Чумакова Анна Сергеевна «Возрастные и тканеспецифические
advertisement
На правах рукописи ЧУМАКОВА АННА СЕРГЕЕВНА ВОЗРАСТНЫЕ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ ПРИ ОСТРОМ СТРЕССЕ И ВВЕДЕНИИ αТОКОФЕРОЛА НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА Специальность 03.00.13 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань – 2009 Работа выполнена на кафедре физиологии и морфологии человека и животных Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет», г. Астрахань Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Нестеров Юрий Викторович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Клаучек Сергей Всеволодович доктор биологических наук, профессор Сердюков Василий Гаврилович Ведущая организация: ГОУ ВПО «Волгоградский государственный университет» Защита состоится « 26 » июня 2009 года в 12-00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу 414056, г.Астрахань, ул.Татищева, 20а. Автореферат разослан « Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук » __________ 2009 года. Нестеров Ю.В. Список условных сокращений АФК – активные формы кислорода ОМ – окислительная модификация ОМБ – окислительная модификация белков ПОЛ – перекисное окисление липидов ПОБ – перекисное окисление белков СРО – свободнорадикальное окисление АКМ – активные кислородные метаболиты СР – свободные радикалы СОД – супер оксид дисмутаза АОС – антиокислительная система МДА – малоновый диальдегид ОС – окислительный стресс ПОС – прооксидантная система ПОЗ – прооксидантная защита АОЗ – антиоксидантная защита 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время по-прежнему актуальной для современной биологии и медицины остается проблема стресса и его влияния на различные функциональные системы организма. Стресс рассматривается как способ достижения резистентности организма к действию экстремальных факторов различного генеза (Тигранян Р.А., 1988; Судаков К.В., 1996; Ерохин И.А., 1993). Вместе с тем, стресс может стать фактором, оказывающим повреждающее действие на органы и системы, ведущим к развитию заболеваний (Судаков К.В., 1996; Тигранян Р.А., 1988; Теплый Д.Л., 2008). Важным проявлением стресс-реакции и адапционной перестройки является совершенствование деятельности регуляторных механизмов, участвующих в поддержании оптимального уровня интенсивности обменных процессов на уровне целостного организма (Федоров Б.М., 1991). При этом, несомненно, должны существовать органоспецифические особенности в осуществлении мобилизации различных механизмов при стрессе и проблема реализации стресс-реакции на уровне отдельных органов и тканей остается актуальной. В частности, малоизученным остается вопрос об изменениях метаболических процессов при развитии стресс-реакции. Как известно, одним из ведущих повреждающих факторов при стрессе, детерминирующих развитие вторичных изменений органов и тканей, является интенсификация свободнорадикального окисления, которая наряду с этим рассматривается как один из универсальных физиологических процессов – окисление биологических субстратов при действии АФК (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988; Барабой В.А., 1991; Ланкин В.З., 2001; Дубинина Е.Е., 2003). Анализ современной научной литературы позволяет прийти к заключению о том, что значительное количество работ посвящено перекисному окислению липидов (ПОЛ), в том числе стрессиндуцированному, при этом окислительной деструкции белков клеток и тканей уделяется меньшее внимание. Механизмы и последствия стресс-реакции в организме зависят не только от метаболических возможностей различных тканей, но и от возраста индивидуума. В то же время, возрастной аспект исследования свободнорадикальной деструкции белковых и липидных компонентов тканей, незначительно представленный в литературе, должен дополнить известные к настоящему времени закономерности стресс-реакции на разных этапах онтогенеза и позволит существенно углубить представления о возрастных особенностях механизмов адаптации к экстремальным, стрессиндуцирующим воздействиям. Цель исследования состояла в изучении возрастных и тканеспецифических особенностей перекисного окисления белков и липидов у крыс разных возрастных групп при остром стрессе и введении природного антиоксиданта альфа-токоферола. 4 Задачи исследования: 1.Провести сравнительное изучение интенсивности перекисного окисления белков и липидов интактных животных разных возрастных групп и выявить его тканеспецифические особенности в условиях фоновой активности. 2.На модели острого эмоционально-болевого стресса исследовать уровень липидной и белковой пероксидации в мозговой ткани и органах висцеральной системы у неполовозрелых, взрослых и старых крыс. 3.Провести сравнительный анализ выраженности возрастных и стрессиндуцированных изменений свободнорадикального окисления липидов и перекисной деструкции белков. 4.Изучить влияние природного антиоксиданта витамина Е на свободнорадикальное окисление липидных и белковых компонентов различных тканей в условиях фоновой активности, острого стресса и на разных этапах постнатального онтогенеза. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Свободнорадикальные процессы в условиях фоновой активности и стресса имеют тканевую специфичность, которая заключается в различной выраженности и направленности перекисного окисления белков и липидов в мозге, печени, легких и миокарде экспериментальных животных. 2. Процессы окислительной модификации белковых и пероксидного окисления липидных компонентов тканей не находятся в тесной зависимости друг от друга. 3. Реакция организма на однократное стрессорное воздействие зависит от возраста животного и отличается динамикой накопления продуктов перекисного окисления белков и липидов. 4. Антиоксидантное и (или) прооксидантное действие природного антиоксиданта α-токоферола зависит от ткани и возраста животного. Научная новизна. Впервые исследованы и сопоставлены процессы белковой и липидной пероксидации в различных тканях на разных этапах постнатального онтогенеза. В эксперименте выявлены возрастные особенности стрессорной динамики показателей ПОЛ и ПОБ в мозге, печени, легочной ткани и миокарде. Показано, что процессы СРО в этих органах не всегда изменяются однонаправлено у крыс разного возраста в норме и после стрессирования животных. Получены ранее не известные данные о достаточно высокой силе влияния возрастного фактора на фоновую активность процессов белковой и липидной пероксидации в мозге, легких и миокарде, а также на стрессорную динамику изучаемых параметров. В частности, показано сильное влияние возраста на стрессорный уровень МДА в конечном мозге и легких и ПОБ в миокарде, мозге и печени. В ходе исследования показано также, что предварительное введение α-токоферола приводит к его выраженному антиоксидантному действию в большинстве, но не во всех органах у молодых и половозрелых животных. 5 Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования демонстрируют наличие возрастных и тканеспецифических различий свободнорадикальных процессов при остром стрессорном воздействии и расширяют представления о механизмах ранней реакции антиоксидантной системы на стресс-индуцирующие воздействия. Онтогенетические различия в динамике накопления продуктов свободнорадикального окисления липидных и белковых компонентов тканей служат основанием для анализа результатов повреждающего действия эмоционально-болевого стресса в эксперименте и клинической практике. Выявленные эффекты природного антиоксиданта α-токоферола открывают дальнейшие перспективы для его более широкого практического использования в медицине и ветеринарии при профилактике и лечении стрессорных повреждений органов. Материалы диссертационного исследования могут быть включены в курсы лекций по физиологии, экологической физиологии для студентов биологических специальностей университетов. Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции “Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье населения. Актуальные проблемы биологии и медицины” (Астрахань, 2000), ХХ международном симпозиуме “Экологофизиологические проблемы адаптации” (Москва, Российский Университет Дружбы Народов, 2001), ХХI международном симпозиуме “Экологофизиологические проблемы адаптации”(Москва, Российский Университет Дружбы Народов, 2003), Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), VIII Международной научно-практической конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря (Медико-биологические исследования)» (Астрахань, 2007), на итоговых научных конференциях студентов, аспирантов и преподавателей Астраханского государственного университета (2005-2008),. По материалам диссертационного исследования опубликовано 9 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, включающего четыре подглавы, главы материал и методы исследования, двух глав, посвященных результатам исследования и их обсуждению, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован 8 таблицами и 25 рисунками. Библиографический список включает 321 источников, из которых 184 иностранных. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводились на белых крысах-самцах в трех сериях опытов на 3-х возрастных группах животных: 1 – неполовозрелые 7 недельного возраста массой 64 г; 2 – половозрелые животные 4-х месячного 6 возраста, средней массой 153 г.; 3 – старые животные 18-ти месячного возраста, средней массой 385 г, всего 84 животных. Животные были разделены на следующие группы: 1) интактные животные, 2) животные, подвергавшиеся эмоционально-болевому стрессу, 3) крысы, получавшие масляный раствор α-токоферолацетата в течение 14 дней per os в дозе 1 мг/100 г массы тела, 4) крысы, подвергавшиеся эмоционально-болевому стрессу с предварительном введением α-токоферола в той же дозе. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. По окончании опытов животных декапитировали после предварительной наркотизации крыс внутрибрюшинным введением нембутала в дозе 4 мг/100 г массы тела (Арушанян Э.Б., Толпышев Б.А., 1981). Перед экспериментом животных хендлировали (Жуков Д.А., ВиноградоваЕ.П., 1995; Виноградова Е.П., Чаадаева Е.В., 1994). Моделью эмоционально-болевого стресса служило электрокожное раздражение, для чего использовали прямоугольную камеру с решетчатым металлическим полом, соединенным с источником переменного тока фиксированного сопротивления, получаемого с помощью лабораторного автотрансформатора. Крысу помещали в установку на 5 мин. для ознакомления с ней, а затем подавали электрический ток с напряжением 40 V на протяжении 15 мин. с интервалами 30 сек. (Буреш Я. И соавт, 1991). Животных забивали сразу после извлечения из камеры. После декапитации забирали кровь, выделяли большие полушария и гипоталамус, вскрывали грудную и брюшную полость и отпрепаровывали легкие, сердце и печень для последующей гомогенизации, экстрагирования тканей и биохимического анализа. О развитии стресса у животных судили по изменению количества эозинофильных гранулоцитов (проба на эозинопению) и количеству адреналина в крови, а также относительной массе надпочечников (по отношению к массе тела). Количество эозинофильных гранулоцитов в крови, забираемой из хвостовой вены, определяли после их окрашивания жидкостью Дунгера в камере Горяева с последующим пересчетом числа эозинофилов в 1 мм3 крови (Ронин В.С., Старобинец Г.М., 1989). Для окрашивания эозинофилов готовили основной раствор (эозин К, вода и 40% формалин) и рабочий раствор (2 части основного раствора, 2 части ацетона и 6 частей воды). Во флакон помещали 0,2 мл рабочего раствора, пипеткой от гемометра добавляли 0,02 мл крови, взятой из хвостовой вены, перемешивали и заполняли камеру Горяева. Подсчет проводили через 4 минуты при увеличении по всей поверхности сетки. Количество адреналина в крови, получаемой после декапитации животных, проводили по методу, основанном на колориметрическом определении интенсивности синего окрашивания, возникающего при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина (по Филиппович Ю.Б. и 7 соавт., 1975). Для этого к 1 мл плазмы крови добавляли 4 мл свежеприготовленного 10% раствора N2СО3, 0,5 мл реактива Фолина и доводили объем пробы раствором N2СО3 до 10 мл. Параллельно готовили стандартный раствор адреналина с концентрацией 0,05 мг/1 мл. Экстинцию проб измеряли при λ=700. Расчет проводили по формуле: С х Eоп/Ест., где С - концентрация адреналина в стандартном растворе, Е - экстинция опытной и стандартной проб. Уровень свободнорадикального окисления определяли по скорости перекисного окисления липидов и перекисного окисления белков (ПОБ) в гомогенатах больших полушарий, гипоталамусе, печени, легких и миокарде. Для определения перекисного окисления белков использовали методику Дубининой Е.Е., Бурмистрова С.О., Леоновой Н.В. (1995 г.). Для анализа использовали 0,05-0,1 мл экстракта тканей, осаждение белков осуществляли с помощью 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). К денатурированным белкам приливали равный объем (1мл) 0,1 М 2,4денитрофенилгидразина (2,4-ДФГ), растворенного в 2 М НСL. В контрольную пробу добавляли вместо 2,4-ДФГ равный объем 2 М HCL. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем пробы центрифугировали при 3000 g в течение 15-20 мин. Осадок промывали 3 раза раствором этанол – этилацетат (1:1). Полученный осадок подсушивали с целью устранения оставшегося растворителя этанол — этилацетат и затем растворяли в растворе мочевины. Мочевину приливали к осадку в объеме 2,5 мл и выдерживали в кипящей бане в течение 5 мин до полного растворения. Оптическую плотность образовавшихся денитрофенилгидразонов измеряли при длине волны 540 нМ. Перекисное окисление липидов в гомогенатах тканей оценивали по скорости спонтанного и неферментативного аскорбатзависимого ПОЛ, содержанию в тканях конечного продукта ПОЛ – малонового диальдегида (МДА). Метод определения малонового диальдегида и скорости пероксидного окисления липидов в гомогенатах тканей (Строев Е.А., Макарова Е.Г., 1986) основан на определении содержания конечного продукта ПОЛ – малонового диальдегида, который при взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой образует окрашенный в розовый цвет триметиновый комплекс, имеющий максимум поглощения при λ=530-532. Навеску тканей 0,5 г гомогенизировали в 19,5 мл охлажденного 1,2% раствора хлорида калия. В одну пробирку наливали 2 мл гомогената и 0,2 мл дистиллированной воды, во вторую – 2 мл гомогената и по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты (2,6 мМ) и соли Мора (4·10-5) , в третью – те же вещества, что и во вторую и 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты. Все пробы помещали на 10 минут в водяную баню при 37ºС, после чего в первые две пробирки прибавляли по 1 мл трихлоруксусной кислоты и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Далее отбирали по 2 мл надосадочной жидкости, добавляли по 1 мл 0,8% раствора тиобарбитуровой кислоты и помещали 8 пробы в кипящую водяную баню на 10 минут. После этого их охлаждали и измеряли экстинцию на фотоэлектроколориметре при 532 нм. Расчет проводили по формулам: Х1(Х2) = Е1(Е2) х 3 х 3,2 х 6 ; Х3 = Е3 х 3 х 3,2 0,156 х 2 0,156 где Х1 – скорость спонтанного ПОЛ (нмоль МДА/0,05 г/ за час инкубации), Х2 – скорость аскорбатзависимого неферментативного ПОЛ (нмоль МДА/0,05 г за час инкубации), Х3 – содержание МДА в исходном гомогенате (нмоль/0,05 г сырого веса ткани); Е – экстинции соответственно 1-й, 2-й и 3-й проб; 3,2 – общий объем исследуемых проб, мл; 2 – объем надосадочной жидкости, взятой на определение МДА, мл; 3 – объем проб, взятой на фотометрию, мл; 0,156 – экстинция 1 нмоль МДА в 1 мл при 532 нм. Весь экспериментальный материал обрабатывался статистически с вычислением средней арифметической, ошибки средней, достоверности различий по критерию Стьюдента и проведением корреляционного и дисперсионного анализа с вычислением достоверности силы влияния по Фишеру (Плохинский Н.А, 1980; Лакин Г.Ф., 1990). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ С целью подтверждения развития стресса и выявления возрастных различий в стресс-реактивности экспериментальных животных наряду с поведенческими реакциями изучались некоторые физиологические показатели до и после однократного электрокожного раздражения (табл. 1). В ходе эксперимента у половозрелых крыс наблюдалась выраженная реакция на электро-болевое воздействие со стороны крови и дыхания: частота дыхания увеличилась по сравнению с контролем на 73,1% у половозрелых и на 56,1 у старых животных. Причем частое и глубокое дыхание наблюдали у крыс в течение всего периода воздействия (15 минут) и сразу после извлечения крыс из камеры. По эозинопеническому критерию данное воздействие оказалось стресс-реализующим, что выражалось в значительном снижении числа эозинофильных гранулоцитов в крови половозрелых крыс (на 16%). Анализ крови на содержание адреналина выявил значительное его увеличение после стресса - на 34,8% (половозрелые) и на 16,6% (старые). При этом относительная масса надпочечников достоверно не изменялась, хотя тенденция к ее увеличению наблюдалась у крыс этих двух возрастов (на 10,8% и 11,3%) (табл.1). Реакция неполовозрелых крыс на ЭКР имела свои особенности. Частота дыхательных движений у них при стрессе понижалась (на 21,2%). В отличие от выраженной гипервентиляции у взрослых крыс, у крысят наблюдали частое поверхностное дыхание, которое сопровождалось периодическими длительными остановками с видимым спазмом брюшной мускулатуры. Обращает на себя внимание разница в исходных значениях частоты дыхания (у взрослых - 87,4 ± 3,2, у крысят - 124,0 ± 3,9, р<0,01). Можно полагать, что гиповентиляционные эффекты и недостаточная реактивность внешнего 9 дыхания к действию стрессора у неполовозрелых крыс связаны с незрелостью дыхательного центра, его меньшей чувствительностью к углекислому газу и, как следствие этого, быстрым функциональным истощением респираторной системы организма (табл.1). Реакция крови крысят на ЭКР проявилась в выраженной эозинопении (число эозинофилов снизилось на 41 %) и повышением, хотя намного меньшим по сравнению с половозрелыми и старыми, уровня адреналина (на 5,9%). Исходный уровень катехоламина в крови крысят был значительно выше, чем у взрослых животных. При этом относительная масса надпочечников у крысят достоверно не изменялась и даже наблюдалась тенденция к ее снижению. Таблица 1 Показатели стресс-реактивности животных разных возрастных групп в условиях острого эмоционально-болевого стресса (М±m) Возраст животных Показатели Частота дыхания, мин. Р Адреналин мг/мл плазмы Р Эозинофил ы, в 13 мм крови Неполовозрелые Половозрелые Старые Контроль Стресс Контроль Стресс Контроль Стресс 124,0±3,9 97,7±8,4 87,4±3,2 151,3±5,1 87,1±4,56 136,0±3,08 <0.01 0,0776± 0,001 <0.001 0,0822± 0,001 0,0453± 0,002 <0.05 595,0±18,7 0,0611± 0,004 <0.001 0,0301± 0,0008 <0.05 351,8± 23,0 513,3± 17,7 0,0351± 0,0001 <0.001 431,4± 21,3 Р <0.001 <0.02 Масса 0,0953± 0,0855± 0,0775± 0,0859± надпочечн 0,003 0,004 0,004 0,003 иков, мг/г Р >0.5 >0.05 Примечание. Р дано в сравнении с контролем. 185,0±12, 5 461,5±17,1 >0.05 0,0623 ±0,005 0,0694± 0,002 >0.05 Повышение уровня катехоламинов в крови при остром стрессе является неоспоримым фактом (Филаретов А.А, 1987; Пшенникова М.Г. и соавт., 2000). Различные варианты реакции дыхательной системы на шок, по имеющимся в литературе данным, сопровождаются определенными изменениями нейрогормональных взаимоотношений. Так, стресс-вызванные гипервентиляционные эффекты (при наличии частого и глубокого дыхания) сопровождаются повышением функциональной активности симпатоадреналовой, холин- и серотонинергической систем, а стрессиндуцированная гиповентиляция (при наличии асинхронно частого и поверхностного дыхания) определяется усилением адренергических процессов 10 и падением активности систем ацетилхолин-холинэстераза и серотонинмоноамиоксидаза (Базаревич Г. Я., 1973). Наши данные позволяют сделать заключение о развитии стойкой стресс-реакции взрослых крыс в ответ на действие электрического тока, что подтверждается соответствующими изменениями показателей стресс-реактивности, которые сопровождаются адекватной реакцией со стороны внешнего дыхания. У неполовозрелых животных, наряду с выраженной стресс-индуцированной реакцией крови по гормональному и иммунному компонентам, имеют место гиповентиляционные эффекты при изначально высокой исходной частоте дыхания (табл. 1). При анализе полученных в ходе экспериментов данных у интактных животных разного возраста нами обнаружены как онтогенетические, так и тканеспецифические особенности пероксидного окисления как белковых компонентов тканей так и липидной пероксидации. Так, уровень конечного продукта ПОЛ в гипоталамусе был более высоким у крысят по сравнению с половозрелыми, при этом у старых животных он заметно отличался от уровня МДА у неполовозрелых. В этой области мозга фоновый уровень ПОБ имел одинаковые значения у взрослых и старых (0,016 нмоль/ч), который превышал величину ПОБ у неполовозрелых крыс. Что касается кинетических характеристик ПОЛ, то скорость индуцированного ПОЛ у взрослых и старых крыс был ровно в два раза ниже, чем у крысят. Уровень спонтанного ПОЛ у половозрелых понизился на 13%, а у старых увеличился на 244% по сравнению с крысятами (табл. 2). При биохимическом анализе ткани больших полушарий мозга возрастных различий в уровне малонового диальдегида обнаружено не было. При этом, кинетические характеристики ПОЛ имели возрастные особенности: спонтанное ПОЛ повышалось у третьей возрастной группы по сравнению с крысятами и половозрелыми, скорость аскорбатзависимого ПОЛ так же у старых в полтора раза превышала его уровень у молодых и взрослых крыс. Такая же тенденция обнаружена нами и в отношении окислительной деструкции белков в конечном мозге животных. Исследования показали, что в тканях висцеральных органов имела место достоверная разница в уровне МДА у животных разного возраста, что наблюдалось и в случае с ПОБ. Однако необходимо отметить, что более видимые возрастные отличия изучаемых параметров у интактных животных имели место в легочной ткани для ПОЛ и в легких и миокарде для ПОБ (табл.2). Далее одной из задач исследования было изучение стрессчувствительности различных органов крыс разных возрастных групп в отношении свободнорадикального окисления. На модели острого электрокожного раздражения обнаружены разнонаправленные изменения уровня ПОЛ в различных тканях, причем это касалось как концентрации в гомогенатах тканей МДА, так и кинетических характеристик ПОЛ. 11 Таблица 2 Уровень перекисной деструкции белков и свободнорадикального окисления липидов в различных органах крыс разного постнатального возраста в условиях острого эмоционально-болевого стресса (M±m) Стресс Р Контроль Стресс Р Контроль Стресс Р Контроль Стресс Р 0,39±0,0003 ∆∆∆ 0,36±0,0004 ∆∆∆ Р<0,001 2,06±0,003∆ ∆∆ 2,72±0,003 ∆∆∆ Р<0,001 4,20±0,274 ∆∆∆ 4,24±0,010 ∆∆∆ Р<0,001 0,011±0,0002 0,40±0,0004 ∆∆∆ 0,33±0,0004 ∆∆∆ Р<0,001 1,90±0,001 ∆∆∆ 2,09±0,002 ∆∆∆ Р<0,001 1,97±0,002 ∆∆∆ 2,65±0,124 ∆∆ Р<0,001 0,011±0,0001 0,33±0,0001 ∆∆∆ 0,32±0,0004 1,91±0,001 ∆∆∆ 2,39±0,001 ∆∆∆ 2,10±0,002 0,010±0,0001 ∆∆∆ 0,011±0,0001 P>0,05 Р<0,001 Р<0,001 4,92±0,013 ∆∆∆ 0,015±0,0001 ∆∆∆ Р<0,001 0,012±0,0001 ∆∆ Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001 0,016±0,0001 *** 0,012±0,0001 *** ∆ Р<0,001 0,32±0,003 *** 0,34±0,001* ** Р<0,05 1,98±0,022 *** 2,06±0,052 *** P>0,05 2,25±0,044 *** 2,69±0,078 *** P>0,05 0,012±0,0002 ***∆∆∆ 0,013±0,0002 ***∆∆∆ Р<0,001 0.34±0.0002 *** 0.35±0.0002 *** Р<0,001 3.083±0.002 *** 3,23±0.003 *** Р<0,001 5.25±0.007 *** 4.89±0.003 *** Р<0,001 0,015±0,0002 *** 0,018±0,0005 *** Р<0,001 0,012±0,0001 ***∆∆∆ 0,011±0,0002 ***∆∆ Р<0,001 0,43±0,004 *** 0,41±0,008 *** Р<0,001 2,83±0,022 *** 2,56±0,067 * P>0,05 2,41±0,072 *** 2,61±0,025 *** Р<0,01 0,011±0,0001 0,010±0,0001 *** 0,011±0,0002 *** ∆∆∆ Р<0,001 0,33±0,0002 *** 0,32±0,0002 *** Р<0,001 2,01±0,003 *** 2±0,006 *** Р<0,001 1,92±0,011 *** 2,17±0,002 ** P>0,05 0,011±0,0001 0,010±0,0002 ∆∆∆ 0,011±0,0001 0,30±0,006 *** 0,31±0,016 1,78±0,008 *** 1,76±0,033 *** 2,21±0,175 0,011±0,0001 *** 1,65±0,033 *** Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001 Р<0,01 0,012±0,0038 Примечание. P дано в сравнении с контролем; * - p< 0.05 – 0.001 в сравнении с неполовозрелыми; ∆ - p< 0,05 – 0,001 в сравнении со старыми животными. 12 ПОБ, нмоль/ч 0,011±0,0001 ∆∆∆ 0,014±0,0001 ∆∆∆ Р<0,001 ГИПОТАЛАМУС 2,18±0,017 0.34±0.0002 2.46±0.007 ***∆∆∆ ***∆∆∆ *** ∆∆∆ 3,28±0,008 0.36±0.0003 4.79±0.018 *** ∆∆∆ *** ∆∆∆ *** ∆∆∆ Р<0,001 Р<0,001 Р<0,001 БОЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ 0,35±0,003 2,22±0,002 2,94±0,427 ***∆∆ ***∆∆∆ ∆∆∆ 0,34±0,0004 2,26±0,002 4,52±0,014 *** ∆∆∆ ***∆∆∆ *** ∆∆∆ Р<0,01 Р<0,001 P>0,05 ПЕЧЕНЬ 0,35±0,003 2,48±0,003 2,94±0,427 *** ∆∆∆ ***∆∆∆ * 0,34±0,0004 2,27±0,001 4,52±0,014 *** ∆∆∆ *** ∆∆∆ *** ∆∆∆ Р<0,01 Р<0,001 P>0,05 ЛЕГКИЕ 0,36±0,0004 2,04±0,002 2,11±0,003 *** ∆∆∆ ***∆∆∆ ***∆∆∆ 0,34±0,0003 2,13±0,003 2,24±0,002 *** ∆∆∆ ***∆∆∆ ** ∆∆∆ Р<0,01 Р<0,001 Р<0,001 МИОКАРД 0,37±0,0005 2,16±0,002 2,35±0,003 ***∆∆∆ ***∆∆∆ *** 0,34±0,0004 2,25±0,002 3,72±0,006 *** ***∆∆∆ ***∆∆∆ ПОБ, нмоль/ч 3,16±0,004 ∆∆∆ 3,97±0,006 ∆∆∆ Р<0,001 Аз.ПОЛ, нмоль МДА/ч 2,02±0,002 ∆∆∆ 2,33±0,002 ∆∆∆ Р<0,001 Спонт. ПОЛ, нмоль МДА/ч 0,37±0,0003 ∆∆∆ 0,32±0,0004 ∆∆∆ Р<0,001 Р<0,001 МДА, нмоль/0,05 г ткани 0,011±0,0001 ∆∆∆ 0,021±0,0002 ПОБ, нмоль/ч 4,62±0,007 ∆∆∆ 5,67±0,012 ∆∆∆ Р<0,001 Аз.ПОЛ, нмоль МДА/ч Контроль 0,39±0,0001 ∆∆∆ 0,34±0,0005 ∆∆∆ Р<0,001 Спонт. ПОЛ, нмоль МДА/ч Р 2,35±0,003 ∆∆∆ 3,45±0,006 ∆∆∆ Р<0,001 Старые МДА, нмоль/0,05 г ткани Стресс Аз.ПОЛ, нмоль МДА/ч Контроль Половозрелые Спонт. ПОЛ, нмоль МДА/ч Воздействи е МДА, нмоль/0,05 г ткани Неполовозрелые 0,016±0,0002 *** 0,023±0,0004 Р<0,001 0,012±0,0002 *** Р<0,001 0,013±0,0003 *** Р<0,001 Так, в мозговой ткани (гипоталамус) электорокожное раздражение вызвало достоверное увеличение уровня МДА у всех возрастных групп животных. В то же время в больших полушариях была выраженная тенденция к понижению на фоне стресса уровня МДА у неполовозрелых и взрослых крыс, в отличие от старых животных, у которых этот показатель достоверно повысился после стресса. В легких и сердечной мышце значение этого показателя после электрокожного раздражения также понижалось у всех возрастных групп животных, за исключением миокарда старых животных где стресс не вызвал видимых изменений этого показателя (табл. 2, рис. 1). Наряду с этим в ходе исследования после острого стрессирования мы наблюдали незначительное, но в большинстве случаев достоверное повышение интенсивности белковой пероксидации в сердце, легких и больших полушариях животных всех возрастных групп. Что касается гипоталамуса и печени, то у крысят и старых животных обнаружена такая же тенденция к стрессиндуцированному усилению ПОБ, при этом в этих тканях у половозрелых 4-х месячных крыс ЭКР спровоцировало снижение ПОБ посравнению с контрольными значениями. Особенно это проявилось в гипоталамусе, где уровень ПОБ снизился после ЭКР с 0,016 ± 0,0001 до 0,012 ± 0,0001 (p< 0,001) (табл.2, рис. 2). Обращает на себя внимание выявленный нами факт возрастной специфики стрессорного уровня малонового диальдегида. Так, в гипоталамусе и миокарде стрессорный уровень МДА у старых крыс был значительно ниже такового у молодых крысят и взрослых животных; в ткани конечного мозга и легких возрастных изменений не наблюдали, при этом в печени стрессорный уровень МДА был гораздо выше у старых крыс (табл.2, рис.1). Что касается стрессорных значений ПОБ, то в легочной ткани и сердце его уровень был практически одинаков у всех возрастных групп, в печени – более высоким у неполовозрелых, в больших полушариях – также высоким у старых, а в гипоталамусе был выражено снижен у 4-х месячных крыс в сравнении с другими возрастными группами (табл.2, рис.2). Такая же тканевая специфичность в реакции на острый стресс имела место и в отношении спонтанного и индуцированного пероксидного окисления липидов. Таким образом, вышеописанные результаты исследования позволяют прийти к заключению о том, что однократное стрессирование животных электрическим током сопровождается выраженными изменениями интенсивности свободнорадикальных процессов, которые выражаются, как правило, в усилении ПОЛ и ПОБ в большинстве изучаемых тканей и органов у животных разного возраста. Однако, имеют место тканевые и возрастные особенности, которые заключаются в разнонаправленности изменений параметров свободнорадикального окисления. Необходимо также отметить, что наиболее чувствительные к стрессу являются процессы липидной пероксидации по сравнению с белковой (табл. 2, рис.1, рис.2). 13 Учитывая выше изложенное, представляет интерес изучение взаимосвязи интенсивности двух процессов – ПОЛ и ПОБ, а также зависимость изменений изучаемых параметров от возраста животного. Зависимость уровня интенсивности ПОЛ и ПОБ в условиях стрессорного напряжения и в норме изучали путем корреляционного анализа. Нами получены достаточно разнонаправленные значения коэффициента корреляции как в контрольных группах, так и в разных органах при стрессе. Тесная положительная корреляция между уровнем белковой пероксидации и накоплением в ткани малонового диальдегида имеет место в гипоталамусе, больших полушариях и печени контрольных крыс всех возрастов, в то время как для легких и миокарда достоверных корреляционных связей не выявлено и коэффициент корреляции имел невысокие, но отрицательные значения. В условиях стресса между содержанием МДА и перекисным окислением белков в разных тканях также не прослеживается общей закономерной зависимости – коэффициент корреляции имеет различные величины и иногда прямопротивоположную направленность для разных органов и возрастных групп. Наиболее четкая положительная связь средней силы между ПОЛ и ПОБ обнаружена в гипоталамусе, больших полушариях и легких половозрелых крыс, легких старых животных и печени молодых. В то же время отрицательные значения коэффициента корреляции получены для гипоталамуса и миокарда крысят и для легких старых животных. Таким образом, прослеживается следующая закономерность: наиболее тесная как положительная, так и отрицательная связь между ПОЛ и ПОБ наблюдается в печени, легких, мозге крыс, в миокарде же получены менее выраженные и недостоверные значения коэффициента корреляции. Обращает так же на себя внимание положительная корреляционная зависимость между этими двумя окислительными процессами на фоне стресса только у взрослых половозрелых крыс. В целом можно сделать заключение об отсутствии тесной однонаправленной связи между ПОЛ и ПОБ, значения показателей которых зависимо изменяются не во всех органах животных. С целью изучения статистического влияния возрастного фактора на исследуемые параметры нами проведен дисперсионный анализ полученных данных (табл. 3). Сила влияния возраста на изменение окислительной модификации белков и перекисного окисления липидов обнаружена нами как в контроле, так и в группах стрессированных крыс. Наиболее высокая сила влияния имеет место в мозговой ткани, легких и миокарде для контрольных значений ПОБ и так же в печени для контрольных значений ПОЛ. Влияние возрастного фактора на стрессорную динамику изучаемых параметров было так же достаточно высоко во всех органах для ПОБ. Особенно выражено влияние возрастного фактора на стрессорный уровень МДА в конечном мозге и легких и стрессорный уровень белковой пероксидации в миокарде, мозговой ткани и печени. Только в миокарде стрессированных крыс нами не 14 обнаружена достоверная сила влияния возраста в содержании малонового диальдегида. Таблица 3 Результаты дисперсионного анализа в опытах по изучению влияния возраста на окислительную модификацию белков и липидов в тканях крыс в условиях фоновой активности и острого стресса Содержание ПОБ, нмоль/ч МДА, нмоль/0,05 г Ткань Группы ηx2 P ηx2 P 0.96±0.02 <0.001 Контроль 0.98±0.01 <0.001 Стресс 0.96±0.02 <0.001 Контроль Большие полушария 0.97±0.015 <0.001 Стресс 0,39±0,31 <0.01 Контроль Печень 0.95±0.025 <0.001 Стресс 0.71±0.15 <0.001 Контроль Легкие 0.85±0.075 <0.001 Стресс 0.71±0.15 <0.001 Контроль Миокард 0.92±0.04 <0.001 Стресс Примечание. P – достоверность силы влияния по Фишеру ηx2 - сила влияния Гипоталамус 0.96±0.02 0.52±0.24 0.93±0.035 0.99±0.005 0.94±0.03 0.74±0.13 0.99±0.005 0.99±0.005 0.92±0.04 0.16±0.42 <0.001 <0.01 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 >0.05 Следующим этапом нашей работы было изучение влияния природного антиоксиданта α-токоферола с целью выявления возможных его протекторных или регулирующих влияний на окислительные процессы в тканях в условиях фоновой активности и стрессорного воздействия. Для этого нами были выделены две группы опытных животных разных возрастных групп: крысы, которые в течение двух недель получали витамин Е в дозе 1 мг/100 г массы тела и животные, которые после 14-ти дневного перорального введения антиоксиданта подвергались стрессированию по выше описанной модели. В ходе комплексной оценки изучаемых показателей у животных, подвергавшихся действию стрессора и предварительно получавших антиоксидант, выявлено выраженное, как правило в большинстве случаев стресс-протекторное антиоксидантное действие витамина Е во всех изучаемых тканях и по основным показателям. Однако имеются факты разнонаправленных изменений показателей свободнорадикального окисления у этой группы опытных животных (стресс + витамин Е) у разных возрастных групп по показателям, как перекисной деструкции белковых так и липидных компонентов тканей. Так, при биохимическом анализе гипоталамической ткани показано значительное снижение под действием α-токоферола стрессорного уровня СРО у неполовозрелых животных: содержание МДА на 9%, скорости аскорбатзависимого ПОЛ на 39%, ПОБ – на 64%. Такая же тенденция по показателям ПОЛ имела место у взрослых и старых крыс, причем более выраженный антиоксидантный эффект проявился у половозрелых крыс, в 15 А 60 ГИПОТАЛАМУС 50 40 30 20 БОЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ 10 ПЕЧЕНЬ ЛЕГКИЕ МИОКАРД 0 -10 -20 С -30 Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е Б 60 50 ГИПОТАЛАМУС 40 30 20 10 БОЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ 0 ПЕЧЕНЬ ЛЕГКИЕ МИОКАРД -10 -20 С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е В 70 60 МИОКАРД 50 40 30 ПЕЧЕНЬ 20 ГИПОТАЛАМУС 10 БОЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ ЛЕГКИЕ 0 -10 С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е Рис.1. Изменение содержания малонового диальдегида в различных тканях неполовозрелых (А), половозрелых (Б) и старых (В) крыс при остром стрессе и введении витамина Е (в % к контрольным значениям) С – стрессорное воздействие, Е – введение α-токоферола, С+Е – предварительное стрессу введение α-токоферола 16 гипоталамусе которых уровень МДА снизился на 26%, скорость аскорбатзависимого ПОЛ на 50% по сравнению с крысами подвергавшимися электорокожному раздражению и не получавших антиоксидант. Совсем иная закономерность обнаружена нами в отношении белковой пероксидации у животных этих возрастов. Так под действием витамина Е уровень ПОБ у половозрелых крыс повысился на 91,6 %, а у старых достоверных изменений этого показателя не выявлено. Обращает на себя внимание факт значительного повышения ПОБ в гипоталамусе у 4-х месячных крыс у группы животных (стресс + витамин Е) не только по-сравнению со стрессом, но и с контрольным значением этого параметра. У старых же крыс значительных изменений уровня ПОБ не обнаружено, хотя так же наблюдалась тенденция к его повышению у этой опытной группы по сравнению с группой только стрессированных крыс (рис.1, рис.2). Дальнейшее исследование мозговой ткани обнаружило такую же реакцию больших полушарий у группы (стресс + витамин Е), причем единственная тенденция к повышению уровня ПОБ наблюдалась только у старых крыс, у которых в то же время имело место увеличение аскорбатзависимого ПОЛ (на 14,5%) (рис.1, рис.2). В ходе анализа результатов исследования СРО в органах висцеральной системы наряду с антиоксидантным действием витамина Е также было обнаружено и его прооксидантное действие по ряду показателей и у разных возрастных групп животных. Результаты указывают на снижение стрессорного уровня МДА, спонтанного и индуцированного ПОЛ в печени у крысят и половозрелых животных. Величина этих параметров по сравнению с группой крыс, подвергавшихся только стрессу понижалась в 1.5-2 раза. Однако совсем иная закономерность показана у старых крыс, у которых предварительное введение α-токоферола вызвало повышение уровня МДА в печени на 27% и тенденциозное повышение скорости спонтанного ПОЛ. При этом уровень белковой пероксидации у молодых животных этой группы (стресс + витамин Е) по сравнению с ЭКР достоверно повышался на 26,6%, а у половозрелых и старых наблюдалось лишь незначительное, но повышение ПОБ (рис.1, рис.2). В легких и миокарде неполовозрелых крысят предварительное введение токоферола также оказало протекторное действие, причем более выраженное в сердечной ткани, где уровень МДА снизился на 16%, скорость спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ на 21,4% и 60% соответственно. У половозрелых животных как и у старых предварительное введение витамина Е по ряду показателей не сопровождалось изменениями их значений, в некоторых случаях (аскорбатзависимое ПОЛ у взрослых и старых) снижало стрессорный уровень, а в некоторых случаях (МДА в миокарде у старых и аскорбатзависимое ПОЛ в легких у половозрелых) антиоксидант на фоне стресса приводил к достоверному повышению интенсивности СРО по сравнению с животными подвергшимися ЭКР и не получавших витамин Е (рис.1). 17 А 160 140 ГИПОТАЛАМУС 120 100 80 БЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ 60 ПЕЧЕНЬ 40 ЛЕГКИЕ 20 МИОКАРД 0 С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е Б 60 50 ГИПОТАЛАМУС ЛЕГКИЕ БОЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ 40 ПЕЧЕНЬ МИОКАРД 30 20 10 0 -10 -20 -30 С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е В 60 50 ГИПОТАЛАМУС БОЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ 40 МИОКАРД 30 ПЕЧЕНЬ 20 ЛЕГКИЕ 10 0 -10 -20 -30 С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е С Е С+Е Рис. 2. Влияние острого электрокожного раздражения и природного антиоксиданта на интенсивность перекисного окисления белков в различных тканях неполовозрелых (А), половозрелых (Б) и старых (В) крыс (в % к контрольным значениям) С – стрессорное воздействие, Е – введение α-токоферола, С+Е – предварительное стрессу введение α-токоферола 18 Наряду с этим в наших опытах значительных изменений уровня ПОБ в печени, легких и миокарде обнаружено не было, однако практически во всех случаях наблюдалась тенденция к его повышению у этой опытной группы животных (стресс + витамин Е) всех возрастных групп (рис.2). В контексте полученных нами данных о влиянии α-токоферола в условиях острого стрессирования несомненный интерес представляют эффекты антиоксиданта в условиях фоновой активности для чего мы провели сравнительный анализ его влияния, сопоставив значение изучаемых параметров у интактных (контрольных) животных и крыс, получавших супрафизиологические дозы α-токоферола на протяжении 14 дней. Результаты исследования показали снижение практически во всех тканях содержания малонового диальдегида после введения витамина Е только у неполовозрелых и взрослых животных, в отличие от старых, у которых токоферол во всех случаях оказал выраженный прооксидантный эффект. Это выражалось в повышении уровня МДА на 12% в гипоталамусе, на 9% в больших полушариях, на 4,5% в печени, на 8,4% в легких и на 32% в сердечной мышце. Причем повышение уровня липидной пероксидации после введения антиоксиданта подтвердилось и кинетическими характеристиками перекисного окисления липидов во всех органах именно у старых животных. У молодых животных стабильное снижение уровня МДА во всех органах за исключением гипоталамической области мозга сопровождалось разнонаправленными изменениями спонтанного и индуцированного ПОЛ. В частности, в больших полушариях, легких и миокарде эти показатели по сравнению контролем имели большее значение, а в печени и гипоталамусе видимых изменений не обнаружено (рис.1). На основании этого можно прийти к заключению о возрастной специфике влияния витамина Е на ПОЛ, которая выражается в его прооксидантном эффекте на позднем этапе онтогенеза и свойственном ему антиоксидантном действии у молодых и половозрелых животных. Исключение составляет гипоталамус крысят и 4-х месячных животных, где токоферол повысил исходный (контрольный) уровень МДА. Интересным представляется обнаруженный нами факт увеличения перекисной деструкции белков после введения витамина Е по сравнению с контрольными значениями изучаемых параметров. Так, у крысят уровень ПОБ повысился в гипоталамусе на 136,3%, в конечном мозге на 56,5%, в печени на 27,2%, легких на 18% и миокарде на 10%. Такая же закономерность наблюдалась у взрослых 4-х месячных и старых крыс (рис.2). В целом, вышеописанные результаты исследования влияния природного антиоксиданта позволяют прийти к следующим выводам. Сочетанное действие острого стресса и витамина Е вызвало выраженные антиоксидантные эффекты последнего в большинстве органов в отношении перекисного окисления липидов. При этом токоферол проявил такое стресслимитирующее действие только у молодых животных (крысят) и 4-х месячных. У старых крыс витамин Е в ряде органов (миокард, печень, 19 конечный мозг) не только не оказал протекторное действие, но и усилил накопление в них продуктов свободнорадикального окисления липидов при сочетанном действии острого стрессора (рис.1). Что касается перекисной деструкции белков у крыс, подвергшихся ЭКР и предварительно получавших витамин Е, то эффекты последнего имели возрастную и тканевую специфичность. Так, у крысят под действием витамина Е с последующим стрессированием интенсивность перекисного окисления белков понижалась по сравнению только с ЭКР в мозге, а повышалась в печени, легких и миокарде. У 4-х месячных крыс во всех тканях обнаружено увеличение ПОБ в группе (стресс + витамин Е), причем наибольший прооксидантный эффект наблюдался в гипоталамусе. И, наконец, у старых опытных животных сочетанное воздействие ЭКР и антиоксиданта также привело к увеличению накопления окисленных белков во всех тканях за исключением легочной, где наблюдалась тенденция к его снижению по сравнению с группой крыс, подвергнутых только стрессированию (рис.2). ВЫВОДЫ 1. На трех этапах постнатального онтогенеза обнаружены возрастные различия интенсивности свободнорадикальных процессов, которые заключаются в повышении уровня белковой пероксидации у старых крыс (мозг, миокард) и разнонаправленных тканезависимых изменениях уровня перекисного окисления липидов. Наиболее высокая сила влияния возраста на изучаемые параметры выявлена в мозговой ткани, легких и миокарде интактных животных для ПОБ и мозга, печени, легких и миокарда для ПОЛ. 2. На модели острого эмоционально-болевого стресса показана достоверная стресс-индуцированная активация перекисной деструкции белков, которая наиболее выражена в печени, конечном мозге крысят, гипоталамусе крысят и старых животных. Стрессорные изменения уровня липидной пероксидации носят разнонаправленный характер и зависят от возраста и ткани животного. 3. Наибольшей стресс-устойчивостью к свободнорадикальному окислению липидов обладают старые животные, у которых показана меньшая выраженность стрессорного усиления ПОЛ во всех изучаемых тканях. В разных органах молодых и половозрелых 4-х месячных крыс в условиях стресса показатели пероксидного окисления липидов отличаются разной направленностью и выраженностью изменений. 4. В ходе исследования выявлено влияние возрастного фактора на стрессорную динамику свободнорадикальных процессов во всех органах, что подтверждается результатами дисперсионного анализа полученных данных. Особенно выражено влияние возраста животного на стрессорный уровень малонового диальдегида в мозговой ткани, печени и миокарде для ПОБ и конечном мозге и легких для ПОЛ. 5. Процессы белковой и липидной пероксидации не находятся в тесной зависимости друг от друга; как в условиях фоновой активности, так и при 20 стрессорном воздействии не обнаружено тесной однонаправленной корреляционной связи между перекисной деструкцией белковых и липидных компонентов тканей. 6. Предварительное стрессированию введение альфа-ткоферола вызывает его выраженные антиоксидантные стресс-протекторные эффекты в большинстве органов в отношении ПОЛ только у молодых и половозрелых крыс. У старых животных витамин Е в ряде органов (миокард, печень, конечный мозг) оказывает прооксидантное действие. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Чумакова А.С. Тканеспецифические особенности возрастной и стрессорной динамики свободнорадикальных процессов в эксперименте / Ю.В. Нестеров, А.С. Чумакова // Естественные науки. – 2007. - №4(13). – С. 73-76. – 0,25 п.л., личный вклад 50%. Чумакова А.С. Возрастная динамика и тканеспецифические особенности свободнорадикальных процессов внутренних органов и центральной нервной системы белых крыс / Ю.В. Нестеров, Д.Л.Теплый, А.С. Чумакова// Естественные науки. –2008. - №2(23). – С. 73-76. – 0,25 п.л., личный вклад 33,3%. Чумакова А.С. Влияние острого эмоционально-болевого стресса, αтокоферола и их сочетания на перекисное окисление белков и липидов у крыс разного постнатального возраста / Ю.В. Нестеров, А.С. Чумакова// Астраханский медицинский журнал. – 2008 – Т.3, №3. – С. 51-58., 0,504 п.л., личный вклад 50%. Чумакова А.С. Тканеспецифические и возрастные особенности свободнорадикальных процессов в условиях фоновой активности и острого стресса в эксперименте / Ю.В. Нестеров, А.С. Чумакова // Современные научные технологии: Тезисы и материалы научной конференции молодых ученых АГУ 28-29 сентября 2006 г. - Астрахань, 2007. - С. 101-104. – 0,25 п.л., личный вклад 50%. Чумакова А.С. Влияние стресса и введения витамина Е на процессы перекисного окисления липидов в разных тканях / А.С. Чумакова, Д.А. Круглова, Н.В. Некрасова, Н.А. Ломтева // Тезисы докладов итоговой научной конференции Астраханского государственного университета. – Астрахань, 2003. – С. 23., 0,063 п.л., личный вклад 25%. Чумакова А.С. Динамика процесса перекисного окисления липидов при действии эмоционально-болевого стресса на ранних этапах постнатального онтогенеза / Ю.В. Нестеров, А.С. Чумакова, Е.В. Мамонтова // Свободные радикалы, антиоксиданты и старение: Материалы Международной научной конференции 2-3 ноября 2006 г. Астрахань, 2006. - С. 102-105., 0,25 п.л., личный вклад 33,3%. Чумакова А.С. Тканеспецифические особенности перекисного окисления белков и липидов у крыс разного возраста / Ю.В. Нестеров, А.С. 21 8. Чумакова // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря: Материалы IX Международной научной конференции 1011октября 2006 г. - Астрахань, 2006. - С. 177-179., 0,188 п.л., личный вклад 50%. Чумакова А.С. Онтогенетические особенности свободнорадикальной деструкции белков и липидов мозговой ткани при остром стрессе и введении α-токоферола / Ю.В. Нестеров, А.С. Чумакова// Биологические исследования. – 2008. - №1. – С. 64-66., 0,188 п.л., личный вклад 50%. _________________________________________________________________ Подписано в печать ___________2009 г. Бумага офсетная. Печать офсетная. Формат 60*84 1/16. Усл.печ.л. – 1.5 Заказ № ____. Тираж 100 экз. Издательство Астраханского государственного университета 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20. 22
