализованные
биотехнологические процессы производства витаминов А и D, рибофлавина,
аскорбиновой кислоты, цианкобаламина (В12).
Аскорбиновая кислота, или витамин С — это противоцинготный витамин,
имеющийся у.всех высших растений и животных; только человек и микробы не
синтезируют ее, но людям она неотложно необходима, а микробы не нуждаются в ней. И,
тем не менее, определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к биосинтезу
полупродукта этой кислоты — L-сорбозы. Таким образом, весь процесс получения
аскорбиновой кислоты является смешанным, то есть химико-ферментативным.
Биологическая
стадия
процесса
катализируется
мембраносвязанной
полиолдегидрогеназой, а последняя (химическая) включает последовательно следующие
этапы: конденсация сорбозы с диацетоном и получение диацетон — L-сорбозы, окисление
диацетон — L-сорбозы до диацетон-2-кето-Е-гулоновой кислоты, подвергаемойзатем
гидролизу с получением 2-кето-Ь-гулоновой кислоты; последнюю подвергают энолизации
с последующей трасформацией в L-аскорбиновую кислоту.
Ферментацию G.oxydans проводят на средах, содержащих сорбит (20%),
кукурузный или дрожжевой экстракт, при интенсивной аэрации (8—10 г Ог/л/ч). Выход
L-сорбозы может достичь 98% за одни-двое суток. При достижении культурой log-фазы
можно дополнительно внести в среду сорбит, доводя его концентрацию до 25%. Также
установлено, что Coxydans может окислять и более высокие концентрации полиспирта
(30—50%), создаваемые на последних стадиях процесса. Это происходит благодаря
полиолдегидрогеназы, содержащейся в клеточной биомассе. Ферментацию бактерий
проводят в периодическом или непрерывном режиме.
Принципиально доказана возможность получения L-сорбозы из сорбита с
помощью иммобилизованных клеток в ПААГ. Аскорбиновую кислоту используют как
антиоксидант в здравоохранении и пищевой промышленности.
Получение микробных препаратов — удобрителей почв, стимуляторов и
регуляторов роста растений. На основании более чем векового изучения
азотфиксирующих микроорганизмов утвердилось представление о целесообразности
производства в промышленных масштабах лишь клубеньковых бактерий, поскольку
эффективность от внесения в почву препаратов из свободноживущих азотфиксаторов по
разным причинам является незначительной. Однако ясно, что в условиях интенсивного
земледелия и бурного роста населения земли плодородие почвы — одна из главнейших
проблем, на решение которой должны быть направлены усилия различных специалистов,
включая биотехнологов. И нельзя считать, что свободноживущие азотфиксаторы не будут
вновь объектами биотехнологии. Очевидно не все изучено применительно к их
ассоциативным взаимоотношениям в среде обитания и значение самой среды, заметно
изменяющейся при энергичном воздействии на нее человека.
Микроорганизмы, фиксирующие азот из воздуха, подразделяют
на
свободноживущие в природных условиях и на симбиотические с растениями или другими
микробами. К свободноживущим относят азотобактеры, актиномицеты, определенные
цианобактерии и др., к микробам-симбионтам: азотоспириллы — симбионты папоротника
азолла, ризобии — симбионты бобовых растений, отдельные виды цианобактерии в
составе лишайников (лишайники представляют собой пример устойчивого симбиоза
некоторых грибов с цианобактериями или водорослями), и др.
Микробы-азотофиксаторы ежегодно фиксируют примерно 17,5* 107 т
молекулярного азота из воздуха, из которых 10—15% приходится на цианобактерии.
Очевидно, что до тех пор, пока не будут созданы "молекулярные гибриды" микробов —
азотофиксаторов с широким набором полезных растений методами генной инженерии,
использование соответствующих "препаратов-удобри-телей" будет целесообразным и
экономически оправданным.
В таком же ряду находятся микробные стимуляторы и регуляторы роста растений
— гиббереллины, фузикокцин и др.
Ризотрофин — своеобразный "потомок" коммерческого препарата "нитрагин",
впервые созданного в 1896 г. в Германии. Он представляет собой торфяную основу,
смешанную с ризобактериям. Производство ризотрофинаразработано во ВНИИ
сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург).
Технологический процесс производства ризотрофина включает подготовку
клубеньковых бактерий и получение инокулята, подготовку торфа, "обсеменение" торфа
ризобактериями (отбор видов' с учетом целесообразных рекомендаций по выращиванию
соответствующих растений-"хозяев").
В производстве используют клубеньковые бактерии, быстро или сравнительно
медленно размножающиеся на простых средах, содержащих растительные экстракты или
отвары, сахарозу (рН 6,8—7,0) — для первых, почти то же самое — для вторых, но
добавляют глюкозу, маннит, сахарозу.
Инокулюм готовят в условиях умеренной аэрации на подобных средах, но
дополнительно вводят неорганические соли: фосфаты, сульфаты, карбонаты (температура
28—30оС); необходимо пеногашение. Накапливают примерно 5 млрд. клеток в 1 мл Такую
суспензию вносят в "кислый" торф (рН 3,0—6,0) при 10-15оС.
Предпочтительнее использовать древесно-осоковые или осоковые торфа с
удельной площадью поверхности порядка 300 м2/г. Торф до "обсеменения" бактериями
должен быть специально подготовленным —гомогенным, подсушенным, размолотым,
увлажненным, смешанным с мелом, расфасованным в полиэтиленовые пакеты по 150—
160 г и простерилизованным методом радиационного облучения — 2,5 Мрад. В
подготовленный торф "инъецируют" 50-60 мл суспензии бактерий (в торфе должно
содержаться 0,5—1 млрд. клеток/г). После этого содержимое пакетов перемешивают во
вращающемся барабане и продукт сохраняют до полугода при 5—10оС — применительно
к быстро растущим ризобактериям и при 12—15оС — применительно к медленно
растущим ризобактериям. Расход ризотрофина — 200 г на гектарную норму семян любых
бобовых растений.
В странах Юго-Восточной Азии используют цианобактерии Anaboena azollae,
обитающие в полостях листьев папоротника Azolla. Азоллу выращивают в специальных
прудах, откуда ее вывозят по назначению. Такая симбиотическая ассоциация — хороший
"удобритель" азотом рисовых полей.
В последние годы много внимания уделяют бактериям рода Asospirillum —
активному азотофиксатору, обитающему в почве (реже — на надземной части растений) в
ассоциации с кукурузой, просом, сахарным тростником и др.
Вопросы для самоконтроля:
1. Какие виды производств продуктов микробного синтеза относят к первой фазе?
2. Какие виды производств продуктов микробного синтеза относят ко второй фазе?
3. Какие микроорганизмы являются возбудителями спиртового брожения? Химизм
процесса.
4. Каким образом осуществляется ацетонобутиловое брожение?
5. Какие микроорганизмы являются производителями молочной кислоты?
6. Опишите технологическую схему получения L( + )-молочной кислоты.
7. Что такое антисептики, дезинфектанты?
8. На каких принципах базируется технология получения аминокислот?
9. Охарактеризуйте процесс получения витаминов.
10. Получение микробных препаратов — удобрителей почв, стимуляторов и регуляторов
роста растений.
Использованная литература:
1. Елинов Н. П. Основы биотехнологии.
2. Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. Основы микробиологии и биотехнологии.
3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
4. Жвирблянская А.Ю., О.А. Бакушинская Микробиология в пищевой
промышленности.
Лекция № 6
Тема: Витаминные препараты.
План:
1. Витамины. Общее понятие.
2. Получение витамина В12.
3. Получение витамина В2.
4. Получение эргостерина.
Витамины – это низкомолекулярные органические вещества, способные в очень
низких концентрациях оказывать сильное и разнообразное действие. Природным
источником многих витаминов являются растения и микроорганизмы. В настоящее время
в производстве многих витаминов ведущие позиции принадлежат химическому синтезу,
однако при производстве отдельных витаминов микробный синтез имеет огромное
значение, например при производстве кормовых препаратов витаминов. Отдельные
витамины, кобаламины, менахиноны продуцируются только микробными клетками.
Витамины принимают активное участие во многих процессах метаболизма человека и
высших животных (процессы цикла трикарбоновых кислот, распад и синтез жирных
кислот, синтез аминокислот и др.), оказывая влияние на разнообразные физиологические
процессы.
Микробиологическим путем получают некоторые витамины группы B, а также
эргостерин и каротин, являющиеся, соответственно, предшест-венниками витаминов D2 и
провитамина A.
Получение витамина В12
Витамин В12 – (α-5,6-диметилбензимидазол)-цианкобаламин – полимер сложного
строения, являющийся гематопоэтическим и ростовым фактором для многих животных и
микроорганизмов. Микробиологический синтез является единственным способом
получения данного витамина.
Способность к синтезу данного витамина широко распространена среди
прокариотических
микроорганизмов.
Активно
продуцируют
витамин
В12
Propionibacterium, а также Pseudomonas и смешанные культуры матанообразующих
бактерий. Получение витамина на основе пропионовокислых бактерий, способных к
самостоятельному синтезу аденозилкобаламина 5,6 ДМБ (коэнзима В12), осуществляется
в две стадии в двух последовательных аппаратах объемом 500 л при коэффициенте
заполнения 0.65–0.70.
Первую стадию культивирования проводят в течение 80 ч и слабом перемешивании
в анаэробных условиях до полной утилизации сахара; полученную биомассу
центрифугируют. Сгущенную суспензию инкубируют во втором аппарате еще в течение
88 ч, аэрируя культуру воздухом (2 м3/ч). Среда содержит сахара (обычно глюкозу 1–10
%), добавки солей железа, марганца, магния и кобальта (10–100 мг/л), кукурузный
экстракт (3–7 %). В качестве источника азота принят (NH4)2SO4. Ферментацию проводят
при 30°С, рН стабилизируют на уровне 6.5–7.0 подтитровкой культуры раствором
(NH)4OH. На второй стадии происходит образование ДМБ. После завершения
ферментации витамин экстрагируют из клеток, нагреванием в течение 10–30 минут при
80–120°С. При последующей обработке горячей клеточной суспензии цианидом
происходит образование CN-кобаламина; продукт сорбируют, пропуская раствор через
активированный уголь и окислы алюминия; затем элюируют водным спиртом или
хлороформом. После выпаривания растворителя получают кристаллический витамин.
Выход В12 составляет до 40 мг/л.
Активными продуцентами В12 являются бактерии рода Pseudomonas. Разработаны
эффективные технологии на основе термофильных бацилл Bacillus circulans, в течение 18
ч при 65–75°С в нестерильных условиях. Выход витамина составляет от 2.0 до 6.0 мг/л.
Бактерии выращивают на богатых средах, приготовленных на основе соевой и рыбной
муки, мясного и кукурузного экстракта. Продукция В12 для медицины составляет около
12 т/г; форма выпуска – стерильный раствор CN-В12 на основе 0.95-го раствора NaCl и
таблетки витамина в смеси с фолиевой кислотой или другими витаминами. Для нужд
животноводства витамин В12 получают на основе смешанной ассоциации термофильных
метаногенных бактерий.
Ассоциация состоит из 4-х культур, взаимосвязанно расщепляющих органический
субстрат
до
СО2
и
СН4:
углеводсбраживающих,
аммонифицирующих,
сульфатвосстанавливающих и собственно метанобразующих бактерий. В качестве
субстрата используют декантированную ацетонобутиловую барду, содержащую 2.0–2.5 %
сухих веществ. Брожение проходит при 55–57°С в нестерильной культуре в две фазы: на
первой образуются жирные кислоты и метан, на второй – метан, углекислота и витамин
В12. Длительность процесса в одном аппарате составляет 2.5–3.5 суток, в двух
последовательных – 2–2.5 суток. Концентрация витамина в бражке достигает 850 мкг/л.
Параллельно в значительных количествах, до 20 м3/м3 образуется газ (65 % метана и 30 %
углекислоты). Бражка имеет слабощелочную реакцию. Для стабилизации витамина ее
подкисляют соляной или фосфорной кислотой, затем в выпарном аппарате сгущают до 20
% содержания сухих веществ и высушивают в распылительной сушилке. Содержание В12
в сухом препарате – до 100 мкг/г.
Получение витамина В2
Витамин В2 (рибофлавин) получил свое название от сахара рибозы, входящего в
состав молекулы витамина в виде многоатомного спирта D-рибита. Широко
распространен в природе и в значительных количествах синтезируется растениями,
дрожжами, грибами, бактериями. Животные, не синтезирующие этот витамин, должны
получать его в составе комбикормов. При дефиците рибофлавина в организме
нарушаются процессы белкового обмена, замедляется рост. Препараты рибофлавина
используют в медицине для лечения ряда заболеваний, а в животноводстве – в качестве
добавки в корма. Микроорганизмы синтезируют рибофлавин и две егокоферментные
формы – ФАД и ФМН.
Продуцентами витамина являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes,
Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, C. flaveri), микроскопические
(Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii) и плесневые грибы (Aspergillus niger).
Промышленное получение рибофлавина осуществляется химическим синтезом,
микробиологическим и комбинированным: при этом синтезированная микроорганизмами
рибоза химически трансформируется в В2.
Для медицинских целей микробиологический рибофлавин получают на основе
гриба Aspergillus. Для высоких выходов витамина (до 7 г/л) используют
усовершенствованные штаммы и оптимизированные среды, содержащие (в %):
кукурузный экстракт – 2.25, пептон – 3.5, соевое масло – 4.5 и стимуляторы (пептоны,
глицин). Используют активный инокулят, которым засевают стерильную среду.
Ферментацию проводят в течении 7 суток при 28°С и хорошей аэрации (0,3 м3/м3⋅мин.).
Исходный рН составляет около 7.0, в ходе ферментации в связи с выделением кислот
среда подкисляется до рН 4.0–4.5. После утилизации углеродного субстрата продуцент
начинает утилизировать кислоты; рН повышается и после этого начинается образование
витамина В2. При этом кристаллы рибофлавина накапливаются в гифах и вне мицелия. На
постферметационной стадии для выделения витамина мицелий нагревают в течение 1 ч
при 120°С.
В ряде стран для получения кормовых препаратов витамина В2 используют
достаточно простой способ на основе микроскопического гриба Eremothecium ashbyii,
который выращивают в глубинной культуре в течение 80–84 ч при 28–30°С на среде с
глюкозой или мальтозой (2.5 %), источником азота в виде NH4NO3 и карбоксидом
кальция (0.5 %). Выход рибофлавина составляет 1250 мкг/мл. Культуральная жидкость
концентрируется в вакуумной выпарке до содержания сухих веществ 30–40 % и
высушивается в распылительной сушилке. Товарная форма продукта – порошок с
содержанием рибофлавина не менее 10 мг/г и 20 % сырого протеина, в препарате
присутствуют никотиновая кислота и витамины В1, В3, В6 и В12. Полученный
генноинженерным методом штамм Bacillus subtilis образует за 35 суток ферментации до 4
г/л рибофлавина.
Получение эргостерина
Эргостерин – (эргоста-5,7,22-триен-3β-ол) – исходный продукт производства
витамина D2 и кормовых препаратов дрожжей, обогащенных этим витамином. Витамин
D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетом эргостерина, который в
значительных количествах синтезируют бурые водоросли, дрожжи, плесневые грибы.
Наиболее активные продуценты эргостерина – Saccharomyces, Rhodotoryla, Candida.
В промышленных масштабах эргостерин получают при культивировании дрожжей
и мицелиальных грибов на средах с избытком сахаров придефиците азота, высокой
температуре и хорошей аэрации. Более интенсивно эргостерин образуют дрожжи рода
Candida на средах с углеводородами. При получении кристаллического препарата
витамина D2 культивируют плесневые грибы (Penicillium, Aspergillus). Для получения
кормовых препаратов облучают суспензию или сухие дрожжи (Candida). Облучают
тонкий слой 5 % суспензии дрожжей ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280–
300 нм. Кормовые препараты дрожжей содержат в 1 г АСВ 5000 Е витамина D2 и не менее
46 % сырого белка.
Для получения кристаллического препарата витамина дрожжи или грибной
мицелий подвергают кислотному гидролизу при 110°С. Витамин экстрагируют спиртом,
фильтруют, далее фильтрат упаривают, несколько раз промывают спиртом. Спиртовый
экстракт сгущают до 50 % концентрации сухих веществ, омыляют щелочью. Полученные
кристаллы витамина очищают перекристаллизацией и сушат в эфире, отгоняя последний.
Кристаллический осадок растворяют в масле. Данный препарат используют в
медицинских целях. Эргостерин является также исходным продуктом для получения ряда
стероидных гормонов, пищевых и лекарственных препаратов.
Контрольные вопросы:
1.Дайте определение витаминам.
2.Какие витаминные препараты получают микробиологическим синтезом?
3.Опишите технологию получения витамина В 12.
4.Каким образом получают витамин В 2?
5. Каковы особенности получения эргостерина?
Использованная литература:
1. Т. Г. Волова Биотехнология.
2. Елинов Н. П. Основы биотехнологии.
3. Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. Основы микробиологии и биотехнологии.
4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
Лекция № 7
Тема: Получение биологически активных добавок.
План:
1. Классификация, структура и функции биологически активных веществ.
2. Общие закономерности синтеза БАВ.
1. В основе изучения предмета технологии синтеза и биосинтеза биологически
активных веществ лежат знания о способах и средствах проведения производственных
процессов получения биологически активных веществ (продуктов), из исходного
материала (сырья) как путем химических реакций, так и в процессе обмена веществ в
живом организме.
Традиционное понятие биологически активных веществ как химических веществ,
необходимых для поддержания жизнедеятельности живых организмов, их
физиологической активности, не полностью отражает функции БАВ.
Биологически активные вещества – химические вещества, необходимые для
поддержания
жизнедеятельности
живых
организмов,
обладающие
высокой
физиологической активностью при небольших концентрациях по отношению к
определенным группам живых организмов или их клеткам, злокачественным опухолям,
избирательно задерживая (или ускоряя) их рост или полностью подавляя их развитие.
За единицу биологической активности химического вещества принимают
минимальное количество этого вещества, способное подавлять развитие или задерживать
рост определенного числа клеток, тканей стандартного штамма (биотеста) в единице
питательной среды.
В настоящее время известен широкий спектр биологически активных веществ
различного назначения, которые могут быть либо получены из природных живых
организмов, либо синтезированы с помощью различных химических превращений.
Природные БАВ образуются в процессе жизнедеятельности живых организмов.
Они могут образовываться в процессе обмена веществ, выделяясь в окружающую среду
(экзогенные) или накапливаться внутри организма (эндогенные). Эффективность синтеза
БАВ зависит от физиологических особенностей живых организмов, экологических
факторов.
К экзогенным природным БАВ можно отнести:
колины – органические соединения, выделяемые высшими растениями через
корневую систему, вызывающие угнетение низших растений;
фитонциды – летучие органические соединения, выделяемые высшими
растениями в атмосферный воздух, вызывающие гибель патогенных микроорганизмов;
антибиотики – органические вещества – продукты жизнедеятельности
микроорганизмов в процессе обмена веществ, выделяющиеся в окружающую среду или
накапливающиеся внутри клетки, подавляющие или угнетающие другие виды
микроорганизмов;
маразмины – органические вещества, выделяемые микроорганизмами,
вызывающие угнетение низших растений.
Воздействие одних живых организмов на другие за счет продуцирования БАВ
называется аллелопатией.
Микотоксины – биологически активные вещества, вырабатываемые грибами (рода
Fusarium, Aspergillus и др.) в процессе обмена веществ, которые выделяются в организм
высших растений (злаковых) при их совместном развитии, и вызывающие заболевание
последних. Опасность микотоксинов связана с их устойчивостью при хранении,
термической обработке, способностью быстро распространяться в органах и тканях
организма, вызывая ингибирование синтеза белка, поражение сердечно- сосудистой
системы, клеток костного мозга, лимфатических узлов. Многие микотоксины обладают
канцерогенными свойствами.
Душистые вещества – органические вещества, обладающие характерным
приятным запахом. Природные душистые вещества представляют сложные смеси
различных веществ, чаще всего представлены эфирными маслами (розовое, гераниевое,
лавандовое), экстрагированные из цветков растений. Душистые вещества используют для
получения косметических и парфюмерных композиций. Как правило, эти экстракты
содержат сложные смеси различных веществ.
Для получения стойких парфюмерных композиций необходимы стабилизаторы
запаха. К природным стабилизаторам запаха относятся мускусные препараты.
К эндогенным БАВ можно отнести: белки, жиры, углеводы, аминокислоты,
витамины, ферменты, гормоны, красители.
Белки – природные полимеры, молекулы которых построены из остатков
аминокислот. По своему строению белки делятся на простые и сложные. Протеины (от
греч. protas – первый, важный) представляют собой простые белки. К ним относятся
альбумины, глобулины, глютемины.
Протеиды относятся к сложным белкам, которые кроме белковых макромолекул
содержат в своем составе небелковые молекулы. К ним относятся нуклепротеиды (кроме
белка содержат нуклеиновые кислоты), липопротеиды (кроме белка содержат липиды),
фосфолипиды (кроме белка содержат фосфорную кислоту). Белки играют ключевую роль
в жизни клетки. Они необходимы для образования клеток, тканей организма, составляют
основу биомембран, а также поддержания жизненных функций живых организмов. Белки
выполняют каталитические (ферменты), регуляторные (гормоны), транспортные
(гемоглобин, миоглобин), структурные (колаген, фиброин), двигательные (миозин),
защитные (иммуноглобулин, интерферон) функции, позволяющие снизить риск
инфекционных или стрессовых ситуаций, а также запасные (казеин, альбумин),
биоэнергетические функции. В свою очередь биологическая активность белков тесно
связана с аминокислотным составом. В состав белков входят 20 аминокислот и два амида
(аспаргин, глутамин). Растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать
все входящие в их состав аминокислоты из простых веществ – углекислоты, воды и
минеральных солей. В организм животных и человека некоторы аминокислоты не могут
синтезироваться и должны поступать в готовом виде как компоненты пищи. Такие
кислоты называются незаменимыми. К ним относятся: валин, лейцин, изолейцин, лизин,
метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Длительное отсутствие в организме хотя бы
одной незаменимой аминокислоты приводит к тяжелым заболеваниям человека и
животных. Все необходимые аминокислоты должны содержаться в белках в
определенных соотношениях, отвечающих потребностям данного организма. Если хотя
бы одна аминокислота содержится в недостатке, то другие аминокислоты, оказавшиеся в
избытке, не используются для синтеза белков. Биологически полноценными считаются
белки, имеющие оптимальное содержание аминокислот. Недостающее до нормы
количество какой-либо аминокислоты балансируют добавлением "чистых" препаратов
дефицитных аминокислот или белковой массы, имеющей более высокое содержание
данной аминокислоты по сравнению с эталоном. В растениях концентрация белковых
веществ варьируется в зависимости от условий выращивания, климата, погоды, типа
почвы, агротехники и других. Высокой интенсивностью синтеза белков отличаются
многие микроорганизмы, причем белки микробных клеток имеют повышенное
содержание незаменимых аминокислот.
Витамины – низкомолекулярные органические вещества, обладающие высокой
биологической активностью и выполняющие рол биорегуляторов. Биологическая
активность витаминов определяется тем, что они в качестве активных групп входят в
состав каталитических центров ферментов или являются переносчиками функциональных
групп.
При недостатке этих веществ понижается активность соответствующих ферментов
и, как следствие, ослабляются или полностью прекращаются биохимические процессы,
происходящие с участием данных ферментов, что приводит к серьезным заболеваниям.
Организмы человека и животных не способны к синтезу витаминов. Основным
источником их поступления в организм человека и животных являются растения и
микроорганизмы, которые синтезируют почти все витамины (за исключением В12). Почти
все витамины содержат гидроксильную группу (-ОН) или карбонильную группу (-С=О).
Различают жирорастворимые и водорастворимые витамины.
Липиды – это сложная смесь органических соединений с близкими физикохимическими свойствами, которые участвуют в построении клеточных мембран.
Являются обязательным компонентом клетки. Их общий признак – наличие в молекуле
длинноцепочечных углеводородных радикалов и сложноэфирных группировок. По
химической природе жиры представляют собой эфиры глицерина и жирных кислот,
которые отличаются по природе жирных кислот.
В растениях жиры накапливаются в плодах и семенах, в животных и рыбах –
концентрируются в подкожных жировых тканях, брюшной полости и тканях,
окружающих многие важные органы (сердце, почки), а также в мозговой и нервных
тканях. Длительное отсутствие в живом организме приводит к нарушению центральной
нервной системы, снижается устойчивость к инфекциям, сокращается продолжительность
жизни. Для извлечения липидов необходимо разрушить их связь с белками, углеводами и
другими компонентами клетки. При извлечении из природного сырья липидов получают
смесь, состоящую из липидов и жирорастворимых веществ (пигменты, витамины,
стероиды).
Ферменты (лат. fermentum – закваска), или энзимы (enzime – дрожжи) –
биокатализаторы белковой природы, ускоряющие обме веществ в клетках и имеющие
молекулярную массу от 15000 до 1000000. Различают однокомпонентные (мономерные)
ферменты, состоящие только из белка (″складчатых″ полипептидных цепочек), и
двухкомпонентные, состоящие из белковых макромолекул и небелковых молекул.
Активность фермента определяется структурой белковой части. Ферменты используются
в различных областях практической деятельности человека как биологические
катализаторы. Основным поставщиком ферментов долгое время были грибы. В настоящее
время все более широкое применение находят ферменты бактерий. Уровни накопления
ферментов в клетках могут быть повышены в 100-1000 раз путем генетического обмена и
подбора питательных сред. Культивирование продуцентов ферментов экономично только
тогда, когда ферментационные циклы коротки, сравнительно дешевы питательные среды,
а также высока специфичность внутри- или внеклеточных ферментных белков.
Микробные ферменты используются как терапевтические средства при проведении
клинических анализов, а также в качестве кормовой добавки (0,1-1,5% от сухой массы
кормов) для улучшения эффективности использования растительных кормов (зерна,
силоса, грубых кормов и др.) сельскохозяйственными животными, содержащих
трудноперевариваемые вещества: клетчатку, лигнин, гемицеллюлозу. Так, например, у
жвачных животных клетчатк переваривается на 40-65%, растительные белки на – 60-80%,
липиды на – 60-70%, крахмал и полифруктозиды на – 70-80%. Кроме того,
ферментныепрепараты используются при приготовлении кормов методом силосования
для ускорения молочно-кислого брожения.
Углеводы образуются в растениях в пластидах в процессе фотосинтеза под
действием квантов солнечной энергии из углекислого газа, воды минеральных солей
благодаря ассимиляции хлорофилла. По химическому строению углеводы делятся на
моносахариды и полисахариды. Наибольшей биологической активностью обладают
моносахариды, которые являются сильными восстановителями. В природных условиях
моносахариды в присутствии ферментов распадаются до углекислого газа, воды или
спирта (дыхание). При этом выделяется большое количество тепла:
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O аэробный процесс
С6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 анаэробный процесс
Углеводы выполняют пластические функции (входят в состав тканей и жидкостей),
защитные (гепарин предотвращает свертывание крови в сосудах). При длительном
отсутствии углевода глюкозы в крови происходит нарушение поведения, бред, потеря
сознания, структурные изменения в мозге и в конечном итоге может наступить смерть.
Полисахариды (крахмал, клетчатка, пектиновые вещества) относятся к так называемым
балластным веществам. Они ускоряют процесс выведения из организма токсичных
продуктов. Наибольшей биологической активностью обладают производные
моносахаридов – гликозиды, молекулы состоят из остатков моносахаридо и спиртов,
ароматических соединений, стероидов. В семенах черной горчицы, корнях хрена
содержится гликозид синиргин, придающий им специфический запах и горький вкус. В
косточках персика, абрикоса, слив, вишен, яблок, груш, семенах горького миндаля,
листьях лавровишни содержится гликозид амигдалин. При ферментативном гидролизе
гликозидов образуются моносахариды и соответвующие несахаридные составляющие,
многие из которых токсичны.
Фитогормоны – вещества, которые синтезируются в растениях в процессе обмена
веществ, транспортируются по ним и способны вызывать ростовые или формативные
эффекты (деформации), так называемые регуляторы роста и развития растений, или
фиторегуляторы.
Фитогормоны играют важную роль в реализации наследственной программы и
адаптации к меняющимся условиям среды, отвечают за формирование и развитие стебля,
листа и корня, ускоряя дифференцирование клеток, клеточные деления, образование
новых тканей и органов, темпы роста и развития растений, их продуктивность и качество
урожая. Гормональные эффекты реализуются путем конформационных изменений
белковых молекул (варьирование формы и пространственной структуры) за счет
образования гормоно-рецепторного активного комплекса. Такие белки могут
функционировать как рецепторы фитогормонов, выполняя роль преобразователя сигнала
между рецептором и определенной ферментативной системой. Большинство
фитогормонов образуется из органических кислот, в частности аминокислот.
Биологические особенности транспортировки фитогормонов заключаются в том,
что, образовавшись в одном органе (например, в апикальной меристеме стебля), они
должны регулировать рост в другом органе (корне). Ускорение или замедление роста
начинает проявляться при концентрации 10-13-10-7 М. По физиологическому действию
фитогормоны подразделяют на ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизовую
кислоту, этилен, брассиностероиды. Фитогормональными свойствами обладают
некоторые органические кислоты (жасминовая, салициловая), олигосахариды, полиамины,
фенольные соединения.
Лекарственные препараты являются биологически активными веществами эндоили экзогенной природы, законодательно разрешенные для профилактики и лечения
заболеваний человека. Эти вещества при определенных концентрациях должны оказывать
четко выраженные бактерицидное, антисептическое, наркотическое, дезинфицирующее и
другие действия. Терапевтический эффект лекарственных препаратов определяетс дозой.
При определенных дозах лекарственные препараты могут привести к отравлению или
смерти. Терапевтическое действие оказывают и БАВ, образующиеся в организме
растений, животных и человека (алкалоиды, гормоны, витамины, антибиотики).
2. В промышленном масштабе наибольшее значение имеют химический и
микробиологический методы.
Химический метод синтеза БАВ носит название тонкого органического синтеза,
отличительными особенностями которого являются: многостадийность получения
веществ; необходимость тщательной очистки; небольшие объемы производства; большой
ассортимент; высокая стоимость продуктов синтеза.
В основу выбора способа синтеза БАВ должны быть положены знания о механизме
химических
реакций,
свойствах,
используемых
для
синтеза
химических
предшественников, сведения о рациональных методах их получения и очистки.
Принципы микробиологического синтеза БАВ основываются на принадлежности
биообъектов к надцарствам живых существ (акариот, прокариот, эукариот);
функциональной активности биообъекта (биосинтез, биотрансформация), возможности
вычленения отдельных этапов из биотехнологических схем производства в виде
самостоятельных процессов (подготовка питательных сред и оборудования, ферментация,
стерилизация сред и оборудования).
Преимущества микробиотехнологии: простота организации генома; легкая
приспосабливаемость (лабильность) к среде обитания в естественных и искусственных
условиях; достаточно высокие скорости протекания ферментативных реакций при низких
температурах (20-60оС) и нарастания клеточной массы; возможность использования
недефицитного, дешевого сырья (отходы промышленности, сточные воды).
К недостаткам технологии микробного синтеза БАВ можно отнести:
многокомпонентность питательных сред; необходимость стерилизации питательных сред,
оборудования и коммуникаций для удаления или разрушения контаминантов при
сохранении качества среды, а также трудности в управлении процессом биосинтеза и
автоматизации. Это связано с процессами саморегуляции биообъектов (включая
способность к мутации), которые могут привести к непредвиденному изменению
биотехнологического процесса. При размножении и развитии происходит постоянное
изменение отдельных параметров, и в каждый момент времени клетки функционируют в
иных условиях. В связи с этим при управлении технологическим процессом биосинтеза
БАВ следует учитывать индивидуальные особенности «поведенческих реакций»
биообъекта в конкретных условиях культивирования, а именно: чувствительность
биообъектов к воздействию физико-механических факторов при перемешивании, а также
знание химической природы синтезируемого БАВ, характера биохимических процессов,
осуществляемых биообъектами, специфику наследственных свойств данного вида.
Основные технологические показатели биосинтеза БАВ Для нормального роста,
размножения биообъекта в процессе биосинтеза БАВ необходимо поддерживать
оптимальные условия его культивирования. При нарушении оптимальных условий
нарушается обмен веществ, прекращается или ограничивается рост и размножение
культуры, снижается выход и качество целевого продукта. Параметры контроля процесса
культивирования, относящиеся к основным технологическим показателям биосинтеза
БАВ: температура; рН- среды; количество биомассы клеток; скорость потребления
источников питания; количество растворенного кислорода (в случае аэробных
биообъектов); количество образующегося метаболита.
Основные технологические стадии микробиологического синтеза БАВ
предферментация (подготовительные работы); ферментация (накопление и выделение
целевого продукта).
Предферментация включает подготовительные стадии до биосинтеза: 1)
приготовление и подготовка среды; 2) получение и подготовка посевного материала; 3)
выбор и подготовка оборудования.
Основная стадия в подготовке оборудования, питательных сред, посевного
материала заключается в стерилизации. Стерилизации подлежат пеногасители, жидкие
добавки, коммуникации, датчики. Необходимость стерилизации вызвана тем, что
микроорганизмы-контаминанты не только могут подавить функциональное развитие
биообъекта в силу конкуренции и антиобиоза, но и дезорганизовать какую-либо ткань или
среду выращивания. Некоторые из них способны продуцировать токсичные вещества,
которые могут попасть в целевой продукт. В производственных условиях источниками
микроорганизмов-контаминантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди.
Наличие в воздухе частиц пыли или капелек влаги создают благоприятную среду
для жизнедеятельности микроорганизмов.
Защита
биотехнологических
процессов
от
микробов-контаминантов
осуществляется с помощью фильтров.
В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и других объектов
осуществляют в автоклавах паром (t = 120-1220C) под давлением не менее 0,3 МПа (3
кГс/см2) или холодным способом. Наиболее универсальный метод – использование
влажного тепла.
Датчики измерительных приборов и регуляторов не выдерживают высоких
температур при стерилизации, поэтому к ним применяют холодные или химические
способы стерилизации. Для этих целей используются бактерицидные газы (этилен),
растворы антисептиков (формалин и др.).
Сахаросодержащие материалы стерилизуют отдельно от других компонентов
питательной среды в мягких условиях для избежания реакций меланоидирования,
гумификации, карамелизации, реверсии,кислотного разложения.
Для контроля процесса стерилизации вводится критерий стерильности,
называемый временем выдержки, или длительностью экспозиции.
Длительность экспозиции, или время выдержки – это тот интервал, в пределах
которого погибают микроорганизмы. Гибель последних спор в среде является случайным
процессом, поэтому введено понятие «критерий стерильности» (N) – отношение числа
операций стерилизации, в результате которых выжили по одной термостойкой споре к
общему числу проведенных операций. Для стерилизации сред принимают критерий
стерильности, равный 0,01+0,001. Если исходное количество спор в среде принять Nо, то
получим соотношение N/Nо – уровень стерильности, иликоэффициент выживания,
который означает, что для достижения заданного критерия стерильности (например, 0,01)
среда должна выдерживаться при температуре стерилизации строго определенное время,
чтобы популяция спор снизилась от исходного значения Nо до N/Nо (например, до 10-16).
Технология выделения и очистки конечных продуктов ферментации После
завершения ферментации отделяют либо клетки (клеточную массу), либо жидкость, в
которой содержится БАВ. В первом случае отходом является культуральная жидкость, во
втором – плотная часть (клетки).
Выбор метода отделения или разделения целевых продуктов зависит от размера
частиц (включая микроклетки) образовавшегося продукта.
Крупные частицы от мелких отделяют седиментацией при использовании тканевых
волокнистых фильтров, сит, сетчатых фильтров фракционирования в пене и пузырьках.
Низкомолекулярные нерастворимые частицы отделяют диализом, электродиализом,
ионным обменом, экстракцией, обратным осмосом.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что понимают под биологически активными веществами
2. Что принимают за критерий биологической активности веществ?
3. Все ли продукты жизнедеятельности, образующиеся в результате обмена веществ
живых организмов, являются биологически активными?
4. Какие принципы положены в основу классификации БАВ?
5. Какие принципы лежат в основе биосинтеза БАВ?
6. В чем состоит отличие синтеза и биосинтеза БАВ?
7. По каким технологическим показателям осуществляют контроль биосинтеза БАВ?
8. Из каких стадий состоит технология биосинтеза БАВ?
9. В чем заключаются особенности этапа предферментации?
Использованная литература:
1. Н.Ю. Громова, Ю.Ю. Косивцов, Э.М. Сульман. Технология синтеза и биосинтеза
биологически активных веществ
2. Елинов Н. П. Основы биотехнологии.
3. Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. Основы микробиологии и биотехнологии.
4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
5. Жвирблянская А.Ю., О.А. Бакушинская Микробиология в пищевой
промышленности.
Лекция № 8
Тема: Лекарственные и профилактические препараты.
План:
1. Лекарственные препараты.
2. Промышленное производство рекомбинантного инсулина. Схема получения
рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli – США)
3. Интерфероны
4. Интерлейкины
5. Противоопухолевые антибиотики.
Биологически активные вещества представляют собой сложные органические
соединения, активность которых зависит от структуры молекулы и расположения
функциональных групп.
Среди широкого спектра БАВ особый интерес представляют лекарственные
вещества, главная особенность которых заключается в том, что они предназначены для
введения внутрь организма человека или животных и необходимы для поддержания
жизнедеятельности живых организмов и их физиологической активности. При синтезе
этого типа. БАВ необходимо учитывать требования, которые предъявляет к ним
медицина.
Биологическая активность лекарственных препаратов связана с изменениями
функций организма, которые могут нарушаться или оставаться неизменными. При
попадании в организм биологические системы (органы, ткани) активно взаимодействуют с
лекарственными препаратами в процессе обмена веществ, претерпевая ряд превращений
на пути его действия с образованием метаболитов. Взаимодействие может происходить в
водной (биологические жидкости) или в липофильной (биологические мембраны) среде. В
этом случае следует учитывать фактор среды.
В ряде случаев метаболиты могут быть значительно активнее лекарственного
препарата и способны привести к терригенным (воздействие на плод), мутагенным,
канцерогенным изменениям в организме. Поэтому для использования лекарственных
препаратов следует учитывать не только дозу, но и фактор времени.
Механизм действия лекарственного препарата в живом организме складывается из
трех стадий:
1) проникновение в место расположения мишени;
2) распознавание мишени и химическое взаимодействие с ней по принципу
сродства (аффинности);
3) активизация мишени в результате структурных изменений при взаимодействии с
лекарственными препаратами.
Под мишенью понимают акцепторы, рецепторы, ферменты, клеточные органеллы,
клетки, ткани, органы, функциональные системы.
Это обуславливает особые требования к чистоте получаемых веществ, к
отсутствию в них токсичных примесей.
2. Промышленное производство рекомбинантного инсулина. Инсулин, как вы
знаете, является регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин
синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При
отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный
диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа). При сахарном диабете повышается
содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа
(инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за
проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого
заболевания как сахарный диабет.
Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина. Итак,
инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:
А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.
В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков
Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают
пространственную структуру белка инсулина. При синтезе инсулина в поджелудочной
железе вначале образуется предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот
проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных
остатков С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и
проинсулин переходит в активный инсулин
Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении
инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.
Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем. До
внедрения в промышленность метода получения инсулина с использованием
рекомбинантных микроорганизмов существовал только один способ получения инсулина
– из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин, получаемый из
поджелудочной железы крупного рогатого скота отличается от инсулина человека на 3
аминокислотных остатка, а инсулин, получаемый из железы свиньи, только на один
аминокислотный остаток, то есть он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при
введении белков, отличающихся по структуре от белков человека даже в таком
незначительном выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой
инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови
образующимися антителами.
Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов
свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата).
С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое жеколичесвто
инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный
микроорганизм Escherichia coli.
Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х
годов (восьмидесятых годов).
Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli- ЭлиЛилли, Соединенные Штаты Америки):
1 этап Путем химического синтеза были созданы последовательности нуклеотидов,
которые кодируют образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические гены.
2 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят
ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).
3 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот
ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться бурной репликации плазмид.
4 этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки и получают
две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.
5 этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу,
которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды
активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов,
синтезирующих А и В цепи.
6 этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с
бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от
бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.
7 этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.
Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своей
структуре. Применение современных методов очистки исключает наличие в инсулине
эндотоксинов и пирогенных примесей.
3.
Интерфероны – группа белковых веществ, вырабатываемых клетками,
зараженными вирусами. Интерфероны индуцируют противовирусные реакции
Виды интерферонов: α-группа (лейкоцитарный интерфероны),
b-группа
(интерферон фибробластов), g-группа (иммунный интерферон, Т-лимфоциты).
Интерфероны обычно получают из донорской крови человека, хотя в настоящее
время уже применяют генноинженерные способы получения интерферонов.
Методом генной инженерии получают также реаферон (рекомбинантный α2интерферон). Ген человеческого α2-интерферона включают в штамм Pseudomonas
aerogenosa.
Ген человеческого лейкоцитарного интерферона был получен синтетическим путем
(человеческий интерферон состоит из 150 аминокислот). Его включают в плазмиду
микроорганизма Escherichia coli, или в дрожжи.
4.
Интерлейкины - это большая группа цитокинов (от ИЛ-1 до Ил-18),
синтезируемых в основном T-клетками, но в некоторых случаях также мононуклеарными
фагоцитами или другими тканевыми клетками. Интерлейкины обладают разнообразными
функциями, но большинство их стимулирует другие клетки для деления или
дифференцировки, при этом каждый из них действует на отдельную, ограниченную
группу клеток, экспрессирующих специфичные для данного интерлейкина рецепторы.
Это растворимые пептиды, сильные иммунорегуляторы локального действия; активируют
Т- клетки. Функции интерлейкинов связаны с активностью других физиологически
активных пептидов и гормонов: эндотелина , пролактина , брадикинина ( Agui T. et al.,
1994 , Dewito W. et al., 1995 , Tsukagoshi H. et al., 1995 ).
Интерлейкин-1 был открыт в 1972 г., когда было показано, что фитогемагглютинин
или липополисахарид в культуре прилипающих клеток способствуют выделению фактора,
стимулирующего пролиферацию лимфоцитов [ Gery ea 1972 ].
ИЛ-1
осуществляет
различные
функции:
индуцирует
хемотаксис
полиморфноядерных лейкоцитов , хемотаксис макрофагов [ Durum ea 1985 ],
пролиферацию эндотелиальных клеток и остеобластов [ Burke ea 1993 ], стимулирует
дифференцировку и пролиферацию B-клеток [ Oppenheim ea 1986 ], высвобождение
факторов, связанных с ростом и дифференцировкой миелоидной и лимфоидной
клеточных линий [ Oppenheim ea 1986 ], играет роль в регуляции и транскрипции гена ИЛ2 и гена ИЛ-3 в определенных Т-клеточных линиях [ Hagiwara ea 1987 ].
Терапевтические применения ИЛ-1 следующие: его возможно использовать как
адъювант при вакцинации, ранозаживляющее вещество, стимулятор гемопоэза и
продукции антител [ Anliytsky ea 1994 ].
Имеется две формы данного цитокина: ИЛ-1альфа и ИЛ-1бета с мол. весом 17 кД,
которые контролируются самостоятельными, неаллельными близкосцепленными генами
[Bencher ea 1988 ]. Доминирующей формой у человека является ИЛ-1бета, в то время как
у мышей - ИЛ-1альфа.
Изучение структуры данного цитокина выявило отсутствие у цитоплазматического
предшественника лидерных N-пептидов или каких-либо гидрофобных участков в иных
местах полипептидной цепи, необходимых для прохождения через мембрану. Возможно,
предшественникам ИЛ-1 в цитоплазме оказывается помощь какими-то гидрофобными
белками, выполняющими, помимо основной функции, роль "извозчика" для этого
цитокина.
Методами рентгеноструктурного анализа установлено, что ИЛ-1 представляет
собой глобулу, N- и С-концевые последовательности которой находятся в
пространственной близости. Именно эти концевые участки молекулы формируют центр,
взаимодействующий с соответствующим рецептором.
Основным источником продукции ИЛ-1 являются фагоцитирующие мононуклеары
различной тканевой локализации: макрофаги и моноциты периферичекой крови и
перитонеального экссудата, купферовские клетки печени, клетки Лангерганса в
эпидермисе, клетки микроглиии нервной ткани. Активными продуцентами ИЛ-1 являются
также эндотелиоциты . Кроме того, способностью секретировать данный цитокин
обладают Т-лимфоциты и В-лимфоциты , фибробласты , НК-клетки , кератиноциты ,
нейтрофилы
5. Противоопухолевые антибиотики
Противоопухолевые антибиотики могут обладать, но могут и не обладать
антимикробной активностью, что будет зависеть от того, проникают ли они внутрь
микроорганизмов. Поотивоопухолевые антибиотики подавляют синтез нуклеиновых
кислот.
Классификация противоопухолевых антибиотиков:
1. противоопухолевые антибиотики, которые действуют на синтез
предшественников пуринов и пиримидинов. (представителем таких антибиотиков
является азосерин, который подавляет синтез пуринов и является структурным аналогом
глутамина).
2. противоопухолевые антибиотики, которые действуют на стадии включения
нуклеотидов в РНК. Такие антибиотики являются аналогами аденозина (нуклеотид). К
ним относятся тойокомицин, формицин, 5-фторурацил.
3. ДНК-тропные антибиотики (реагируют более активно с ДНК опухолевых
клеток). Это группа актиномицинов, в основе действия которых находится реакция с
парами оснований (они имеют хромофор и две пептидные цепи). В результате их действия
прекращается синтез по матрице ДНК. Представителями этой группы антибиотиков
являются: дактиномицин- продукт жизнедеятельности актиномицета Streptomyces
parvuilus, оливомицин
Продуцируется лучистым грибом Actinomyces olivoreticuli, и хромомицин.
4. Группа антрациклинов. В своей структуре они имеют 4 шестичленных кольца и
аминосахар. Продуцентами этой группы антибиотиков является актиномицеты.
Представители этой группы: даунорубицин, доксорубицин. Их применяют для
лечения лейкозов, рака легких, рака молочной железы. Антрациклины кардиотоксичны,
так как они в клетке подавляют синтез ДНК и РНК и вызывают в ДНК одно и двунитевые
разрывы.
5. Митомицин отличается тем, что предварительно активируется в клетке
(восстанавливается) и сшивает комплементарные нити ДНК, подавляя репликацию ДНК (
в этом случае нити ДНК не могут разойтись).
6. Блеомицин - характеризуется избирательным подавлением синтеза ДНК,
вызывая фрагментацию молекул ДНК. Он способен накапливаться в коже и поэтому
особенно эффективен при раке кожи и слизистых оболочек. Этот антибиотик является
продуктом жизнедеятельности гриба и по структуре является полипептидом.
Вопросы для самоконтроля
1. Каков механизм действия лекарственного препарата в живом организме?
2. Опишите промышленное производство рекомбинантного инсулина.
3. Что такое интерфероны?
4. Что такое интерлейкины?
5. Охарактеризуйте противоопухолевые антибиотики.
Использованная литература:
1. Катлинский А.В., Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Курс лекций по
биотехнологии
2. Елинов Н. П. Основы биотехнологии.
3. Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. Основы микробиологии и биотехнологии.
4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология.
5. Жвирблянская А.Ю., О.А. Бакушинская Микробиология в пищевой
промышленности.
Темы лабораторных занятий.
Лабораторное занятие №1
Методы культивирования гетеротрофных
Тема занятия:
и фототрофных
микроорганизмов.
Цель занятия: Изучить методы культивирования гетеротрофных и фототрофных
микроорганизмов.
Задание:
1.
Методы
методы
культивирования
гетеротрофных
и
фототрофных
микроорганизмов.
2. Оформить отчет по работе.
3. Ответить на контрольные вопросы.
Контрольные вопросы:
1. Каким образом осуществляется культирование гетеротрофных микроорганизмов?
2. Опишите методы культивирования фототрофных микроорганизмов
3. Наличие каких факторов осложняет процесс культивирования микроорганизмов?
Лабораторное занятие №2
Тема занятия: Биологически активные добавки к пище (БАД) - продукты современных
биотехнологических производств.
Цель занятия: Изучить биологически активные добавки к пище (БАД) - продукты
современных биотехнологических производств.
Задание:
1. Изучить биологически активные добавки к пище (БАД) - продукты современных
биотехнологических производств
2. Оформить отчет по работе.
3. Ответить на контрольные вопросы.
Контрольные вопросы:
1. Дайте определение биологически активным добавкам к пище.
2. Классификация биологически активные добавки к пище.
3. Применение биологически активные добавки к пище.
4. Каковы отличия БАД от пищевых добавок?
Лабораторное занятие №3
Тема занятия: Получение биологически активных добавок на основе фототрофных
микроорганизмов.
Цель занятия: Изучить технологию получения биологически активных добавок на
основе фототрофных микроорганизмов.
Задание:
1.Изучить технологию получения биологически активных добавок на основе
фототрофных микроорганизмов.
2.Оформить отчет по работе.
3.Ответить на контрольные вопросы.
Контрольные вопросы:
1. Какие фототрофные микроорганизмы Вы знаете?
2. Какие биологически активные добавки получают на основе фототрофных
микроорганизмов?
3. Опишите технологию получения биологически активных добавок на основе
фототрофных микроорганизмов.
Лабораторное занятие №4
Тема занятия: Технология производства этанола из различных субстратов.
Цель занятия: Изучить технологию производства этанола из различных субстратов
Задание:
1. Изучить технологию производства этанола из различных субстратов
2. Оформить отчет по работе.
3. Ответить на контрольные вопросы.
Контрольные вопросы:
1. Назовите основные виды субстратов для производства этанола.
2. Требования, предъявляемые к основным видам субстратов для производства
этанола.
3. Охарактеризуйте микроорганизмы – продуценты этанола.
4. Опишите технологию производства этанола из различных субстратов.
Лабораторное занятие № 5
Тема занятия: Производство сыра и молочнокислых продуктов.
Цель занятия: Изучить сыра и процессы производства молочнокислых продуктов.
Задание:
1.Изучить сыра и процессы производства молочнокислых продуктов.
2.Оформить отчет по работе.
3. Ответить на контрольные вопросы.
Контрольные вопросы:
1. Опишите технологический процесс производства сыров.
2. Опишите технологический процесс производства молочнокислых продуктов.
Лабораторное занятие №6
Тема занятия: Производство национальных кисломолочных продуктов – айрана, кумыса
и шубата с использованием спонтанных и производственных заквасок.
Цель занятия: Изучить процессы производства национальных кисломолочных продуктов
– айрана, кумыса и шубата с использованием спонтанных и производственных заквасок.
Задание:
1.Изучить процессы производства национальных кисломолочных продуктов – айрана,
кумыса и шубата с использованием спонтанных и производственных заквасок.
2.Оформить отчет по работе.
3.Ответить на контрольные вопросы.
Контрольные вопросы:
1. Каковы особенности производства национальных кисломолочных продуктов?
2. Опишите технологический процесс производства айрана.
3. Опишите технологический процесс производства кумыса.
4. Опишите технологический процесс производства шубата.
Лабораторное занятие № 7.
Тема занятия: Биологическое консервирование растительное сырья.
Цель занятия: Изучить методы биологического консервирования растительного сырья.
Задание:
1.Изучить методы биологического консервирования растительного сырья.
2.Оформить отчет по работе.
3.Ответить на контрольные вопросы
Контрольные вопросы:
1. Каковы принципы и методы биологического консервирования растительного
сырья?
2. Какие биохимические процессы протекают при консервировании растительное
сырья?
3. Микроорганизмы – вредители плодовоовощных консервов.
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
СЕМИПАЛАТИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ имени ШАКАРИМА
Кафедра «Стандартизация и биотехнология»
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
к лабораторным работам по дисциплине
«Биотехнология микроорганизмов»
для магистрантов специальности 050701 «Биотехнология»
Семей 2010
Разработано преподавателями кафедры «Стандартизация и биотехнология»
к.т.н. Молдабаевой Ж.К., Бепеевой А.Е.
Утверждено на заседании кафедры «Стандартизация и биотехнология»,
протокол № ___ от ____________ 20___ г.
Заведующая кафедрой ______________Ж. Какимова
Лабораторная работа № 1
Тема: Приборы и аппараты лаборатории «Биотехнология микроорганизмов»
Цель работы: Ознакомиться с приборами и аппаратами лаборатории «Биотехнология
микроорганизмов».
Задание:
1. Изучить конструкцию и принцип работы суховоздушного электрического термостата,
автоклава.
2. Изучить принцип работы сушильного шкафа, центрифуги, рн-метра, рефрактометра.
3. Изучить требования к стеклянной посуде лаборатории.
4. Приготовить ватные пробки и петли для работы.
Аппараты и приборы. Термостаты
(воздушные — рис. 1) предназначены для
выращивания микроорганизмов на питательных средах при постоянной заданной
температуре.
В лабораторий устанавливают несколько термостатов с разной температурой,
благоприятной для развития отдельных групп микроорганизмов: мезофилов—28—30
°С, термофилов—43—55, патогенных видов —37 °С. Термостаты бывают различной формы, размеров и конструкций: от небольшого шкафчика до поли-. термостата с
несколькими отделениями или отдельной термостатной комнаты.
Автоклавы служат для стерилизации посуды, питательных сред и других
материалов насыщенным паром под давлением выше атмосферного. Автоклавы бывают
разных конструкций (вертикальные, горизонтальные), но принципиальная схема их
устройства одинакова (рис. 2).
Сушильный шкаф (рис.3) с терморегулятором предназначен для сушки и
стерилизации лабораторной посуды, для высушивания различных материалов до
постоянной массы. Сушильный шкаф изготовляют из термостойких материалов (металла
и асбеста) и рассчитывают на диапазон температур в рабочей камере от 40 до 200 °С.
Длительность разогревания до предельной температуры около 1,5 ч. Внутри шкаф
оборудован полками из дырчатых листов металла, на которых размещают посуду или
высушиваемый материал.
Холодильник используют для хранения при температуре около +4 °С музейных и
рабочих культур микроорганизмов, питательных сред, некоторых реактивов и растворов.
Центрифуга служит для разделения жидких и твердых фаз суспензий и взвесей.
Центрифуга снабжена двумя роторами, которые попеременно насаживаются на вал
электродвигателя: ротором-крестовиной с четырьмя стаканами и ротором углового типа с
гнездами для стеклянных или полиэтиленовых пробирок. Скорость вращения роторов от
3000 до 6000 об/мин.
Лабораторный рН-метр (марки рН-340) предназначен для измерения активности
ионов водорода (рН) и окислительно-восстановительного потенциала (Eh).
Рефрактометр используют для определения содержания сухих веществ, Сахаров,
спиртов, аминокислот, витаминов, экстрактивных веществ. Шкала указывает показатель
преломФотоэлектроколориметр применяют для измерения оптической плотности и
коэффициентов пропускания окрашенных и коллоидных растворов. Прибор снабжают
набором узкополосных светофильтров в области спектра 315—630 нм. Колориметрнефелометр позволяет оценивать по степени мутности растворов концентрацию клеток
микроорганизмов.
3—5 мм и диаметром 33—140 мм, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. С
увеличением содержания целлюлозы пористость фильтра возрастает. Выпускаются
фильтры марки Ф2 и, СФ (стерилизующие). Фильтры вставляются в воронку (рис. 4), как
правило, из никелированного металла. Воронка состоит из двух частей: верхней
цилиндрической и нижней конусообразной, между которыми на металлической сетке
укладывают асбестовый фильтр. Затем воронку завинчивают или туго зажимают
специальными винтами, а узкий тубус вставляют в резиновую пробку колбы Бунзена.
Посуда. Для микробиологических исследований необходима различная стеклянная
посуда. Чашки Петри {диаметр 10 см, высота 1,5 см) применяют для выделения чистых
культур, количественного учета микроорганизмов, анализа микрофлоры на плотных
питательных средах и других исследований; колбы Виноградского, плоские бутылиматрацы, качалочные колбы для выращивания аэробных микроорганизмов, пробирки и
колбы с поплавками (рис. 5)—для изучения процессов брожения. Кроме специальной
микробиологической посуды широко используют обычную химическую посуду: колбы
плоскодонные конические Эрленмейера, круглодонные, мерные (на 25, 50, 100, 200 мл);
пипетки градуированные (на 1, 2, 5, 10 мл), пипетки Мора (на 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100
мл), пастеровские пипетки с оттянутым капилляром, пробирки биологические (без
ранта) 18x2,0; 18X1,5; 15x1,5 см; бюретки, ка пельницы, воронки, мензурки, цилиндры,
бюксы, склянки.
Приготовление ватных пробок. Колбы и пробирки, используемые для
приготовления и стерилизации питательных сред и выращивания культур микро
организмов, закрывают ватными пробками (рис. 6). Пробки изготовляют вручную или при
помощи специальной машины. Правильно изготовленная пробка должна иметь длину 3—
4 см, умеренно туго входить в пробирку, быть плотно! и не менять своей формы при
многократном применении. Ватная пробка лучше сохраняется, если ее обернуть кусочком
марли, концы которой в верхней части плотно завязать ниткой.
Инвентарь. В микробиологической практике применяют петли, иглы, пинцеты,
ножницы, сверла для пробок, металлические цилиндры для пипеток, проволочные или
металлические с отверстиями корзины для стерилизации пробирок, пластмассовые или
металлические штативы для пробирок и др.
Петли и иглы изготовляют из платиновой, никелевой или хромоникелевой
проволоки длиной 8 см, диаметром 0,4—0,5 мм и впаивают в стеклянные или
металлические держатели. Свободный конец проволоки аккуратно загибают в виде петли
с плотно прижатым концом (рис. 7), иначе жидкость в кольце не будет удерживаться.
Контрольные вопросы:
1.Конструкция и принцип работы термостата.
2. Конструкция и принцип работы автоклава.
3. Конструкция и принцип работы сушильного шкафа и центрифуги.
4. Предназначение лабораторного рН-метра и рефрактометра.
5.Что представляют собой фильтры Зейтца.
Лабораторная работа №2
Тема: Правила работы в лаборатории.
Цель работы: Изучить правила работы и техники безопасности в лаборатории.
Задание:
1. Изучить правила работы и техники безопасности в лаборатории «Биотехнология
микроорганизмов».
2. Законспектировать основные положения техники безопасности в тетрадь для
лабораторных работ.
3. Ответить на контрольные вопросы.
Правила работы в микробиологической лаборатории
1. К занятиям допускаются магистранты только в белых халатах. Входить в
лабораторию в пальто, в головном уборе, вносить посторонние вещи не
разрешается.
2. Каждый магистрант работает на своем рабочем месте и несет ответственность за
закрепленное за ним оборудованием, включая микроскоп, чистоту рабочего места.
3. Строго соблюдать правила обращения с реактивами и красителями.
4. Запрещается работать с неисправными электроприборами. Обо всех
неисправностях следует сообщить преподавателю.
5. При работе со спиртовкой необходимо перед зажиганием продуть пары спирта,
накопившиеся под крышкой, приподняв фитиль. Затем осторожно поджечь
спиртовку. Не бросать горящих спичек, не зажигать спиртовку от спиртовки, не
переносить зажженную спиртовку с одного места на другое.
6. При работе с культурами микроорганизмов следует быть предельно аккуратными,
чтобы не допустить попадания содержимого пробирки на поверхность стола,
одежды и т.д. В случае нарушения целостности объема, в котором находится
культура (например, при разбивании, проливании) следует поставить в известность
преподавателя и принять меры к дезинфекции.
7. Поскольку некоторые микроорганизмы в чистых культурах, особенно споры
грибов, являются аллергенными, нельзя допускать их распыления: ни в коем
случае не оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами
микроорганизмов.
8. В лаборатории запрещается принимать пищу, пить, курить, жевать.
9. Перед уходом из лаборатории дежурный проверяет рабочие места, закрывает воду,
выключат свет, электроприборы. После ознакомления с техникой безопасности при
работе на кафедре микробиологии магистранты расписываются в журнале.
В микробиологической лаборатории строго соблюдают ряд предосторожностей и
поддерживают определенный режим. Работают в белых халатах, шапочках или косынках.
На рабочем месте не должно быть лишних предметов. Все принадлежности располагают
на определенных местах. Пробирки и колбы с культурами микроорганизмов должны
иметь четкие надписи чернилами по стеклу, емкости с реактивами и растворами —
этикетки. При работе со спиртовками остерегаются воспламенения паров спирта. Нельзя
зажигать спиртовку от другой горящей спиртовки. Гасят пламя спиртовки только
специальными колпачками. При воспламенении ватных пробок на них не дуют, так как
это усиливает горение. Для предупреждения доступа воздуха горящие пробки вводят в
пробирки, колбы или накрывают сверху полотенцем.
До и после работы тщательно моют и дезинфицируют поверхность стола, на
котором проводится исследование микроорганизмов. Микробная масса не должна
загрязнять руки, стол и окружающие предметы. Петли, иглы, пинцеты после каждого
соприкосновения с микроорганизмами прожигают в пламени спиртовки или газовой
горелки и ставят в специальный штатив. Пролившуюся микробную взвесь обезвреживают,
используя дезинфицирующие средства.
По окончании работы загрязненную микроорганизмами посуду немедленно
стерилизуют кипячением или автоклавированием, чтобы уничтожить живые клетки, и
только после этого ее можно мыть. Поверхность плотных сред с микробами заливают
дезинфицирующим раствором. Через сутки среды можно выбрасывать и мыть посуду.
Использованные пипетки помещают в 3 %-ный раствор хлорамина, после чего моют и
стерилизуют. Предметные и покровные стекла после работы помещают в
дезинфицирующий раствор, затем тщательно моют в проточной воде. Посуду моют
только в резиновых перчатках. Неаккуратное обращение с микроорганизмами может
привести к образованию в воздухе микробного аэрозоля.
При работе с бактерицидными лампами пользуются темными или простыми
защитными очками. Нельзя смотреть на свет лампы незащищенными глазами, так как это
может привести к потере зрения.
Строгого соблюдения правил предосторожности требует обращение с аппаратами,
работающими под давлением, напряжением или при высокой температуре.
В лаборатории не разрешается курить, есть, пить, много ходить, вносить в нее
посторонние предметы. Категорически запрещается выносить микробные культуры за
пределы лабораторного помещения.
Следует строго соблюдать личную гигиену — тщательно дезинфицировать и мыть
руки с мылом после окончания работы и перед едой.
В специальном журнале магистранты и сотрудники делают запись о проведении
инструктажа и ознакомлении с режимом работы в лаборатории.
Лабораторная работа №3
Тема: Электронная микроскопия. Подготовка и стерилизация посуды, инструментов и
приборов.
Цель работы: Знать устройство электронного микроскопа, виды стерилизации
посуды, инструментов и приборов.
Задание:
1.
2.
приборов.
3.
4.
Изучить устройство и принцип работы электронного микроскопа.
Провести подготовку и стерилизацию посуды, инструментов и
Оформить отчет по работе.
Ответить на контрольные вопросы.
Материалы и оборудование: таблицы, плакаты и слайды по теме; электронные
микроскопы настроенные.
Каждому магистранту – пробирки по 2 шт., чашки Петри – 2 шт., пипетки 1 шт,
колбы разные вместимостью 100 мл, 50 мл, 25 мл, бумага оберточная, фильтры бумажные
и ватно-марлевые, вата и марля для приготовления ватно-марлевых пробок.
Теоретическая часть
Электронная микроскопия.
Разрешающая способность оптических микроскопов составляет 0,2 мкм и зависит от
длины волн используемых лучей света. Увеличить разрешение в 100 и более раз можно,
если вместо световых лучей с длиной волны 350-600 нм применить поток движущихся
электронов. Высокая разрешающая способность современных электронных микроскопов
(15-10-5А и даже 3 и 1,5 А) позволяет наблюдать и изучать объекты, невидимые в
световом микроскопе: вирусы, фаги, микоплазмы, тонкое строение клеток прокариот и
эукариот, их макро- и микроструктурные элементы, другие субмикроскопические
органеллы.
Электронный микроскоп состоит из нескольких сложных узлов: колонные, в
которой находятся осветительная система (электронная пушка и конденсорная линза),
камера объекта (предметный столик, объективная, промежуточная и проекционная
линзы), экран, фотокамера; вакуумной системы; установки для электропитания,
размещенной в металлическом шкафу за колонной; вспомогательных устройств (рис.1).
Выпускаются электронные микроскопы нескольких систем и классов. В электронных
микроскопах «просвечивающего типа» использована схема светового микроскопа,
повернутая окуляром вниз, но все оптические элементы заменены электромагнитными
линзами. Они создают электромагнитное поле, управляющее движением потока
электронов. Применять стеклянные линзы нельзя, так как стекло непроницаемо для
электронов. Источником электронов служит вольфрамовая нить диаметром 0,1 мм,
потенциал которой равен 30-100 кВ. Воздух препятствует движению электронов, поэтому
внутри микроскопа необходимо поддерживать вакуум.
Вылетающий из электронной пушки поток электронов высокой энергии (60 кВ,
длина волны равна 0,05 А) концентрируется конденсорной линзой и направляется на
исследуемый объект. Пучок электронов пронизывает объект, рассеивается и фокусируется
в электромагнитном преломляющем поле объективной линзы. Получается первое
увеличенное действительное изображение объекта, которое можно наблюдать через
специальное смотровое стекло. Затем поток электронов попадает в электромагнитное поле
проекционной линзы (аналогичной линзе окуляра), которая увеличивает первое
изображение и позволяет получить увеличение объекта в 40000-50000 Х. Конечное
изображение, увеличенное еще в 5-6 раз, получают на флуоресцирующем экране или на
фотопластинке, для чего под экраном монтируют фотокамеру. Общее увеличение может
составить 200 000-300 000 и даже 1000000-2000000 Х.
Препараты для электронной микроскопии должны быть прозрачными и прочными.
Их готовят на специальных тончайших пленках – подложках из коллодия. Толщина
пленок около 1 мкм. Для их получения пользуются 0,5-2%-ным раствором коллодия в
амилацетате. Пленки осторожно укладывают на опорную металлическую сетку с очень
мелкими ячейками (4-10 ячеек на 1 мм). Приготавливают препарат, тщательно промывают
его дистиллированной водой от посторонних примесей (остатков среды, солей), сушат,
напыляют металлом (хромом) или контрастируют фосфорно-вольфрамовой кислотой,
уранилацетатом, уранилнитратом и др. Для изучения структуры клеток, выявления
локализации вирусов после специальной обработки готовят очень тонкие срезы на
специальных ультрамикротомах. Следовательно, в электронных микроскопах
микроорганизмы исследуют не в живом состоянии, а в виде фиксированных препаратов.
В световом микроскопе при работе с иммерсионной системой глубина фокуса
составляет 0,25 мкм. Увеличить глубину фокуса более чем в 100 раз можно с помощью
сканирующего электронного микроскопа. Он позволяет получать трехмерные (объемные)
снимки поверхностной структуры объективов вместо двумерных (плоских) изображений,
которые дают обычно световые и электронные просвечивающие микроскопы. Работа
сканирующего микроскопа основана на принципе телевизионной развертки пучка
электронов по поверхности исследуемого объекта.
Это позволяет определить его пространственный рельеф. Хотя разрешающая
способность сканирующего микроскопа ниже, чем у электронного просвечивающего
микроскопа почти на целый порядок, качество изображения выигрывает за счет высокой
глубины резкости и объемности изображения (рис. 2).
Стерилизация стеклянной посуды
Стеклянную посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре
165-170 ºC в течение 1,5-2 ч или путем автоклавирования. Посуду перед стерилизацией
тщательно моют и высушивают. Пробирки и колбы закрывают ватными пробками.
Пробки завертывают по 10-20-40 шт в бумагу. На колбы надевают бумажные колпачки,
предохраняющие горлышко от пыли. В концы пипеток, которые кладут в рот, вставляют
ватные тампоны. Пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4-5 см и
помещают в специальные металлические или картонные пеналы с крышкой. При работе
пипетки вынимают из пакета только за верхний конец, где вставлен ватный тампон.
Чашки Петри завертывают в бумагу каждую отдельно или вместе по 2-3 шт.
Подготовленную посуду размещают на решетчатых полках в сушильном шкафу или
загружают в автоклав, но не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию горячего
воздуха или сухого насыщенного пара и равномерный нагрев посуды. Сушильный шкаф
должен быть плотно закрыт. Если шкаф не снабжен терморегулятором, необходимо все
время следить за температурой. Повышать температуру более 175 ºC не следует, так как
бумага и пробки начинают разрушаться. Чтобы предохранить посуду от растрескивания,
по окончании стерилизации сушильный шкаф охлаждают до 100-70 ºC, после чего посуду
можно вынимать. Для сохранения стерильности посуду разворачивают непосредственно
перед работой.
Стерилизация инструментов и приборов
Для стерилизации мелких металлических инструментов (петли, иглы, ланцеты,
пинцеты, ножницы) применяют прокаливание в пламени горелки или спиртовки
(фламбирование) непосредственно перед использованием. На пламени кратковременно
обжигают горлышки пробирок, колб, бутылок, а также ватные пробки при пересевах
культур и разливе сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры
микроорганизмов.
Приборы для культивирования микроорганизмов, детали к этим приборам,
резиновые пробки, соединительные шланги стерилизуют автоклавированием,
предварительно завернув в плотную бумагу.
Чистые центрифужные пробирки, изготовленные из термолабильных пластмасс,
стерилизуют ультрафиолетовым облучением (мощность лампы 15 Вт, длительность
обработки устанавливают экспериментально) и хранят в стерильной посуде.
Контрольные вопросы:
1. Устройство электронного микроскопа.
2. Приготовление препаратов для электронной микроскопии.
3. Мойка и подготовка стеклянной посуды к стерилизации.
4. Стерилизация посуды, инструментов и приборов.
Лабораторная работа №4,5,6
Тема: Питательные среды и техника их приготовления.
Цель работы: Ознакомление с техникой приготовления и основными компонентами,
которые используются для приготовления питательных сред.
Задание:
1. Изучить требования, предъявляемые к питательным средам.
2. Изучить стерилизацию питательных сред.
3. Ознакомиться с техникой приготовления основных питательных сред (МПБ,
МПА и сред с углеводами).
4. Определить рН МПБ.
5. Оформить отчеты и ответить на контрольные вопросы.
Материалы и оборудование: рефрактометр, рН – метр, плитки электрические 2 шт,
кастрюли для варки мяса, колбы емкостью 250-500 мл термостойкие, бумажные фильтры,
емкость для выращивания солода, дистиллированная вода, раствор едкого натра 1%, йод
медицинский, мясо говядина 500 гр, пептон 50 гр, поваренная соль 50 гр.
Теоретическая часть.
К питательным средам предъявляются следующие требования:
1. Они должны содержать источники азота и углерода, неорганические соединения,
микроэлементы, а также факторы роста, витамины, в основном группы В. В качестве
универсального источника азота используют пептоны. Пептоны – это продукты
гидролизного расщепления мяса или казеина. В них содержатся полипептиды,
аминокислоты и основные минеральные вещества. В качестве универсального источника
углерода в питательные среды добавляют углеводы (сахара) – глюкозу, лактозу, сахарозу;
органические кислоты – молочную, лимонную и др.; многоатомные спирты – манит,
глицерин, сорбит и др.
2. Питательные среды должны иметь определенную реакцию среды. Так, для
большинства кокковых, гнилостных и патогенных микроорганизмов оптимум рН 7,0-7,4,
плесневые грибы, дрожжи, молочнокислые микроорганизмы лучше развиваются при рН
6,0.
3. Питательная среда должна быть стерильной, т.е. не содержать микроорганизмов.
4. Питательная среда должна быть влажной, так как питание у микроорганизмов
осуществляется по законам диффузии и осмоса. Многие среды должны быть прозрачными
для того, чтобы можно было различить на них рост микроорганизмов и наблюдать за
физиологическими изменениями, происходящими в результате их жизнедеятельности.
Стерилизация питательных сред
Стерилизацией или обеспложиванием (sterilis - бесплодный)называют полное
уничтожение вегетативных клеток микроорганизмов и их спор в каком – либо материале
(питательной среде, посуде, приборе, инструменте, перевязочном материале и т.д.). Выбор
способа стерилизации зависит от свойств стерилизуемого объекта.
Автоклавирование. Питательные среды стерилизуют главным образом в автоклавах
насыщенным паром под давлением 0,05-0,2 МПа. Температура насыщенного пара при
различных давлениях показана ниже:
Показатели
Температура
Показания
Температура
манометра, МПа
насыщенного пара, манометра, МПа
насыщенного пара,
ºC
ºC
0,00
100
0,15
128
0,05
12
0,20
134
0,10
121
0,30
144
Автоклав работает при высоких давлениях и температурах и к его обслуживанию
допускаются только специально подготовленных лиц. При работе с автоклавом строго
соблюдают правила, указанные в прилагаемой к аппарату инструкции. Подготовку
автоклава к работе и процесс стерилизации осуществляют следующим образом.
Тщательно проверяют исправность аппарата. В водопаровую камеру через воронку
заливают дистиллированную воду до тех пор, пока ее уровень не дойдет до верхней метки
водомерного стекла. После этого кран перекрывают. Питательные среды в пробирках или
колбах, закрытых ватными пробками с бумажными колпачками, завернутую в бумагу
посуду и другой стерилизуемый материал помещают на решетчатую подставку и
накрывают бумагой. Автоклав закрывают крышкой, равномерно завинчивают зажимы, не
допуская перекосов и не плотностей. Открывают спускной кран пароотводной трубы,
включают автоклав в электрическую сеть и начинают прогрев. Образующийся пар должен
вытеснить из автоклава весь воздух, так как температура чистого насыщенного пара выше
температуры смеси пара с воздухом. После полного удаления воздуха и влажного пара
непрерывную струю свистящего сухого пара выпускают еще 10-15 мин и перекрывают
спускной кран. Пар выпускают через резиновый шланг, надетый на пароотводную трубку
и опущенный в сосуд с водой. За повышением рабочего давления в автоклаве следят по
манометру. Время стерилизации отсчитывают с момента установления необходимого
давления.
Излишний
пар,
образующийся
в
результате
нагрева,
выпускается
предохранительным клапаном, как только стрелка манометра переходит черту требуемого
давления. По истечении времени стерилизации автоклав выключают из электрической
сети, нагревание прекращают и ждут момента, когда давление по манометру упадет до
нуля. Только после этого можно открыть спускной кран, осторожно выпустить из
автоклава остаток пара, затем отвинтить и откинуть крышку. Если спускной кран открыть
раньше, чем стрелка займет нулевое положение, может произойти бурное вскипание
жидких сред и смачивание ватных пробок. Резкое снижение давления может привести к
выталкиванию пробок и даже выплескиванию жидкости из сосудов. Нельзя
преждевременно отвинчивать и открывать крышку, так как вырывающиеся струи пара
могут вызвать ожоги обслуживающего персонала и окружающих. Автоклаву дают
несколько остыть и вынимают простерилизованный материал. Оставлять автоклав
закрытым до полного охлаждения не рекомендуется, так как пар конденсируется и влага
пропитывает ватные пробки. В нерабочем состоянии автоклав держат открытым и
свободным от воды. Для проверки стерильности питательные среды помещают на 2-3 сут
в термостат при 30ºC, и если обнаруживают рост микроорганизмов, среды готовят заново.
Для контроля соответствия показаний манометра температуре, внутри автоклава
пользуются веществами, имеющими определенную точку плавления. Например,
бензонафтол плавится при 110 ºC, антипирин – при 113 ºC, резорцин и сера – при 119 ºC,
бензойная кислота – при 120 ºC. В стеклянную ампулу или пипетку Пастера длиной 5-6
см, запаянную с одного конца, насыпают одно из указанных веществ, и прибавляют
несколько кристаллов сухого анилинового красителя (фуксина, сафранина или
метиленового синего). Трубочку запаивают и помещают в автоклав между
стерилизуемыми предметами. Если температура соответствует давлению, контрольное
вещество расплавится и окрасится в цвет взятого красителя.
Температура и продолжительность автоклавирования определяются составом
питательных сред и их рН. Субстраты, легко разрушающиеся при нагревании до 120 ºC,
стерилизуют при 0,05 МПа. При кислой реакции некоторые вещества, входящие в состав
питательной среды, в процессе автоклавирования гидролизуются. Во избежание этих
явлений, растворы некоторых компонентов (сахара, многоатомные спирты, витамины,
аминокислоты) стерилизуют отдельно при значениях рН, обеспечивающих их
устойчивость, и добавляют после стерилизации. Такой способ обеспложивания
называется раздельной стерилизацией.
Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация). Данный способ
применяют для стерилизации питательных сред, изменяющих свой состав и свойства под
действием температур выше 100 ºC. Сущность дробной стерилизации состоит в том, что
нагревание среды (или ее компонентов) проводят при 100 ºC три раза по 30 мин трое
суток подряд. Кратковременное прогревание среды кипячением уничтожает в основном
термолабильные вегетативные клетки микроорганизмов. Поэтому между нагреваниями
питательные среды выдерживают при комнатной температуре (или в термостате при 30
ºC) и дают возможность прорасти оставшимся жизнеспособным спорам. Образовавшиеся
из термоустойчивых спор вегетативные клетки погибают при повторном кипячении.
Продолжительность нагревания может быть увеличена до 45-60 мин, что зависит от
объема жидкости.
Дробную стерилизацию питательных сред проводят в аппарате Коха или в автоклаве
с закрытой, но не завинченной крышкой. Так как нагревание ведут в парах кипящей воды,
способ называют стерилизацией текучим паром. Дробной стерилизации подвергают
среды, в состав которых входят сахара, многоатомные спирты, желатин.
Стерилизация путем прерывистого нагрева была предложена английским
физиком Джоном Тиндалем и получила название тиндализации. Среды необратимо
изменяющиеся при кипячении, осторожно прогревают при более низкой температуре: при
60-80 ºC в течение 5 сут подряд по 30-60 мин или при 56-58 ºC на протяжении 6-7 сут, в
первые сутки – 2 ч, в последующие – по 1 ч. Температурную обработку сред ведут на
водяной бане или в ультратермостате, где температура автоматически поддерживается на
определенном уровне с помощью специального устройства. В промежутках между
нагревами среды выдерживают в обычном термостате при 30 ºC.
Пастеризация. Пастеризация, или неполная стерилизация, предложена Луи
Пастером. Она предназначена для уничтожения в основном аспорогенных
микроорганизмов однократным прогреванием при температуре 60-75 ºC и выдержке 15-30
мин или при 80 ºC в течение 10-15 мин. Пастеризации подвергаются продукты и среды,
которые при воздействии боле высоких температур претерпевают глубокие изменения,
теряют качество и питательную ценность. Пастеризацию широко применяют в пищевой
промышленности.
Стерилизация фильтрованием. Стерилизацию жидких питательных сред, не
выдерживающих даже незначительного нагревания, производят фильтрованием через
специальные мелкопористые бактериальные фильтры. На бактериальных фильтрах
задерживаются механические взвешенные примеси, в том числе и клетки
микроорганизмов. Исключение составляют вирусы и фаги. Фильтрованию подвергают
среды с белками, антибиотиками, витаминами, летучими веществами, а также
культуральные жидкости с целью освобождения от клеток и сохранения всех продуктов
метаболизма в неизменном виде. Фильтры изготавливают из положительно заряженных
материалов.
Техника приготовления основных питательных сред
Для культивирования микробов в лабораторных условиях готовят питательные
среды с учетом потребности в питательных веществах каждого вида в отдельности.
Питательная среда в своем составе должна содержать углерод, водород, кислород, азот,
фосфор, серу, магний, железо, микроэлементы и биостимуляторы роста.
Различают питательные среды естественные (молоко, яйца, картофель и т. п.),
искусственные, приготовленные из продуктов животного или растительного
происхождения, и синтетические (среды Чапека, Сабуро). По консистенции среды могут
быть жидкими, полужидкими и плотными.
Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар или желатин.
Агар-агар представляет собой продукт переработки высушенных морских водорослей
рода анфельция, состоящий в основном из полисахаридов. В холодной воде агар-агар
набухает и размягчается, в горячей (90—100° С) расплавляется, образуя клееобразную
массу. Застывает агар-агар при 40° С, образуя студень. Как питательное вещество агарагар микробами не используется.
Желатин получают путем вываривания кожи, костей и сухожилий животных. При
нагревании с водой желатин образует коллоидный раствор, застывающий при 18—20° С в
однородный коллоидный студень и расплавляющийся при 25—27° С.
В бактериологической практике обычно применяют среды из продуктов животного и
растительного происхождения, содержащие пептоны, экстрактивные вещества мяса,
кровь, сыворотку, сусло, углеводы и т. п.
Необходимые питательные вещества должны содержаться в среде в доступной
форме и в определенных соотношениях.
Питательные среды должны быть стерильными (должно быть обеспечено получение
чистых культур микроорганизмов), прозрачными (выросшие на них микроорганизмы
должны быть хорошо видны и иметь определенную величину рН).
Хранят готовые среды в прохладном месте, в плотно закрывающихся шкафах или
ящиках, что предохраняет их от быстрого высыхания. Надолго хранившихся средах
микробы развиваются слабо или совсем не растут.
Питательные среды принято делить на три группы:
1) стандартные (универсальные) — предназначаются для культивирования
большинства микробов;
2) специальные элективные, избирательные — предназначаются для выращивания
только определенного вида микробов, рост других микроорганизмов на этих средах
подавляется;
3) дифференциально-диагностические — предназначаются для изучения
биохимических свойств микробов с целью дифференцирования различных видов
микроорганизмов.
СТАНДАРТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Мясопептонный
бульон (МПБ). В состав МПБ входят мясная вода, пептон
и поваренная соль. Для приготовления мясной воды используют свежее мясо
крупного рогатого скота или лошадей. Мясо освобождают от костей, жира и сухожилий
и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водой из расчета 1:2
(например, 1 кг фарша заливают 2 л воды). Ставят на 18—20 ч в прохладное место (4—6°
С), затем кипятят в течение часа и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш
отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема, разливают его по
колбам или бутылям и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в
течение 30 мин. Или заливают двукратным количеством воды, кипятят в течение часа,
дают остыть, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату
добавляют воды до первоначального объема и стерилизуют его в течение 30 мин при
избыточном давлении 0,1 МПа.
При варке мясной воды на поверхности жидкости появляется некоторое количество
жира, который необходимо снять.
Для приготовления МПБ к мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% химически
чистой поваренной соли, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр,
устанавливают рН 7,2—7,4 прибавлением щелочи или двууглекислой соды и снова
кипятят 10 мин. Профильтрованный бульон должен быть цвета соломы и совершенно
прозрачным. Бульон разливают по пробиркам и колбам, закрывают ватными пробками,
пробки обвязывают пергаментной бумагой и стерилизуют 20—30 мин при избыточном
давлении 0,1 МПа.
Мясопептонный агар (МПА). К мясопептонному бульону добавляют 2—3%
нарезанного агар-агар; нагревают в автоклаве или в текучепаровом аппарате до полного
расплавления агар-агара. Устанавливают рН 7,2—7,4. Дают остыть до 50° С, осветляют
путем добавления белка одного куриного яйца, разведенного двойным количеством
дистиллированной воды . Ставят на 20 мин в автоклав при избыточном давлении 0,1 МПа
для свертывания белка и тем самым осветляют среду, фильтруют через слой марли и ваты
(рис. 1). Можно пользоваться другой методикой. К мясопептонному бульону добавляют
2—3%
нарезанного агар-агара, нагревают до полного расплавления его.
После
остывания застывший плотный агар вынимают из посуды и отрезают нижнюю часть,
содержащую осадок. Затем вновь расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют
при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Необходимо, чтобы прозрачность
агара позволяла свободно читать напечатанный на бумаге шрифт при наложении на него
бактериологической чашки с агаром, налитым слоем толщиной 20 мм.
После
стерилизации для того, чтобы агар в пробирках застыл столбиком, их оставляют в
вертикальном положении. Если нужно приготовить агар скошенной формы, пробирки с
расплавленным агаром располагают в наклонном положении так, чтобы среда заняла две
трети пробирки, и в таком виде оставляют до застывания среды (рис. 2). При этом пробирки необходимо предохранять от действия солнечного света.
Мясопептонный желатин (МПЖ). К мясопептонному бульону добавляют 10%
зимой и не менее 18—20% летом измельченного желатина и подогревают в
текучепаровом аппарате до полного растворения желатина. Подщелачивают среду до рН
7,2 путем добавления 10%-ного раствора NaОН. После охлаждения до 60° С осветляют
яичным белком (в таком же количестве, как и для МПА), подогревают в текучепаровом
аппарате 20—30 мин. В горячем виде фильтруют через ватный или марлевый фильтр и
разливают по пробиркам. Стерилизуют дробно по 15—20 мин три дня подряд при
температуре 100° С.
Картофельная среда. Отбирают крупный картофель, промывают щеткой под
водопроводной водой, удаляют кожуру и поврежденные места. Клубни снова моют под
струей водопроводной воды и помещают в 1%-ный раствор двууглекислой соды на
2—3 ч для нейтрализации кислой среды. Из картофеля пробником вырезают столбики,
диаметр которых должен соответствовать ширине пробирок. Столбики помещают в чашки
с водой и разрезают по диагонали на две части, подсушивают фильтровальной бумагой и
половинки помещают в пробирки с перехватом внизу (в нижнюю часть этих пробирок
стекает вода, выделяемая при стерилизации). За неимением специальных пробирок
используют обычные пробирки, поместив на дно стеклянные или деревянные палочки, а
на них — картофель. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20—25
мин.
Пептонная вода. Приготовляют ее различными способами. В 1 л дистиллированной
воды растворяют 5 г химически чистой поваренной соли и 10 г пептона и стерилизуют в
автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 10 мин. Для выращивания
гнилостных бактерий пептонную воду готовят несколько иначе: в 1 л дистиллированной
воды растворяют 30 г пептона. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение
20 мин. Концентрированная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 100 г
пептона и 50 г поваренной соли, нагревают до кипения, отфильтровывают, добавляют 50 г
глюкозы, устанавливают рН 7,4— 7,6 (с помощью насыщенного раствора углекислой
соды), разливают по 10 мл в колбы и склянки емкостью 250 мл с поплавками и
стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром. Разведенная глюкозопептонная среда. В
1 л воды растворяют 10 г пептона и 5 г поваренной соли, нагревают до кипения и
добавляют 5 г глюкозы. Устанавливают рН среды 7,4—7,6, разливают по 10 мл в
пробирки с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром.
Сухой питательный агар. Содержит рыбный или мясной бульон, агар, хлористый
и фосфорнокислый натрий. К 5 г порошка агара добавляют 100 мл холодной
дистиллированной воды. Тщательно взбалтывают и нагревают при помешивании до
полного растворения агара, не допуская пригорания. По мере надобности раствор
фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа
в течение 20 мин.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ (ЭЛЕКТИВНЫЕ) ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Среды
для
выращивания
анаэробных
микробов. Мясопептонный
печеночный бульон Кита - Тароцци (МППБ). Свежую или замороженную печень
(лучше крупного рогатого скота) режут на мелкие куски, заливают равным по массе
количеством водопроводной воды, варят в течение часа, фильтруют через вату и
добавляют к 1 части полученного экстракта 3 части мясопептонного бульона. Смесь
нагревают до кипения, добавляют химически чистую поваренную соль (на 1 л среды 1,25
г) и доводят рН до 7,6—7,8, после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через
бумажный или увлажненный ватный фильтр. К профильтрованному бульону добавляют
мелко нарезанные кусочки (по 1,5— 2 г) печени, из расчета на 1 л бульона 100 г печени
(печень предварительно очищают от пленок и промывают водой). В пробирку помещают
несколько таких кусочков, наливают высоким столбиком 7—10 мл бульона, на
поверхность его наслаивают вазелиновое или парафиновое масло.
Бульон с кусочками печени стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в
течение 30 мин. С целью удаления из пробирки кислорода перед посевом среду кипятят 10
мин и быстро охлаждают водой.
Полужидкий агар для анаэробов. К МПБ добавляют 0,25—0,75% агар-агара и 1%
глюкозы; рН среды 7,4. Среду разливают высокими столбиками в пробирки. Стерилизуют
дробно текучим паром по 15—20 мин в течение 3 дней.
Среды для
выращивания
молочнокислых бактерий. Молоко (цельное).
Нагревают до кипения. Наливают в тубусную склянку и ставят на 10—20 ч в холодное
место для отстаивания сливок. По истечении этого времени через кран тубуса разливают
обезжиренную часть молока по пробиркам, закрывают ватными пробками. Стерилизуют
дробно при 100° С три дня по 20 мин или при 112° С однократно 30 мин.
Обезжиренное
молоко. Для получения обезжиренного молока цельное молоко
сепарируют и далее поступают так же, как при использовании цельного молока.
Гидролизованное молоко (по Богданову). Берут 1 л прокипяченного и
остуженного до 45° С обезжиренного молока, устанавливают рН 7,6—7,8, добавляют 0,5
г порошка панкреатина (разведенного предварительно в небольшом количестве теплой
воды) или 2—3 г измельченной поджелудочной железы и через несколько минут 5 мл
хлороформа. После этого бутыль тщательно встряхивают, плотно закрывают корковой
пробкой и помещают на 3 суток в термостат при температуре 40° С при ежедневном
встряхивании жидкости. По истечении указанного срока с целью удаления хлороформа
бутыль открывают, жидкость фильтруют и разбавляют в 2—3 раза водопроводной водой.
Доводят рН среды до 7,0— 7,2 и стерилизуют.
Агар из гидролизованного м о л о к а. К гидролизованному молоку прибавляют
1,5—2% агара, расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют под избыточным
давлением 0,1 МПа в течение 15 мин. На этой среде хорошо растут молочнокислые
палочки.
Сывороточный агар. На 100 мл водопроводной воды берут 7,5 г агара, кипятят до
полного растворения, добавляют воды до первоначального объема (т. е. в объеме, равном
объему испарившейся воды), прибавляют 400 мл заранее приготовленной молочной
сыворотки, подвергают действию текучего пара в течение 30 мин, фильтруют через слой
ваты, разливают по пробиркам и стерилизуют под давлением 0,05 МПа в течение 30 мин.
Капустная среда. 200 г измельченной капусты (или люцерны) заливают 100 мл воды
и кипятят в кастрюле 10 мин, отжимают через двойной слой марли. Полученную
жидкость фильтруют и разводят в 2 раза водопроводной водой. Добавляют 2% глюкозы и
1% пептона, разливают по пробиркам и стерилизуют три избыточном давлении 0,05 МПа
в течение 15 мин.
Среда для выращивания осмофильных дрожжей. Примерно в 1 л
дистиллированной воды вносят 200 г предварительно подогретого меда, 1 г
двуфосфорнокислого калия, 0,5 г сульфата магния, 0,5 г виннокислого аммония, 0,1 г
хлористого натрия и 0,1 г хлористого калия. Все компоненты смешивают и стерилизуют
под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.
Среда для выращивания галофилов. Используют обычные мясопептонные среды
с добавлением от 10—15 до 20—30% поваренной соли. Кроме того, при изготовлении
плотных питательных сред увеличивают и процентное содержание агара. Стерилизацию
проводят под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.
Среды обогащения. Среда Мюллера. К 4,5 г химически чистого мела,
предварительно простерилизованного сухим жаром, добавляют 90 мл МПБ и стерилизуют
под избыточным давлением 0,1 МПа в течение-20 мин. Готовят: а) раствор гипосульфита
(50 г чистого кристаллического гипосульфита заливают до 100 мл дистиллированной
водой, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин); б) раствор йода (20 г
металлического йода и 25 г йодистого калия заливают до 100 мл дистиллированной
водой). Перед посевом к бульону с мелом стерильно добавляют 10 мл раствора
гипосульфита и 2 мл раствора йода. При добавлении каждого ингредиента смесь
взбалтывают. Разливают по стерильным пробиркам или колбам.
Среда Киллиана. К 100 мл обычного МПБ стерильно добавляют перед
использованием 1 мл водного раствора (1:1000) бриллиантового зеленого.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ (ЦВЕТНЫЕ)
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Среда Эндо. К 100 мл нейтрального расплавленного 3%-ного мясопептонного агара
прибавляют 1 мл 10%-ного водного раствора кристаллического углекислого натрия,
выдерживают в текучепаровом аппарате в течение 10 мин при температуре 100° С,
охлаждают до 60° и стерильно прибавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в
5 мл стерильной воды, и смесь фуксина с безводным сульфитом натрия. Смесь готовят
следующим образом. Растворяют 0,5 г сульфита натрия в 5 мл стерильной воды и
добавляют к 1 мл насыщенного спиртового раствора основного кристаллического фуксина
до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной или слегка розоватой. Обесцвеченную
смесь фуксина с сульфитом добавляют к расплавленному агару, и последний принимает
розоватый цвет. После тщательного перемешивания (следят за тем, чтобы не
образовывалась пена) среду разливают по чашкам. При остывании среда делается
цветной, в толстых слоях имеет розоватый оттенок. На этой среде можно легко отличить
кишечную палочку, паратифозных бактерий.
Готовят среду перед посевом. Во избежание покраснения ее защищают от света.
Выпускается в виде сухого порошка. Способ приготовления указывается на
этикетке.
Среда
Гисса. Для изготовления индикатора Андредэ берут 100 мл
дистиллированной воды, 0,5 г фуксина кислого и 16 мл 4%-ного водного раствора едкого
натра. Выдерживают на водяной бане 10 мин. Хранят в темном месте.
Среду с индикатором Андредэ приготовляют следующим образом. Готовят
пептонную воду. Для этого берут 1% пептона и 0,5% поваренной соли на определенный
объем дистиллированной воды. Кипятят до растворения пептона, фильтруют через
бумажный складчатый фильтр, устанавливают рН 7,0—7,2. После подщелачивания 10%ным раствором NаОН снова кипятят в течение 10 мин, фильтруют и к готовой 1%-ной
пептонной воде (рН 7,0—7,2) добавляют 1% индикатора Андредэ. К среде с индикатором
добавляют требуемые углеводы или многоатомные спирты в количестве 0,5% — 1% (лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит, дульцит и др.). Среды разливают по пробиркам,
снабженным для учета образования газа бродильными трубочками. Вместо трубочек
иногда помещают кусочки ваты — 0,02 г на пробирку. Проводят дробную стерилизацию
при температуре 100° С в течение 20 мин три дня подряд.
Правильно приготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет.
Среда Кесслера. В 1 л водопроводной воды вносят 50 мл свежей бычьей желчи и 10
г пептона. Кипятят на водяной бане 15 мин, постоянно взбалтывая. После полного
растворения среду фильтруют через вату и добавляют 10 г лактозы. Доводят рН до 7,7. К 1
л среды добавляют 4 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета и разливают в
пробирки с поплавками. Стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в
течение 15 мин.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Для культивирования микробов
на
искусственных питательных средах особое
значение имеет концентрация водородных ионов, так как каждый вид микроба может
развиваться только при определенной кислотности или щелочности. Большинство
бактерий приспособлено к росту и размножению в нейтральной или слабощелочной среде
(рН 7,0—7,6).
Для определения реакции питательной среды применяют два
метода:
электрометрический
(с
помощью рН-метра) и колориметрический. В лабораторной
практике чаще всего используется наиболее простой колориметрический метод по
Михаэлису, основанный на изменении цвета индикатора вследствие диссоциации его в
зависимости от концентрации водородных ионов в среде. При определении рН по
Михаэлису применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Ввиду того, что для
выращивания микробов готовят среды слабощелочной реакции, при определении рН
среды в качестве индикатора используют метаннитрофенол, который позволяет
определять рН в пределах от 6,8 до 8,4. Растворы индикатора готовят на
дистиллированной воде и хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
Контрольные вопросы:
1. Состав питательных сред.
2. Как культивируют в лабораторных условиях микроорганизмы?
3. Какие бывают питательные среды по консистенции?
4. Как различают питательные среды по происхождению?
5. Плотные питательные среды и их характеристика.
6. Сухие питательные среды и их характеристика.
7. Углеводные питательные среды, их характеристика.
8. Автоклавирование.
9. Стерилизация текучим паром.
10. Пастеризация.
11. Стерилизация фильтрованием.
12. Как готовят МПБ, МПЖ, МПА?
Лабораторная работа №7,8
Тема: Методы посева и культивирование продуцентов.
Цель работы: Дать магистрантам представление о способах культивирования
продуцентов, как самостоятельного разряда микроорганизмов, Ознакомить магистрантов
с поверхностными и глубинными способами посева микроорганизмов, аэробными и
анаэробными методами культивирования. Научится проводить посев на плотные и жидкие
питательные среды.
Задание:
1. Изучить технику посева на питательные среды.
2. Сделать посев и пересев на жидкие питательные среды.
3. Провести посев на плотные питательные среды
- на скошенный мясо-пептонный агар;
- уколом в столбик питательной среды;
- петлей на среду в чашку Петри;
- шпателем или тампоном на среду в чашку Петри;
- в толщу питательной среды.
4.
Изучить образовавшиеся колонии. Определить
микроорганизмов.
5.
Приготовить мазки и окрасить по Граму.
6.
Промикроскопировать полученные препараты.
7.
Зарисовать увиденное в микроскопе в тетрадь.
8.
Оформить отчеты и ответить на контрольные вопросы.
морфологию
Материалы и оборудование: Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт –
Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева;
бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один
стерильный завернутый шпатель на двух магистрантов; насос Камовского, эксикатор,
анаэростат, карандаши по стеклу.
Теоретическая часть.
Для выделения культуры микробов из исследуемого материала (молока, мяса, воды,
почвы и т. д.) в лабораторных условиях используют метод посева и пересева. Посевом
называется внесение части исследуемого материала в чистую, стерильную питательную
среду, пересевом— перенос части выросшей на питательной среде культуры микробов на
другую, свежую стерильную питательную среду (рис. 1).
П о с е в на п л о т н у ю п и т а т е л ь н у ю с р е д у . Техника посева зависит
от консистенции питательной среды, на которой желают вырастить культуру микробов.
Посев производят с помощью бактериологический петли и иглы или пипетки Пастера.
Рис. 1. Пересев из одной пробирки в другую
С целью предупреждения загрязнения среды микрофлорой воздуха пробирки держат
наклонно над пламенем горелки или спиртовки. Далее поступают следующим образом:
1) в левую руку берут пробирку с микробной культурой и пробирку со стерильной
питательной средой и держат в наклонном положении между большим и указательным
пальцем; в правой руке держат петледержатель в вертикальном положении над пламенем
горелки, прокаливают петлю до появления красного цвета, затем наклоняют
горизонтально и 2—3 раза быстро проводят через пламя петледержатель;
2) взяв мизинцем и безымянным пальцами правой руки наружный конец ватной
пробки, вынимают около пламени пробку из пробирки, после чего обжигают края обеих
пробирок. Следят за тем, чтобы пробки ни к чему не прикасались;
3) вводят петлю в пробирку с микробной культурой. Для охлаждения петли нужно
сначала прикоснуться к поверхности агара, где нет культуры, после чего осторожно
снимают небольшое количество культуры или каплю жидкости (если среда жидкая) и
быстро переносят (не прикасаясь к стенкам пробирки!) во вторую пробирку со стерильной
питательной средой; петлю опускают до конденсационной воды, находящейся на дне
пробирок со свежими средами, и делают посев культуры одним из трех способов:
посев ш т р и х о м — проводят зигзагообразную линию, свободно скользя петлей по
поверхности среды от одного края пробирки к другому;
посев ч е р т о й — проводят петлю по прямой линии посредине поверхности
питательной среды;
посев с п л о ш н о й — растирают материал непрерывными круговыми движениями
по всей поверхности питательной среды;
4) вынимают петлю, обжигают края пробирок и внутренние концы пробок (если
пробки загораются, дуть на них ни в коем случае нельзя); следует быстро ввести их в
пробирки, наружный конец гасят рукой или пинцетом;
5) прокаливают петлю на пламени и ставят ее на место;
6)
па пробирке карандашом или чернилами по стеклу ставят дату посева,
название культуры микроба.
В столбики МПЖ или МПА сеют у к о л о м (рис. 2). С этой целью стерильной иглой
с набранным на нее материалом прокалывают столбик агара или желатин в средней части,
следя за тем, чтобы игла нигде не подходила к стенкам пробирки. Не доводя на сантиметр
до дна пробирки, иглу извлекают, обжигают на пламени спиртовки до красного каления
(убивают оставшихся на петле микробов), после чего край пробирки еще раз обжигают на
огне, проводят через пламя пробку и закрывают пробирку. Край пробирки во время посева
держат, не отнимая, около огня, фиксируя левую руку в этом положении упором о край
стола. Бактериологическую петлю помещают в ШТАТИВ, а пробирку, отметив на ней номер
экспертизы, дату посева и место, откуда был взят материал, помещают в термостат.
П о с е в в жидкую с р е д у . При посеве в жидкую питательную среду стерильную
бактериологическую петлю с набранным на нее материалом вносят в пробирку с
соблюдением всех предосторожностей, описанных выше. Материал тщательно растирают
по стенке пробирки у верхнего края среды, все время смывая его средой. При посеве
пастеровской (рис. 3) пипеткой поверхность обжигают на пламени спиртовки, охлаждают,
отнеся в сторону от огня, затем обломав стерильным пинцетом запаянный конец,
набирают в нее материал, быстро вносят в пробирку и производят посев так же, как это
делают петлей, соблюдая правила стерильности.
Рис. 2
Посев уколом
Рис. 3. Пользование пипеткой Пастера
После использования пипетки ее помещают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью
(5%-ным раствором карболовой кислоты или др.).
Методы культивирования анаэробов. Для культивирования анаэробов на
искусственных питательных средах требуется поддерживать в среде анаэробные условия
не только в момент посева, но и в период их роста.
Для создания анаэробных условий применяют физический, химический,
биологический и комбинированный методы.
Ф и з и ч е с к и й метод. В жидких питательных средах
(Китт- Тароцци)
анаэробные условия создаются путем:
а) удаления поглощенного средой кислорода кипячением в течение 10—15 мин с
последующим быстрым охлаждением под струей холодной воды, после чего тотчас же
производят посев и помещают в термостат;
б) заливки поверхности жидкости слоем индифферентного масла (вазелинового, парафинового), прекращающим доступ в среду атмосферного воздуха;
в) разливка среды в узкие пробирки высоким столбиком;
Рис. 4. Культура анаэробов в чашках Петри, помещенных в эксикатор, соединенный
с масляным насосом
г) добавления к жидким средам до их стерилизации кусочков печени, мышц,
картофеля, яичного белка, а, также углеводов (глюкозы и др.), расщепляемых анаэробами
в процессе размножения.
Анаэробные условия создаются путем удаления воздуха из анаэростатов или
эксикаторов (рис. 4) или замене его каким-либо индифферентным газом (водородом,
углекислым газом, азотом). Снижения давления воздуха в эксикаторах и анаэростатах до
0,0001 МПа (1 мм рт. ст.) путем выкачивания его при помощи вакуум-насоса под
контролем ртутного манометра достаточно для выращивания строгих анаэробов. На дно
эксикатора для поглощения избытка влаги помещают 20—30 г сухой поваренной соли или
5—6 г хлористого кальция. Анаэростат представляет собой металлический Цилиндр с
герметически закрывающейся крышкой и краном, посредством которого он
присоединяется к насосу. После выкачивания воздуха кран закрывают, и анаэростат
помещают в термостат.
Атмосферный воздух из герметически закрытых сосудов часто вытесняют какимлибо другим, индифферентным газом (например, водородом или азотом).
Х и м и ч е с к и й м е т о д . Химический метод основа на химической реакции,
протекающей в герметически замкнутом сосуде, где происходит связывание свободного
кислорода воздуха.
Рис. 5. Прибор Аристовского
Для этого используют пирогаллол и щелочь или гидросульфат натрия и углекислый
натрий.
Посевы в пробирках и чашках Петри помещают в эксикатор или аппарат
Аристовского (рис. 5), на дно которого помещают открытую чашку Петри, насыпают
углекислый натрий и гидросульфит натрия. Смесь слегка увлажняют водой и
перемешивают; эксикатор герметически закрывают и помещают в термостат. В результате
химической реакции происходит поглощение кислорода и создаются анаэробные условия.
Б и о л о г и ч е с к и й м е т о д . Биологический метод предусматривает совместное
культивирование аэробов и анаэробов. В герметически закрывающийся сосуд помещают
пробирки с посевом анаэробов и аэробов из расчета 10—15 пробирок с посевами аэробов
на 1 пробирку анаэробов. Сосуд герметически закрывают и помещают в термостат.
Аэробы при своем росте поглощают кислород и тем самым создают условия для роста
анаэробов.
К о м б и н и р о в а н н ы й м е т о д . Метод заключается в комбинировании для
создания анаэробных условий физического метода с химическим или биологическим, а
также химического метода с биологическим.
Практическая часть
1. Провести посев в мясо-пептонный бульон (МПБ).
Берут петлю, обжигают ее в пламени спиртовки вводят в емкость, в которой
находятся микроорганизмы, затем охлаждают и берут материал для посева. Если материал
для посева жидкий, то его набирают в стерильную пастеровскую или градуированную
пипетку. Петлю и пипетку держат тремя пальцами правой руки (большим, указательным и
средним). В левую руку берут пробирку с жидкой питательной средой и открывают
пробку пальцами правой руки, прижав ее мизинцем к ладони или держа между
указательным пальцем и мизинцем. Осторожно вводят петлю или пипетку в пробирку с
питательной средой и погружают в нее. Если материал вязкий и с петли не снимается, его
растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Из пипетки материал для
посева вливают.
После проведения посева пробирку закрывают пробкой, которую в течение всего
посева держат в руке, и содержимое тщательно перемешивают, осторожно встряхивая,
чтобы не замочить пробку, или вращая сначала в одну сторону, затем в другую сторону.
При посевах культур, растущих в виде поверхностной пленки, последнюю очень
осторожно снимают и опускают на поверхность свежей питательной среды, не давая
погрузиться вглубь.
Полученные посевы термостатируют в течение 24 часов при температуре 37ºC.
2. Провести посев на скошенный мясо-пептонный агар.
В правой руке, как писчее перо, держат петлю, предварительно прокаленную в
пламени горелки и охлажденную, с взятым для посева материалом. Пробирку держат
между большим и указательным пальцами левой руки так, чтобы ее основание находилось
на поверхности кисти. Посев осуществляют под контролем глаз. Мизинцем и безымянным
пальцем правой руки вынимают из пробирки пробку, держа ее за наружный конец, не
прикасаясь к части пробки, которая входит внутрь пробирки. Пробку вынимают над
пламенем горелки, после чего обжигают ее края. Нужно следить за тем, чтобы пробка ни к
чему не прикасалась. Затем вводят петлю с материалом для посева в пробирку до дна и
делают посев или на поверхность питательной среды, или в конденсационную воду.
Пересев культуры из одной пробирки в другую осуществляется аналогично. Только в
левую руку берут сразу две пробирки, а затем правой рукой (мизинцем и безымянным
пальцем) вынимают сразу две пробки.
Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37ºC.
3. Провести посев петлей на среду в чашку Петри.
При проведении посева на поверхность плотной питательной среды в чашку Петри
чашка стоит на столе. Левой рукой приоткрывают ее крышку с одной стороны так, чтобы
в щель могла пройти петля, на которой находится материал для посева. Небольшое
количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность
питательной среды. Посев делают одним из трех способов: штрихом, чертой, сплошной.
Затем петлю вынимают из чашки Петри и закрывают ее. Прокаливают петлю в
пламени горелки и ставят ее на место.
Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37ºC.
4. Провести посев исследуемого материала в толщу плотной питательной среды.
Материал, засеваемый в толщу питательной среды, должен быть в жидком
состоянии. Для этого из материала, подлежащего посеву, готовят взвесь (в стерильной
воде или физиологическом растворе), затем набирают ее в стерильную пипетку в объеме
0,1; 0,5 или 1 мл (в зависимости от предполагаемого микробного загрязнения) и выливают
в пустую стерильную чашку Петри. После этого чашку заливают мясо-пептонным агаром
(10-15 мл), предварительно расплавленным и остуженным до 40-45 ºC (если приложить
колбу со средой к руке, то она не должна вызывать ощущения ожога, т.е. рука не должна
отдергиваться). Для равномерного распределения материала в среде чашку Петри
прижимают за крышку к столу и делают круговые вращения, следя за тем, чтобы
содержимое не попало на крышку.
Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37ºC.
5. Провести посев уколом в столбик питательной среды.
Посев уколом в столбик делается иглой. В правой руке, как писчее перо, держат
иглу, предварительно прокаленную в пламени горелки и охлажденную, с взятым для
посева материалом. Пробирку с питательной средой (мясо-пептонный агар, желатин и
др.), застывшей в виде столбика, берут в левую руку, открывают пробку (как указано
выше) и в центр среды до дна пробирки вкалывают иглу с находящимся на ней
материалом.
Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37ºC.
6. Провести посев шпателем или тампоном на среду в чашку Петри.
При помощи петли исследуемый материал вносят на поверхность питательной среды
у края чашки Петри, а затем шпателем или тампоном распределяют его равномерно по
всей поверхности агара.
При большом количестве бактерии растут в виде пленки, покрывающей всю
поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название
сплошного, или газонного. Посев газоном производят в том случае, когда нужно получить
большое количество микробной культуры одного вида.
7. Описать полученные посевы микроорганизмов.
Характер роста колоний изучают при помощи лупы или при малом увеличении
микроскопа. Для микроскопирования колоний чашку Петри с агаровой культурой
помещают дном вверх на предметный столик микроскопа, рассматривают и делают
описание колоний.
Рост микроорганизмов на МПБ.
При описании роста микробов на МПБ указывают:
- на характер помутнения;
- образование пленки на поверхности среды (тонкая, толстая, морщинистая,
складчатая, слизистая и т.д.);
- количество, характер и цвет осадка (точечный, обильный, зернистый, слизистый,
хлопьевидный, серый, беловато-желтый и т.д.);
- наличие пристеночного кольца и его характер: узкое, широкое, тонкое, узловатое,
серой, синеватое и т.д.
Для анаэробов отмечают еще и наличие газообразования.
Рост на плотных средах.
Рост на плотных средах может быть сплошным или в виде отдельных колоний,
обильным, слабым или умеренным. При описании роста колоний обращают внимание на
следующие факторы:
- форму (круглая, овальная, неправильная, звездчатая и др.);
- размер (мельчайшие или росинчатые, мелкие, точечные, крупноточечные). Более
крупные колонии измеряют по их диаметру (2-3-5 мм);
- поверхность (плоская, выпуклая, блюдцеобразная, с приподнятым центром,
складчатая, влажная, блестящая, матовая, сухая);
- края (ровные, волнистые, зубчатые, бухтообразные, бахромчатые и др.);
- прозрачность (прозрачные, полупрозрачные и непрозрачные);
- цвет (синеватые, серовато-синеватые, серые, беловато-серые, желтые, оранжевые и
др.).
7.3 Характер роста по уколу.
Характер роста по уколу указывает на отношение микроба к кислороду воздуха:
аэробы растут в виде гвоздя, шляпкой вверх, факультативные анаэробы растут
равномерно по всему уколу, облигатные (строгие) анаэробы – в нижней части укола.
При выращивании на желатине одни виды бактерий (протеолитические) его
разжижают, другие – не разжижают.
8. Приготовить мазки и окрасить их по Грамму.
Из колоний, выросших при выделении чистой культуры, готовят мазки, окрашивают
их по Грамму и микроскопируют при максимальном увеличении микроскопа для
установления однородности формы микробных клеток. Увиденное в микроскопе
зарисовывают в тетрадь.
Вопросы для самоконтроля.
1. Как проводится посев микроорганизмов на плотные питательные среды?
2. Как проводится посев микроорганизмов на жидкие питательные среды?
3. Что назевается чистой культурой микроорганизмов?
4. Какие приемы предосторожности против заражения исследуемого материала
посторонними микроорганизмами используются при посевах?
Лабораторная работа №9,10
Тема: Изучение роста микроорганизмов и влияние на него рН и температуры
культивирования.
Цель работы: Изучить влияние факторов внешней среды (рН среды, температуры)
на развитие микроорганизмов.
Задание:
1. Сделать посев бактерий на питательных средах с различным значением рН.
2. Воздействовать на спорообразующие и неспорообразующие бактерии
высокой температурой и сделать их посевы.
3. Сделать посевы плесневых грибов на питательных средах и вырастить их
при различных температурах.
4. Провести оценку интенсивности роста бактерий на питательных средах с
различным значением рН.
5. Повести оценку интенсивности роста бактерий после воздействия на них
высокой температуры.
6. Из выросших культур приготовить мазки и окрасить их по Граму.
7. Промикроскопировать препарат и установить форму бактерий..
8. Провести оценку интенсивности роста и спорообразования плесневого гриба
при различных температурах выращивания.
Материалы и оборудование: Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт –
Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева;
бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один
стерильный завернутый шпатель на двух магистрантов; карандаши по стеклу.
Теоретическая часть.
В естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию разных по
своей природе факторов, которые могут как стимулировать, так и тормозить их развитие
(замедлять метаболические процессы) и даже приводить их к гибели.
Температура является одним из наиболее мощных факторов, воздействующих на
микроорганизмы. И хотя в целом развитие микроорганизмов происходит в очень широком
диапазоне температур, для каждого конкретного вида существуют определенные
температурные границы, в которых происходит их жизнедеятельность. Эта температурная
зависимость характеризуется тремя точками:
- минимальной температурой развития (t minimum). Это такая температура, при
незначительном снижении которой скорость роста стремится к нулю (V роста→0);
- оптимальной температурой развития (t optimum). Это такая температура, при
которой скорость роста является максимальной (V роста = max);
- максимальной температурой развития (t maximum). Это такая температура, при
незначительном увеличении которой скорость роста стремится к нулю (V роста→0).
В зависимости от отношения к той или иной температуре все микроорганизмы
делятся на три основные группы: психрофилы, мезофиллы, термофилы.
Психрофилы (греческое «психрос» - холод, «филео» - люблю) развиваются при низких
температурах. Минимальной температурой развития у них является температура
замерзания среды (около -2ºC), оптимальная -15-20ºC, а максимальная – 30-35ºC. К ним
относятся обитатели холодных источников северных морей и океанов. Их часто
обнаруживают на поверхности рыб. Многие из них, относящиеся к родам Pseudomonas,
Achromobacter, способны быстро вызывать микробиальную порчу рыбы, хранящейся при
температуре 0ºC. К психрофилам относится большинство светящихся бактерий рода
Photobacterium. Их развитие в морской воде вызывает ее свечение.
Мезофиллы («мезос» - средний) – наиболее распространенная группа
микроорганизмов, развивающихся в температурных пределах от 5-10 до 40-50ºC.
Температурный оптимум для них составляет 25-30ºC. К этой группе относятся многие
гнилостные бактерии, вызывающие порчу пищевых продуктов при положительных
температурах, а также все патогенные и токсичные формы бактерий. Вместе с тем
большинство промышленных процессов (получение органических кислот, ферментов и
т.д.) осуществляется с помощью мезофиллов.
Термофилы («термос» - теплый) развиваются в температурных пределах от 30-35 до
+80 и даже до +90ºC с оптимумом 5-60ºC. Они присутствуют в почве, навозе, иле. Среди
них есть как споровые, так и неспоровые бактерии. Наибольшее количество термофилов
наблюдается в местах, постоянно испытывающих действие высоких температур
(например, в горячих источниках).
Термофилия широко распространена среди анаэробов. В большинстве это споровые
формы (например, представители рода Clostridium), причем споры у них отличаются
особой термоустойчивостью. Поэтому они могут переносить стерилизацию и вызывать
плоско-кислую порчу консервов.
Отрицательное воздействие на микроорганизмы оказывают как низкие, так и
высокие температуры, но механизм их действия различен. Низкие температуры
оказывают в основном бактериостатическое действие вследствие замедления протекания
биохимических процессов (замедления метаболизма).
Гибель микроорганизмов (бактерицидное действие) наблюдается в случае чисто
механического разрыва клеток образующимися в них кристаллами льда. Чем меньше
образующиеся кристаллы льда и чем равномернее они распределены в клетке, тем меньше
гибель микроорганизмов. И наоборот, чем крупнее кристаллы, тем больше клеток
погибнет. Поэтому наиболее губительны для микроорганизмов температуры, которые
соответствуют криоскопической точке цитоплазмы (от -2 до -5,6ºC). Чем дальше
температура отстоит от криоскопического значения, тем меньше гибель микроорганизмов.
Наиболее губительны для микроорганизмов высокие температуры. Повышение
температуры приводит к ускорению биохимических реакций, но скорость реакций в
клетке изменяется непропорционально, что приводит к дисбалансу и нарушению
протекания метаболических процессов.
Высокие температуры (70-80ºC и выше) оказывают бактерицидное действие. Под их
воздействием происходит денатурация белка, приводящая к нарушению проницаемости
клеточных стенок, потере активности ферментов, изменению структуры цитоплазмы и,
как следствие всего этого, гибели клетки.
Разные группы микроорганизмов проявляют разную чувствительность к действию
высоких и низких температур. Наиболее чувствительны к действию низких температур
термофилы и мезофиллы, а к действию высоких – психрофилы и мезофиллы. Наибольшей
устойчивостью к действию высоких температур обладают споры. Воздействие высоких
температур широко используется для подавления развития микроорганизмов.
Реакция среды рН определяется концентрацией ионов водорода. Хотя в целом
микроорганизмы развиваются в очень широком диапазоне, каждой физиологической
группе и даже отдельным видам соответствуют определенные значения рН (оптимальная
зона рН), в пределах которых происходит их развитие. Плесневые грибы, дрожи и
бактерии рода Acetobacter лучше всего развиваются в кислой среде при рН = 3-5. Такие
микроорганизмы называются ацидофильными. Для большинства бактерий наиболее
благоприятна нейтральная или слабощелочная среда с оптимумом рН 7,0-7,3. Изменение
рН в кислую сторону губительно отражается на гнилостных бактериях. Наоборот,
уксуснокислые бактерии к кислой среде устойчивы. Особенно чувствительны к
изменению реакции среды азотофиксирующие бактерии, в частности азотобактер. Он
лучше всего развивается при рН 7,4-7,6, поэтому в кислых почвах его практически нет.
Клубеньковые бактерии тоже лучше развиваются при слабощелочной реакции среды, хотя
зона рН, при которой они могут развиваться, значительно шире, чем у азотобактера.
Влияние рН на развитие микроорганизмов основано на том, что реакция среды
влияет на активность ферментов, так как каждый фермент проявляет свою активность
только при определенных значения рН. От концентрации ионов водорода зависит также
поступление питательных веществ внутрь клетки и физическое состояние белков. Так,
денатурация и выпадение большинства белков в осадок под действием высоких
температур наиболее быстро и полно происходит в слабокислой среде. Увеличение
кислотности среды наряду с температурой широко используется для подавления развития
микроорганизмов при консервировании пищевых продуктов.
Практическая часть
1. Провести посев бактерий на питательные среды с различным значением рН.
Посев проводят в четыре пробирки на МПА с различным значением рН: в одной из
них рН равно 3, во второй – 5, в третьей – 7 и в четвертой – 9. Перед началом посева
каждую пробирку подписывают: указывают значение рН и ставят свой номер.
Для посева используют бактерии или из чистой бульонной культуры, или из плотной
питательной среды. Посев производят бактериальной петлей или бактериальной иглой с
соблюдением правил асептики. При посева на плотную среду пользуются иглой, а на
жидкую – петлей.
Петлю или иглу стерилизуют перед каждым посевом в пламени спиртовки
(фламбирование). После посева пробирки с засеянными средами помещают в штатив и
ставят в термостат. Термостатирование проводят в течение 24-48 ч при температуре 37ºC.
После этого выращенные культуры микроорганизмов переставляют в холодильник и
хранят там до следующего занятия.
2. Провести посев бактерий на косой агар после воздействия на них высокой
температуры.
Сначала готовят взвеси из культур бактерий, образующих и не образующих споры.
Для этого берут две пробирки со стерильным изотоническим раствором. В одну вносят
культуру сенной палочки (образует споры), а во вторую – молочнокислого стрептококка
(не образует споры). Обе пробирки помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. После
кипячения пробирки охлаждают и из каждой делают посев при помощи петли на косой
агар. Перед каждым посевом петлю стерилизуют.
Пробирки с посевами подписывают, указав культуру, которая в них посеяна, и свой
номер, помещают в штатив и ставят в термостат. Посевы термостатируют 24 ч при
температуре 37ºC. После этого выращенные культуры переставляют в холодильник и
хранят там до следующего занятия.
3. Провести выращивание плесневых грибов при разных температурах.
Посеять споры плесневого гриба в три чашки Петри на сусло-агар (СА) или среду
Сабуро с агаром. Предварительно готовят водяную суспензию спор. Для этого берут
культуру плесневого гриба со зрелыми органами размножения (конидиями или
спорангиями) и проводят по ним бактериальной петлей, предварительно смоченной в воде
(чтобы споры лучше к ней прилипали). Затем вносят петлю в стаканчик или пробирку с
водой (перенося туда споры) и тщательно перемешивают. Переносить споры в пробирку
можно несколько раз.
После этого стерильной бактериальной петлей берут каплю водяной суспензии спор
плесневого гриба и осторожно наносят ее на СА, прикасаясь ребром петли в центр каждой
чашки. При повторных посевах петлю можно не стерилизовать. Все чашки необходимо
подписать, указав на каждой из них температуру выращивания, и поставить свой номер.
Все надписи делаются только на дне чашек.
Засеянные чашки переворачивают вверх дном и ставят посевы на выращивание.
Выращивание микроорганизмов при температурах 5ºC проводят в холодильнике, а при
температуре 25ºC – в комнатных условиях, недалеко от батарей центрального отопления
(при этом чашки надо накрыть темным материалом, чтобы не попадал свет), при 40ºC – в
термостате. Через 48-72 ч все чашки переставляют в холодильник и хранят там до
следующего занятия.
4. Выполненные на предыдущем занятии посевы достают из холодильника и
проводят их анализ.
Провести оценку роста бактерий на средах с различными значениями рН.
Интенсивность роста бактерий на средах с различными значениями рН определяется
по степени мутности среды. Перед этим ставят содержимое каждой пробирки, на которой
был проведен посев на предыдущем занятии, тщательно перемешивают (вращая пробирки
между ладонями) и затем сравнивают друг с другом.
Для оценки интенсивности развития бактерий пользуются условными
обозначениями: рост отсутствует (-); рост слабый (+); рост умеренный (++); рост сильный
(обильный) (+++). Степень мутности оценивается визуально. Полученные данные
фиксируют в таблице 1 и делают вывод о влиянии рН на развитие взятых для посева
бактерий.
Таблица 1
Интенсивность развития бактерий при различных значения рН
Название
бактерий
3
Оценка роста при различных значениях рН
5
7
9
Провести оценку роста бактерий после воздействия на них высокой температуры.
Действие высоких температур на спорообразующие и неспорообразующие бактерии
определяют по характеру роста микроорганизмов на косом агаре (сплошной, в виде
отдельных колоний или обильный, слабый, умеренный, отсутствие роста). Полученные
данные фиксируют в таблице 2 и формулирую выводы.
Таблица 2
Действие температуры на спорообразующие и неспорообразующие бактерии
№
Культура бактерий
Температура
Время действия
температуры
Результаты
Приготовить мазки, окрасить их по Грамму и промикроскопировать.
Для распознавания изучаемых бактерий (микрококки, сарцины, бациллы и
неспороносные палочки) из двух пробирок с рН 7 и нулевой концентрацией соли готовят
мазки, высушивают и фиксируют их, а затем окрашивают по Грамму и микроскопируют с
увеличением объектива 90х или 100х. Увиденное под микроскопом зарисовывают в
тетрадь и формулируют выводы.
Провести оценку роста плесневого гриба, растущего при разных температурах.
Показателями влияния температуры на рост плесневых грибов служат величина
колоний и интенсивность их спороношения. Для определения этих показателей чашки
Петри, на которых росли грибы, переворачивают и со стороны дна чашки измеряют при
помощи линейки диаметр выросших при разной температуре колоний. Полученные
результаты записывают в таблицу 3 и делают выводы.
Для оценки интенсивности спороношения, как и в предыдущих опытах, пользуются
следующими условными обозначениями: спороношение отсутствует (-); спороношение
слабое (+); спороношение умеренное (++); спороношение сильное, или обильное (+++).
Полученные данные заносят в таблицу 3 и делают выводы о влиянии различных
температур на рост и спороношение плесневого гриба.
Таблица 3
Интенсивность развития плесневого гриба при различных температурах
Родовое
название
гриба
Показатель
интенсивности
развития
Диаметр колоний,
мм
Спороношение
Интенсивность развития при температуре
5ºC
25 ºC
40 ºC
Вопросы для самоконтроля
1.
Почему для развития микроорганизмов имеет значение концентрация
вещества в питательной среде?
2.
Как влияет на развитие микроорганизмов рН среды?
3.
На какие группы по отношению к температуре делятся микроорганизмы?
4.
Каков механизм действия на микроорганизмы высоких и низких
температур?
Лабораторная работа №11,12
Тема: Выделение чистых культур бактерий.
Цель работы: Научиться проводить посев на плотные и жидкие питательные среды
и выделять чистые культуры бактерий.
Задание:
1. Провести выделение чистой культуры микроорганизмов:
- методом рассева в глубине среды;
- по методу Дригальского.
Материалы и оборудование: Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт –
Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева;
бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один
стерильный завернутый шпатель на двух магистрантов; карандаши по стеклу.
Теоретическая часть.
Чистые культуры – это потомство одной микробной клетки (без примеси других),
выросшее на питательной среде.
Выделение чистой культуры микроба является основой бактериологической работы,
так как чаще всего исследуемый материал содержит смесь различных видов микробов.
Изучение свойств микроорганизмов и установление их видовой принадлежности
возможно только при наличии чистой культуры.
Основной задачей при выделении чистых культур из материала, содержащего смесь
различных микробов, является получение отдельных микробных колоний (потомство
одной микробной клетки на плотной питательной среде).
При выделении чистых культур микробов из исследуемого материала, часто
содержащего смесь микробов, используют различные методы: механические, химические
и биологические.
Методы механического разделения микроорганизмов.
Метод Пастера (метод разбавлений) заключается в том, что из исследуемого
посевного материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной
среде: каплю посевного материала вносят в колбу или пробирку со стерильным МПБ, из
нее каплю переносят в следующую и т.д. до 8…10 колб или пробирок. С каждым
разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться, и
можно получить такие разведения (последние), в которых во всей колбе или пробирке со
средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая
культура микроорганизма. Так как в жидких средах микроорганизмы растут диффузно,
т.е. легко распространяются по всей среде, изолировать одну микробную клетку от другой
будет трудно, что не всегда обеспечивает получение чистой культуры. В настоящее время
этот метод не применяется для изолирования чистых культур, а используется только для
предварительного уменьшения концентрации микробов в материале перед его посевом в
плотную питательную среду.
Метод Коха (метод пластинчатых разводок). Исследуемый материал вносят
бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленным
МПА или МПЖ. Равномерно размешивают его, вращая пробирку между ладонями. Каплю
разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй в третью и т.д.
(количество разведений зависит от предполагаемого загрязнения материала микробами).
Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри.
Для этого вынимаю пробку из пробирки и после обжигания края пробирки быстро
выливают агар в чашку со слегка подогретым на пламени спиртовки дном, приподнимая
крышку чашки настолько, чтобы прошел край пробирки. Легким покачиванием чашки
агар равномерно распределяют по дну и дают ему остыть. После застывания среды посевы
помещают в термостат (вверх дном, чтобы конденсат не осаждался на поверхности среды)
для культивирования.
При посеве микроорганизмов на плотную среду они не могут распространяться по
всей среде, как это имеет место в жидкости, а размножаются только на том месте, куда
первоначально попали. Из каждой жизнеспособной клетки образуется видимое
невооруженным глазом скопление микроорганизмов – колония.
В настоящее время этот метод применяется для выделения чистых культур редко, но
имеет большое практическое значение для количественного учета микроорганизмов в
определенном объеме исследуемого материала. Он заключается в том, что в пустую
стерильную бактериологическую чашку вносится точно отмеренное количество (чаще от
1 до 0,1 см3) исследуемого материала, после чего чашка заливается расплавленным и
охлажденным до45-48ºC МПА. После тщательного перемешивания посевного материала
со средой и застывания агара посевы помещают в термостат и культивируют при
определенной температуре для определения группы микроорганизмов.
Метод Дригальского основан на механическом разобщении микробных клеток на
поверхности плотной питательной среды. Каждая микробная клетка, фиксируясь на том
месте, куда она попала, начнет размножаться и через 2-3 дня образует колонию – массу
микробных клеток. Колония образуется путем деления одной клетки и в связи с этим
представляет собой чистую культуру микроорганизма (т.е. особи одного вида).
Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых
плотной питательной средой. На поверхность застывшей среды в первую чашку вносят
каплю исследуемого материала, содержащего микроорганизмы. Затем с помощью
стеклянного шпателя или бактериологической петли каплю растирают по всей
поверхности среды. Этим же шпателем (не обжигая его) проводят по поверхности среды
во второй и в третьей чашках. В процессе растирания микробные клетки разъединяются.
После посева на крышках чашек делают надпись: наименование исследуемого материала,
номер анализа, дату посева и номер чашки, фамилию магистранта. Обычно в первой
чашке появляется рост в виде сплошного налета. В следующих количество колоний
меньше и встречаются изолированные, из которых отсевом легко выделить чистую
культуру.
Метод нагревания исследуемого материала применяется для выделения чистых
культур споровых форм микробов (гнилостных, маслянокислых бактерий и т.д.). Перед
посевом исследуемый материал прогревают на водяной бане при температуре 75-85 ºC в
течение 20-30 мин. Вегетативные формы погибают во время прогревания, а споры
микробов остаются живыми и при последующих высевах на плотную среду прорастают,
формируя колонии.
Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ.
Метод используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к
определенным химическим веществам.
Например, такой метод используется для выделения культур туберкулезных
бактерий, которые устойчивы к действию кислот, щелочей и спирта. Исследуемый
материал перед посевом заливают 15%-ным раствором кислоты или антиформином и
выдерживают в термостате 3-4 ч. После воздействия кислоты или щелочи клетки
возбудителя туберкулеза остаются живыми (поскольку они кислото- и щелочеустойчивы),
а все другие микроорганизмы погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи,
высева материала на плотную питательную среду получает рост только возбудитель
туберкулеза.
Методы обогащения.
Их часто применяют для выделения чистых культур различных микроорганизмов
(например, сальмонелл и др.) из материалов, в которых
мало выделяемых
микроорганизмов, но содержится большое количество сопутствующей микрофлоры. Для
увеличения численности выделяемого вида микроорганизма вначале делают посев
исследуемого материала в питательные среды, которые содержат вещества,
стимулирующие его рост и угнетающие или задерживающие размножение
сопутствующей микрофлоры. Например, для выделения сальмонелл проводят посев в
среды обогащения Кауфмана, Мюллера и др. При выделении культур молочнокислых
бактерий из почвы или растений посевы делают на стерильное обезжиренное молоко,
содержащее 5% этилового спирта для подавления роста гнилостных бактерий.
После культивирования из накопительной среды проводится высев на плотные
питательные среды в чашки Петри для выделения чистых культур микроорганизмов.
Биологические методы выделения чистой культуры (заражение лабораторных
животных) применяются для изолирования культур патогенных микроорганизмов из
исследуемого материала, загрязненного большим количеством сапрофитных бактерий.
Подозревая исследуемый материал на наличие определенного вида возбудителя,
заражают этим материалом (вводят внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно)
лабораторное животное, которое наиболее восприимчиво к данному виду патогенного
микроба.
Практическая часть
1. Выделить чистую культуру методом рассева в глубине среды.
Берут 3-5 пробирок, в которых находится по 5-10 мл питательного желатина или
мясо-пептонного агара и расплавляют их содержимое на водяной бане. Пробирки с
расплавленной средой охлаждают до 43-45ºC и ставят в теплую воду, чтобы предупредить
застудневание среды. В одну из пробирок стерильной пипеткой или петлей вносят
исследуемый материал. Затем другой стерильной пипеткой или петлей часть содержимого
первой пробирки переносят во вторую, из второй – в третью и т.д. Засеянные пробирки со
средой хорошо перемешивают, зажав их между ладонями (вращают несколько раз то в
одну, то в другую сторону). Приготовленные таким образом разведения бактерии
выливают из пробирок в чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими
номерам пробирок.
После загустевания среды чашки помещают в термостат и термостатируют 24 часа
при температуре 37 ºC. Количество выросших в чашках Петри колоний уменьшается по
мере увеличения разведения взятого на посев материала.
2. Выделение чистой культуры по методу Дригальского.
Расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри с толщиной слоя не
менее 0,5 см. Застывшую среду обязательно подсушивают. В первую чашку петлей вносят
небольшое количество исследуемого материала и шпателем Дригальского или шпателем,
сделанным из пастеровской пипетки, втирают его в поверхность питательной среды.
Затем шпатель (не обжигая и не набирая нового материала) переносят сначала во вторую
чашку, а затем в третью. В каждой из них оставшийся на шпателе материал втирают в
поверхность питательного агара.
Вместо шпателя можно использовать бактериальную петлю. Для этого ее с
небольшим количеством микроорганизмов кладут плашмя на питательную среду и
проводят, не повреждая поверхности, штрихи по всей среде или по секторам, разделив
дно чашки (если среда прозрачна) на 4 или 8 частей. Штрихи можно проводить в двух
взаимно перпендикулярных направлениях. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые
петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет линию посева
и дает возможность получить изолированные колонии микробов.
Вопросы для самоконтроля
1. Что называется чистой культурой микроорганизмов?
2. Каково назначение чистых культур микроорганизмов?
3. Как выделяют чистые культуры по методу Коха?
4. Как выделяют чистые культуры по методу Дригальского?
Лабораторная работа №13
Тема: Количественный учет микроорганизмов.
Цель работы: знакомство с техникой количественного учета микроорганизмов с
помощью счетных камер и измерения величины микробных клеток с помощью окуляр микрометра.
Задание:
1. Подготовка питательных сред для количественного учета микроорганизмов
чашечным методом.
2. Засев питательных сред пробами почвы, воздуха, воды, смывом с рук для
определения микробного числа.
3. Провести количественный учет клеток дрожжей, содержащихся в
предоставленной суспензии (подсчет клеток дрожжей в исходной (неразбавленной)
суспензии и суспензии, разбавленной в 2,5 и 10 раз в трехкратной повторности;
4. Подсчет клеток дрожжей в счетной камере Горяева при объективе 20 или 40.
5. Определить: 1) цену деления окуляр - микрометра с помощью объектив микрометра; 2) величину, размеры дрожжей.
6. Оформление протокола исследования.
Материалы и оборудование: микроскоп и осветитель, объектив-микрометр, окулярмикрометр, камера Горяева, бактериологическая петля, стерильные пипетки на 1–2 мл,
капельница с водой, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага,
дезинфицирующий раствор, чистые культуры грибов.
Теоретическая часть.
Количественный учет микроорганизмов путем счета колоний(чашечный метод
Коха)
Этот метод является наиболее распространенным для определения общей микробной
обсемененности различных субстратов. Сущность чашечного метода заключается в том,
что производят посев определенного объема исследуемого материала в чашки Петри с
плотной питательной средой. При последующем выращивании посева в термостате из
каждой клетки в результате размножения образуется колония; количество их
подсчитывают.
В качестве питательной среды для учета бактерий применяют мясопептонный агар,
для подсчета плесневых грибов и дрожжей - сусло-агар.
Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на
плотную питательную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.
Приготовление разведений. Количество микроорганизмов в объектах внешней
среды, как правило, велико, поэтому для получения отдельных колоний готовят ряд
разведений исследуемого вещества.
Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физиологическом
растворе (0,5%-ый водный раствор NаСl), обычно пользуют десятикратными
последовательными разведениями (1:10, 1:100, 1:1000 т. д.).
При исследовании продукта твердой консистенции на технических весах отвесить, с
помощью часового стекла и стерильного скальпеля пробу продукта (1-10 г), перенести в
стерильную ступку и растереть в однородную массу, добавляя стерильный кварцевый
песок. Полученную навеску количественно и асептически перенести в колбу со 100 мл
стерильного физиологического раствора - получится 1-е разведение (1:100). Суспензию в
колбе тщательно взболтать в течение 3-5 мин, стерильной пипеткой взять 1 мл
полученной суспензии и перенести в пробирку с 9 мл стерильного раствора NaCl. Это
второе разведение 1:103. Суспензию этого разведения перемешивают с помощью другой
стерильной пипетки, вбирая и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру
повторяют 3-5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензий и уменьшает адсорбцию
клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл этой взвеси и переносят ее
во вторую пробирку – это разведение 1:104. Таким образом, готовят и последующие
разведения.
Степень разведения исследуемого образца определяется предполагаемым
количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше,
чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.
Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку.
Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата,
иногда в 1000 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией
микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из
пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на
стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится
причиной получения завышенного результата.
Посев на агаризованные среды в чашки Петри для поверхностного роста. В
стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане
агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляет на горизонтальной
поверхности, пока не застынет агар. Затем их в большинстве случаев выдерживают 2-3
суток при 30° С крышками вниз для подсыхания поверхности среды и проверки ее
стерильности. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда
используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие
повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агара.
Посев делают из определенных разведений в зависимости от предполагаемого
количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят
определенный объем (обычно 0,05, 0,1 или 0,2 мл) соответствующего разведения,
предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашке
Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем
этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной
материал не вносили.
При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно
невелико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке
Петри.
Из каждого разведения делают, таким образом, 4-6 параллельных высевов. Для
параллельных рассевов из одного разведения можно пользоваться одной стерильной
пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений, используют новую
стерильную пипетку и новый шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в
термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития
выявляемых микроорганизмов, перевернув их вверх дном.
Для глубинного посева (в толще среды) используют обычно мерные количества
плотной среды, заготовленные в пробирках по 10-15 мл. Культуру вносят в пробирки с
расплавленным и охлажденным до 40-45° С агаром, а затем заливают смесь в чашку
Петри. Возможен и другой способ глубинного посева: взвесь микроорганизмов вносят
непосредственно в стерильную чашку Петри на дно, слегка приоткрыв крышку, а затем
заливают ее расплавленным и охлажденным агаром. Среду с культурой тщательно
перемешивают круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности стола.
После этого чашку оставляют на столе до застывания агара.
Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно
применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во
взвесях (суспензиях).
Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер имеет
ограниченное применение, связанное с тем, что в счетных камерах проводится учет всех
клеток микроорганизмов без их дифференциации на живые и мертвые клетки. Кроме того,
счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных
объектов – клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе
8–40.
Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с нанесенными на
нем поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные плоские
площадки (см. рисунок). Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам,
причем на каждой половине нанесена квадратная сетка. Две боковые площадки
расположены на 0,1 мм выше средней. Эти площадки служат для притирания покровного
стекла. Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, по
разному сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является маленький
квадрат (ABCD, сторона которого равна 1/20 мм, площадь 1/400 мм2, а объем при высоте
камеры 1/10 мм – 1/4000 мм3, или 1/4000000 мл.
Так называемый большой квадрат АВСД состоит из 16 малых квадратиков.
Счетная камера Горяева: вид сверху.
Камера Горяева имеет площадь 9 мм2 и разбита на 225 больших квадратов (15 рядов
по 15 больших квадратов в каждом ряду). Каплю взвеси наносят на сетку камеры и сверху
накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна
равномерно без пузырьков распределиться по всей сетке, не выступая в желобок между
стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым
площадкам камеры до появления ньютоновских колец. Камеру с исследуемым
материалом помещают на предметный столик микроскопа и микроскопируют с
объективом ´10–40 (в поле зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и
клетки микроорганизмов).
Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80 малых),
расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, размещенные внутри квадрата и на
пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки,
разделенные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех границ
квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не
учитывают.
Находят среднее количество клеток в одном квадратике. Допустим, в пяти больших
квадратах (80 малых) – 240 клеток, тогда в одном малом квадратике среднее количество
клеток – 240 : 80 = 3. Пересчет на 1 мл суспензии с учетом разведения производят по
формуле
N = а · 1000K/h · S,
где N – число клеток в 1 мл суспензии; а – среднее число клеток в малом квадрате; h
– глубина камеры, мм; S – площадь малого квадрата, мм; K – разведение исходной
суспензии; 1000 – коэффициент пересчета мм3 в мл (1 мл = 1000 мм3).
Определение размеров клеток проводят под микроскопом с помощью окулярной
линейки (микрометра) или окулярного винтового микрометра, используя чаще всего 24часовые культуры микроорганизмов. Размеры клеток особенно удобно определять,
пользуясь фазово-контрастным устройством.
Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре
которой выгравирована линейка длиною 5 мм. Линейка разделена на 50 частей.
Окулярный микрометр вставляют в окуляр. Однако делениями окуляр - микрометра
нельзя непосредственно измерять величину клетки, т. к. последние рассматриваются через
объектив и окуляр, а деления линейки – только через верхнюю линзу окуляра. Поэтому,
прежде чем приступить к измерению величины клеток, необходимо определить цену
деления окулярного микрометра для данного микроскопа. Определение цены деления
проводят с помощью объективного микрометра.
Объективный микрометр – пластинка с отверстием в центре. В отверстие вставлено
стекло, на котором нанесена линейка длиною в 1 мм. Эта линейка разделена на 100 частей,
так что одно деление объективного микрометра соответствует 0,01 мм, или 10 мк. Для
определения цены деления окулярного микрометра объектив-микрометр помещают на
столик микроскопа и фокусируют при малом увеличении. Изображение линейки
перемещают в центр поля зрения и только после этого меняют объектив на тот, при
котором будут определять размер клеток. Перемещая столик микроскопа и поворачивая
окуляр, устанавливают микрометры так, чтобы их шкалы были параллельны и одна
перекрывала другую. Определение цены деления окулярного микрометра проводят по
принципу нониуса, т. е. совмещают одну из черточек шкалы окулярного и объективного
микрометров и находят следующие совмещения. Устанавливают, скольким делениям
объективного микрометра соответствует одно деление окулярного микрометра. Например,
два деления объект - микрометра (20 мк) соответствуют пяти делениям окуляр микрометра, следовательно, одно деление окуляр - микрометра равняется 4 мк (20:5).
Если теперь на столик микроскопа положить препарат с клетками микроорганизмов и
рассмотреть его при этом же увеличении, то можно измерить величину клетки. Для этого
определяют, какому числу делений окулярной линейки соответствует величина
измеряемого объекта, и умножают это число на цену деления окулярного микрометра.
Очень удобно измерять размеры клеток с помощью винтового микрометра MOB-1-15-х,
правила работы с которым подробно изложены в инструкции, прилагаемой к прибору.
Практическая часть
1. Определение микробного числа почвы
Стерильную расплавленную среду МПА (для выявления бактерий) и сусло - агар
(для выявления дрожжей и плесневых грибов) разливают каждую в 3 стерильные чашки
Петри (всего 6 чашек). Навеску почвы, взятую в асептических условиях, суспендируют 2
мин в 100 мл стерильной водопроводной воды. Дают отстояться частичкам почвы в
течение 5-10 мин. Из надосадочной жидкости отбирают 1 мл и переносят в другую
пробирку, заполненную 9 мл стерильной водопроводной воды (разведение 1:103).
Встряхивают суспензию, отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в третью
пробирку с 9 мл воды (разведение 1:104). Посев производят из второй или третьей
пробирки на выбор: 0,05 мл суспензии соответствующего разведения наносят на
поверхность питательного агара в чашке Петри и размазывают стерильным шпателем
Дригальского по поверхности плотной питательной среды (МПА и СА). Чашки
переворачивают вверх дном, и чашки с МПА инкубируют при 37° С 48 ч, а с СА
выдерживают при 24° С 6-7 суток. Подсчет выросших колоний проводится на следующем
занятии.
2.Определение микробного числа воздуха
Методы
микробиологического
исследования
воздуха
подразделяют
на
седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седиментационный
метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах
отбора проб воздуха и выдерживают в течение определенного времени (5-30 мин), после
чего закрывают и термостатируют.
По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха,
пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность
питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов,
сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной
колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество
микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха.
Для определения микробной загрязненности воздуха расплавляют на водяной бане
стерильные среды МПА и СА и разливают каждую в 3 стерильные чашки Петри (всего 6
чашек). Чашки ставят в месте отбора проб и открывают на 5, 10 и 15 мин. Время
выдержки отмечают на крышке чашки.
Затем чашки с МПА термостатируют при 37° С 48 ч, а с СА - при 24° С 6-7 суток,
перевернув их вверх дном. Подсчет колоний ведут на следующем занятии.
3. Определение микробного числа воды
Микробное число воды - это общее количество микроорганизмов, содержащееся в 1
мл воды. Для санитарно-микробиологического исследования водопроводной воды пробы
берут из уличных водоразборов и кранов внутренних водопроводов. Краны обжигают,
затем полностью открывают и спускают воду 10 мин., а затем отбирают пробы воды с
соблюдением требований асептики, не смачивая пробки, в количестве не менее 0,5 л. Если
вода подвергалась хлорированию, то ее собирают в колбы, содержащие 2 мл 1,5%-ого
стерильного раствора тиосульфата натрия. При посеве в агаризованную среду 1 мл воды
вносят в пустую стерильную чашку Петри, куда затем наливают 10-12 мл расплавленного
МПА (45° С) и тщательно перемешивают. После застывания агара посевы инкубируют
при 37° С 24 ч. Из одной пробы воды засевают 3 параллельных чашки и не только на
МПА, но и на сусло - агар для выявления роста дрожжей и грибов, в этом случае посевы
инкубируют 2-З суток при температуре 24° С.
4. Определение микробной загрязненности предметов обихода и рук
Для анализа микробной загрязненности столов, оборудования, полотенец, халатов,
рук персонала используют тампонный метод. Для этого готовят ватные тампоны,
стерилизуют их, погружают в пробирки с 2 мл стерильной воды или изотонического
раствора хлорида натрия, при этом тампон не должен касаться поверхности жидкости,
смачивают тампон непосредственно перед взятием проб. Для отбора проб с плоских
крупных поверхностей (столы) используют трафареты из проволоки или жести, которые
предварительно стерилизуют фламбированием; затем накладывают их на поверхность
стола, производят смыв влажным тампоном (салфеткой) с поверхности 100 см2,
ограниченной трафаретом; тампон помещают в пробирку, добавляют еще 8 мл жидкости и
тщательно прополаскивают тампон (салфетку) с последующим отжимом его.
Общую микробную загрязненность определяют, засевая 1 мл смыва, в глубину
расплавленного МПА в чашке Петри, как это описано для определения микробного числа
воды. Посевы выращивают сутки при 37° С, подсчитывают количество выросших колоний
и определяют общую микробную загрязненность данного объекта. Для выявления
дрожжей и грибов делают посев на сусло-агар.
Смывы с рук получают, тщательно протирая ладони, межпальцевые и подногтевые
пространства влажным стерильным тампоном на деревянной пилочке. Тампон погружают
в ту же пробирку, в которой он смачивался, добавляют еще 8 мл стерильной воды. Смывы
с поверхности предметов содержатся в 10 мл стерильной воды (2 мл для увлажнения
салфетки, 8 мл доливают к смывам), поэтому исходный смыв уже разведен 1:10. Для
приготовления разведения 1:100 1 мл исходного смыва (1:10) помещают в пробирку и
доливают к нему 9 мл стерильной водопроводной воды. Берут две стерильные чашки
Петри, нумеруют их со стороны дна (№ 1 и 2). В первую чашку вносят 1 мл исходного
разведения смыва (1:10), во вторую - 1 мл разведения 1:100. Заливают в каждую чашку 1530 мл расплавленного и охлажденного до 35° С МПА. После застывания агара посев
термостатируют при 37° С сутки. Параллельно ведут посев на 2 чашки со стерильным СА.
Этот посев выдерживают при 24° С 4- 5 суток.
В отчете по данной работе указать классификацию и способы стерилизации
питательных сред, этапы подготовки микробиологических материалов для
количественного учета чашечным методом, схему подготовки разведении и посева,
описать конкретную задачу.
Вопросы для самоконтроля
1. Какие счетные камеры вам известны?
2. Что из себя представляет счетная камера Горяева?
3. Из каких этапов складывается процесс изготовления исследуемого
препарата для проведения количественного учета с помощью счетных камер?
4. Каковы размеры бактериальных клеток?
5. Способы измерения микроорганизмов.
6. Как определить цену окуляр-микрометра?
Лабораторная работа №14,15
Тема: Отделение биомассы микробов от культуральной жидкости.
Цель работы: Изучить
методы выделения и очистки конечных продуктов
биотехнологического производства.
Задание:
1. Изучить теоретическую часть лабораторной работы.
2. Отделение биомассы гриба от культуральной жидкости.
3. Определение массы сухого мицелия.
4.Оформить отчет по результатам лабораторной работы.
5. Ответить на контрольные вопросы.
Материалы и оборудование: микроскоп, хлопчатобумажная салфетка,
фильтровальная бумага, дезинфицирующий раствор, чистые культуры грибов, колбы,
пробирки.
Теоретическая часть.
Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных суспензий
или растворов, при этом характерно невысокое содержание основного компонента и
наличие многих примесных веществ.
В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки
культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит метаболиты,
представляющие практическую ценность. В производствах, где целевым продуктом
являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке,
позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных
вод.
Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды зависят от
природы продуцента. Например, сахаромицеты (хлебопекарные дрожжи) имеют
относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения
биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В
дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с
высоким содержанием живых клеток, имеющих высокую хлебопекарную активность.
Дрожжи же рода Candida, служащие источником кормового белка плохо
флотируются и фильтруются. Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также
бактерии-продуценты белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются,
причем в несколько ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все
компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному приему
прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов и
удобрений. Конечный продукт удается получить в активной форме лишь в принципе
отказавшись от выделения его из культуральной жидкости: содержимое реактора
выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих жизнеспособность конечного продукта.
Неутилизированные компоненты культуральной жидкости могут отразиться на
способности продукта к хранению.
При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных
количеств целевого продукта, осаждается добавлением извести или других твердых
компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно - физическое осаждение.
Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал, внутриклеточные
биополимеры возможно и методом фильтрации. Так как фильтруемая суспензия склонная
к гелеобразованию, то производительность фильтров быстро падает. Предотвратить это
можно добавлением в смесь или на фильтрующую ткань размолотых вулканических
пород, содержащих оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую
структуру.
Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных
частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2
фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость.
Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена,
кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны
со специально подобранным размером пор.
Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента
(например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения клеточных оболочек
(дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или
комбинированные методы.
К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение
лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое
отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в
ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпресия (сжатие с
последующим резким снижением давления).
Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут
быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Культуральную
жидкость освобождают от сопутствующих растворимых веществ и фракционируют.
Освобождение от растворимых веществ производят несколькими способами:
1.
Осаждение
физическое
(нагревание,
охлаждение,
разбавление,
концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических
веществ).
Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической
постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного
слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы
добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве
осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах
растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол
осаждает 80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы.
Высаливание - механизм тот же, что и при действии органических веществ,
гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый
реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и
фосфат калия.
2. Экстракция.
При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую,
при жидкожидкофазной - из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из
спиртовой вытяжки переходит в бензин). Для извлечения антибиотиков, витаминов,
каротиноидов,
липидов
применяют
жидкожидкофазную
экстракцию,
когда
культуральную жидкость смешивают с органическими растворителями.
3. Адсорбция - частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент - твердое
тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы,
заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты
на основе целлюлозы: - катионит - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д.
Адсорбция идет по ионообменному механизму.
Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами.
Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на
специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы,
покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля
(хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку
одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта).
По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы
образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они
связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в
связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо
сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат,
окрашивают и определяют положение различных молекул.
Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения
их размеров.
Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по
сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия,
происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии
используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными
лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют
определенный белок.
Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их
высокоскоростному центрифугированию. Такая обработка делит клеточные компоненты
по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее.
Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро
оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне
центрифужной пробирки. Центрифугирование является, как правило, первым этапом
фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по
размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций,
необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора.
При ультрацентрифугировании различные фракции седиментируют с различной
скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить. Во избежание
перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и
хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно
увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь
такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные
полосы, которые можно выделить.
Электрофорез - метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном
растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды,
например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный
или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или
отрицательно заряженных групп аминокислот.
Виды сепарации:
1. Флотация. Если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости
накапливаются в поверхностных слоях жидкости, то жидкость предварительно
вспенивают, затем отделяют ее верхний слой с клетками. Флотаторы различных
конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоящую из пузырьков газа
с прилипшими к ним клетками. Флотацию широко используют как первый этап отделения
дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости.
2. Фильтрация - задержание биомассы на пористой фильтрующей перегородке.
Применяют фильтры однократного или многократно использования: барабанные,
дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные, вакуум-фильтры, фильтр-прессы
различных конструкций, мембранные фильтры. Диаметр пор может превышать размеры
клеток. Иногда биомассу сдувают с поверхности фильтра сжатым воздухом или срезают
специальным ножом.
3. Центрифугирование - осаждение взвешенных в жидкости частиц с применением
центробежной силы. Требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование.
Поэтому оно оправдывает себя, если:
а) суспензия фильтруется медленно;
б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от
содержащихся частиц;
в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры
рассчитаны только на периодическое действие.
Практическая часть
1. Отделение биомассы гриба от культуральной жидкости
На аналитических весах взвешивают пустые бумажные фильтры, предварительно
высушенные до постоянной массы (вес записывают), и вставляют в воронки. Колбу
открывают, и содержимое фильтруют через фильтр. Отделенная от культуральной
жидкости биомасса гриба является материалом для определения массы сухого мицелия.
После фильтрования замеряют объем культуральной жидкости и доводят до 100 мл
дистиллированной водой.
2. Определение массы сухого мицелия
Фильтры с биомассой гриба помещают в сушильный шкаф при температуре 130С
на 40 мин (до полного высушивания). Затем фильтры переносят в эксикатор для
охлаждения на 10-15 мин, после чего взвешивают на аналитических весах. Разность
между массой фильтра с сухим мицелием и массой пустого фильтра является массой
сухого мицелия (Х), образовавшегося за период культивирования гриба в термостате:
Х = Мм - Мф , (2.1)
где Х – масса сухого мицелия, г; Мф - масса пустого фильтра, г; Мм - масса фильтра с
высушенным мицелием, г.
Контрольные вопросы:
По какому принципу различается стадия выделение целевого продукта?
Что такое сепарация ?
Что такое флотация?
Что такое фильтрация?
Что такое центрифугирование ?
Основные процессы отделение и очистка продуктов?
Лабораторная работа №16,17
Тема: Изучение ферментативной активности (бродильной, протеолитической,
целлюлозолитической) микроорганизмов.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Цель работы: Ознакомиться с биохимическими свойствами микробов.
Задание:
1.
Просмотреть посевы предыдущего занятия, описать колонии на агаре в
чашках Петри (форма, размер, цвет и т.д.);
2.
Просмотреть под микроскопом окрашенные мазки из тех же колоний;
3.
Произвести пересев изолированных колоний на МПБ, МПА и МПЖ в
пробирках для определения биохимических свойств микробов.
4.
Заполнить таблицу.
5.
Ответить на контрольные вопросы.
Материалы и оборудование: Посевы предыдущего занятия, бактериологические
петли, пастеровские пипетки (стерильные), предметные стекла, набор растворов красок
для окраски по Грамму, фильтровальная бумага, микроскопы; пробирки с питательными
средами для определения биохимических свойств бактерий (МПА, МПБ, МПЖ среды с
углеводами и индикатором Андреде), молоко цельное, лакмусовое, метиленовое,
пробирки с бактериальной культурой для посева на эти среды, спиртовые или газовые
горелки.
Теоретическая часть.
Биохимические свойства микробов обусловлены наличием в клетке различных
ферментов, которые производят расщепление и синтез различных химических веществ.
Изучение этих свойств микроорганизмов имеет большое практическое значение в
технологии многих пищевых производств (молочном, пивоварении, хлебопечении и др.), а
также при дифференциации видов микробов.
При изучении биохимических свойств микробов практический интерес представляет
определение сахаролитических, протеолитических и редуцирующих свойств.
Сахаролитические свойства микробов. Сахаролитическая способность микробов
определяется по ферментативному расщеплению многоатомных спиртов и некоторых
углеводов, именуемых сахарами, на альдегиды, кислоты, газообразные продукты (СО 2,
СН4, и Н2).
Для определения способности микроорганизмов расщеплять сахар используют
специальные жидкие, полужидкие и плотные питательные среды с соответствующими
углеводами и индикатором.
Набор жидких или полужидких сред с углеводами и индикатором называют
«пестрым» рядом. Название «пестрый» ряд обусловлено тем, что под действием
ферментов растущего микроба использованные сахара расщепляются до продуктов
промежуточного распада (кислота). В результате накопления кислоты снижается рН
среды, изменяется цвет индикатора и среды. При отсутствии у микроба какого-либо
фермента углеводы не расщепляются, рН остается неизменным, индикатор остается в
обесцвеченной форме, цвет среды не изменяется.
Для определения сахаролитической способности бактерий используют чаще всего
среды Гиса с индикатором Андреде. Они состоят из пептонной воды, углеводов и
индикатора (кислый фуксин, обесцвеченный раствором едкой щелочи). Применяют также
полужидкие среды с индикатором «ВР» (водно-голубой краситель, обесцвеченный
розоловой кислотой).
Если исследуемая культура микроба под действием фермента разлагает углевод с
образованием кислоты, то происходит восстановление цвета индикатора и окрашивание
среды (в розово-малиновый цвет с индикатором Андреде или в голубой с индикатором
«ВР»). Кислота вступает в реакцию с щелочью или розоловой кислотой и нейтрализует
их.
Если расщепление углевода идет до конечных продуктов, т.е. до СО2 и воды, то
наличие газа определяется в газовках (если среды жидкие) или пузырьки газа
обнаруживают в толще полужидкой среды.
Посевы на углеводные среды (с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом,
дульцитом и др.) проводят распрямленной в виде стержня бактериологической петлей
уколом по центру среды.
Для обнаружения газа в пробирку со средой перед стерилизацией помещают
небольшой клочок ваты или маленькую запаянную с одного конца стеклянную трубочку
(поплавок). Пузырьки газа задерживаются ватой или собираются в верхнем конце
трубочки, вытесняя среду, заполнившую трубку при стерилизации.
Протеолитические свойства микробов. Протеолитические свойства проявляются
выделением во внешнюю среду протеолитических ферментов, которые расщепляют белки
до промежуточных продуктов (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов
конечного распада (индол, сероводород, аммиак и др.) и определяют путем посева
микробов в желатин, на свернутую кровяную сыворотку и молоко.
При росте в молоке микробы, выделяющие протеолитические ферменты, через
несколько дней вызывают пептонизацию молока. Пептонизация сопровождается
растворением сгустка казеина под действием фермента казеиназы, выпадением осадка и
просветлением молочной сыворотки.
В посевах на молоке определяют способность микробов свертывать молоко (в
результате ферментации лактозы и образования молочной кислоты) и пептонизацию. Если
молоко после культивирования микробов не свернулось, его кипятят в пробирке, вынув
пробку, так как молоко при кипячении может выбрасываться из пробирки и вызывать
ожог. Если после кипячения молоко не свернется, то углевод не разлагается.
Посевы в МПЖ культивируют 5-7 сут при комнатной температуре, так как желатин
расплавляется в термостате. Микробы, обладающие протеолитическими свойствами,
разжижают желатин. Многие протеолитические микроорганизмы дают разный характер
разжижения: послойное (идущее ровно, сверху вниз), воронкообразное, реповидное, в
форме чулка и т.д.; микроорганизмы, не обладающие протеолитической способностью,
дают в МПЖ рост без разжижения желатина.
В посевах со свернутой кровяной сывороткой протеолитические микроорганизмы
также вызывают разжижение, а непротеолитические не изменяют ее консистенцию.
На молочном агаре (смесь водного раствора агар-агара и обезжиренного молока)
вокруг колоний протеолитических микробов образуются зоны просветления вследствие
разложения казеина. Зоны протеолиза широкие, зоны пептонизации узкие.
Распад белков под действием протеолитических ферментов, выделяемых
микроорганизмами, протекает неодинаково: некоторые виды бактерий образуют конечные
продукты распада – индол, сероводород, аммиак.
а) Определение индола. Определяют по способности микроба расщеплять
аминокислоту триптофан под действием фермента триптофаназы. Предложено несколько
методов определения индола. Наиболее часто употребляется метод Эрлиха – Боме.
Реактив Эрлиха – Боме: 1 г парадиметиламидобензальдегида растворяют в 95 мл 960
спирта и 20 мл НCl (плотность 1,19). К 5 мл 2-3-дневной бульонной культуры добавляют
2-3 мл эфира. Встряхивают и реактив добавляют по стенке. В присутствии индола весь
эфирный слой или его нижняя часть окрашивается в красный цвет.
Можно индол обнаружить путем использования индикаторных бумажек.
Фильтровальную бумагу пропитывают первым реактивом Эрлиха, затем ее высушивают
на воздухе и нарезают на тонкие полоски. Первоначальный цвет пропитанных реактивом
Эрлиха бумажек желтый. Хранят индикаторные бумажки в стерильной банке с притертой
пробкой. Для определения индола делаю посев в пробирку с МПБ, под пробирку
вставляют индикаторную бумажку (нижний конец бумажки не должен прикасаться к
среде) и культивируют при 370С в течение 24-48 ч. Если исследуемая культура бактерий
разлагает белок с образованием индола, нижняя часть индикаторной бумажки
окрашивается в малиновый цвет.
б) Определение сероводорода. Для определения сероводорода производят посев
исследуемой культуры бактерий на мясопептонный бульон (с 3% пептона) или пептонную
воду. Между стенкой пробирки и ватной пробкой помещают фильтровальную полоску
бумажки, пропитанной 10%-ным раствором уксуснокислого свинца. Если засеянные
микроорганизмы расщепляют белковые вещества с образованием сероводорода, то
полоска фильтровальной бумажки чернеет в результате образования сернистого свинца. К
числу микробов, вызывающих расщепление белковых веществ с образованием
сероводорода, относятся некоторые виды паратифозной группы бактерий, гнилостные
бактерии.
в) Определение аммиака. Присутствие аммиака обнаруживают так же, как и
сероводород, но для этого используют лакмусовую бумажку. При наличии аммиака
розовая лакмусовая бумажка принимает синюю окраску. К таким микробам относятся
флюоресцирющие бактерии, уробактерии и др.
Практическая часть
Ферментация
Индолооб
разование
Культиви
рование
молока и
пептониза
Выделени
ция
е H2S
Морфология
Разжижен
ие
Свертыва
желатина
ние
№
Вид
микроорга
низмов
1. Просмотреть посевы предыдущего занятия, описать колонии на агаре в чашках
Петри (форма, размер, цвет и т.д.);
2. Просмотреть под микроскопом окрашенные мазки из тех же колоний;
3. Произвести пересев изолированных колоний на МПБ, МПА и МПЖ в пробирках
для определения биохимических свойств микробов.
4. Заполнить таблицу.
сахарозы
маннита
лактозы
глюкозы
МПБ
МПА
подвижность
Окраска по
Граму
капсула
спора
форма
Вопросы для самоконтроля
1. Для чего используют «цветные» углеводные питательные среды?
2. Как определяют образование бактериями индола?
3. на что указывает разжижение желатина в посеве микроба на VG: и почернение по
месту укола в агаровой среде с ацетатом свинца?
Лабораторная работа №18,19
Тема: Исследование хлебопекарных дрожжей.
Цель работы: Знать основные расы хлебопекарных дрожжей. Уметь проводить
микробиологический контроль хлебопекарных дрожжей.
Задание:
1. Изучить характеристику основных рас хлебопекарных дрожжей.
2. Провести микроскопирование прессованных и сухих дрожжей. Зарисовать.
3. Определить степень загрязнения ЧК и ЕЧК посторонними дрожжами на
ацетатной среде.
4. Приготовить среду с нистатином по методу Розмановой и определить
количество бактерий.
5. Определить процентное содержание сахаромицетов и посторонних
микроорганизмов по предоставленным методикам.
6. По результатам исследования дать сравнительную оценку качества дрожжей.
Материалы и оборудование: Бактериологические петли, пастеровские пипетки
(стерильные), предметные стекла, набор растворов красок для окраски по Грамму,
фильтровальная бумага, микроскопы; пробирки с питательными средами, спиртовые или
газовые горелки, хлебопекарные дрожжи.
Теоретическая часть.
В производстве хлебопекарных дрожжей используют специально отобранные
расы Sacch. cerevisiae. При отборе культуры принимают во внимание способность
дрожжей сбраживать тесто, т. е. они должны обладать хорошей подъемной силой и
ферментативной активностью, хорошо расти на мелассной среде в условиях глубинной
ферментации и давать высокий выход биомассы. Клетки дрожжей должны легко
отделяться от культуральной жидкости сепарированием или фильтрацией и хорошо
сохраняться в прессованном виде. Подъемную силу дрожжей выражают в минутах, в
течение которых определенное количество дрожжей развиваясь в определенном
количестве теста, увеличивает его объем на предусмотренную стандартом величину.
Для хороших дрожжей подъемная сила не должна превышать 75 мин, зимазная
активность — 30—40 мин, мальтазная активность — 50— 80 мин.
Зимазную и мальтазную активность определяют по методу Елецкого, в основе
которого лежит выделение определенного объема газа в сахарозной и мальтозной среде.
Хлебопекарные дрожжи обладают и бродильной активностью, но чтобы достигнуть
использования сахаров только для образования биомассы, спиртовое брожение надо
ограничить всеми доступными средствами. Это достигается интенсивной аэрацией
среды, а также поддержанием низкой концентрации сахара в ней (0,5—1,5%). При
высокой концентрации Сахаров имеет место катаболитная репрессия ферментов цикла
Кребса и переключение энергетического метаболизма преимущественно на брожение.
Чтобы избежать этого, сахар в среду подают непрерывно с постоянной или возрастающей
скоростью притока.
Чтобы предотвратить чрезмерное размножение побочной микрофлоры, особенно так
называемых диких дрожжей, удельная скорость роста которых выше, чем у
хлебопекарных дрожжей, процесс ферментации обычно ведут по периодической схеме в
течение 10—20 ч.
Технология получения дрожжей имеет много различных вариантов.
В размножении культуры дрожжей различают следующие стадии: лабораторную;
чистой культуры; естественно чистой культуры; товарных дрожжей.
В лаборатории размножение дрожжевой культуры идет через три этапа в 10—12%ной солодовой среде при использовании колб на 100, 1000, 8000 мл, в которых
выращивание дрожжей длится по 24 ч. Границы оптимальной температуры 28—32°С,
реакция среды рН 4,5—5,5.
Для ограничения бактериальной инфекции в начальных стадиях стараются
использовать более низкую реакцию среды — рН 4,3—4,6. Допускается также
спиртовое брожение.
В стадии чистой культуры (ЧК) Дрожжи размножаются в двух герметических
аппаратах на 12%-ной мелассной среде, обогащенной солодовым экстрактом и
двузамещенным фосфатом аммония: Емкость первого аппарата 80—100 л, второго —
800— 820 л. Среда периодически аэрируется. Длительность ферментации 10—20 ч.
Получают 2—4 кг дрожжей в пересчете на сухое вещество.
В следующей стадии естественно чистой культуры (ЕЧК) получают посевной
материал на 7—8%-ной мелассной среде в условиях непрерывной, на первых стадиях
менее интенсивной аэрации, а в конце на единицу объема жидкости за 1 мин вводят уже
единицу объема воздуха. На последних стадиях дрожжи сепарируют и прессуют.
Полученный посевной материал, который называют технической чистой культурой,
хранят при 4°С и используют в качестве посевного материала при производстве товарных
дрожжей. С целью улучшения качества товарных дрожжей, уменьшения количества
сопутствующей бактериальной микрофлоры желательно ЕЧК перед засевом
подвергнуть кислотной обработке. Для этого прессованную ЕЧК суспендируют в
воде ( 1 : 1 ) и добавляют 100%-ную молочную кислоту в количестве 2% от массы
дрожжей, перемешивают и выдерживают 1 Ч. Для этих же целей можно использовать
фуразолидон (0,05% к объему дрожжевой суспензии) при выдержке в течение 1 ч.
Товарные дрожжи обычно получают в три этапа. Сначала размножают первый
посевной материал (задаточные дрожжи), затем вторые задаточные дрожжи и из них
получают товарные дрожжи. Получение первых задаточных дрожжей идет без притока
среды; длительность процесса 6—7 ч. На втором этапе стремятся полностью
исключить спиртовое брожение, поэтому дрожжи выращивают в условиях очень
интенсивной аэрации, лимитируя концентрацию сахара в среде, по проточному методу
культивирования. Чаще всего длительность этого этапа 10—12 ч. Последний этап
производства товарных дрожжей длится 10— 24 ч.
Практическая часть
1. Определение степени загрязнения ЧК и ЕЧК посторонними дрожжами на
ацетатной среде.
Степень загрязнения ЧК и ЕЧК посторонними дрожжами определяют на
элективной среде — ацетатной, непригодной для размножения производственных
дрожжей-сахаромицетов. Исследуемый материал (1—2 капли) из аппарата или комочек
прессованных дрожжей ЧК или ЕЧК (около 0,5 г) стерильно вносят в пробирку с
ацетатной средой, помещают в термостат при 30 °С и ведут ежедневные наблюдения.
Появление пленки на поверхности среды или помутнения через 5 и более суток дает
основание считать, что культура чистая, не содержит посторонних дрожжей. Если пленка
образовалась через 3—4 дня, дрожжи ЧК или ЕЧК удовлетворительные. Появление
пленки через 1—2 сут свидетельствует о неудовлетворительном качестве дрожжей ЧК или
ЕЧК и их непригодности в качестве засевных. при работе по удлиненным схемам.
2. Приготовить среду с нистатином по методу Розмановой и определить
количество бактерий.
Для определения количества бактерий в пробах, содержащих дрожжи, Розмановой
Н. В. предложен метод высева на среды с антибиотиком нистатином. Нистатин подавляет
рост дрожжей и грибов в концентрации 40—60 ед. на 1 мл среды. Водно-спиртовой (1:1)
раствор нистатина готовят с таким расчетом, чтобы в 1мл его содержалась фунгицидная
концентрация, достаточная для подавления дрожжей. В стерильные чашки Петри вносят
по 1 мл раствора нистатина, заливают расплавленную и охлажденную до 43—450С среду и
хорошо перемешивают. Далее все операции проводят как обычно при высеве проб на
плотные питательные среды. Активность нистатина в процессе хранения снижается,
поэтому при появлении на средах слабого роста дрожжей количество вносимого в чашки
нистатина увеличивают Б 2—3 paза.
3. Определить процентное содержание сахаромицетов и посторонних
микроорганизмов
Микроскопирование. При микроскопировании оценивают качество дрожжей —
по величине и однородности клеток—сахаромицетов и наличию посторонних
микроорганизмов.
В нескольких миллилитрах стерильной воды размешивают петлю дрожжей. Каплю
полученной суспензии смешивают на предметном стекле с метиленовым синим.
Просматривают несколько полей зрения, определяя морфологическое состояние
дрожжевых клеток, процент мертвых клеток, несовершенные дрожжи и бактерии.
Определение процентного содержания сахаромицетов и посторонних
микроорганизмов. Если подъемная сила или стойкость готовой продукции резко
ухудшились, микробиологический состав прессованных дрожжей и степень их заражения
посторонними дрожжами и бактериями определяют упрощенным методом — посевом на
сусло-агар с мелом или усложненным методом на несколько элективных питательных
сред для выявления количества клеток вредных микроорганизмов и распределения их по
группам.
Присутствие Bacillus subtilis можно определить следующим образом: пробирку с
2 мл взвеси дрожжей (из I разведения) помещают на 20—30 мин в кипящую воду,
прибавляют 5 мл стерильного солодового сусла и ставят в термостат при 37 °С на однидвое суток. При наличии данных бактерий появляется типичная морщинистая пленка.
При исследовании дрожжей на присутствие Proteus vulgaris производят посев капли
I и II разведения в конденсационную воду скошенного агара. Через 24—48 ч роста при 37
°С Proteus vulgaris обнаруживают по тонкому бактериальному налету, поднимающемуся
по стенке пробирки.
В доброкачественных прессованных дрожжах допускается присутствие
посторонних дрожжей не более 30 %, кислотообразующих бактерий — не более 15—35%,
гнилостных бактерий не должно быть.
4. Качество прессованных дрожжей.
Товарные прессованные дрожжи относятся к скоропортящимся продуктам.
Согласно ГОСТу готовые дрожжи должны иметь сероватый цвет с желтоватым оттенком,
без пятен, плотную, не мажущуюся консистенцию, специфический дрожжевой запах, без
плесневого и других посторонних запахов, свойственный прессованным дрожжам вкус;
влажность — не более 75 %, подъем теста до 70 мм — не более 75 мин; кислотность 100 г
дрожжей в день выработки — не более 120 мг, после 12 суток хранения при температуре
от 0 до 4°С — не более 360 мг в пересчете на уксусную кислоту; стойкость —не менее 48
ч при температуре хранения 5 °С и 10 сут при температуре хранения от 0 до 4°С;
мальтазная активность — 60—90 мин, зимазная — 50—60 мин при определении
газометрическим способом.
Вопросы для самоконтроля
1. Какие расы микроорганизмов используют при производстве хлебопекарных
дрожжей?
2. Опишите лабораторную стадию размножения дрожжей.
3. Охарактеризуйте стадию чистой культуры.
4. Опишите стадию естественно чистой культуры.
Лабораторная работа №20,21
Тема: Методы получения аминокислот из микробной массы.
Цель работы: Иметь представление о технике выделения из микробной массы
аминокислот.
Задание:
1. Ознакомиться с теоретической частью лабораторной работы.
2. Провести выделение аминокислот из микробной массы.
Материалы и оборудование: Каждому магистранту – пробирку с жидкой питательной
средой с культурой Bac. subtilis или Bac. Mesentericus, центрифуга, раствор серной
кислоты, 25 % раствор сульфита натрия, кипящая водяная баня, шкаф сушильный,
выпарные чашки, мерные пипетки, жидкая среда с культурой аспергилла, сухой порошок
гидроксида кальция, 20% раствор серной кислоты, фильтр бумажный, бумаги
индикаторные.
Теоретическая часть.
В состав природных белков обычно входят следующие аминокислоты: аланин,
аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глицин, глутаминовая кислота,
гистидин, глутамин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, оксипролин, пролин, серии,
тирозин, треонин, триптофан и валин. Восемь аминокислот организм животных не может
синтезировать, поэтому их называют биологически незаменимыми аминокислотами. К
ним относятся фенилаланин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и
валин. Эти аминокислоты должны регулярно и в нужном количестве поступать в организм
вместе с пищевыми продуктами. Недостаток одной из этих аминокислот в пище может
стать фактором, лимитирующим рост и развитие организма.
В растительных продуктах, составляющих основу питания человека и животных, в
недостаточном количестве может быть лизин, метионин и иногда триптофан. Препараты
этих аминокислот имеют большое значение в формировании правильного питания
человека и в сбалансированности кормов для домашних животных. В пищевой
промышленности и кулинарии многих стран в качестве специи используется натриевая
соль глутаминовой кислоты, придающая ощущение сытости. Сейчас во всем мире в
больших количествах получают глутаминовую кислоту или ее натриевую соль (около 100
ООО т в год), L-лизин и метионин (по 50 000 т в год). Большую часть этого количества
дает микробиологический синтез (за исключением получения метионина). Для биосинтеза
используют ауксотрофные мутанты, т. е. бактерии, которые под влиянием мутагенных
факторов (облучение, химическое воздействие и др.), утратили способность
самостоятельно синтезировать какую-нибудь необходимую для роста и развития
аминокислоту, например гомосерин, а с другой стороны, приобрели способность к
сверхсинтезу другой аминокислоты. Это значит, что для роста и размножения таких
бактерий в среде должны содержаться определенные аминокислоты — гомосерин,
треонин или метионин и т. д. Очень часто этим мутантам необходим и биотин. Такие
бактерии называют гомосериндефицитными или биотиндефицитными. В то же время эти
мутанты обладают способностью в большом количестве синтезировать другую
аминокислоту — лизин или глутаминовую кислоту и выделять их в окружающую среду.
Мутагенные факторы могут изменить нормальный биосинтез аминокислот в
клетке, воздействуя на генетический аппарат. Если в результате облучения или
воздействия химических факторов ДНК не дает информацию для синтеза фермента и в
клетке не синтезируется, например фермент гомосериндегидрогеназа, катализирующий
превращение полуальдегида аспарагиновой кислоты в гомосерин, то клетка может
синтезировать необходимые для своего существования белки только в том случае, если в
питательной среде уже содержится готовый гомосерин.
Так как аспарагиновая кислота является исходным пунктом биосинтеза не только
гомосерина, но и треонина, изолейцина, метионина, а также лизина, то отсутствие
упомянутого фермента влияет на биосинтез всех этих аминокислот. Прекращение
биосинтеза гомосерина одновременно прекращает биосинтез треонина, изолейцина и
метионина, поэтому эти аминокислоты также должны содержаться в среде роста данной
культуры. В данных условиях весь ход биосинтеза аминокислот в клетке идет в
направлении от аспарагиновой кислоты к лизину.
В результате изучения ауксотрофных мутантов выяснено, что продуценты
орнитина являются аргинин- или цитруллиндефицитными; продуценты гомосерина или
диаминопимелиновой кислоты треониндефицитными; продуценты изолейцина — лизиндефицитными; продуценты тирозина — фенилаланиндефицитными. Иногда встречаемые
природе бактерии способны в процессе роста накопить в среде до 2—5 г/л свободных
аминокислот, но ауксотрофные мутанты продуцируют их в значительно больших
количествах — 20—100 г/л.
Еще 50 лет назад ученые Осборн и Мендель доказали, что в белке пшеницы мало
лизина. В настоящее время установлено, что лизин в организме является не только
структурным элементом белка, но и выполняет ряд важных биохимических функций —
является предшественником карнитина и оксилизина, способствует транспорту кальция и
стронция в клетки и др. В настоящее время во многих странах препарат лизина добавляют
к хлебу для повышения его биологической ценности, а также для улучшения внешнего
вида. Доказано, что лизин улучшает аппетит, способствует секреции пищеварительных
ферментов, предотвращает кариес зубов у детей.
Лизин является самой дефицитной в кормах животных незаменимой
аминокислотой. Установлено, что добавка лизина в количестве 0,1—0,4% к кормам
значительно увеличивает продуктивность домашних животных.
Для биосинтеза лизина используют гомосериндефицитные мутанты ауксотрофных
бактерий родов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium и др.
Активный продуцент лизина Brevibacterium sp. 22 получен в Институте биохимии
им. А. Баха АН СССР под руководством В. Букина.
Продуценты лизина культивируются на средах, содержащих углеводы или
уксусную кислоту, источники азота и кислород. В клетках бактерий лизин синтезируется
из пировиноградной, аспарагиновой и янтарной кислот по схеме, показанной при
получении лизина необходимо исключить нежелательные побочные процессы. Так, при
недостаточной аэрации может идти образование аланина или молочной кислоты вместо
синтеза лизина. Очень важным фактором является концентрация дефицитных
аминокислот — гомосерина, метионина и треонина. Для нормального роста и биосинтеза
лизина культурой Brevibacterium sp. 22 оптимальной считается концентрация треонина в
800 мг, метионина — 200 мг на литр питательной среды. Кроме того, для развития
культуры необходим тиамин в концентрации 200 мкг на 1 л среды. Важным регулятором
процесса является биотин. Одна и та же культура Brevibacterium sp. 22 при концентрации
биотина в среде, равной 1—4 мкг/л, продуцирует глутаминовую кислоту, а при
концентрации 15—20 мкг/л — лизин. Считают, что биотин изменяет проницаемость
клеточной оболочки. При концентрации биотина 2,5 мг/л стимулируется также
образование молочной кислоты.
Важную роль играет треонин, являясь обязательным фактором роста на начальном
этапе ферментации. Однако концентрация его не должна быть большой, так как на
дальнейших этапах ферментации (при синтезе лизина) он может действовать как
ингибитор фермента аспартаткиназы. Присутствие лизина усиливает ингибирующие
свойства треонина.
Среду для получения лизина готовят из мелассы (7—12% сахара), кукурузного
экстракта (1—2%), солей аммония (1 — 2%), одно- и двузамещенного фосфата калия (по
0,05%). В Институте микробиологии им. А. Кирхенштейна было показано, что
кукурузный экстракт можно заменить концентратом клеточного сока картофеля
(побочный продукт при производстве крахмала), дрожжевым гидролизатом или вытяжкой
из пшеничных отрубей. После стерилизации такую среду используют для выращивания
посевного материала, а также и для главной ферментации. Сначала культуру размножают
на качалке в колбах, затем в ферментаторах объемом 100 и 3000 л. Количество посевного
материала 5—10%, оптимальная температура 30—33°С, рН 7,4. Длительность
ферментации посевного материала на каждой стадии около 24 ч.
Главная ферментация идет 50—70 ч при аналогичных режимах. Концентрация
лизина в растворе достигает 20—40 г/л, а выход по сахару — 25—35%. Концентрация
клеточной биомассы 10—15 г/л (по сухой массе). Проточная культура обладает
повышенной лизин-синтезирующей способностью (на 20—25% выше по сравнению с
периодической), поэтому рациональной является комбинированная технология получения
лизина: непрерывная ферментация на стадии приготовления посевного материала и
периодический процесс главной ферментации.
При наличии хорошо герметизированной и автоматически управляемой
ферментационной аппаратуры можно осуществить трехступенчатый процесс, который
обеспечивает 20— 30 г/л лизина при выходе культуральной жидкости из третьего
аппарата (табл. 16).
Высокую концентрацию лизина (до 60 г/л) в культуральной жидкости можно
получить на мелассной среде, если во время ферментации вести подкормку путем дробной
подачи части питательной среды при соблюдении точной регуляции культивирования.
Мелассу можно заменить на сахарозу, диффузионный сок сахарной свеклы, глюкозу или
гидролизаты крахмала, древесины, торфа, а также на уксусную кислоту.Для получения
кристаллического лизина клеточную массу центрифугируют, а культуральную жидкость
пропускают через катионит КУ-2 или КВ-4-Р-2. Лизин элюируют 2,0—3,5%-ным
раствором NH4OH, элюат упаривают в вакууме при температуре 60°С до V20—7зо части
исходного объема. Затем при помощи НС1 устанавливают рН 4,5—5,0, охлаждают до
14—18°С и кристаллизуют. Фильтрацией или центрифугированием кристаллов получают
технический лизин, содержащий 94—96% лизина монохлоргидрата. Для получения
чистого лизина кристаллы технического лизина в небольшом количестве воды нагревают
до 70°С, добавляют активированный уголь, перемешивают и фильтруют. При помощи
НС1 устанавливают рН 4,9, раствор упаривают и кристаллизуют. Кристаллы сушат при
температуре 60°С. Полученный таким образом лизин содержит 99,9% лизина
монохлоргидрата, 0,1% золы и не более 0,001% тяжелых металлов. После отделения
лизина из фильтрата еще выделяют бетаин, используемый в медицине (препарат асидин),
а также в животноводстве.
Для кормовых нужд на Ливанском опытном биохимическом заводе (Латвийская
ССР) получают концентрат лизина. В соответствии с методом, разработанным в
Институте биохимии им. А. Баха АН СССР совместно с Институтом микробиологии им.
А. Кирхенштейна АН ЛатвССР, после ферментации культуральную
жидкость
подкисляют до рН 5,0—6,0, добавляют для стабилизации 0,15%-ный раствор бисульфита
натрия и выпаривают в вакуум-аппаратах до 40—50%-ного содержания сухих веществ.
Полученный жидкий концентрат лизина (ЖКЛ) можно использовать для обогащения
кормов. При высушивании жидкого концентрата лизина в распылительных сушилках
(температура поступающего воздуха 300°С, выходящего — 90—100°С) до влажности 5—
6% получают сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ).
Термическое обезвоживание продуктов ферментации лизина может вызвать
связывание лизина с редуцирующими сахарами среды. При соединении глюкозы или
других соединений, содержащих карбонильные группы, с е-аминогруппой лизина, он
переходит в форму, не усвояемую организмом. Поэтому надо следить, чтобы в процессе
ферментации были полностью использованы все редуцирующие вещества, рН раствора
лизина перед высушиванием и упариванием должен быть кислым, необходимо также
стабилизировать среду сульфитом натрия или гексаметафосфатом натрия.
Сухой ККЛ очень гигроскопичен, поэтому сразу после сушки его упаковывают в
полиэтилен - бумажные мешки. Менее гигроскопичный и сыпучий концентрат получают,
высушивая лизин вместе с наполнителями — костяной мукой, кормовыми дрожжами,
пшеничными отрубями и др. Гигроскопичность снижается, если оставшиеся в
культуральной жидкости сахара и органические кислоты усваивают специальные
культуры дрожжей в процессе дображивания.
Биологическая и зоотехническая проверки показали, что по биологическим
свойствам концентрат лизина ценнее, чем кристаллический лизин.
Производство ККЛ почти в 2 раза дешевле производства кристаллического лизина,
кроме того, легче очищаются сточные воды.
Учитывая содержание ряда биологически активных веществ в концентрате лизина,
а также его стабилизирующие свойства, выгодно на основе жидкого концентрата лизина и
сухого концентрата лизина с наполнителем готовить витаминно-аминокислотные
премиксы. Сухой премикс получают на основе ККЛ с отрубями путем добавления
предусмотренного соответствующей рецептурой количества витаминов и других
биологически активных веществ. При этом учитывается не только собственно лизин ККЛ,
но также бетаин и рибофлавин. Лизин можно получать, работая по двухступенчатому
методу.
На первой ступени при помощи микробиологического синтеза (аналогичного
биосинтезу лизина) или химического синтеза (из толуола, керосина и др.) получают а, е-
диаминопимелиновую кислоту. На второй ступени
декарбоксилирование а, е-диаминопимелиновой кислоты.
Практическая часть
проводят
ферментативное
1. Выделение аминокислот из микробной массы.
1 метод. Отделяют микробную массу от питательной среды, сливают жидкую
фракцию в выпарную чашку и концентрируют выпариванием до половины объема. После
этого подкисляют концентрат раствором соляной кислоты (0,2-0,4 мл раствора на 1 мл
концентрата). В этот момент происходит выпадение кристаллов глутаминовой кислоты
или лизина. Кристаллы отделяют декантированием, растворяют кипящей водой в
соотношение 1:5, повторно кристаллизируют и сушат выпариванием.
2 метод. На лабораторной работе группа магистрантов делится на две бригады, первая
бригада выделяет белок из муки злаковых культур, вторая – из измельченных бобовых
культур.
Для создания лучших условий экстрагирования белков необходимо просеять муку,
выделяя фракцию с размером частиц не более 100 мкм, и отбрасывая оболочки и более
крупные частицы, богатые крахмалом. Взвесить в химическом стакане навеску муки
массой 10 г, постепенно прилить к ней 60 мл 10 % (NH4)2SO4. Суспензию настаивать
10…15 мин для растворения белков. Содержимое стакана разлить поровну в две
центрифужные пробирки. Разделить суспензию на центрифуге при скорости вращения
ротора 500 об/мин и продолжительности процесса центрифугирования 10 мин.
Фугат собрать в чистый химический стакан и определить с помощью биуретового
метода Яроша концентрацию белка. Для этого в пробирку объемом 20 мл прилить 2,4 мл
раствора мочевины, 0,1 мл фугата и 2,5 мл биуретового реактива. Записать время внесения
биуретового реактива. Смесь хорошо перемешать и поместить в водяную баню с
температурой 40 °С на 10 мин. Затем охладить ее до 20 °С под струей холодной воды или
на воздухе. Через 30 минут после внесения биуретового реактива определить оптическую
плотность раствора, пользуясь кюветами № 5 и светофильтром № 6 ФЭК-56. Количество
белка определить по предварительно построенной калибровочной кривой.
В три пробирки объемом 20 мл налить по 5 мл фугата и провести экстракцию белков
раствором сульфата алюминия разной концентрации. В первую пробирку добавить 5 мл
0,5 % Al2(SO4)3 c температурой 3…5 °С, во вторую – 5 мл 2,5 % Al2(SO4)3 c
температурой 3…5 °С, в третью – 5 мл 5 % Al2(SO4)3 c температурой 3…5 °С.
Содержимое каждой из пробирок тщательно перемешать и провести высаливание белков
при температуре 3…5 °С (в холодильнике) в течение 15 мин. Образовавшийся осадок
отделить фильтрованием через складчатый фильтр. В фильтрате определить количество
белка с помощью биуретового метода Яроша в соответствии с пунктами 5 и 6. Рассчитать
коэффициент извлечения белка
сн  ск
сн
где сн – концентрация белка в фугате, г/л; ск – концентрация белка в фильтрате, г/л.
Полученные экспериментальные данные и результаты расчетов внести в табл. 1.
Б
Таблица 1. Экспериментальные данные и результаты расчетов выделения белков из
белоксодержащих продуктов
Показатели
Время внесения
биуретового
Фугат
Фильтрат после осаждения Al2(SO4)3, %
0,5
2,5
5
реактива
Средняя
оптическая
плотность
Количество
растворенного
белка
Доля
извлеченного
белка
Построить график зависимости концентрации остаточного белка от концентрации
экстрагента и сравнить эффективность выделения белка из различного сырья.
Вопросы для самоконтроля:
1. Какие методы применяются для получения аминокислот?
2. Продуценты лизина, их характеристика.
3. Охарактеризуйте биотехнологию получения лизина. Основные технологические
параметры.
4. В чем заключается сущность биуретового метода определения концентрации
белков?
Лабораторная работа №22,23
Тема: Методы экстрагирования из микробной массы ферментов, витаминов и
липидов.
Цель работы: Иметь представление о методах микробиологического производства
ферментов, витаминов и липидов.
Задание:
1. Ознакомиться с теоретической частью лабораторной работы.
2. Провести экстрагирование из микробной массы ферменты, витамины,
липиды.
Материалы и оборудование: Жидкая питательная среда с культурой Staphylococcus,
ацетон, пустые флаконы, выпарные чашки, баня водяная, шкаф вытяжной, 5% раствор
соляной кислоты, культура Аspergillus.
Теоретическая часть.
Продуценты ферментных препаратов. Технические препараты ферментов.
Для получения ферментных препаратов используют как микроскопические грибы,
так и бактерии и дрожжи. Иногда получение технического ферментного препарата
кончается проведением процесса ферментации, например в спиртовой промышленности
для осахаривания крахмала используют жидкую культуру Aspergillus niger, выращенную
глубинным методом культивирования на спиртовой барде с добавками крахмала (1%) и
различных солей. Впоследствии ее добавляют в жидком виде в количестве 10—12% к
осахариваемому затору. Однако активность ферментов в культуральной жидкости быстро
снижается. Поэтому широко практикуют получение сухих технических ферментных
препаратов.
Технические препараты ферментов. Комплексный амилолитический ферментный
препарат получают путем выращивания плесневых грибов на твердой питательной среде с
последующей сушкой и измельчением полученной массы. Более активный препарат
фермента получают путем экстракции такого «грибного солода» с последующим
выпариванием и сушкой. Еще более активные ферментные препараты можно выделить из
культуральной жидкости путем осаждения амилазы ацетоном и дальнейшим
высушиванием коагулята при температуре 27—28°С. Для осаждения фермента часто
используют и сульфат аммония. Предварительно культуральную жидкость выпаривают
при температуре 40°С до 40%-ного содержания сухих веществ. Коагулят сушат вместе с
наполнителем. В Японии для пищевых нужд используют технический препарат амилазы,
полученный адсорбцией фермента из культуральной жидкости особо обработанным
крахмалом. Затем амилазу вместе с крахмалом лиофилизируют.
Препарат, содержащий пектиназу, получают из отходов производства лимонной
кислоты — мицелия Aspergillus niger, высушивая его или коагулируя из экстракта
белковую фракцию мицелия. Этот препарат используют для осветления соков и
увеличения их выхода при обработке ягод и фруктов. В качестве продуцента амилазы
применяют Aspergillus awamori или другую культуру рода Aspergillus.
Характерной особенностью синтеза целлюлазы Т. lignorum на среде с молочной
сывороткой является активное накопление ферментов в культуральной жидкости в
интервале 36—54 ч и довольно быстрое падение активности в последующие часы.
Максимум накопления целлюлазы в культуральной жидкости совпадает по времени с
максимальным потреблением лактозы среды и рН 7,6— 7,8. Далее, в течение нескольких
часов (в среднем 2—4) происходит повышение рН до 8,0—8,1 и резкое падение
активности целлюлазы почти вдвое. Об окончании ферментации можно судить по рН
среды 7,8, внешнему виду мицелия — плотный желтого цвета и прозрачной
культуральной жидкости. Повышение рН до 8,0 и выше сопровождается началом автолиза
мицелия и помутнения культуральной жидкости. Быстрое падение активности целлюлаз в
культуральной жидкости через несколько часов после завершения ферментации
происходит, по-видимому, из-за действия протеолитических ферментов, образующихся за
счет наличия сывороточного белка в среде. Осаждение целлюлаз из культуральной
жидкости можно осуществить ацетоном, изопропанолом и танином с желатином. При
использовании ацетона, изопропанола и этанола необходимо добавить три объема
осадителя на объем культуральной жидкости. Исходный рН среды 7,6—7,8, температура
10—15°С. Осадок отделяют через 20—30 мин после добавления осадителя.
Высаливание сульфатом аммония необходимо вести при 80% насыщении,
исходном рН среды 7,8 и температуре 10—15°С. Длительность формирования осадков 24
ч. Отделяют осадок центрифугированием при 3000—4000 об/мин в течение 10—15 мин.
Ферментный осадок лиофильно или под вакуумом сушат при 25—30°С до остаточной
влажности 10—12%.
Наиболее эффективно осаждение целлюлозы танином и желатином.
Выделение и очистка ферментов. Ферменты, растворенные в цитоплазме клеток,
легко экстрагируются из них водой или разбавленными растворами солей. Затем эти
ферменты очищают и отделяют друг от друга, фракционируя сульфатом аммония.
Ферменты, связанные со структурными элементами клеток, можно выделить
только после разрушения клеточной оболочки — дезинтеграции. Клетки можно
разрушить механически — растирая, замораживая и оттаивая, подвергая действию
ультразвука, или же ферментативно, используя специальные ферментные препараты. Для
разрушения клеток биомассу вначале промывают децимолярным раствором сахарозы (рН
7,3), содержащим какой-либо буфер, этилендиаминтетрауксусную кислоту и альбумин.
Затем добавляют стеклянные микрошарики и гомогенизируют в дезинтеграторе 1—2 мин
при 13000 об/мин. Клеточные стенки и стеклянные микрошарики отделяют
центрифугированием.
Если фермент содержится в липопротеидных комплексах, не растворимых в воде,
тогда при помощи бутилового спирта в количестве 3—6% объема ферментного раствора
из него извлекают липиды. Фермент остается в водном слое, а липиды переходят в слой
бутилового спирта. Концентрирование растворов ферментов достигают, избавляясь
прежде всего от балластных белков. Если фермент термостабилен, например
рибонуклеаза, то от белков освобождаются нагреванием раствора. Осадок отделяют
центрифугированием.
Для коагуляции белков и очистки фермента используют также органические
растворители — ацетон, этиловый спирт, метиловый спирт, диоксан.
Дальнейшую очистку ферментного препарата, содержащего в небольших
количествах примеси белков, сходных по физико-химическим свойствам с ферментом,
ведут методом ионообменной хроматографии. Белки в ионообменном процессе
взаимодействуют с ионитом и при помощи электростатического взаимодействия
связываются с его поверхностью. Для элюирования белков с поверхности ионита
используют изменение концентрации при рН пропускаемого через ионит буфера или
введение нейтральных солей (NaCl, КС1).
Получение витаминов. Рибофлавин. Цианкоболамин.
Микроорганизмы содержат много витаминов, которые чаще всего входят в состав
ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств
данной культуры микроорганизмов и условий культивирования. Некоторые витамины
микроорганизмы синтезируют, другие напротив усваивают в готовом виде из
окружающей среды. Культура, способная синтезировать какой-либо витамин, называется
аутотрофной по отношению к нему, если культура не способна синтезировать данный
витамин, она является аутогетеротрофной.
Витамины группы В. Сравнительно богаты витаминами группы В дрожжи
(хлебопекарные, пивные, кормовые). Изменяя условия среды, содержание отдельных
витаминов можно увеличить. Так, количество рибофлавина зависит от интенсивности
аэрации и содержания железа в среде. Количество витаминов в клетках, а также их
выделение из последних можно изменить при помощи микроэлементов. Например,
небольшие добавки марганца способствуют накоплению инозита в клетках. Так,
повышенные дозы кобальта (100— 500 мкг хлорида кобальта на 100 г) увеличивают
содержание пиридоксина (витамин Вб) в культуральной жидкости.
Рибофлавин. Для получения препарата витамина В2 используют культуру дрожжей
Candida guilliermondia, бактерии Clostridium acetobutylicum, даже продуцент лизина
Brevibacterium и др. Однако наибольшую продуктивность в биосинтезе рибофлавина
имеет дрожжеподобная культура Eremothecium ashbuii, дающая до 6000 мкг рибофлавина
на 1 г сухого вещества питательной среды.
Рибофлавин накапливается в клетках микроорганизмов либо в виде
флавинадениннуклеотида, либо в свободном виде. В последнем случае он представляет
собой желтые кристаллы, находящиеся в вакуолях. Максимального количества биомассы
культура Eremothecium ashbuii достигает на второй день культивирования. В это время
наблюдается интенсивное спорообразование и синтез рибофлавина. При старении
культуры, особенно через 4—5 сут культивирования, клетки начинают автолизироваться и
рибофлавин переходит в среду.
Микроорганизм Eremothecium ashbuii развивается и синтезирует рибофлавин на
синтетических средах с уменьшенным содержанием углеводов (0,25—1,5%) и
повышенным количеством пептона (1—5%), в присутствии витаминов — тиамина,
биотина и инозита, а также аминокислот — лейцина, аргинина, метионина, гистидина и
тирозина.
Биосинтез рибофлавина стимулируют ацетат аммония и ненасыщенные жирные
кислоты, а замедляет железо, поэтому питательную среду предварительно обрабатывают
для уменьшения содержания железа до 5—10 мкг на 1 л. В производственных, условиях
питательную среду готовят из 1—3% мелассы, гидроля или глюкозы, 3—8% кукурузного
экстракта или дрожжевого автолизата, добавляя N, Р205, К, Mg, Zn. Процесс ведут по
методу глубинной ферментации при интенсивности аэрации 1,5—2,0 м3/мин воздуха на
каждый кубический метр культуральной жидкости и температуре 29—30°С. Ферментация
Длится до стадии лизиса мицелия и образования спор.
Многочисленными опытами на животных установлена высокая биологическая
эффективность как кристаллического препарата витамина В12, так и его кормовых
концентратов. В природе витамин В12 синтезируют только микроорганизмы, например
Ргоpionibacterium shermanii, метанобразующие бактерии, Bact. Megatherium и др.
Для синтеза молекулы витамина В12 в питательной среде должен быть кобальт, а
также 5, 6- диметилбензимидазол, который некоторые микроорганизмы синтезируют
сами. Для получения медицинского препарата витамина B12 широко используют
Propionibacterium freudenreichii или Рг. shermanii, их выращивают по методу глубинной
ферментации, на среде, содержащей 1 % гидролизата казеина, 1% пептона, 1,25% лактата
натрия, 0,3% дрожжевого экстракта, соли кобальта и 5,6-диметилбензимидазол. В
анаэробных условиях ферментация культуры Propionibacterium длится 72 ч при
температуре 28—30°С.
За это время в культуральной жидкости накапливается 3000—10 000 мкг/л
витамина B12. Биосинтез витамина В12 может идти и при аэробных условиях, используя
актиномицеты, например Actinomyces olivaceus.
В этом случае среду готовят из кукурузного экстракта или барды спиртовой
промышленности, гидроля, крахмала, глюкозы, сульфата аммония и солей кобальта.
Образование активной формы витамина и в этом случае стимулируют добавки 5,6диметил-бензимидазола.
Для получения кристаллов витамина B12 культуральную жидкость центрифугируют
и выделяют содержащую витамин клеточную массу. Затем ее гидролизуют и очищают
полученный раствор витамина. Очистку витамина B12 из водных растворов можно
провести, обрабатывая раствор:
1) бензиловым спиртом, добавляя к экстракту хлороформ и экстрагируя витамин
водой;
2) гидроокисью цинка;
3) смесью крезола и тетрахлоруглерода (1 : 1);
4) хроматографически, пропуская через колонку с А120з и элюируя витамин 50%
смесью вода — ацетон.
Очищенный раствор витамина кристаллизуют. Получают темно-фиолетовые
кристаллы витамина B12 с 75—76%-ной степенью чистоты. Выход витамина составляет
67—70%. Себестоимость витамина, полученного в процессе стерильной ферментации,
сравнительно высока, поэтому для нужд животноводства его получают по более
простому) методу метанового брожения, используя в качестве сырья отходы пищевой
промышленности.
Получение липидов.
Под липидами в данном случае подразумеваются растворимые в неполярных
растворителях клеточные компоненты микроорганизмов. Их концентрация составляет до
75% сухой биомассы. В состав липидов микроорганизмов входит сравнительно много
ненасыщенных жирных кислот. Так, в липидах плесневого гриба Penicillium soppii из
жирных кислот содержатся пальмитиновая — 22%, стеариновая — 7,6%, олеиновая —
45,2% и линолевая — 20% от общего их количества. Соотношение насыщенных и
ненасыщенных кислот зависит не только от свойств продуцента, но и от условий
культивирования. Низкая температура стимулирует синтез ненасыщенных жирных
кислоту грибов. Общее количество и соотношение жирных кислот зависит и от
присутствия К, Mg, Na и их соотношения в среде.
Синтез липидов стимулируют ингибиторы углеводного обмена, например арсенит
натрия.
Для производства липидов микробного происхождения может быть использовано
дешевое сырье, они в перспективе могут заменить жиры и масла растительного и
животного происхождения, используемые для технических нужд. Таким дешевым
исходным сырьем являются гидролизаты древесины или торфа, а также продукты нефти.
В качестве примера можно привести культивирование дрожжей Lipomyces lipoferus на
гидролизатах торфа, нейтрализованных известковым молоком до рН 6,0 и содержащих
1,5% РВ. К среде добавляют дополнительно КН2РО4— 0,1 г/л, MgS04 — 0,04 г/л и СаС12
—0,04 г/л. Содержание азота в гидролизате вполне достаточно для роста культуры.
Содержание липидов в биомассе после 4—5 сут выращивания составляет 50% по
сухому веществу. В их состав входят 5,0 — 6,0% фосфолипидов, 4,8 — 6,5% стеринов, 2,1
— 10,7% моно- и диглицеридов, 2,3—9,6% свободных жирных кислот, 70,7—75,1%
триглицеридов и 1,7—2,1% эфиров стеринов и воска.
Липиды выделяют из биомассы экстракцией эфиром. Из 1 т сухого торфа можггЪ
получить 40—50 кг липидов. По физико-химическим свойствам они близки к
растительным маслам, которые используют во многих отраслях промышленности для
технических нужд. Возможно отобрать такие культуры микроорганизмов и создать
условия культивирования, чтобы в биомассе накапливалось меньше липидов (15—30%),
но больше белков (30—40%)- В этом случае после экстракции липидов получают ценный
кормовой препарат — микробный жмых. В последнее время доказано, что
микроорганизмы могут выделять липиды из клеток в культуральную жидкость. Культура
дрожжей Rhodotorula glutinis выделяет из клеток уксусную (40%), миристиновую (1%),
пальмитиновую (14%), стеариновую (1,5%), олеиновую (29%), линолевую (3%),
линоленовую (0,5%) и 3-дигидроксигексадекановую (8,5% ) кислоты (данные приведены в
процентах к общей массе экстрацеллюлярных липидов). При культивировании Candida
bogoriensis в среде образуются игольчатые кристаллы липидов с температурой плавления
74—76°С.
Практическая часть
1 метод.
Культуру микроорганизмов отделяют центрифугированием. К осадку добавляет
при постоянном перемешивании 5 мл ацетона на 1 г осадка. Перемешивание проводят в
течение 10-15 мин. Жидкую фракцию отделяют и выпаривают ацетон на водяной бане. В
выпарной чашке остаются микробные липиды.
Культуру Аspergillus заливают кипящей водой в соотношение 1:5, перемешивают в
течение 10 минут и подкисляют раствором соляной кислоты. Жидкую фракцию отделяют
центрифугированием. Затем к ней добавляют ацетон в количестве 1 мл на каждый мл
жидкости и помещают в морозильную камеру холодильника для выпадения кристаллов
ферментов. После этого кристаллы ферментов отделяют декантацией.
2 метод.
Засеять питательную среду суспензией спор гриба. Для этого в пробирку с культурой
гриба на скошенной агаризованной среде налить стерильную воду до верхнего края
косяка. Конидий перевести концом стерильной пипетки во взвешенное состояние и
отобрать 1 мл суспензии спор, перенося ее затем в колбу со стерильной средой. После
засева среду тщательно перемешать путем встряхивания и пересыпать в стерильную
кювету, потом закрыть ее крышкой. Кювета имеет перфорации для воздухообмена.
Операции по засеву среды необходимо производить, соблюдая асептические условия,
возле пламени спиртовки. Кюветы с засеянной средой поместить в термостат.
Выращивание проводить в течение 48…54 ч при температуре 33 °С в течение первых 12 ч
роста и 28…30 °С – в последующие. Выросшая культура имеет вид коржа с пушистой
поверхностью. Провести экстракцию ферментов из выросшей культуры гриба. Корж
тщательно измельчить в кювете с помощью шпателя и на технических весах взвесить 5 г
поверхностной культуры. Шпатель обязательно погрузить в дезинфецирующий раствор.
Взвешенную порцию поместить в фарфоровую ступку и тщательно растереть пестиком со
100 мл забуференной дистиллированной воды, которую получают смешивая 10 мл
ацетатного буфера (рН 4,7) и 90 мл дистиллированной воды. После чего поместить в
термостат на 30 мин при 30 °С. По истечению времени экстракции содержимое
фарфоровых ступок перенести на капроновый фильтр и хорошо отжать для отделения
экстракта от биошрота (остатков питательной среды и мицелия). Осветлить полученный
экстракт (вытяжку) путем центрифугирования. Для этого мерным цилиндром отмерить 25
мл фильтрата и перенести в центрифужные стаканчики, которые устанавливают на роторе
центрифуги попарно напротив друг друга. Центрифугирование длится 5 мин при 3 тыс.
оборотах. Осветленный экстракт слить в колбу для дальнейшего анализа.
Определить амилолитическую способность (АС) экстракта, используя капельный
метод (по Климовскому и Родзевич).
В основе метода лежит способность фермента амилазы, находящегося в вытяжке,
катализировать гидролиз крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов.
Для определения АС важно строго соблюдать температурные условия реакции. Для
этого все растворы – субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и
дистиллированная вода должны быть нагреты до 30 °С в ультратермостате в течение 10
мин.
В широкую пробирку залить 25 мл раствора крахмала. Не вынимая пробирок из
термостата, с помощью пипеток добавить воду, а затем вытяжку от 1 до 25 см3. Общий
объем реакционной смеси должен составлять 50 см3. Если ферментная вытяжка
малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см3, а воду вообще не добавлять.
Содержимое в пробирке перемешать палочкой и отметить время по секундомеру,
когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала:
• каждые 60 с из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирать палочкой каплю
пробы;
• каплю помещать на белую фарфоровую пластину, соединяя эту каплю с каплей
рабочего раствора йода и наблюдать окраску;
• реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать
изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 с;
• изменение окраски йода отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель
– йода и реакционной смеси.
Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не
окрашивающихся йодом, должно быть в пределах 10…20 мин. Если время гидролиза
крахмала менее 10 мин, то определение повторяют, уменьшая объем вытяжки, а
увеличивая объем воды. Если гидролиз крахмала не заканчивается в течение 20 мин, то
анализ также повторяют, увеличивая объем ферментной вытяжки и уменьшая объем воды.
Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ,
вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.
Вопросы для самоконтроля:
1. Опишите процесс экстрагирования ферментов из микробной массы.
2. Охарактеризуйте процесс экстрагирования витаминов.
3. Как проводят экстрагирование липидов из микробной массы?
Лабораторная работа №24,25,26
Тема: Бактериальные препараты, используемые в пищевой промышленности
(закваски, бифидумбактерии, лактобактерии).
Цель работы: Ознакомиться с основными бактериальными препаратами пищевой
промышленности. Изучить микробиологические требования, предъявляемые согласно СанПин, к
закваскам, методики исследования качества заквасок и провести сравнительную характеристику
представленных образцов.
Задание:
1. Изучить требования, предъявляемые СанПиН 2.3.2.1078-01 к жидким и сухим
закваскам.
2. Провести оценку качества представленных образцов заквасок по содержанию
заквасочных микроорганизмов и контаминантов - дрожжей и плесеней.
3. Дать качественную характеристику микроорганизмов, входящих в состав
представленных образцов заквасок.
4. Провести количественный учет пробиотических микроорганизмов в продуктах
«Био-Йогурт», «Бифилайф» и «Активия».
Материалы и оборудование: Закваска сливочного стрептококка 100 мл, закваска
термофильного стрептококка 100 мл, закваска ацидофильной палочки 100 мл, закваска
пропионовокислых бактерий 100 мл, конические колбы емкостью 250 мл – 6 шт, пипетки
градуированные на 1-2 мл – 40 шт, химические стерильные стаканы или конические
(плоскодонные колбы) емкостью 100 мл – 6 шт, пипетки на 10 мл – 8 шт, стерильный
физиологический раствор (0,85% NaCl) – 400 мл (разлитый в пробирки по 10 мл),
краситель метиленовый синий, набор красителей по Грамму, спиртовки, предметные
стекла, смесь спирта и эфира 1:1, раствор NаОН 0,1 N концентрации, термостаты на 30 оС
и на 37оС, 1% раствор фенолфталеина, микроскопы 4 шт, среда КМАФанМ, среда
Кесслер, среда Сабуро, раствор КОН 40% концентрации, пробирки на 50 мл 4 шт,
фарфоровые чашки 4 шт, фильтры бумажные 4 шт, воронки 4 шт, петли
микробиологические 4 шт, вода дистиллированная, стерильные чашки Петри 8 шт, баня
водяная.
Теоретическая часть.
Все микроорганизмы, встречающиеся в молоке и молочных продуктах, можно
разделить в зависимости от их роли в формировании качества продукции на три основные
группы: технически важная микрофлора, патогенные и санитарно-показательные
микроорганизмы.
К первой группе относятся в первую очередь микроорганизмы, вводимые в закваски,
а также посторонняя микрофлора, вызывающая пороки.
В состав микрофлоры заквасок на чистых культурах, используемых в производстве
кисломолочных продуктов, входят следующие виды молочнокислых бактерий: S. lactis, S.
cremoris, S. lactis subsp. diacetylactis, S. lactis subsp. acetoinicus, S. thermophilus, L.
bulgaricus, L. acidophilus.
Бифидобактерии – палочки, чрезвычайно вариабельные по внешнему виду: на
питательных средах для них характерны слегка изогнутые и разветвленные формы с
булавовидными и гантелевидными утолщениями на концах. Клетки располагаются
хаотично, отдельно или скоплениями.
Для использования в производстве рекомендуются штаммы бифидобактерий,
относящиеся к видам B. bifidum, B. longum и B. adolescentis.
Производство кисломолочных продуктов основано на применении одно- и
многовидовых многоштаммовых заквасок.
Микрофлора кисломолочных продуктов определяется следующими факторами:
1) Температурой пастеризации молока. (После пастеризации в молоке
преимущественно остаются термоустойчивые молочнокислые палочки и энтерококки. Эта
микрофлора преобладает на оборудовании при производстве кисломолочных продуктов).
2) Видом заквасочных микроорганизмов. (Основная микрофлора, ведущая процесс
сквашивания, вносится с закваской, но микрофлора пастеризованного молока и
попадающая с оборудования также размножается в процессе сквашивания).
3) Интенсивностью развития незаквасочной микрофлоры. (При этом необходимо
учитывать, что при ферментации происходит одновременно развитие микроорганизмов
незаквасочного происхождения, которые могут активизироваться или подавляться
микроорганизмами закваски).
4) Соблюдением режимов ферментации. (Интенсивность размножения микрофлоры
кисломолочных продуктов и конечное соотношение между ее представителями зависит,
прежде всего, от качества молока, но может определяться температурой и длительностью
сквашивания (и созревания), а также соблюдением режимов охлаждения).
С точки зрения микробиологии основные кисломолочные продукты в зависимости от
применяемых при производстве микроорганизмов могут быть разделены на следующие
группы.
1) Продукты, приготовляемые с использованием многокомпонентных заквасок:
кефир, кумыс.
2) Продукты, приготовляемые с использованием термофильных молочнокислых
бактерий: йогурт, простокваша Южная, ряженка, варенец.
3) Продукты, приготовляемые с использованием мезофильных и термофильных
молочнокислых бактерий: напитки малой жирности и обезжиренные с плодово-ягодными
наполнителями.
4) Продукты, приготовляемые с использованием ацидофильных и бифидобактерий:
ацидофильное молоко, ацидофилин, ацидофильно-дрожжевое молоко, ацидофильная
паста, детские ацидофильные смеси, бифивит, бифидок и др.
В настоящее время растет ассортимент кисломолочных продуктов пробиотического
значения. Пробиотики – живые микроорганизмы или ферментируемые ими продукты,
которые оказывают благотворный эффект на здоровье человека и животных в большей
степени реализующийся в желудочно-кишечном тракте. К числу таких микроорганизмов
относятся: лактобактерии, бифидобактерии, и другие микроорганизмы, оказывающие
положительное влияние на микрофлору кишечника, его ферментативную,
витаминсинтезирующую, иммуномоделирующую и другие функции.
Практическая часть
1. Изучить требования, предъявляемые СанПиН 2.3.2.1078-01 к жидким и сухим
закваскам.
Пользуясь СанПиН 2.3.2.1078-01 изучить и занести в лабораторный отчет
микробиологические требования, предъявляемые к закваскам.
2. Провести оценку качества представленных образцов заквасок по содержанию
заквасочных микроорганизмов и контаминантов - дрожжей и плесеней.
Изучить ГОСТ 9225-84 на проведение исследований по содержанию в заквасках
молочнокислых микроорганизмов, дрожжей и плесеней. Провести анализ представленных
образцов на соответствие требованиям СанПин и сделать заключение о качестве заквасок.
Результаты представить в таблице 1.
Таблица 1 – Анализ соответствия качества заквасок требованиям СанПин
№
пробы
Качественный
состав
микрофлоры
Содержание
заквасочных
Микрокартина
микроорганизмов, КОЕ/г
Содержание
дрожжей и
плесеней,
КОЕ/г
Заключение
о
качестве
1.
2.
3.
3. Дать качественную характеристику микроорганизмов, входящих в состав
представленных образцов заквасок.
Провести качественный анализ представленных образцов заквасок (определить
кислотность, содержание углекислого газа и диацетила) и сделать заключение о роли
входящих в состав заквасок микроорганизмов в формировании качества молочных
продуктов. Результаты оформить в виде таблицы 2.
Методика определения наличия диацетила в кисломолочных продуктах.
Три капли фильтрата закваски смешивают в фарфоровой чашке с тремя каплями
40%-ного раствора КОН. Если в закваске есть ацетоин и диацетил, через 10-15 мин
появляется розовое окрашивание. Окрашивание через 30 минут не учитывается.
Методика определения наличия углекислого газа в кисломолочных продуктах.
В пробирку наливают 20 мл хорошо перемешанной закваски, отмечают ее уровень и
помещают в водяную баню с холодной водой. Температуру воды в бане поднимают до
900С и, не вынимая пробирки из бани, отмечают уровень поднятия сгустка. Если в
закваске есть СО2, сгусток становится губчатым и поднимается над сывороткой на 0,6-3
см и больше. Это указывает на присутствие в закваске ароматобразующих стрептококков
или дрожжей.
Таблица 2-Сравнительная характеристика заквасок
№
пробы
Качественный
состав
микрофлоры
Содержание
Кислотность углекислого
о
Т
газа,
мм
Содержание
диацетила
(+ -)
Роль в
формировании
качества продукта
1.
2.
3.
4. Провести
количественный учет пробиотических
продуктах «Био-Йогурт», «Бифилайф» и «Активия».
микроорганизмов
в
Методика определения наличия бифидобактерий в кисломолочных продуктах.
В асептических условиях отбирается стерильной пипеткой 1 мл продукта, из
которого затем готовят разведения в физрастворе до предполагаемого содержания
микроорганизмов (106-1012). Из соответсвующих разведений делают пересев 1 мл на
питательную среду (гидролизат-молочно-кукурузная среда ГМК, питательный агар и др.)
и ставят в термостат при соответствующей температуре на 24-72 часа. Количественную
оценку проводят визуально, подсчитывая колонии на соответствующем разведении и
промикроскопировав их.
2. Для анализа бактериальных препаратов необходимо определить общее количество
молочнокислых
бактерий. При определение общего количества микроорганизмов
рекомендуются следующие нормы разведения: 1,2,3,4,5.
Количество молочнокислых бактерий проводят чашечным методом и методом
предельных разведений.
Магистранты чашечным методом проводят количественный учет молочнокислых
бактерий. Для этой цели после посева молочнокислых бактерий, чашки Петри заливают
агаром с гидролизованным молоком и мелом. Посевы выдерживают в термостате при
температуре 30˚С в течение 3 суток. Колонии молочнокислых бактерий распознают по
зонам просветления, которые образуются в результате растворения мела молочной
кислотой.
Вопросы для самоконтроля:
1) Что представляет собой заквасочная микрофлора?
2) Какие микроорганизмы относят к контаминантам заквасок?
3) Какие микроорганизмы относятся к термофильным молочнокислым бактериям?
4) Какие микроорганизмы относятся к мезофильным молочнокислым бактериям?
5) Физиолого-биохимические свойства пропионовокислых бактерий?
6) Влияния заквасочных микроорганизмов на качество молочных продуктов.
7) Методы оценки качества заквасок.
8) Требования, предъявляемые СанПин к качеству заквасок.
Лабораторная работа №27,28
Тема: Микрофлора молочнокислых продуктов.
Цель работы: Изучить особенности заквасочной и не заквасочной микрофлоры,
встречающейся в кисломолочных продуктах. Исследовать состав микрофлоры
кисломолочных продуктов, содержащих многокомпонентный симбиоз микроорганизмов.
Задание:
1. Определить в кефире, полученном от разных производителей основные продукты
метаболизма: сумму органических кислот (по титруемой кислотности) и
содержание углекислого газа.
2. Изучить особенности микрофлоры представленных образцов творога и творожных
изделий.
3. Определить соотношение молочнокислых стрептококков и палочек в
представленных образцах сыра.
Материалы и оборудование: 1. Кефир 4 пробы разных производителей по 100 мл,
раствор КОН 40% концентрации, пробирки на 50 мл 4 шт, фарфоровые чашки 4 шт,
фильтры бумажные 4 шт, воронки 4 шт, пипетки градуированные на 1-2 мл – 40 шт,
стерильный физиологический раствор (0,85% NaCl) –300 мл (разлитый в пробирки по 10
мл), молоко стерилизованное подкисленное до значений, рН=4,0-4,5 – 8 пробирок по 10
мл, раствор NаОН 0,1 N концентрации, 1% раствор фенолфталеина, спиртовки, спирт
74%, термостат на 30оС, среда картофельно-лактозная, среда картофельно-сахарозная,
среда КМАФанМ, стерильные чашки Петри 24 шт., баня водяная, творог, полученный от
разных производителей 4 пробы по 50 г, творожные изделия, полученные от разных
производителей 4 пробы по 50 г, сыр 4 пробы по 50 г, пипетки градуированные на 1-2 мл
– 20 шт, стерильный физиологический раствор (0,85% NaCl) – 100 мл (разлитый в
пробирки по 10 мл), среда Кесслер, среда Эндо, петли микробиологические 4 шт,
предметные стекла, смесь спирта и эфира 1:1, микроскопы 4 шт.
Теоретическая часть.
В настоящее время в промышленном масштабе вырабатывается только один
кисломолочный продукт, содержащий многокомпонентную симбиотическую микрофлору
- это кефир.
Кефирные зерна являются примером стойкого симбиоза дрожжей, молочнокислых и
уксуснокислых бактерий. Микрофлора кефира включает до 46 различных штаммов только
молочнокислых микроорганизмов и до 23 штаммов дрожжей. В кефире присутствуют
мезофильные молочнокислые стрептококки – молочный и сливочный, термофильные
молочнокислые палочки и ароматобразующие стрептококки.
Среди дрожжей кефира преобладает группа не сбраживающих лактозу, но
присутствуют также дрожжи сбраживающие лактозу, при чем от последних в большей
степени зависит количество спирта и антибиотическая активность закваски. Соотношение
в кефире дрожжей различных групп зависит от условий культивирования, качества сырья
и времени года.
Уксуснокислые бактерии находятся в кефире в симбиозе с молочнокислыми. Они
используют в качестве источника энергии молочную кислоту и тем самым снижают
кислотность закваски и синтезируют ряд аминокислот и витаминов, в том числе большое
количество витамина В12, что создает благоприятные условия для развития
молочнокислых. Слишком интенсивное развитие уксуснокислых бактерий угнетает
размножение дрожжей и приводит к появлению пороков вкуса, запаха и консистенции,
поэтому необходимо строго контролировать их содержание в кефирной закваске. Среди
кисломолочных молочных продуктов гетероферментативного брожения широкую
известность получили также кумыс, курунга, айран и мацони. Трудность приготовления
данных продуктов в промышленном масштабе заключается в многокомпонентности
микрофлоры.
При изготовлении таких молочных продуктов, как творог, в качестве заквасок
используют молочнокислые и ароматобразующие бактерии. В России при изготовлении
творога применяются в основном мезофильные молочнокислые стрептококки Str. lactis,
Str. сremoris, с добавлением ароматобразующего стрептококка Str. diacetilactis или Str.
acetoinicus. При производстве творога используется также сычужный фермент –
активностью 100000 ед. и хлористый кальций в количестве 0,4 кг на 1 м3 молока.
За рубежом для получения творога используют быстросквашивающие закваски,
которые состоят преимущественно из штаммов Lb. bulgaricus, Lb. lactis, Lb. herveticum
(палочковидные молочнокислые бактерии) и Str.termophilus (шаровидные).
При изготовлении творожных изделий используют творог, вкусовые наполнители
(сахар, ванилин, цукаты, орехи, корицу, кофе, какао, шоколад, изюм, джем, варенье,
повидло, соль, томат, укроп, тмин, перец и т. п.). Особую группу составляют творожные
изделия, предназначенные для детского питания, а также включающие фруктовые,
карамельные, растительные и другие добавки, к которым предъявляются особые
санитарногигиенические требования. Белковые продукты содержат большое количество
влаги, в связи с чем являются хорошей питательной для развития посторонней
микрофлоры и в т.ч. БГКП.
Сыры вырабатывают с использованием чистых и смешанных культур
молочнокислых бактерий, пропионовокислых бактерий, микроорганизмов сырной слизи и
плесневых грибов. Для обеспечения условий формирования качественного состава
микрофлоры сыра молоко подвергают бродильной и сычужно-бродильной пробам,
позволяющим по характеру сгустка судить о присутствии различных групп
микроорганизмов в молоке.
Основные биотехнологические превращения происходят при созревании сыров.
Созревание – очень сложный многоэтапный процесс, на который оказывают влияние вид
использованных культур, качество сырья, соблюдение технологических и санитарногигиенических требований при производстве.
Процессы созревания в химическом отношении весьма многообразны. В молодом
сыре весь азот входит в состав нерастворимого белка, но по мере созревания сыра белок
расщепляется на растворимые пептиды, а далее на свободные аминокислоты (протеолиз),
интенсивность этого процесса зависит от протеолитической активности микрофлоры.
В некоторых сырах расщепление белка ограничено: в твердых сырах в растворимые
продукты превращаются всего 25-35 % белка, в мягких практически весь белок. Помимо
изменений в белковых компонентах, при созревании происходит гидролиз значительной
части жира (липолиз) при этом основную роль играют липолитические ферменты
содержащихся в сыре микроорганизмов.
Некоторые микроорганизмы играют весьма специфическую роль в созревании
определенных сортов сыра. Синяя и зеленоватая окраска и неповторимый вкус Рокфора
обусловлены ростом в толще сыра плесени Penicillium rogueforti. Иногда при созревании
сыров, созревающих под действием плесени, используют бесцветный мутант Pen.
rogueforti, чтобы учесть запросы тех потребителей, которым нравится вкус, но неприятна
окраска сыра.
Практическая часть
1. Определить в кефире, полученном от разных производителей основные
продукты метаболизма: сумму органических кислот (по титруемой
кислотности) и содержание углекислого газа.
Количество углекислого газа в кефире необходимо определить следующим образом.
В пробирку наливают 20 мл хорошо перемешанной закваски, отмечают ее уровень и
помещают в водяную баню с холодной водой. Температуру воды в бане поднимают до
900С и, не вынимая пробирки из бани, отмечают уровень поднятия сгустка. Если в
закваске есть СО2, сгусток становится губчатым и поднимается над сывороткой на 0,6-3
см и больше. Это указывает на присутствие в закваске ароматобразующих стрептококков
или дрожжей.
Кислотность определяют согласно ГОСТ 3624-92.
2. Изучить особенности микрофлоры представленных образцов творога и
творожных изделий.
Микроскопирование творога проводят приготовлением препарата «отпечаток». Для
чего берут щупом пробу из потребительской упаковки творога, прижимают к продукту
предметное стекло, далее его высушивают, окрашивают метиленовым синим и
просматривают в иммерсионном объективе. Результаты микроскопирования зарисовать.
Сделать вывод о качестве продукта и наличии посторонней микрофлоры.
3. Определить соотношение молочнокислых стрептококков и палочек в
представленных образцах сыра.
Произвести отбор проб сыра согласно ГОСТ 9225-84 и приготовить
микроскопический препарат. Для чего из щупа берут 10 г сыра, отрезают тонкий кусочек
стерильным ножом, сдавливают между двумя предметными стеклами, затем стекла
разнимают и оставшийся на них мазок-отпечаток фиксируют спиртом, обезжиривают
эфиром и красят. Результаты исследований отразить в виде рисунка микрокартины после
проведения испытаний. Сделать вывод о соответствии состава микрофлоры испытуемого
образца сыра требованиям НД.
Вопросы для самоконтроля:
1) Какими факторами определяется микрофлора кисломолочных продуктов?
2) На какие группы делится современный ассортимент кисломолочных продуктов.
3) Как влияют продукты метаболизма на качество кефира?
5) Лечебно-профилактические свойства ацидофильных молочнокислых бактерий.
6) Что такое пробиотики?
7) Какие микроорганизмы можно отнести к пробиотикам?
Лабораторная работа №29,30
Тема: Лекарственные и профилактические биологические препараты.
Цель работы: Ознакомить магистрантов с биологическими перпаратами микробного
происхождения.
Задание:
1. Изучить общую характеристику препаратов микробного синтеза.
2. Изучить основу технологии препаратов микробного синтеза.
3. Изучить классификацию препаратов микробного синтеза.
Теоретическая часть.
Микробиологический синтез – в настоящее время весьма перспективный и
экономически выгодный способ получения многих биологических препаратов. Одна из
важных задач микробиологического синтеза биологически активных веществ – получение
высокоактивных штаммов – продуцентов, в частности, с использованием методов генной
инженерии.
Одним из наиболее важных научных положений микробиологического синтеза
аминокислот считается вопрос об их происхождении: находящиеся в среде аминокислоты
– продукты ферментативного распада белков в результате автолитического процесса или
результат синтеза из других соединений. При использовании синтетических сред для
культивирования продуцентов достаточно определенно показано, что аминокислоты,
обнаруживаемые в среде, представляют собой продукты синтеза de novo.
Для получения витамина В12 бактерии культивируют периодическим методом в
анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и
сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором
щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду вносят
предшественник – 5,6-ДМБ.
Многообразно применение ферментных препаратов в медицине. Их используют для
растворения тромбов, лечения наследственных заболеваний (вместо отсутствующих
эндогенных ферментов), удаления нежизнеспособных, денатурированных структур,
клеточных и тканевых фрагментов, освобождения организма от токсических веществ.
Яркий пример-спасение жизни больных с тромбозом конечностей, легких, коронарных
сосудов сердца при помощи тромболитических ферментов (стрептокиназы, урокиназы).
Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на
инфицирование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия
интерферонов до конца не выяснен. Предполагается, в частности, что интерфероны
препятствуют проникновению вирусных частиц в клетку. Интерфероны стимулируют
деятельность иммунной системы и препятствуют размножению клеток раковых опухолей.
Все аспекты действия интерферонов важны с точки зрения их терапевтического
применения.
Практическая часть
1.
2.
3.
Изучить основные технологические процессы при изготовлении препаратов
микробного синтеза.
Зарисовать схемы биотехнологического производства лекарственных
препаратов.
Зарисовать схему биотехнологического производства профилактических
препаратов.
Вопросы для самоконтроля:
1.
2.
3.
Перечислите
основные
лекарственные
препараты,
получаемые
биотехнологическим путем.
Какие
профилактические
биологические
препараты
получают
биотехнологическим путем?
Приведите схемы производства.
Скачать

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ