На правах рукописи БУТ СЕРГЕЙ ЮРЬЕВИЧ ГЕНЫ И ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА САХАРОЗЫ
advertisement
На правах рукописи БУТ СЕРГЕЙ ЮРЬЕВИЧ ГЕНЫ И ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА САХАРОЗЫ У ГАЛОТОЛЕРАНТНОГО МЕТАНОТРОФА METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино – 2013 1 Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук Научный руководитель: Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Троценко Юрий Александрович Дедыш Светлана Николаевна доктор биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, зав. лабораторией Ивановский Руслан Николаевич доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ведущий научный сотрудник Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Защита состоится «28» марта 2013г. в 10:00 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук по адресу: Московская область, г. Пущино, проспект Науки, д.5, ИБФМ РАН, 142290. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФМ РАН. Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak.ed.gov.ru и на сайте Института www.ibpm.ru. Автореферат разослан «27» марта 2013 г. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Н.В. Васильева 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Сахароза - один из основных природных продуктов. Являясь ключевым углеводом растений и цианобактерий, сахароза может синтезироваться двумя путями: с помощью последовательного действия сахарозофосфатсинтазы (SPS) и сахарозофосфатфосфатазы (SPP) с образованием интермедиата сахарозо-6-фосфата или напрямую, под действием сахарозосинтазы (SuS), которая также участвует в деградации этого дисахарида. В участвующие в настоящее время выделены и синтезе сахарозы у высших охарактеризованы ферменты, растений и цианобактерий – сахарозофосфатсинтаза, сахарозофосфатфосфатаза и сахарозосинтаза [Lunn, MacRae, 2003; Hagemann, 2011]. Биосинтез сахарозы - довольно редкое явление у протеобактерий, реализуется у галофильных аэробных метилотрофов с рибулозомонофосфатным (РМФ) путем С 1ассимиляции [Khmelenina et al., 1999; Троценко, Хмеленина, 2008], а гомологи генов биосинтеза сахарозы найдены также в геномах хемоавтотрофов Nitrosomonas europaea, Magnetococcus sp. MC-1, Acidithiobacillus ferrooxidans [Norton et al., 2008]. Однако распространение пути биосинтеза сахарозы и функциональная роль дисахарида в клетках метилотрофов и других протеобактерий не исследованы. Априорно сахарозе отводится роль запасного соединения, накопление которого при различных стрессовых воздействиях указывает на защитную функцию, аналогичную таковой, показанной для трегалозы [Lunn, 2002]. Так, выживаемость клеток Escherichia coli, несущих ген сахарозофосфатсинтазы, возрастала в 104 раз [Billi et al., 2000]. Недавно показано, что сахароза выполняет функцию термопротектора у умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12 [Медведкова и др., 2007]. Однако до сих пор гены и ферменты биосинтеза сахарозы не охарактеризованы ни у одного представителя протеобактерий. Пути метаболизма сахарозы изучены лишь у не синтезирующих сахарозу гетеротрофов, но использующих ее в качестве ростового субстрата - Zymomonas mobilis [Zembrzuski et al., 1992], Lactococcus lactis [Thompson et al., 1991] и E. сoli [Sigrell et al., 1998]. У этих бактерий гены, кодирующие ферменты метаболизма сахарозы, локализованы в кластерах, включающих также гены транспортных белков [Reid, Abratt, 2005]. В связи с вышеизложенным, представлялось актуальным исследовать гены и ферменты метаболизма сахарозы у протеобактерий на примере галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Цель и задачи исследования. Цель данной работы – определение путей метаболизма сахарозы у модельного галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи: 3 1. Идентификация генов, участвующих в метаболизме сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. 2. Очистка и характеристика рекомбинантных сахарозофосфатфосфатазы, амилосахаразы и фруктокиназы из Mm. alcaliphilum 20Z. 3. Получение и фенотипическая характеристика мутантов по генам sps и ectBC. 4. Изучение распространенности и филогенетический анализ генов метаболизма сахарозы у прокариот. Научная новизна. Гены четерыхгенные кластеры, протеобактерий (хемоавтотрофов метаболизма обнаружены и у сахарозы, организованные в трех- и различных метилотрофных групп микроорганизмов бактерий) и – цианобактерий. Филогенетический анализ показал, что данные кластеры были приобретены путем горизонтального переноса генов. Установлено, что сахароза выполняет роль осмопротектора у Mm. alcaliphilum 20Z. Получен мутантный штамм, дефектный по генам биосинтеза эктоина ectB и ectC, который накапливает в 8 раз больше сахарозы по сравнению с исходным штаммом. Также получен мутант по гену sps, не способный синтезировать сахарозу, что подтверждает ключевую роль сахарозофосфатсинтазы в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. Впервые у протеобактерий очищены до электрофоретической гомогенности и охарактеризованы рекомбинантные сахарозофосфатфосфатаза, амилосахараза и фруктокиназа. Доказана котранскрипция генов ams и fruK, что подтверждает участие фруктокиназы в реутилизации фруктозы, образующейся при деградации эндогенной сахарозы. Научно-практическое значение. Благодаря высокой активности, стабильности и строгой специфичности к фруктозе препарат очищенной рекомбинантной фруктокиназы может использоваться в биохимических исследованиях в качестве сопрягающего фермента, а также для аналитического определения фруктозы. Мутант с инактивированным геном sps при выращивании на среде с высоким содержанием NaCl имеет больший, по сравнению с родительским штаммом, выход мультифункционального биопротектора эктоина, что может найти практическое применение. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2010-2012гг), на XV и XVI Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011-2012 гг), на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011» (Тула, 2011 гг), на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2011-2012 гг). Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы 4 «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398). Работа была поддержана грантами РФФИ №10-04-01224-а, 11-04-97544р_центр_а. Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 5 тезисов. Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н., с.н.с. Решетникову А.С., к.б.н. Розовой О.Н., к.б.н., н.с. Мустахимову И.И., к.б.н., н.с. Федорову Д.Н., к.т.н., с.н.с. Ежову В.А. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям ― д.б.н., в.н.с. Хмелениной В.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 113 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 212 ссылок, из них 8 на русском и 204 на английском языках, содержит 9 таблиц и 44 рисунка. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследования служила чистая культура облигатного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z ВКМ B-2133 [Khmelenina et al., 1997]. Клетки выращивали на среде “2П” [Хмеленина и соавт., 1997], содержащей различные концентрации NaCl, в атмосфере метана и воздуха (1:1) или в присутствии 0,5 или 5% метанола. Перед засевом в среду вносили стерильный раствор 1 М NaHCO3 (5 мл на 100 мл среды). Штаммы Escherichia coli Top 10, S-17-1 и Rosetta (DE3) выращивали при 37оС на жидкой или агаризованной средах “LB”, добавляя, при необходимости, селективные антибиотики (канамицин – 50 мкг/мл, тетрациклин – 10 мкг/мл, хлорамфеникол – 25 мкг/мл, ампициллин – 100 мкг/мл). Молекулярно-биологические методы. ДНК выделяли модифицированным методом [Marmur, 1961]. Выделение плазмид, рестрикцию, лигирование, получение компетентных клеток и их трансформацию проводили стандартными методами [Sambrook, Russell, 2001]. Тотальную РНК выделяли модифицированным методом [Chomczynski, Sacchi, 1987]. Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00 и VectorNTI®Advance v.9.0. Аминокислотные последовательности выравнивали посредством программы ClustalX (v1.62b) [Thompson et al., 1997]. Филогенетический анализ проводили, используя пакет программ MEGA4, модель Maximum Parsimony [Tamura et al., 2007]. Клонирование и экспрессия генов. Гены sps, spp, fruK и ams амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в векторах pET30a+, pET28b или pET22b+. Полученными рекомбинантными плазмидами pETsps, pETspp, pETfruK или 5 pETams трансформировали компетентные клетки E. coli Rosetta (DE3). Экспрессию генов в E. coli индуцировали добавлением изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозида (ИПТГ). Рекомбинантные ферменты SPS-His6, SPP-His6, FruK-His6 и Ams-His6 очищали металлхелатной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA-агарозой, согласно протоколу фирмы “Qiuagen” (Германия). Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц белков определяли электрофорезом в 8-12%-ном SDS-ПААГ по методу Лэммли [Laemmli, 1970]. Нативные молекулярные массы градиентного 4-30% ПААГ (м.м.) ферментов определяли с помощью электрофореза. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [Schacterle, Pollack, 1973]. Характеристика сахарозофосфатфосфатазы. Активность SPP определяли по образованию неорганического фосфата двумя методами: непрерывно (с сопрягающими ферментами пирофосфат-зависимой 6-фосфофруктокиназой, фруктозофосфатизомеразой и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой) или периодически, используя реактив Бенцини [Bencini et al., 1983] при 35оС и рН 6,5. Для определения оптимума рН использовали следующие буферы: Na-цитратный (pH 5.0–6.0), MES-KOH (pH 6.0–7.0), Трис-HCl (pH 7.5–9.0) и Naкарбонатный (pH 9.0–10.0). Значения Km и Vmax рассчитывали с помощью программы SigmaPlot 10. Характеристика амилосахаразы. Общую активность амилосахаразы определяли по скорости образования фруктозы, с помощью сопрягающих ферментов – фруктокиназы, фруктозофосфатизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Гидролитическую активность измеряли по скорости образования глюкозы, используя сопрягающие ферменты – гексокиназу и глюкозофосфатдегидрогеназу. Трансгликозилирующую активность рассчитывали как разность общей и гидролитической активности. Измерения проводили при 30оС и рН 8,0. При необходимости в реакционную смесь добавляли гликоген в конечной концентрации 0,1 мг/мл. Для определения оптимума рН использовали следующие буферы: MES-KOH (pH 6.0–7.0), TAPS-KOH (pH 7.5–9.0) и Na-карбонатный (pH 9.0–10.0). Для определения термостабильности фермента аликвоты преинкубировали в микропробирках от 5 мин до 1 ч при 30, 40, 50 или 60°С, быстро переносили в лед, затем измеряли остаточную активность фермента при 30°С. Характеристика фруктокиназы. Активность FruK определяли с помощью сопрягающих ферментов – фруктозофосфатизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Влияние рН на активность FruK изучали с использованием следующих буферов (50 мМ): MES-KOH (pH 6,0–7,0), K-фосфатный (pH 6,5–5,5), Трис-HCl (pH 8,0–9,0) и Na-карбонатный (pH 9,0–10,5). Для определения термостабильности FruK аликвоту фермента преинкубировали от 5 мин до 1 ч при 30–60°С, быстро переносили в лед, затем измеряли остаточную активность фермента при 30°С. 6 За единицу активности ферментов принимали количество белка, катализирующее превращение 1 мкмоль субстрата в минуту. Получение нокаут-мутантов. Фрагменты ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности, фланкирующие гены sps, ams, ectB и ectC, клонировали в суицидальном векторе pCM184. В результате были получены векторы pCMsps, pCMams и pCMectBC. Для коньюгации в Mm. alcaliphilum 20Z использовали штамм-донор E. coli S17-1, который предварительно трансформировали соответствующей плазмидой. Трансконъюганты отбирали по устойчивости к канамицину и чувствительности к тетрациклину. Выделение и анализ осмопротекторов. Низкомолекулярные органические осмопротекторы экстрагировали из клеток метанолом. Содержание сахарозы определяли антроновым методом [Handel, 1968]. Для количественного определения эктоина использовали модифицированный метод ВЭЖХ [Ешинимаев с соавт., 2007]. Все измерения были проведены в трех повторностях, на рисунках и в таблицах представлены средние значения и стандартные отклонения. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение физиологической роли сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. При росте Mm. alcaliphilum 20Z на метане или в присутствии метанола содержание сахарозы в клетках возрастало с увеличением солености среды (рис. 1). Выявленная зависимость накопления сахарозы от внешней солености удовлетворяет определению осмопротектора. Ранее было выдвинуто предположение, что процесс биосинтеза сахарозы у галофильных/толерантных метанотрофов может служить механизмом стока избыточного формальдегида, 25 накапливающегося 1%NaCl 3%NaCl 5%NaCl мкг/мг клеток 20 высоких в среде концентрациях в при экспоненциальном росте клеток на метаноле [Ешинимаев с соавт., 15 2002]. 10 Рис. 1. Накопление сахарозы клетками 5 Mm. alcaliphilum 20Z. 0 метан метанол, 0,5% метанол, 5% 7 Однако, при замене метана на метанол (0,5% по объему) в среде культивирования, внутриклеточное содержание сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z не возрастало, а в клетках, выращенных в среде с низкой соленостью в присутствии 5% метанола, уровень дисахарида уменьшался (рис. 1). Содержание сахарозы в клетках, растущих в присутствии 5% NaCl (0,855М), достигает 14-18 мкг/(мг биомассы), в пересчете на внутриклеточную воду это соответствует приблизительно 50 мМ, что недостаточно для уравновешивания осмотического давления среды. Вместе с тем известно, что при той же солености Mm. alcaliphilum 20Z накапливал эктоин в концентрации около 700 мМ [Khmelenina et al., 1999]. Логично предположить, что у данного метанотрофа сахароза является дополнительным к эктоину осмопротектором. Хромосома 20Z ectA lp-ectBC-F ectB lp-ectBC-R ectC ask pp-ectBC-F pp-ectBC-R Cуицидальный вектор pCM184 ectB R ectC Km рекомбинация Хромосома ΔectBC ectA ectB R Km ectC pcmKm ask pp-ectBC-R Рис. 2. Схема инактивации генов ectB и ectC и расположение праймеров. Для подтверждения осмопротекторной функции сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z, с помощью двойной гомологичной рекомбинации нами был получен штамм ΔectBC с делецией по генам ectB и ectC, кодирующим, соответственно, ферменты биосинтеза эктоина – диаминобутиратаминотрансферазу и эктоинсинтазу (Рис. 2). 160 20Z 140 мкг/мг клеток 120 ΔectBC 100 80 60 40 20 0 1% NaCl 3%NaCl 5%NaCl Рис. 3. Накопление сахарозы клетками штаммов 20Z и ΔectBC, выращенных при различных концентрациях NaCl. В клетках штаммов 20Z и ΔectBC, выращенных в среде с метанолом (0,5% по объему) при различной солености, определяли содержание эктоина и сахарозы. Анализ показал, что мутантный штамм ΔectBC не накапливал эктоин, однако концентрация сахарозы в клетках мутанта была в ~8 раз выше, чем в клетках дикого типа (Рис. 3). Ранее близкие результаты были получены для мутантного штамма Synechocystis sp. PCC 6803, дефектного по гену АДФ-глюкопирофосфорилазы и неспособного синтезировать основной осмопротектор – гликозилглицерин. Содержание сахарозы у мутанта было в 29 раз выше, по сравнению с диким типом, и соизмеримо с уровнем гликозилглицерина у дикого штамма [Miao et al., 2002]. Это указывает на присутствие у галотолерантных организмов компенсаторных механизмов, позволяющих восполнять недостаток одного осмопротектора за счет увеличения концентрации другого. 2. Идентификация и филогенетический анализ генов метаболизма сахарозы В недавно опубликованном частично аннотированном геноме Mm. alcaliphilum 20Z (http://www.genoscope.cns.fr/externe/English/corps_anglais.html) обнаружен локус из 4 генов, продукты которых, предположительно, участвуют в метаболизме сахарозы. Транслированные аминокислотные последовательности этих генов проявляли гомологию с сахарозофосфатсинтазами (SPS), сахарозофосфатфосфатазами (SPP), сахарокиназами pfkBсемейства и амилосахаразами (Ams). Предполагаемая сахарозофосфатсинтаза Mm. alcaliphilum 20Z проявляла наибольшее сходство с ранее охарактеризованными ферментами из цианобактерий Synechocystis PCC 6803 [Lunn et al., 2003], Synechococcus sp. 7002 [Cumino et al., 2010] и Prochlorococcus marinus [Lutfiyya et al., 2007] (соответственно 56,8; 53,1 и 42% идентичности транслированных аминокислотных последовательностей). Значительно меньшее сходство обнаружено с сахарозофосфатсинтазами таких растений, как Nicotiana tabacum [Lutfiyya et al., 2007], Arabidopsis thaliana [Park et al., 2008] и Zea mays [Bruneau et al., 1991] (29; 28,9 и 28,4% идентичности), и SPS галотермофильной анаэробной бактерии Halothermothrix orenii (20,9% идентичности) [Huynh et al., 2005]. Продукт второго гена был гомологичен сахарозофосфатфосфатазе из Synechococcus sp. 7002 [Cumino et al., 2010] (49,8% идентичности), однако имел лишь незначительное сходство с SPP Zea mays и N. tabacum (15,9 и 16, 7 % идентичности) [Lunn et al., 2000; Chen et al., 2005]. Открытая рамка считывания (ОРС), следующая за предполагаемым геном сахарозофосфатфосфатазы, кодировала белок, сходный с сахарокиназами pfkB-семейства. Данное семейство включает АТР-зависимые ферменты: рибокиназу, кетогексокиназу, фруктокиназу, 2-дегидро-3-дезоксиглюкокиназу, 1-фосфофруктокиназу, тагатозокиназу, 69 фосфофруктокиназу архей, а также минорную 6-фосфофруктокиназу (PfkB) E. coli [Bork et al., 1993; Sigrell et al., 1997]. Продукт четвертой ОРС данного кластера был аннотирован в геноме изучаемого метанотрофа как α-амилаза, однако имел наиболее высокую гомологию с охарактеризованными амилосахаразами гетеротрофных бактерий: Alteromonas macleodii [Ha et al., 2009], Neisseria polysaccharea [De Montalk et al., 1999], Deinococcus geothermalis [Jung et al., 2009] и Deinococcus radiodurans [Pizzut-Serin et al., 2005] (39,4; 38,5; 37,6 и 36,7% идентичности соответственно). Идентичные кластеры генов, кодирующих предполагаемые ферменты метаболизма сахарозы (sps-spp-pfkB-ams), обнаружены нами у других представителей метанотрофов (Methylomicrobium album BG8 и Methylobacter tundripaludum SV96), а также у не растущих на метане метилобактерий (Methylophaga aminisulfidivorans MP и Methylophaga thiooxydans DMS010). У Methylomonas methanica MC09, в отличие от других метанотрофов, ген амилосахаразы расположен дистантно, т.е. отдельно на хромосоме. Кроме того, кластеры sps-spp-pfkB-ams обнаружены у цианобактерии Synechococcus sp. 7002 PCC и хемоавтотрофных протеобактерий (Mariprofundus ferrooxydans PV-1, Thiocapsa marina 5811, Thiomicrospira crunogena XL-1 и Marichromatium purpuratum 984 (Рис. 4). Mm. alcaliphilum 20Z, Methylobacter tundripaludum SV96, sps spp fruK ams spp ams Mm. album BG8, Methylophaga aminisulfidivorans MP, Mariprofundus ferrooxydans PV-1, Synechococcus sp. PCC 7002, Thiocapsa marina 5811, Thiomicrospira crunogena XL-1, Marichromatium purpuratum 984 fruK sps fruK sps Desulfomicrobium baculatum DSM 4028 Methylobacillus flagellatus KT, Methylovorus sp. SIP3-4, ams Nitrosomonas sp. AL212 sps spp Methylomonas methanica MC09, fruK Allochromatium vinosum DSM180 fruK sps sus Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC_53993, N. oceani ATCC 19707, N. halophilus Nc4, N. multiformis ATCC 25196 Рис. 4. Структура кластеров генов, кодирующих предполагаемые ферменты метаболизма сахарозы у метилотрофов, хемоавтотрофов и цианобактерий. 10 У некоторых бактерий структура генного кластера метаболизма сахарозы отличалась от таковой Mm. alcaliphilum 20Z. Так, у галофильных аммоний-окисляющих Nitrosococcus halophilus Nc4 и Nitrosococcus oceani ATCC 19707 гены spp располагаются отдельно на хромосоме, хотя сахарозофосфатфосфатазы этих бактерий филогенетически близки ферменту из Mm. alcaliphilum 20Z (41,3% и 40,1% идентичности, соответственно). Более того, в хромосоме метилобактерий Mb. flagellatus KT и Methylovorus sp. SIP3-4, а также у хемовтотрофов A. ferrooxidans ATCC_53993 и Nitrosospira multiformis ATCC 25196 отсутствует ген spp. Интересно, что С-концевой домен как растительных, так и большинства цианобактериальных сахарозофосфатсинтаз гомологичен сахарозофосфатфосфатазе [Cumino et al., 2002; Lunn, 2002; Lunn and MacRae, 2003]. На этом основании предположено, что фермент может катализировать как синтазную, так и фосфатазную реакции [Lunn, 2002]. Итак, анализ доступных в геномов Database микроорганизмов выявил у хемоавтотрофных и метилотрофных бактерий присутствие генов, продукты которых проявляют гомологию с ферментами биосинтеза и реутилизации сахарозы, и которые, как правило, локализованы в трех- или четырехгенном кластерах. Однако гены и ферменты метаболизма сахарозы у протеобактерий не изучались. К настоящему времени охарактеризованы только сахарозофосфатсинтазы и сахарозофосфатфосфатазы некоторых растений и цианобактерий, а ферменты утилизации экзогенной сахарозы – только у бактерий, использующих дисахарид в качестве ростового субстрата. В этой связи представлялось интересным определить функциональность генов кластера sps-spp-pfkB-ams у Mm. alcaliphilum 20Z, выделить и охарактеризовать соответствующие ферменты. 3. Определение функциональной роли гена сахарофосфатсинтазы (sps) Ген sps (GenBank CCE22309.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в векторе pET30a+, далее рекомбинантной плазмидой pETsps трансформировали компетентные клетки E. coli Rosetta (DE3). Экспрессию рекомбинантного белка SPS-His6 индуцировали добавлением ИПТГ. Фермент был очищен из лизата клеток E. coli до электрофоретически гомогенного состояния методом аффинной металл-хелатной хроматографии на колонке с Ni2+-NTA-агарозой. Однако полученный препарат фермента был неактивен. Для определения функциональной роли sps нами был получен мутант с инсерцией канамициновой кассеты в данном гене по схеме мутагенеза, аналогичной таковой для конструирования мутанта ectBC- (Рис. 2). В клетках мутанта, выращенных на метаноле (0,5% по объему) при различной солености среды, определяли содержание сахарозы. Обнаружено, что полученный мутант не накапливал сахарозу. Это свидетельствовало о ключевой роли продукта гена sps в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z, а также о 11 том, что у данного метанотрофа функционирует единственный путь синтеза сахарозы с участием сахарозофосфатсинтазы. 4. Характеристика рекомбинантой сахарозофосфатфосфатазы (SPP). Ген spp (GenBank CCE22310.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 1 и клонировли в вектор pET28b. Фермент, экспрессированный в клетках E. coli Rossetta 20Z (DE3), очищали аффинной металл-хелатной хроматографией до электрофоретически гомогенного состояния. Согласно данным ДСН-ПААГЭ, электрофоретическая подвижность белка соответствовала м.м. ~35 кДа (Рис. 5А), что согласуется с теоретически рассчитанной м.м. (32,7 кДа). Нативный электрофорез в ПААГ с градиентом пористости выявил несколько белковых полос с м.м. примерно 35, 70, 150 и 210 кДа, что указывает на возможность существования фермента одновременно в форме мономера, димера, тетрамера и гексамера (Рис. 5Б) A М М 118 кДа 90 кДа 2 3 4 5 Б Рис. 5. 12% ДСН-ПААГ 669кДа электрофорез (А) и 440 кДа 232 кДа нативный градиентный 4- 48 кДа 30% ПААГЭ 36 кДа рекомбинантной SPP. 1, 2, 3, 27 кДа 4, 5, – 5, 10, 20 и 40 мкг SPP 67 кДа соответственно, М – 20 кДа 35кДа молекулярные маркеры. Рекомбинантный фермент катализировал гидролиз сахарозо-6-фосфата до сахарозы и неорганического фосфата. Наибольшую активность сахарозофосфатфосфатаза проявляла при 35ºС и рН 6,5 (Табл.1). Интересно отметить, что оптимумы работы SPP не совпадали с оптимальными условиями роста штамма 20Z (рН 9 и 30oC), но близки таковым у сахарозофосфатфосфатаз из других организмов (Табл. 1). Возможно, это объясняется приобретением генов синтеза сахарозы путем горизонтального переноса от мезофилов. Зависимость активности SPP от концентрации сахарозо-6-фосфата соответствовала классическому уравнению Михаэлиса-Ментен (Vmax = 18,9±0,6; Km = 36±4 мкМ). Активность сахарофосфатфосфатазы незначительно ингибировалась сахарозой (Ki = 1±0,6 М). Данная константа ингибирования гораздо выше, чем у других охарактеризованных SPP. Повидимому, эта особенность фермента из Mm. alcaliphilum 20Z обусловлена необходимостью поддержания высокой внутриклеточной концентрации сахарозы. 12 Таблица. 1. Свойства некоторых сахарозофосфатфосфатаз Mm. Synechocystis Anabaena sp. Oryza Параметры alcaliphilum sp.PCC 6803 PCC 7120 sativa 20Z Молекулярная масса 32,7 27 28 50 субъединицы, кДа мономер, Субъединичная димер, мономер мономер димер структура тетрамер, гексамер pH оптимум 6,5 6,8 6,5 6,5 Температурный 35 оптимум (oC) Km (мМ) 0,036 0,0075 0,35 0,065 Vmax (Е/мг) 18,9 46 15,7 1250 Ki (сахароза) (мМ) 1000 161 80 Данная [Cumino et [Lunn et Ссылка [Lunn, 2002] работа al., 2001] al., 2000] Pisum sativum 55 димер 6,8 0,25 [Whitaker, 1984] 5. Характеристика рекомбинантой амилосахаразы (Ams). Ген ams (GenBank CCE22312.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в вектор pET30a+. Рекомбинантный фермент Ams-His6 экспрессировали в клетках E. coli Rossetta (DE3), очищали аффинной металл-хелатной хроматографией до электрофоретически гомогенного состояния. Электрофоретическая подвижность белка в ДСН-ПААГ соответствовала ~75 кДа (Рис. 6А), что согласуется с расчетной м.м. (76,7 кДа). Нативный электрофорез в градиенте ПААГ (4-30%) выявил единственную полосу с м.м. около 70 кДа (Рис. 6Б), что свидетельствует о мономерной форме фермента. А М Б М Рис. 6. 8% ДСН-ПААГ 94,6 кДа 669 кДа электрофорез (А) и нативный градиентный 4- 66,2 кДа 440 кДа 232 кДа 30% ПААГЭ рекомбинантной 67 кДа амилосахаразы. 45,0 кДа 35 кДа Аналогично другим описанным амилосахаразам, рекомбинантная Ams из Mm. alcaliphilum 20Z катализировала одновременно гидролиз сахарозы до фруктозы и глюкозы, а также трансгликозилирование с переносом глюкопиранозного остатка сахарозы на 13 полигликан [van der Veen et al., 2006; Pizzut-Serin et al., 2005; Jung et al., 2009; Ha et al., 2009]. Фермент проявлял максимальную активность при 30oC и рН 8,0, что согласуется с экофизиологическими параметрами, оптимальными для роста Mm. alcaliphilum 20Z. Зависимость активности рекомбинантной амилосахаразы Mm. alcaliphilum 20Z от концентрации сахарозы подчинялась классической кинетике Михаэлиса-Ментен (Рис. 7), в отличие от ранее описанных Ams из Neisseria polysaccharea [De Montalk et al., 2000] и Deinococcus radiodurans [Pizzut-Serin et al., 2005]. Амилосахаразы этих гетеротрофных бактерий имели два плато на кривой зависимости активности от концентрации сахарозы и, соответственно, по два значения Vmax и Km (Табл. 3). У амилосахаразы из N. polysaccharea и D. radiodurans имеется дополнительный сайт связывания сахарозы (SB2), наличие которого, по-видимому, обуславливает необычные кинетические свойства фермента [Skov et al., 2002]. Выравнивание аминокислотных последовательностей амилосахараз показало, что у Ams из Mm. alcaliphilum 20Z в позиции, соответствующей Gln445 и Tyr446 в SB2 сайте N. polysaccharea, находятся метионин и аргинин (Рис. 7), что, вероятно, делает дополнительный субстрат-связывающий сайт нефункциональным. Mm.alcaliphilum Mm.album Methylovorus Mb.flagellatus Mp.aminisulfidivorans Synechococcus sp.7002 T.crunogena N.polysaccharea N.subflava D.geothermalis D.radiodurans : DSIASGVPFMRNEKTGDARIAGSLA : HSPARGLVFMRNDETGDARICGSLA : DSIARGVAFGRNDKTGDARISGSLA : GSTATGVAFGVNPKTGDARISGSLA : HSHARGLPFGENEKTGDARISGSLA : DT-SRGLEFMRNDSTGDARICGSLA : ESHARGLPFGENAKTGDARISGSLA :GSFARGVPFQYNPSTGDCRVSGTAA : GSFARGVPFQYNPSTGDCRVSGTAA : GSFARGLVFQYNPVNGDRRISGSAA : GSFARGLVFQHHPQTGDRRISGTAA : : : : : : : : : : : Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей амилосахараз. Рамкой обозначены аминокислоты, участвующие в связывании сахарозы в дополнительном субстрат-связывающем сайте амилосахаразы из N. polysaccharea [Skov et al., 2002]. Амилосахараза имела более высокое сродство к сахарозе в реакции трансгликозилирования (табл. 2), однако при введении в реакционную смесь затравки гликогена кажущаяся Km для сахарозы как в реакции гидролиза, так и в реакции трансгликозилирования была одинакова. Кроме того, добавление гликогена увеличивало скорость трансгликозилирования, при этом скорость гидролиза сахарозы не изменялась. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что основной функцией амилосахаразы является перевод избыточного количества эндогенной сахарозы Mm. alcaliphilum 20Z в полигликаны типа гликогена. 14 Таблица 2. Кинетические параметры рекомбинантной амилосахаразы Mm. alcaliphilum 20Z. Реакция Без добавления гликогена В присутствии 0,1 мг/мл гликогена Kmкаж, мМ Vmax, нмоль/(мин*мг) Vmax, Kmкаж, мМ нмоль/(мин*мг) Трансгликозилирование 60±2 6±1 98±1 11,2±0,8 Гидролиз 53±1 11±1 51±1 12±1 6. Получение инсерционного мутанта по гену ams Методом двойной гомологичной рекомбинации был получен мутант с инсерцией канамициновой кассеты в гене ams. 25 20Z мкг/мг клеток 20 Δams 15 10 5 0 1% NaCl 3%NaCl 5%NaCl Рис. 8. Накопление сахарозы клетками штаммов 20Z и Δams, выращенных при различном содержании NaCl в среде. Полученный мутант и штамм дикого типа выращивали на метаноле (0,5% по объему) при различных концентрациях NaCl. В клетках мутанта обнаружено примерно в 1,3 раза больше сахарозы, по сравнению с исходным штаммом (Рис. 8), что подтверждает участие амилосахаразы в деградации эндогенной сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. 15 Таблица 3. Свойства некоторых амилосахараз прокариот. Параметр Mm. alcaliphilum Субъединичная структура мономер (1×76 кДа) pH оптимум Температурный оптимум,oC Neisseria polysaccharea Deinococcus Deinococcus radiodurans geothermalis Alteromonas addita мономер (1×70 кДа) 8,0 6,0 7,0 30 42 36 8,1 (11,3)* 4,0 ([сахароза] < 20 мМ) 10 ([сахароза] < 41 мМ) 71 ([сахароза] > 20 мМ) 84 ([сахароза] > 41 мМ) 7,0 (Гидролиз) 8,0 (Трансгликозилирование) 47 45 [Ha et al., 2009] Km, мМ Общая активность Трансгликозилирование 6 (11,2)* 8,1 ([сахароза] < 20 мМ) 112 ([сахароза] > 20 мМ Гидролиз 11 (11)* 2,5 ([сахароза] < 20 мМ) 29 ([сахароза] > 20 мМ) kcat , мин -1 Общая активность Трансгликозилирование 8,7 (11,2)* 4,6 (7,5)* 44([сахароза] < 20 мМ) 49,2 ([сахароза] < 41 мМ) 84 ([сахароза] > 20 мМ) 121 ([сахароза] > 41 мМ) 26 ([сахароза] < 20 мМ) 54 ([сахароза] > 20 мМ) Гидролиз 4,1 (4,0)* 21 ([сахароза] < 20 мМ) 31 ([сахароза] < 20 мМ) Ссылка Данная работа [Jung et al., 2009; van der [Emond et al., 2008; [Jung et al., Veen et al., 2006] Pizzut-Serin et al., 2005] 2009] * - в присутствии 0,1 мг/мл гликогена 16 7. Характеристика рекомбинантой фруктокиназы (FruK). Ген, предварительно аннотированный как pfkB (GenBank CCE22311.1), амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в вектор pET22b+. Рекомбинантный фермент экспрессировали в клетках E. coli Rossetta (DE3), трансформированных плазмидой pETfruK. Фермент очищали из лизата клеток аффинной металл-хелатной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA-агарозой до электрофоретически гомогенного состояния. Молекулярная масса субъединицы, определенная с помощью ДСН-ПААГЭ, соответствовала расчетной (34,5 кДа) (Рис. 9А). Нативный градиентный (430%) электрофорез в ПААГ выявил единственную полосу, соответствующую м.м. около 35 кДа (Рис. 9Б). Резонно предположить, что фермент in vivo является мономером. Рекомбинантный белок катализировал АТФ-зависимое фосфорилирование фруктозы до фруктозо-6-фосфата, т.е. являлся фруктокиназой. Рекомбинантная FruK имела абсолютную специфичность к фруктозе, как акцептору фосфорильной группы, но не проявляла активности с глюкозой, ксилозой, рибозой, арабинозой, мальтозой, сахарозой, а также с глюкозо-6-фосфатом и фруктозо-6-фосфатом. Фруктокиназа была способна использовать в качестве фосфорильного донора АТФ, ГТФ и УТФ, но не ЦТФ и не пирофосфат. М М А Б 440 кДа 94,6 кДа 66,2 кДа 232 кДа 45,0 кДа 140 кДа 67 кДа 31,0 кДа 21,5 кДа Рис. 9. 12% ДСН-ПААГ электрофорез (А) и градиентный 4-30% ПААГ электрофорез (Б) рекомбинантной фруктокиназы. Активность фермента зависела от ионов двухвалентных металлов (относительная активность): Mg2+ (100%), Mn2+ (146%), Co2+ (63%), Zn2+(1,1%), Ni2+ (0,8%). Активность фермента не обнаруживалась в отсутствии металла-кофактора. Максимальная активность проявлялась при соотношении концентраций АТФ и Mg2+ в диапазоне 1:1 – 1:1,5 (Рис. 10). 17 По-видимому, фруктокиназа использует комплекс Mg-АТФ и ингибируется свободным АТФ и высокими концентрациями ионов Mg2+. Рекомбинантная фруктокиназа была максимально активна при рН 9,0, что коррелирует с оптимальным значением рН для роста штамма 20Z. Напротив, температурный оптимум FruK (60ºС) вдвое превышал таковой для роста данного метанотрофа. Аномально высокий температурный оптимум был обнаружен также у фруктокиназы из Bifidobacterium longum [Caescu et al., 2004] (Табл. 4). 140 Активность, Е/мг 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Рис. 10. Зависимость активности фруктокиназы от концентрации ионов Mg2+ при постоянной концентрации АТФ (10 мМ). Фруктокиназа из Mm. alcaliphilum 20Z подчинялась классической кинетике Михаэлиса-Ментен, имела достаточно высокую активность и высокое сродство к фруктозе (Vmax = 141±6 Е/мг, кажущиеся Kmфруктоза = 0,26±0,03 мМ, KmАТФ = 1,3±0,2 мМ), что указывает на способность данного метанотрофа метаболизировать фруктозу при достаточно низких концентрациях в клетке. Поскольку Mm. alcaliphilum 20Z не растет на фруктозе или других углеводных субстратах, роль фруктокиназы у данного метанотрофа не связана с ассимиляцией экзогенных сахаров. Учитывая расположение гена fruK в кластере генов метаболизма сахарозы, можно предположить участие фруктокиназы в реутилизации сахарозы, образующейся при амилосахаразой. 18 катаболизме эндогенной сахарозы Таблица 4. Свойства некоторых фруктокиназ прокариот. Mm. Thermococcus Bifidobacterium Zymomonas Lactococcus alcaliphilum 20Z litoralis longum mobilis lactis Молекулярная масса субъединицы, кДа 35 35 35 28 32 Субъединичная структура рН-Оптимум t-Оптимум Субстратная специфичность Km, мМ: Фруктоза ATP Vmax, Е/мг белка: Фруктоза АТФ Относительная активность с донором фосфорильных групп мономер димер мономер димер димер 9,0 60o Фруктоза 7,5-8,0 80o Фруктоза 6,0 50o Фруктоза 7,4 7,0 Фруктоза Манноза Фруктоза Манноза 0,25 1,3 2,3 0,81 0,74 0,77 0,7 0,45 0,31 0,59 141 920 1,8 350 - АТФ (100%), АТФ (100%), АТФ (100%), - АТФ>ГТФ> ГТФ (52%), ИТФ (73%), ИТФ (78%), УТФ (22%), ГТФ (62%), ГТФ (23%), ЦТФ (0%), УТФ (16%), ЦТФ (6%), ФФн(0%) ЦТФ (16%) ТТФ (0,18%) Данная работа [Qiuhao et al., 2004] [Caescu et al., 2004] Параметры Ссылка ИТФ>УТФ [Fennington, Hughes, 1996] [Thompson et al., 1991] 8. Транскрипционная организация генов fruK и ams Для изучения потенциальной котранскрипции генов fruK и ams, проводили ПЦР с применением обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР). кДНК, синтезированную с праймером As-RT, использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами lp-as-F и lp-as-R. В результате был получен фрагмент ДНК ожидаемой длины - 1010 п.н. Следовательно, гены fruk и ams сцеплены и транскрибируются в виде одной мРНК (Рис. 11). fruK ams lp-as-F lp-as-R 1 3 2 М As-RT Рис. 11. Транскрипционная организация fruK и ams генов. 1 – ПЦР продукт, полученный с кДНК, 2 – ПЦР продукт, полученный с хромосомной ДНК (положительный контроль), 3 – ПЦР продукт, полученный с РНК, не подвергнутой обратной транскрипции 1010 п.н. (отрицательный контроль). 19 Одним из продуктов деградации сахарозы под действием амилосахаразы является фруктоза. Котранскрипция генов fruK и ams подтверждает предположение об участии фруктокиназы в реутилизации фруктозы, образовавшейся при катаболизме эндогенной сахарозы. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В частично аннотированном геноме галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z нами впервые обнаружен кластер генов sps-spp-fruKams, продуктами которых являются сахарозофосфатсинтаза, сахарозофосфатфосфатаза, фруктокиназа и амилосахараза, катализирующие биосинтез и последующий метаболизм сахарозы. Показано, что сахароза накапливается в клетках при увеличении солености среды, но не в ответ на смену источника углерода и энергии с метана на метанол или повышение концентрации метанола в среде. Мутантный штамм, дефектный по генам основного осмопротектора – эктоина, накапливал в 8 раз больше сахарозы, по сравнению с родительским штаммом. Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что Mm. alcaliphilum 20Z синтезирует сахарозу в качестве дополнительного осмопротектора. Достоверно установлено, что кластер sps-spp-fruK-ams присутствует в геномах как галофильных, так и негалофильных метилотрофов с РМФ путем С1-ассимиляции. Кроме того, гомологи этих генов найдены у галофильных и соленезависимых автотрофных протеобактерий с РБФ-циклом. В совокупности, это указывает на иные, нежели осмопротекторная, функции сахарозы у прокариот. Наличие аналогичных генных кластеров метаболизма филогенетический анализ сахарозы у различных аминокислотных групп прокариот, последовательностей а также соответствующих ферментов свидетельствуют о горизонтальном переносе генов, участвующих в биосинтезе и деградации сахарозы. Впервые из метанотрофов клонированы гены сахарозофосфатфосфатазы, фруктокиназы и амилосахаразы, получены и охарактеризованы гомогенные препараты этих ферментов. Рекомбинантная сахарозофосфатфосфатаза отличалась от ранее охарактеризованных аналогичных ферментов присутствием нескольких олигомерных форм, а также высокой константой ингибирования сахарозой. Эта особенность сахарозофосфатфосфатазы коррелирует с осмопротекторной ролью сахарозы и необходимостью поддержания относительно высокой внутриклеточной концентрации этого дисахарида. Рекомбинантная амилосахараза Mm. alcaliphilum 20Z, в отличие от описанных амилосахараз гетеротрофных бактерий, имела на порядок более низкую активность и подчинялась кинетике Михаэлиса-Ментен. Низкая активность амилосахаразы может быть 20 также связана с необходимостью поддерживать определенный пул сахарозы в клетке. Инактивация гена ams приводила к увеличению внутриклеточного содержания сахарозы, что подразумевает участие амилосахаразы в катаболизме дисахарида. Поскольку Mm. alcaliphilum 20Z синтезирует гликогеноподобный полисахарид [Khmelenina et al., 1999], логично предположить, что этот метанотроф реализует путь синтеза гликогена с использованием сахарозы в качестве интермедиата. Наличие у Mm. alcaliphilum 20Z высокоактивной фруктокиназы, имеющей строгую специфичность и высокое сродство к фруктозе, а также тот факт, что гены fruK и ams котранскрибируются в виде одной матричной РНК, определенно свидетельствуют в пользу участия данного фермента в активировании образующейся фруктозы для последующего включения в метаболизм. Клонирование и гетерологичная экспрессия гена sps в E. coli не привели к получению активного препарата сахарозофосфатсинтазы. Однако инактивация гена sps сопровождалась потерей способности культуры синтезировать сахарозу, что подразумевает ключевую роль гена этого фермента в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. В то же время, наличие гена сахарозофосфатфосфатазы указывает на то, что биосинтез сахарозы у данного метанотрофа происходит двухступенчато, с образованием сахарозо-6-фосфата в качестве интермедиата, т.е. путем, функционирующим у растений и цианобактерий [Page-Sharp et al., 1999; Lunn et al., 2000]. Как известно, Mm. alcaliphilum 20Z реализует РМФ-путь ассимиляции формальдегида с образованием фосфогексоз, в частности, фруктозо-6-фосфата и глюкозо1-фосфата [Хмеленина с соавт., 1997]. Присутствие в геноме данного метанотрофа геновгомологов АДФ-глюкопирофосфорилазы (YP004918751.1) и УДФ- глюкопирофосфорилазы (YP004918011.1) свидетельствует о том, что синтез сахарозы происходит именно из этих первичных продуктов РМФ-пути (Рис. 12). Кроме того, присутствие амилосахаразы и фруктокиназы означает, что эндогенная сахароза в некоторых случаях (например, при понижении солености среды) используется для синтеза осмотически инертного гликогена (Рис. 12). Наличие у Mm. alcaliphilum 20Z гена, кодирующего гликогенсинтазу, свидетельствует о том, что гликоген может синтезироваться альтернативным путем. Из приведенной схемы следует, что при синтезе гликогена с участием сахарозофосфатсинтазы и амилосахаразы затрачивается на одну молекулу нуклеозидтрифосфата больше, чем при участии гликогенсинтазы. Можно предположить, что синтез сахарозы с последующей трансформацией в гликоген служит своеобразным футильным циклом, используемым метанотрофом для сброса избыточной метаболической энергии. 21 МДГ MMO CH4 ФАДГ CH3OH HCHO ФДГ HCOOH CO2 ГФС Рибулозо-5Ф Гексулозо-6Ф ГФИ Фруктоза AТФ Ams Фруктозо-6Ф FruK Сахароза ФГИ AДФ SPP Глюкозо-6Ф Сахарозо-6Ф SPS ФГМ Pi Глюкозо-1Ф УДФ (Гликоген)n УДФ-глюкоза (Гликоген)n+1 ФФн ГС УТФ ФФн АПФ АДФ-глюкоза АДФ АТФ УПФ Рис. 12. Предполагаемая схема метаболизма сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. MMO – метанмонооксигеназа, МДГ – метанолдегидрогеназа, ФАДГ – формальдегиддегидрогеназа, ФДГ – формиатдегидрогеназа, ГФС – гексулозофосфатсинтаза, ГФМ – гексулозо-фосфатизомераза, ФГИ – фосфоглюкоизомераза, ФГМ – фосфоглюкомутаза, УПФ – УДФглюкопирофосфорилаза, АПФ - АДФ-глюкопирофосфорилаза, ГС – гликогенсинтаза, SPS – сахарозофосфатсинтаза, SPP – сахарозофосфатфосфатаза, FruK – фруктокиназа, Ams – амилосахараза. Таким образом, среди прокариот только фототрофы и хемоавтотрофы, а также аэробные метилотрофы способны синтезировать сахарозу. Исходя из высокой гомологии генов и ферментов метаболизма сахарозы у этих групп бактерий, уместно предположить реализацию у них аналогичного биохимического пути. В совокупности, это подтверждает ранее выдвинутую гипотезу общности происхождения автотрофных и метилотрофных прокариот [Whittenbury et al., 1980]. 22 Данная работа инициировала расшифровку путей метаболизма и функциональной роли сахарозы у метилотрофных протеобактерий. Дальнейшие системные исследования особенностей биологии Mm. alcaliphilum 20Z и негалофильных (Methylobacillus flagellatus KT) или термофильных (Methylocaldum szegediense O-12) метилотрофов, включая анализ их генопротеомов и транскриптомов, приведут к лучшему пониманию феномена полифункциональности сахарозы, а также внесут ясность в сценарий эволюции путей метаболизма сахарозы у прокариот. ВЫВОДЫ 1 . В геноме галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z обнаружен кластер из четырех генов, продукты которых – сахарозофосфатсинтаза (SPS), сахарозофосфатфосфатаза (SPP), фруктокиназа (FruK) и амилосахараза (Ams), участвуют в метаболизме сахарозы. 2 . В экспериментах с мутантами доказано, что сахароза является дополнительным к эктоину осмопротектором. Инактивация двух генов пути биосинтеза основного осмопротектора – эктоина, приводит к 8-кратному увеличению накопления сахарозы в клетках мутанта ΔectBC. Впервые полученный инсерционный мутант по гену сахарозофосфатсинтазы (Δsps) не способен накапливать сахарозу, но при высокой солености среды культивирования синтезирует большее количество эктоина, чем исходный штамм. 3 . Установлено, что рекомбинантная сахарофосфатфосфатаза существует в нескольких олигомерных формах с м.м. 33, 66, 132 и 198 кДа, катализирует гидролиз сахарозо-6-фосфата до сахарозы и неорганического фосфата (Vmax = 18,9±0,6 Е/мг, Kmкаж= = 36±4 мкМ). 4 . Обнаружено, что рекомбинантная амилосахараза является мономером с м.м. 75 кДа, катализирует одновременно гидролиз сахарозы (Vmax = 53±1 мЕ/мг, Kmкаж = 11±1 мМ) и трансгликозилирование с переносом глюкопиранозного остатка сахарозы на гликоген (Vmax = 60±2 мЕ/мг, Kmкаж = 6±1 мМ), тем самым участвуя в деградации сахарозы и образовании полисахарида. 5 . Выявлено, что рекомбинантная фруктокиназа – мономер с м.м. 34,5 кДа, катализирует АТФ-зависимое фосфорилирование фруктозы до фруктозо-6-фосфата (Vmax = 141±6 Е/мг, кажущиеся Kmфруктоза = 0,26±0,03 мМ, KmАТФ = 1,3±0,2 мМ). Гены fruK и ams котранскрибируются в виде одной полицистронной мРНК. 6 . Впервые предложена схема путей метаболизма сахарозы у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Сахароза синтезируется из интермедиатов рибулозомонофосфатного 23 цикла ассимиляции формальдегида: фруктозо-6-фосфата и УДФ-глюкозы. Последующее превращение сахарозы в гликоген, по-видимому, служит не только для запасания углерода, но и для сброса избыточной метаболической энергии в клетках данного метанотрофа. Список публикаций по теме диссертации: Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ: 1. Бут С.Ю., Розова О.Н., Хмеленина В.Н., Решетников А.С., Троценко Ю.А. Свойства рекомбинантной ATP-зависимой фруктокиназы галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Биохимия, 2012, Т. 77, Вып. 4, С. 474 – 480. 2. Бут С.Ю., Хмеленина В.Н., Мустахимов И.И., Троценко Ю.А. Получение и характеристика нокаут-мутантов Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, дефектных по генам синтеза сахарозы и эктоина. Микробиология. 2013. Т.82. №2. С. 251-253. Тезисы докладов: 1. Бут С.Ю., Куревлев С.В., Решетников А.С. Идентификация генов биосинтеза сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. XV Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино, 2011г. С. 360-361. 2. Бут С.Ю., Решетников А.С. Клонирование и характеристика рекомбинантных фруктокиназы и амилосахаразы из галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011». Тула, 2011г. С. 37. 3. Бут С.Ю., Потапова А.В., Решетников А.С. Метаболизм сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2011г. С. 7-9. 4. Бут С.Ю., Решетников А.С. Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. XVI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино, 2012г. С.166-167. 5. Бут С.Ю., Решетников А.С. Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2012г. С. 7-9. 24
