Структура казеинов и механизм сычужного свертывания. 1

УДК 637.325:543.54
СТРУКТУРА КАЗЕИНОВ И МЕХАНИЗМ СЫЧУЖНОГО
СВЕРТЫВАНИЯ. 1. НЕКОТОРЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
И ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ КАЗЕИНОВ.
(Обзор литературы)
Ельчанинов В.В., к.т.н.
ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Россельхозакадемии, Барнаул
Начальной стадией производства сыра является преобразование молока
в молочный (сырный) сгусток. Традиционно, это достигается добавлением
молокосвертывающего фермента к молоку или молочной смеси (молоко,
стартерная закваска, соли кальция). После завершения свертывания молока и
синерезиса (сжатия) сгустка, его разрезают, отделяют от сыворотки, а полученное сырное зерно подвергают соответствующей технологической обработке.
В молоке содержится два типа белков: растворимые глобулярные сывороточные белки, и казеины, которые формируют стабильную коллоидную
суспензию белковых агрегатов или казеиновых мицелл. Именно казеиновые
мицеллы, под воздействием сычужных ферментов, агрегируют и образуют
молочный сгусток. Поэтому физико-химические свойства индивидуальных
казеинов и казеиновых мицелл играют основную роль в процессе сычужного
свертывания молока.
Предметом четырех обзорных статей, предлагаемых Вашему вниманию
в данном сборнике, станут избранные аспекты структуры казеинов и некоторые физико-химические процессы, лежащие в основе сычужного свертывания молока.
Химические свойства казеинов. Казеины входят в семейство фосфопротеинов. В коровьем молоке к белкам этого семейства относятся αs1-,
αs2-, β- и κ-казеины, синтез которых контролируется четырьмя индивидуальными генами. Вместе они составляют около 80% всех белков коровьего молока и содержатся в пропорции примерно 4:1:4:1 [21,22].
Синтезированные de novo казеины претерпевают два типа посттрансляционных модификаций – фосфорилирование и гликозилирование. Обе модификации важны с точки зрения физико-химических свойств и самоассоциации этих белков. Среди казеинов коровьего молока гликозилирован только
каппа-казеин. Гликозилируемые аминокислотные остатки треонина (Thr121,
Thr131 Thr133, Thr135, Thr136, Thr142, Thr165) и, возможно, серина (Ser141),
расположены на гидрофильном С-терминальном участке молекулы κ-казеина
и несут короткие цепи карбогидратов [23-25,28]. Гликозилированию подвергаются далеко не все молекулы κ-казеина, поэтому не гликозилированная
форма является основным компонентом в препаратах этого белка [25]. Гли-
козилированные С-терминальные участки каппа-казеина, высвобождаемые
под действием молокосвертывающих протеаз, называются гликомакропептидами. Олигосахаридные цепи, включают в себя отрицательно заряженные
остатки сиаловой кислоты, что в целом усиливает гидрофильный характер и
гидродинамический объем, экспонированного на поверхности казеиновой
мицеллы, С-терминального участка κ-казеина [2].
Второй важной посттрансляционной модификацией казеинов является
фосфорилирование. Все казеины, в различной степени, фосфорилируются, в
основном, по остатку серина, и лишь изредка - по остатку треонина. Реакция
присоединения остатков фосфорной кислоты осуществляется на участке
аминокислотной последовательности, имеющем структуру: -Ser-X-A-, где Х
– любая аминокислота, А – Gly, SerP и, реже, Asp [26]. Фосфорилированные
остатки серина в аминокислотных последовательностях αs1-, αs2- и βказеинов образуют кластеры (группы, скопления). В молекуле β-казеина имеется один фосфосериловый кластер, в αs1-казеине - два, в αs2-казеине – три
[27]. Каппа-казеин, в отличие от αs1-, αs2- и β-казеинов, не содержит фосфосериловых кластеров. Большинство молекул κ-казеинов содержит только
один фосфорилированный остаток серина в положении 149 [28]. Потенциальные сайты казеинов коровьего молока почти всегда полностью фосфорилированы. Например, одна молекула αs2-казеина может нести от 10 до 13
остатков фосфорной кислоты. По одному потенциальному остатку серина не
фосфорилировано в молекулах αs1- и β-казеинов [29].
Влияние степени фосфорилирования различных групп казеинов отражается на их способности к кальций-индуцированной преципитации. Наиболее кальций-чувствительным белком является αs2-казеин, который преципитирует в присутствии 2 мМ Са2+ [30]. Преципитация αs1-казеина начинается
в диапазоне 3-8 мМ Са2+ [30-32], а β-казеинов – при концентрации ионов
кальция 8-15 мМ [31,32]. Каппа-казеин, при этих же концентрациях кальция
(2-15мМ), остается в растворимой форме, а в смеси с любым другим казеином (αs1-, αs2-, β-), предотвращает его преципитацию, образуя вместо этого,
коллоидную суспензию [2].
Структура казеинов. Данные о степени присутствия вторичной структуры у казеинов – противоречивы. До недавнего времени считалось, что казеины не имеют организованной вторичной структуры, и молекулярная организация этих белков описывается как высоко гидратированный случайный
клубок (random coil). Открытая, подвижная и легко "адаптирующаяся", к изменениям микроокружения структура казеинов, получила название реоморфной (rheomorphic) [33]. Однако, исследования вторичной структуры казеинов, выполненные в начале второго тысячелетия (2001-2002 г.г.), повидимому, изменят прежние представления, так как оказалось, что определенные участки β- и κ-казеинов содержат упорядоченные структуры (так
называемые "структурные мотивы") типа полипролин II-спираль и участки,
напоминающие β-складки [34,35,112].
Но, по мнению D.S. Horne - автора одной из последних моделей структуры казеиновой мицеллы, - с точки зрения механизмов самоассоциации ка-
зеинов и организации казеиновых мицелл, гораздо большее значение, чем
наличие узнаваемых и легко идентифицируемых элементов вторичной структуры, играет амфифильность этих белков [36]. Амфифильные [amphi (греч.) –
оба; phyle (греч.) – сродство] молекулы содержат как полярные (или ионные)
гидрофильные группировки так и гидрофобные неполярные углеводородные группы. Мы уже упоминали о кластерной организации фосфорилированных сериловых остатков в молекулах αs1-, αs2- и β-казеинов. Расположенные на флангах фосфосериловых кластеров полярные и заряженные аминокислотные остатки, придают этим участкам ярко выраженные гидрофильные свойства. Гидрофобные аминокислотные R-группы в молекулах αs1-,
αs2-, β-, и κ-казеинов, также сконцентрированы на определенных участках.
Таким образом, в молекулах казеинов наблюдается выраженное чередование
гидрофильных и гидрофобных участков (блоков), что позволяет рассматривать эти молекулы как линейные сополимеры блоков с разными физикохимическими свойствами [2]. Логично предположить, что гидрофильные и
гидрофобные блоки казеинов в растворах ведут себя совершенно по-разному.
Рассмотрим молекулу β-казеина, состоящую из двух блоков – короткий
N-терминальный участок несет гидрофильный фосфосериловый кластер, а
протяженный С-терминальный пептид богат гидрофобными R-группами
(Рис.1). Поведение бэтта-казеина при контакте с гидрофобной поверхностью,
отражает специфику его блочной структуры – не полярный (гидрофобный)
С-терминальный пептид прочно связывается с гидрофобной поверхностью, а
гидрофильный N-терминус не контактирует с поверхностью, "выпячивается"
в жидкую фазу и взаимодействует только с растворителем. Именно такое поведение β-казеина подтверждается многочисленными расчетами и экспериментальными данными, полученными различными методами [2,37,38,39].
Рассматривая, аналогичным образом, аминокислотную последовательность молекулы αs1-казеина, мы увидим, что её можно разделить на три блока: относительно короткий гидрофобный N-терминальный участок, гидрофильную петлю в центре, несущую фосфосериловые кластеры, и протяженный гидрофобный С-терминальный пептид (Рис.1). В растворе, при наличии
гидрофобной поверхности, С- и N-концы свяжутся с ней, а центральная петля
не адсорбируясь будет "выпячиваться" и контактировать только с растворителем [39].
По аналогии с αs1- и β-казеином аминокислотную последовательность
αs2-казеина можно представить как структуру, состоящую из 4-х блоков.
Это: гидрофильный N-терминальный "хвост", с фосфосериловыми кластерами, далее идет короткий гидрофобный участок, за ним следует гидрофильная
петля, также несущая кластер из фосфорилированных R-групп серина, и замыкает последовательность второй протяженный гидрофобный участок, расположенный на С-терминальном конце молекулы (Рис.1).
Структура κ-казеина является зеркальным отражением структуры βказеина, с гидрофильным С-терминальным казеинмакропептидом, который
"отрезается" химозином, и гидрофобным N-терминальным участком, предшествующим ключевой связи Phe105-Met106 (Рис.1). При этом важно отме-
тить, что макропептидный участок не содержит фосфосериловых кластеров,
а несет только один фосфорилированный остаток серина в положении 149
[2].
Рисунок 1 - Распределение относительного электрического заряда и
относительной гидрофобности по длине полипептидной цепи казеинов [110].
Профили распределения электрического заряда и гидрофобности по
полипептидной цепи κ-казеина даны для не гликозилированного генетического варианта В. Гликозилирование κ-казеина эффективно снижает относительную гидрофобность в районе 130 аминокислотного остатка за счет экранирования гидрофобных R-групп от контакта с растворителем.
Самоассоциация (самосборка) казеинов. В растворе индивидуальные
казеины проявляют сильную тенденцию к самоассоциации, характер и конечные продукты которой (тип ассоциата), определяются топографией гидрофильных и гидрофобных блоков.
Так β-казеин, структура которого напоминает структуру молекулы детергента (гидрофильная "голова" и гидрофобный "хвост"), в растворе формирует детергентоподобные мицеллы, состоящие из гидрофобного ядра и торчащих наружу гидрофильных участков (Рис. 2b), напоминающие свернувшегося в клубок ежа [40]. Aльфа-s1-казеин в растворе образует червеобразные
самоассоциаты (цепочки) (Рис. 2a), за счет связывания друг с другом гидрофобных концов разных молекул [41]. Растворение κ-казеина, также сопровождается формированием мицелл (самоассоциатов), за счет взаимодействия
друг с другом гидрофобных N-терминальных участков, образующих неполярное ядро. При этом в системе устанавливается равновесие: мономерный
κ-казеин↔мицеллярный κ-казеин. Предполагается, что вторичная структура
κ-казеина, особенно в области гидрофобного пара-κ-казеинового участка,
напоминает β-складку [112]. Кроме температуры, рН и ионной силы на рост
полимеров каппа-казеина оказывают влияние межмолекулярные дисульфидные связи, формируемые Cys11 и Cys88 [42,43]. В нативном коровьем молоке
каппа-казеин находится в виде локализованных на поверхности мицеллы полимеров, стабилизированных, помимо гидрофобных, еще и дисульфидными
связями. Но даже после восстановления -S-S- связей каппа-казеин сохраняет
способность к самоасооциации и адсорбции на поверхности казеиновых мицелл [110].
Рисунок 2 – Схемы полимерных структур, формируемых в растворе
молекулами αs1-казеина (а) и β-казеина (b) [4].
Прямоугольные участки и изогнутые линии на схемах казеинов соответствуют гидрофобным и гидрофильным последовательностям полипептидной цепи. Существование таких структур подтверждено экспериментально
[43-46].
Экспериментально показано, что размер полимерных цепей αs1казеинов и мицелл β-казеинов, образуемых путем самоассоциации в растворе, зависит от рН и ионной силы, а в случае бэтта-казеина и от температуры.
Температура значительно влияет на силу гидрофобных взаимодействий
(прямая положительная зависимость), а рН и концентрация ионов определяют интенсивность и "радиус действия" сил электростатического отталкивания. Например, αs1-казеин в разбавленных растворах с низкой ионной силой
и щелочных значениях рН, существует в виде мономеров, но при нейтральном рН мономеры агрегируют, за счет гидрофобных взаимодействий, с образованием рыхлых агрегатов [110,111]. Равновесие между силами гидрофоб-
ного связывания и электростатического отталкивания регулирует размер агрегатов и силу межмолекулярных взаимодействий [2].
Исследование бинарных смесей трех основных семейств казеинов (αs1, β- и κ-казеин) позволило установить, что скорость образования межмолекулярных агрегатов выше, чем скорость формирования мономолекулярных ассоциатов. При одновременном смешивании αs1-, β- и κ-казеинов, в первую
очередь образуются комплексы αs1- : κ-казеины, после чего формируются
комплексы αs1- : β-казеины [110]. В формировании гетерогенных казеиновых
агрегатов участвуют ионы кальция, которые связываются с фосфосериловыми группами αs- и β-казеинов.
Со списком литературы Вы можете ознакомиться, направив запрос по
электронной почте на имя автора, по адресу: ve3636@yandex.ru
Реферат
УДК 637.325:543.54
СТРУКТУРА КАЗЕИНОВ И МЕХАНИЗМ СЫЧУЖНОГО
СВЕРТЫВАНИЯ. 1. НЕКОТОРЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
И ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ КАЗЕИНОВ.
(Обзор литературы)
Ельчанинов В.В., к.т.н.
ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Россельхозакадемии, Барнаул
Статья посвящена специфическим особенностям структуры казеинов,
связанных с механизмами ассоциации этих белков и важных для понимания
механизмов самосборки казеиновой мицеллы. Рассмотрены два типа посттрансляционных модификаций казеинов молока – фосфорилирование и гликозилирование – и их влияние на физико-химические свойства индивидуальных белков. Представлены данные об особенностях ассоциации казеинов в
гомогенных и гетерогенных белковых растворах.