Дзугкоев Сергей Гаврилович - Ростовский государственный
advertisement
На правах рукописи Дзугкоев Сергей Гаврилович МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ, СОПРОВОЖДАЮЩИЕ ПАТОЛОГИЮ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ ОРГАНОВ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ. ПЕРСПЕКТИВЫ КОРРЕКЦИИ. 14. 03. 03. - патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Ростов-на-Дону – 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биомедицинских исследований Владикавказского научного центра Российской академии наук и Правительства Республики Северная Осетия – Алания Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор НИКУЛИНА Дина Максимовна Официальные оппоненты: ЗАХАРОВА Наталия Борисовна доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Саратовский государственный медицинский Университет им. В.И. Разумовского Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая центральной научно-исследовательской лабораторией МОРОЗОВА Ольга Леонидовна доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры патологической физиологии ЗОТОВА Валентина Владимировна доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Государственное бюджетное учреждение Ростовской области «Областная детская больница», заведующая лабораторией Ведущая организация Федеральное государственное образовательное учреждение профессионального образования университет дружбы народов» бюджетное высшего «Российский Защита состоится «_____» ___________2013 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.03 на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29) Автореферат разослан «______» ____________2013 года Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Хаишева Л.А. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы Широкий интерес современной медико-биологической науки к проблеме сахарного диабета (СД) объясняется его значительной распространенностью в мире, где в настоящее время насчитывается более 300 млн. больных СД и по прогнозам ВОЗ к 2030 году ожидается увеличение числа больных до 438 млн. Растущая распространенность, частота и тяжесть сосудистых осложнений приводят к инвалидизации и преждевременной смертности трудоспособного населения (Науменко Л.В., Кузнецова В.А., Спасов А.А., 2010; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2011; Курбанов Э.Ю., Сергеев В.Г., 2011). Особенностями сосудистых осложнений являются микроангиопатии – повреждение мелких сосудов почек, сетчатки глаза и периферической сосудистой системы. Данные ряда авторов (Белкина Л.М., Терехина О.Л., Смирнова Е.А.; 2010) также свидетельствуют, что наличие СД типа 1 сопряжено с высоким риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, в первую очередь, ишемической болезни сердца (ИБС). Изучение функциональных и биохимических механизмов развития сосудистых осложнений СД остается одной из наиболее актуальных проблем фундаментальной и клинической медицины. Среди нескольких гипотез, объясняющих патогенез сосудистых диабетических поражений, особое место занимает развитие окислительного стресса, вследствие повышенной генерации активных метаболитов кислорода (АМК) и нарушения антиоксидантной защиты (АОЗ) клеток (Волчегорский И.А., Рассохина Л.М., Мирошниченко И.Ю., 2010). Фактором риска в условиях окислительного стресса становится эндотелиальная дисфункция, основными механизмами которой могут быть изменения активности и/или экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), сниженный синтез оксида азота (NO) из L-аргинина, сниженная чувствительность гладкомышечных клеток (ГМК) к NO или усиленная его деградация за счет взаимодействия с активными формами кислорода (АФК), включая супероксид-анион и другие продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ). Эффективность образования NO зависит от наличия субстрата – L-аргинина, транспорт которого подвержен негативному влиянию окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛНП) (Судаков Н.П., Никифоров С.Б., Пушкарев Б.Г., 2010). Другой причиной низкой биодоступности NO может быть повышенный уровень в плазме крови ассиметричного 3 диметиларгинина (АДМА) – эндогенного конкурентного ингибитора eNOS (Joutouzas K, Riga M, Stefanidi E et al., 2008). Учитывая важную роль нарушения NOпродуцирующей функции эндотелия в условиях окислительного стресса в развитии сосудистых осложнений СД, необходим новый методологический подход патогенетической терапии диабетических ангиопатий, основанный на применении препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами и способностью нормализовать метаболизм NO (Тюренков И.Н., Воронков А.В., Слиецанс А.А., 2010; Черноморцева Е.С., Покровский М.В., Титарева Л.В., 2010). Из литературных данных известно, что основная утечка супероксиданион радикала О2- при СД происходит на уровне III комплекса дыхательной цепи, а применение SKQ1 и коэнзима Q10 способствует восстановлению ультраструктуры митохондрий и улучшению функции кардиомиоцитов. L-карнитин способствует транспорту ацилов жирных кислот в митохондрии, их последующему окислению и образованию восстановленных коферментов для дыхательной цепи. Другой препарат – селективный анксиолитик афобазол, синтезированный в ГУНИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, обладает способностью позитивно модулировать продукцию NO, ингибируя индуцибельную изоформу NO-синтазы и стимулируя конститутивную эндотелиальную NO-синтазу (NOS-3) и одновременно обладает антиоксидантными свойствами (Середенин С.Б., Воронин М.В., 2010). Изучение влияния эндогенных регуляторов и митохондриально- ориентированных антиоксидантов – коэнзима Q10, L-карнитина, а также афобазола на биохимические и функциональные показатели сосудистой системы является весьма актуальным. Более того, в доступной литературе отсутствуют данные о биохимических маркерах эндотелиальной дисфункции и влиянии эндогенных регуляторов эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), антиоксидантов и афобазола на гемодинамику и структурно-функциональную организацию жизненно важных органов – почки, печень, миокард при экспериментальном сахарном диабете (модель СД типа 1). Цель работы: получить комплексные данные о биохимических и функциональных механизмах развития эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете типа 1, а также метаболических и гистологических изменениях висцеральных органов для разработки способов патогенетической коррекции. Задачи исследования 4 1. Определить роль NO-продуцирующей системы: концентрации суммарных метаболитов оксида азота, уровня экспрессии eNOS в эндотелии аорты в механизмах развития эндотелиальной дисфункции у крыс с моделью СД типа 1. 2. Показать особенности нарушения метаболизма оксида азота, участие в этом процессе L-аргинина и L-NGаргинина, метилового эфира (L-NAME) при экспериментальном сахарном диабете в условиях окислительного стресса. 3. Установить характер метаболических нарушений и структурных повреждений сосудистой системы и висцеральных органов (почки, сердце, печень) при экспериментальном сахарном диабете. Показать влияние коэнзима Q10, Lкарнитина и афобазола на биохимические и гистологические показатели этих систем. 4. Выявить изменения биохимических показателей нарушений углеводного, белкового и липидного обменов у больных сахарным диабетом типа 1 с сосудистыми осложнениями: нефропатия, периферические ангиопатии. Показать выраженность нарушений функциональной способности почек и микроциркуляторной гемодинамики в зависимости от степени компенсации обмена веществ. 5. Разработать и применить технологию коррекции выявленных нарушений с использованием эндогенных регуляторов eNOS: L-аргинина, LNAME, а также их комбинации с антиоксидантами: Q10, L-карнитином и афобазолом при СД в эксперименте. 6. Исследовать влияние комплексной терапии с коэнзимом Q10 на биохимические и функциональные показатели у диабетических больных с нефропатиями и периферическими ангиопатиями с различной степенью компенсации обмена веществ. Научная новизна Впервые в работе использован комплексный подход к исследованию механизмов формирования эндотелиальной дисфункции и ее роли в гемодинамических нарушениях, биохимических и гистологических изменениях висцеральных систем: почек, печени, миокарда. Вскрыты патобиохимические механизмы нарушения метаболизма NO в условиях окислительного стресса, установлен характер изменения экспрессии eNOS при СД в эксперименте и показано участие в этом механизме L-аргинина и ингибитора eNOS L-NAME 5 аналога АДМА; изучены корреляционные взаимосвязи этих показателей с интенсивностью ПОЛ, активностью ферментов АОС и концентрацией NOx. Впервые установлен органо-системный характер окислительного стресса и нарушений, вызванных изменением гомеостаза в NO этих условиях, патогенетической основой которых является эндотелиальная дисфункция. В клинике у больных СД типа 1 с нефропатией и периферическими ангиопатиями различной степени компенсации (декомпенсированные, субкомпенсированные, компенсированные формы) установлена роль СРО и нарушения метаболизма NO в механизмах развития этих сосудистых осложнений. Разработана и применена технология оптимизации традиционного лечения инсулином в комбинации с метаболически корригирующим препаратом - коэнзимом Q10. Результаты фундаментальных исследований позволили установить участие и взаимосвязь нарушений метаболизма оксида азота и показателей окислительного стресса, а также метаболических, функциональных и гистологических механизмов развития сосудистых осложнений СД. На основании сравнительного анализа экспериментальных и клинических данных, полученных фундаментальных знаний, сформирована концепция о механизмах развития сосудистых осложнений СД, а также разработан новый методологический подход, направленный на восстановление NO-продуцирующей функции эндотелия и энергообразования в клетках висцеральных органов. Новизна исследований подтверждается полученными патентами на изобретение (4) и одного свидетельства о государственной регистрации программы для ЭВМ. Научно-практическая значимость Результаты изучения динамики показателей активности про- и антиоксидантных систем и их роли в нарушении механизмов регуляции гомеостаза NO и развитии эндотелиальной дисфункции (ЭД) при СД в эксперименте и клинике имеют общее медико-биологическое, а также клиническое значение для понимания патогенеза сосудистых осложнений СД и направленного поиска адекватных способов оптимизации профилактики и лечения нефро- и ангиопатий. Получены фундаментальные данные о роли доноров NO и ингибиторов eNOS, в частности Lаргинина и L-NAME, а также эндогенных антиоксидантов - коэнзима Q10, Lкарнитина, а также афобазола в регуляции метаболических и гемодинамических изменений в эксперименте при СД. Проведенные клинические исследования 6 свидетельствуют об эффективности комплексного лечения с коэнзимом Q10 у больных СД-1 (субкомпенсированная форма) с нефропатией и периферическими ангиопатиями. Эти данные подтверждают его антиоксидантную роль и позволяют рекомендовать системное применение антиоксидантных препаратов для профилактики и лечения в субкомпенсированной стадии развития сосудистых осложнений СД. Основные положения, выносимые на защиту Сахарный диабет в клинике и эксперименте характеризуется 1. нарушением метаболизма оксида азота в условиях окислительного стресса, который приобретает системно-органный характер и сопровождается нарушением структурной и функциональной организации внутренних органов (почки, печень, сердце). Причинами нарушения гомеостаза оксида азота являются: дефицит 2. субстрата - L-аргинина, повышение в крови эндогенного ингибитора eNOS – ассиметричного диметиларгинина, угнетение экспрессии eNOS, снижение биодоступности оксида азота и нейтрализация его активными формами кислорода. Сосудистые осложнения сахарного диабета в клинике и эксперименте 3. характеризуются нарушением системной гемодинамики, повышением модуля упругости, реографического индекса, упруго-эластических свойств и снижением пульсового кровенаполнения микроциркуляторных сосудов, развитием периферических ангиопатий. 4. Применение эндогенного регулятора экспрессии eNOS - L-аргинина приводит к угнетению окислительного стресса, повышению концентрации NO в плазме крови и экспрессии eNOS, сопровождающиеся ускорением микроциркуляторной гемодинамики, вследствие снижения упруго-эластических свойств (плотности) сосудистой стенки в микроциркуляторном русле. В противоположность этому, L-NAME – аналог эндогенного ингибитора eNOS АДМА, способствует повышению концентрации МДА и снижению содержания оксида азота, что проявляется нарушением микроциркуляторной гемодинамики. 5. Использование препаратов метаболической коррекции – коэнзима Q10, L-карнитина и афобазола при ЭСД способствует угнетению ПОЛ, активации АОС, увеличению концентрации NO в плазме крови, вследствие повышенной доступности субстрата - L-аргинина для NO-продуцирующего фермента, 7 угнетению активности эндогенного ингибитора фермента и повышенной экспрессии NOS-3. 6. Применение эндогенных антиоксидантов и афобазола, угнетающих окислительный стресс при ЭСД, вызывает повышение активности Na,K-АТФазы в гомогенатах почек, печени, миокарда, снижение активности ферментов: АлАТ, АсАТ, ГГТП и экскреторного – щелочной фосфатазы в плазме крови, а также частичное восстановление гистологической структуры внутренних органов. 7. У больных СД типа 1 с диабетической нефропатией (субкомпенсированная форма) комплексная терапия с коэнзимом Q10 способствует компенсации процесса метаболизма, снижению степени протеинурии, повышению трансмембранного транспорта воды, электролитов и снижению в сыворотке крови концентрации креатинина и мочевины. Применение коэнзима Q10 с базисной терапией у диабетических больных с периферическими ангиопатиями вызывает увеличение пульсового кровенаполнения в сосудах нижних конечностей, реографического индекса и модуля упругости на фоне компенсации обмена веществ. Личный вклад автора Автор самостоятельно разработал методические подходы к решению поставленной цели и задач, выполнил экспериментальные и клинические исследования, провел математическую и статистическую обработку и анализ с обобщением полученных результатов. Апробация работы Основные положения работы доложены и обсуждены на: Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ 2010); I Региональной междисциплинарной конференции молодых ученых «Наука–обществу» (Владикавказ, 2010); II международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2011); Международном научном форуме «Наука и общество», Физиология и медицина 21 века, 6 Петербургская встреча лауреатов Нобелевской премии (Санкт-Петербург, 2011); V региональной научнопрактической конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения» (Владикавказ, 2011); на VII MEZINÁRODNI VÊDECKO-PRAKTICKA KONFERENCE «VÊDECKY POKROK NA PRELOMU NYSYACHALETY». (Praha, 8 2011); Х конференции молодых ученых и специалистов СОГМА (Владикавказ, 2012); XI конференции молодых ученых и специалистов СОГМА «Молодые ученые - медицине» (Владикавказ, 2012); 8 международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», г. Судак (Крым, Украина) 2012г; 9 международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения», Астрахань 2013г. Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликована 41 научная работа, в том числе 23 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации. Внедрение результатов работы Материалы диссертации используются в лекциях и научных исследованиях на кафедре биохимии и клинико-лабораторной диагностики ГБОУ ВПО Астраханской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России и кафедре общей и клинической биохимии с клинико-лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО Самарского государственного университета и в научно-исследовательской работе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства Республики Северная Осетия – Алания. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 281 страницах, иллюстрирована 52 таблицами (из них 46 в приложении) и 58 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка литературы, содержащего 412 источников (189 отечественных и 223 зарубежных). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Работа выполнена в период с 2008 по 2013 гг. на базе отдела патобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства Республики Северная Осетия – Алания (экспериментальная часть) и на базе Республиканского эндокринологического диспансера РСО-Алании (клиническая часть). Материалы и методы исследования 9 Эксперименты проводили в хронических опытах, в одно и тоже время суток, сезоны года. Провели 15000 исследований, включая биохимические (определение концентрации глюкозы, гликированного Hb (HbС1) в сыворотке крови, МДА, ГП в эритроцитах, активности СОД, каталазы, Na+,К+-АТФ-азы, концентрации ЦП, суммарных метаболитов NO, экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), общего белка, мочевины, креатинина, активности ферментов: АсАТ, АлАТ, ГГТП, щелочной фосфатазы, показателей обмена ХС: ОХС, ХС ЛВП, ХС ЛНП, ТАГ, содержания Na, K в сыворотке крови и моче, функциональные (характер кровотока в магистральных артериях и в сосудах микроциркуляции), гистологические исследования у животных и клинические исследования у больных СД типа 1 с нефро- и ангиопатиями различной степени компенсации обмена веществ и функционального состояния почек (водо-, электролито- и азотовыделительная функции почек), исследование кровотока в сосудах нижних конечностей – реовазография с помощью диагностической системы «Валента». По реовазограмме определяли следующие показатели: реографический индекс, модуль упругости, время максимального систолического наполнения, диастолический индекс, венозный отток. Экспериментальные исследования проводили на 310 крысах-самцах линии Wistar одной возрастной группы (10-14 месяцев), массой 175-220 гр интактных и с аллоксановым сахарным диабетом. Моделирование аллоксанового диабета производилось внутрибрюшинным введением 5% водного раствора аллоксана, синтезированного в отделе патобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства Республики Северная Осетия – Алания в дозе 15-18 мг/100гр массы на фоне 24-48-часового голодания. Развитие диабета контролировали по уровню глюкозы крови, который определяли глюкозооксидазным методом. Модель считали состоявшейся при повышении сахара крови и диуреза более чем в 2 раза. Животных брали в опыт по окончании остротоксического периода действия аллоксана, т.е. спустя 14 дней с момента развития экспериментального сахарного диабета. В качестве объектов исследования использовали сыворотку, плазму крови, эритроциты, гомогенаты коркового и мозгового вещества почечной ткани, печени и миокарда, мочу, эндотелий аорты, а также ткани почек, печени и миокарда для гистологического 10 исследования. В эксперименте определяли: состояние липидного обмена по уровню общего холестерина (ХС), ХС ЛНП, ХС ЛВП в крови и интенсивность перекисного окисления липидов в эритроцитах, почках, печени и миокарде по концентрации гидроперекисей и вторичного продукта – малонового диальдегида (методом Аsacawa T., 1980). О состоянии антиоксидантной системы судили по активности супероксиддисмутазы, определяемой методом аутоокисления адреналина, каталазы (М.А. Королюк и соавт., 1988) и концентрации церулоплазмина в сыворотке крови. Активность Na+,K+-АТФ-азы определяли по методу Scow JC. (1957). Удельную активность фермента рассчитывали на мг белка в час (мкмоль/Рн/мг белка/час). Белок в пробах определяли по методу Lowry OH. (1951). Определяли концентрацию стабильных суммарных конечных метаболитов оксида азота (NO2- и NO3-, NOХ) в сыворотке крови и уровень экспрессии eNOS в эндотелии аорты (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., Литинская О.А. 2004). Для проведения анализа уровня экспрессии, аорты извлекали, промывали физиологическим раствором и помещали в специальные пластиковые пробирки типа «Эппендорф», которые хранили в жидком азоте. Затем аорты перетирали с жидким азотом в фарфоровой ступке, переносили в микроцентрифужную пробирку, трижды промывали фосфатным буфером, рН 7.4 и осадок после центрифугирования (10 мин. при 1000 x g) собирали в 100 мкл лизирующего буфера. Полосу, соответствующую eNOS, детектировали в соответствии с ее молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Пленку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab. Результаты представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы Х к интенсивности полосы, принятой за контроль на каждой пленке. Аорта и сосуды микроциркуляции экспериментальных крыс подвергались гистологическому исследованию микроскопически. Количественную оценку гистологических изменений проводили по методу Автандилова с помощью цифрового фотоаппарата “Nikon”, совмещенного с микроскопом. Для изучения гемодинамики у наркотизированных животных исследовали кровоток в магистральных сосудах – брюшной аорте (БА), нижней полой вене (НПВ), почечных артериях (ПА) и микроциркуляторном звене допплерографически 11 с помощью ультразвукового портативного допплерографа ММ-Д-Ф фирмы «Минимакс» СП(б), использовали 6 основных точек локации. Обследовано 69 больных с СД типа 1, из них 30 больных с диабетической нефропатией и 39 человек с СД типа 1 с явлениями периферической диабетической ангиопатией и метаболическими нарушениями различной степени компенсации до, после базисной и комплексной терапии и 20 здоровых лиц без сахарного диабета, составивших контрольную группу. Длительность заболевания сахарным диабетом составила в среднем 9,461±1,285 лет, возраст больных варьировал от 18 до 46 лет (в среднем 30,205±1,367 лет). Среди обследованных: 40 мужчин и 29 женщин, больных сахарным диабетом типа 1. Диагностику, оценку степени тяжести СД и фазы компенсации проводили по клинико-лабораторным критериям в Республиканском эндокринологическом диспансере РСО-Алания в соответствии с рекомендациями эндокринологического научного центра РАМН. Для анализа биохимических показателей забирали образцы крови у больных с СД, которые были разделены на 3 группы в зависимости от степени компенсации обмена веществ: декомпенсированные больные - до лечения (n=22 чел.); больные с субкомпенсированной формой СД, получавшие базисную терапию препаратами инсулина короткого действия (актрапид) и промежуточного действия (протапид, монотард, хумулин) (n=25 чел.); больные с субкомпенсированной формой СД, получавшие комплексное лечение: препараты инсулина + коэнзим Q10 по 2 капсулы по 0,5 гр. (Эвалар ЗАО) в день во время еды (n=22). Концепцию и идеологию работы определял дизайн исследования (рис.1.). На каждого пациента формировалась карта сбора информации и компьютерная база данных с оцифрованными вазограммами и результатами биохимических и функциональных исследований. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики, принимая во внимание коэффициент вариации динамических рядов, и оценивали корреляцию, учитывая ее достоверность по стандартным таблицам (Л.С. Каминский), с использованием компьютерной программы статанализа «STATISTIKA 6.0 for Windows». 12 Клинический этап Комплексное обследование функционального и биохимического статуса больных СД-1 с нефропатией и периферической ангиопатией разной степени компенсации обмена веществ Лабораторный этап Изучение особенностей состояния ПОЛ-АОС, метаболизма NO и ферментативного спектра крови и тканей почек, печени и миокарда особенности метаболизма NO: концентрация NOx, доступность L-аргинина и NO, экспрессия eNOS в эндотелии аорты Системно-органный характер окислительного стресса и активности Na,KАТФ-азы направленность изменений активность сопряженной системы ПОЛ и АОС в клетках тканей печени, почек, миокарда Патогенетическое обоснование способов оптимизации лечения и профилактики метаболических нарушений при СД-1 в эксперименте и клинике Анализ эффективности предложенных методов коррекции метаболических нарушений при СД в эксперименте и клинике Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции: Концентрация МДА Активность СОД Экспрессия eNOS Концентрация суммарных метаболитов NO Активность каталазы Концентрация церулоплазмина Биодоступность NO Рисунок 1. Дизайн экспериментально-клинических, лабораторных и функциональных исследований при сахарном диабете. Результаты исследования и их обсуждения На фоне стойкой гипергликемии и повышения концентрации гликированного гемоглобина при ЭСД и у больных СД типа 1 происходит нарушение аэробных процессов окисления, образование АФК, особенно супероксид анион радикала (O2-) на уровне III компонента ЦПЭ и развитие системного окислительного стресса. В хронической стадии аллоксанового диабета отмечается повышение концентрации МДА в эритроцитах, гомогенатах коркового, мозгового вещества почечной ткани, печени и миокарда, снижение активности СОД, увеличение активности каталазы, концентрации церулоплазмина в сыворотке крови (табл.1). У крыс с ЭСД на фоне развившегося оксидативного стресса выявлено снижение концентрации суммарных метаболитов NO (табл.1). Корреляционный анализ показал наличие отрицательной сильной связи между повышением МДА в крови и снижением концентрации суммарных метаболитов NO (r=-0,74). Сниженная продукция NO может быть связана со следующими причинами: 1) взаимодействием NO с 13 супероксиданион-радикалом (О2-) с образованием пероксинитрита, причем О2значительно активнее реагирует с NO, чем скорость реакции дисмутации (О2-) СОД с образованием пероксида (Н2О2); 2) нарушением доступности субстрата L-аргинина для эндотелиальной NO-синтазы (еNOS) и повышением в крови ингибитора еNOS; 3) с низким уровнем экспрессии и активности фермента еNOS и с нарушением биодоступности NO; 4) с изменением гистологической структуры эндотелия. Доступность субстрата для NO-синтазы мы определяли в специальной серии экспериментов при ежедневном введении L-аргинина в течении 4-х недель диабетическим и интактным крысам в дозе 10 мг/кг веса тела. Данные показали уменьшение степени выраженности дисбаланса в системе СРО-АОС и одновременно статистически достоверное повышение концентрации суммарных метаболитов NO в сыворотке крови (табл.1). Введение же интактным и диабетическим крысам ингибитора еNOS – NG-аргинина, метилового эфира (LNAME) вызвало возрастание содержания метаболитов ПОЛ по данным концентрации МДА в эритроцитах при одновременном снижении активности СОД в эритроцитах и сыворотке крови. При этом отмечается снижение концентрации суммарных метаболитов NO на фоне введения L-NAME интактным крысам (табл.1). Активация СРО на фоне ингибитора еNOS – LNAME может быть обусловлена так называемым «разобщением» оксидазного и редуктазного доменов еNOS, когда фермент вместо NO продуцирует АФК. Причиной этому является недостаточность восстановленных коферментов данного энзима, в частности тетрагидробиоптерина (ВН4) в условиях окислительного стресса (Marletta M.A., II Cell 1994; Vasguez-Vival J, Kalyanaraman B, Martasek P. Free Radic Res, 2003). Все эти изменения могут влиять на уровень экспрессии NOS-3 в эндотелии аорты. Результаты исследования уровня экспрессии eNOS в эндотелии аорты у диабетических крыс под влиянием L-аргинина и L-NAME показали, что субстрат энзима L-аргинин повышает уровень экспрессии eNOS, тогда как L-NAME – снижает (рис.2). 14 Рисунок 2. Экспрессия eNOS в эндотелии аорты на фоне L-аргинина и L-NAME у крыс с СД. Примечание: А – метчики; В – эндотелий (стандартная полоса для пересчета); 1-2 - LNAME; 3-4 ЭСД + L-NAME; 5-6 аргинин; 7-8 ЭСД + L-аргинин. Анализ данных допплерографии выявил повышение сосудистого тонуса и нарушение микроциркуляции, на что указывают реографические показатели, характеризующиеся более высокими значениями индекса Гослинга, повышением плотности сосудистой стенки (PI) и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Индекс Пурсело (RI), отражающий общее периферическое сосудистое сопротивление (ОПСС), у животных с ЭСД был выше, чем в контроле. Снижение средней и систолической скоростей кровотока в микроциркуляторных сосудах отражает нарушение гемодинамики. В соответствии с нашими данными можно считать, что эти функциональные изменения являются следствием нарушенного метаболизма NO и интенсивности образования метаболитов ПОЛ, влияющих на проницаемость и тонус сосудов. Не исключается развитие морфологических изменений: гистологическая картина микроциркуляторных сосудов у крыс с СД подтвердила наличие повреждения эндотелия, присутствие очаговой эксфолиации эндотелия, расширение щелей между сохранившимися дистрофически измененными эндотелиоцитами. На транспорт L-аргинина в эндотелиальную клетку могут оказывать влияние окисленные ЛНП (оЛНП). Их содержание в хронической стадии аллоксанового диабета повышается. Гиперхолестеринемия и гипер-β-липопротеинемия способствуют повреждению эндотелия сосудов вследствие атерогенеза. Существует отрицательная корреляционная связь между содержанием NO и концентрацией ЛНП (r= -0,68) и между МДА и NO (r= -0,65). Это способствует уменьшению эндотелийзависимой вазодилатации. Полученные результаты созвучны с литературными данными, свидетельствующими о торможении оЛНП высвобождения NO эндотелиальными клетками (Chin J.H., Azhar S., 15 Hoffman B.B. 1982; Plane F, Bruckdorber K.R., Kerr P. et al., 1992; Zulli A., Widdop B., Hare D.L. et al., 2003). Для выяснения роли дисфункции эндотелия в развитии нарушений висцеральных органов (почки, печень, миокард) мы исследовали в них показатели ПОЛ, активность мембранного фермента – Na,K-АТФ-азы, а также органоспецифических ферментов в сыворотке крови: АлАТ, АсАТ, ГГТП и экскреторного фермента – щелочной фосфатазы у крыс в хронической стадии аллоксанового диабета. Результаты активности Na,K-АТФ-азы висцеральных органов показали, что в условиях окислительного стресса у крыс с ЭСД статистически достоверно снижается активность Na,K-АТФ-азы в обоих слоях почечной ткани, в гомогенатах печени и миокарда. Активность Na,K-АТФ-азы остается сниженной при ЭСД на фоне введения L-NAME и несколько повышается под влиянием L-аргинина. Увеличение активности АлАТ, АсАТ, ГГТП свидетельствуют о повышенной проницаемости мембран гепатоцитов и кардиомиоцитов в результате ПОЛ, изменяющего структуру фосфолипидов и, по мере активации этого процесса, превращающего фосфолипиды в лизофосфолипиды. Повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови свидетельствует Биохимические о нарушении нарушения цитоплазматических экскреторной проницаемости мембран внутренних функции сосудистой органов печени. системы и сопровождались гистологическими изменениями в почках, печени и миокарде. Развивается очаговый экссудативный и продуктивный экстра- и интракапиллярный гломерулонефрит. В миокарде имеет место очаговая дистрофия с мелкими фокусными очагами некроза в кардиомиоцитах, исчезновение поперечной исчерченности в участках кардиомиопатии. В печеночной ткани выявлена жировая дистрофия групп гепатоцитов и признаки микроангиопатии в виде гиперемии, плазматического пропитывания стенок сосудов, лимфогистиоцитарной инфильтрации микроциркуляторного русла долек и портальных трактов, экстравазаты. Т.о., длительно прогрессирующий процесс при декомпенсированном СД приводит к полиорганным нарушениям (нефропатия, кардиопатия, гепатопатия), обусловленным биохимическими и 16 структурными изменениями русла капилляров, артериол, венул и мембран клеток органов. В условиях выраженных метаболических изменений, сопровождающихся активацией перекисных процессов, страдает система, ответственная за продукцию NO и развивается дисфункция эндотелия. Для коррекции дисбаланса ПОЛ - АОЗ, нарушений метаболизма NO и гемодинамических изменений экспериментальным животным вводили, соответственно, коэнзим Q10 (группа №7), L-карнитин (группа №10) и афобазол (группа №13) в различных вариантах: на фоне эндогенных регуляторов экспрессии eNOS – L-аргинина + коэнзим Q10 (группа №8), афобазол (группа №14) и L-карнитин (группа №11) и на фоне L-NAME + коэнзим Q10 (группа №9), афобазол (группа №15) и L-карнитин (группа №12) и в виде монотерапии. В контрольных исследованиях вводили эндогенные регуляторы интактным крысам. Полученные нами результаты свидетельствуют о существенном угнетении ПОЛ по данным снижения концентрации МДА в крови под влиянием коэнзима Q10, L-карнитина и афобазола и их комбинации с L-аргинином. Однако, и на фоне L-NAME эндогенные антиоксиданты вызвали угнетение интенсивности ПОЛ и снижение концентрации МДА в крови. При сравнительном анализе результатов ингибирования ПОЛ наиболее эффективным является коэнзим Q10 и его комбинация с L-аргинином. Анализ активности ферментов антиоксидантной системы показал достоверное возрастание активности СОД в сыворотке крови и эритроцитах, а исходно повышенная активность каталазы и концентрации церулоплазмина достоверно снизились. Характер изменения активности ферментов АОС на фоне коэнзима Q10, L-карнитина и афобазола в комбинации с L-NAME был аналогичен, но эффективность препаратов была менее значимой. Повышение активности СОД ингиброванием во всех накопления вариантах исследований супероксиданиона, сопровождается образованием Н2О2, разрушающейся каталазой (Chang JM, Kuo MC, Kuo HT, Chiu YW, Chen HC., 2005). С другой стороны, это препятствует образованию пероксинитрита, предупреждая при этом повреждение эндотелия сосудов (Ванин А.Ф., 2000). На фоне лечения в 9-ти вариантах исследований у экспериментальных крыс с СД статистически достоверно повысилась концентрация суммарных 17 метаболитов оксида азота в сыворотке крови, причем наиболее значимо на фоне коэнзима Q10 и его комбинации с L-аргинином. Коэнзим Q10, L-карнитин и афобазол частично устранили действие ингибитора eNOS – L-NAME, однако концентрация NOx в сыворотке крови была ниже сравнительно с данными на фоне монотерапии коэнзимом Q10, L-карнитином и их комбинации с Lаргинином. Корреляционный анализ продемонстрировал эффективность действия антиоксидантов на интенсивность ПОЛ и активность ферментов АОЗ. Анализ данных показал прямую корреляционную связь между концентрацией МДА и активностью каталазы (r=+0,57; r= +0,62; r= +0,60; р<0,001) и концентрацией церулоплазмина (r= +0,52; r= +0,59; r= +0,58; р<0,001) на фоне коэнзима Q10 и L-карнитина соответственно и обратной связи между уровнем снижения концентрации МДА и повышением активности СОД в эритроцитах крови (r= -0,54; r= -0,59; r= -0,61; р<0,001). Между концентрацией метаболитов NO и МДА существует отрицательная, сильная корреляционная связь на фоне всех вариантов лечения соответственно (r= -0,59; r= -0,60; r= -0,57; p<0,001). 18 Таблица №1 Биохимические показатели сыворотки крови на фоне эндогенных регуляторов eNOS и антиоксидантов у крыс с ЭСД группы N ЭСД L- аргинин L-name ЭСД + L-name ЭСД + L-аргинин ЭСД + коэнзим Q ЭСД+ L-name + коэнзим Q ЭСД + L-аргинин + коэнзим Q ЭСД + L-карнитин ЭСД + L-name + L-карнитин ЭСД + L-аргинин + L-карнитин ЭСД + афобазол ЭСД + L-name + афобазол ЭСД + L- аргинин + афобазол МДА нмоль/мл 6,87±0,044 8,65±0,031 1111 ) 6,8±0,017 2222 ) 7,213±0,012 111 2222 ) ) 9,186±0,009 1111 2222 3333 ) ) ) 7,88±0,021 1111 2222 3333 ) ) ) 7,20±0,027 1111 2222 4444 ) ) ) 7,97±0,044 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 6,95±0,046 2222 4444 5555 ) ) ) 7,31±0,035 1111 2222 333 4444 ) ) ) ) 8,06±0,031 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 7,05±0,04 111 2222 333 4444 5555 ) ) ) ) ) 7,26±0,061 1111 2222 4444 ) ) ) 8,01±0,053 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 7,03±0,014 111 2222 3333 4444 555 ) ) ) ) ) NO мкмоль 51,069±0,5 32,54±1,56 1111 ) 53,25±0,412 111 2222 ) ) 33,13±0,595 111 ) 30,74±0,567 1111 3333 ) ) 42,27±0,893 1111 2222 3333 ) ) ) 49,046±0,518 111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 41,4±0,982 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 51,18±0,415 2222 333 4444 555 ) ) ) ) 48,3±1,142 1 2222 3333 4444 ) ) ) ) 39,72±1,268 1111 222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 50,11±0,467 2222 3333 4444 5 ) ) ) ) 48,7±0,844 11 2222 3333 4444 ) ) ) ) 40,23±0,62 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 50,54±0,472 2222 3333 4444 5 ) ) ) ) СОД ед.акт. 88,2±1,07 64,4±1,53 1111 ) 88,8±1,031 2222 ) 82,1±1,24 111 2222 ) ) 61,5±2,63 1111 3333 ) ) 70,3±1,096 1111 222 3333 ) ) ) 76,3±0,93 1111 2222 333 4444 ) ) ) ) 71,5±1,69 1111 222 3333 444 5 ) ) ) ) ) 85,3±1,713 2222 4444 555 ) ) ) 72,9±0,615 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 68,54±0,626 1111 22 3333 444 5555 ) ) ) ) ) 80,1±0,741 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 74,6±1,55 1111 2222 333 4444 ) ) ) ) 70,1±1,51 1111 222 3333 444 5 ) ) ) ) ) 82,5±1,276 111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) каталаза мкат/л 225,56±25,57 345,33±3,16 1111 ) 221,72±1,056 2222 ) 310,03±2,054 111 2222 ) ) 382,14±1,58 1111 2222 3333 ) ) ) 320,2±2,08 111 2222 3333 ) ) ) 304,51±3,17 111 2222 4444 ) ) ) 330,37±3,05 1111 222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 280,51±1,004 1 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 311,2±1,674 111 2222 4444 ) ) ) 340,7±3,40 1111 3333 4444 5555 ) ) ) ) 290,7±2,991 11 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 307,6±3,35 111 2222 4444 ) ) ) 338,15±1,84 1111 2 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 283,64±1,42 1 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) ЦП мг/л 338,66±6,365 467,6±8,945 1111 ) 336,3±1,43 2222 ) 360,2±6,697 11 2222 ) ) 497,1±5,25 1111 222 3333 ) ) ) 419,8±6,806 1111 2222 3333 ) ) ) 382,2±6,943 1111 2222 3 4444 ) ) ) ) 426,2±5,589 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 349,7±4,868 2222 333 4444 5555 ) ) ) ) 396,1±6,621 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 433,5±5,314 1111 222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 352,7±4,156 2222 333 4444 5555 ) ) ) ) 394,2±4,86 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 430,1±5,08 1111 222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 351,4±2,676 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) Примечание: 1111) - p<0,001; 111) - p<0,01; 11) - p<0,02; 1) - p<0,05 – достоверность относительно нормы; 2222) - p<0,001; 222) - p<0,01; 22) p<0,02; 2) - p<0,05 - относительно ЭСД; 3333) - p<0,001; 333) - p<0,01; 33) - p<0,02; 3) - p<0,05 – относительно L-name; 4444) - p<0,001; 444) - p<0,01; 44) - p<0,02; 4) - p<0,05 – относительно ЭСД + L-name; 5555) - p<0,001; 555) - p<0,01; 55) - p<0,02; 5) - p<0,05 – между 7/8,9; 10/11,12; 13/14,15. 19 Таблица №2 Липидный спектр крови на фоне эндогенных регуляторов eNOS и антиоксидантов у крыс с ЭСД группы N ЭСД М±m М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p ХС ммоль/л ХС ЛВП ммоль/л ХС ЛНП ммоль/л 1,88±0,033 3,896±0,161 0,673±0,01 0,556±0,012 1,098±0,026 3,124±0,15 1111 1111 1111 ) ) 0,476±0,018 1111 ) 0,652±0,0075 1,114±0,023 0,251±0,009 1,88±0,023 L-name 2222 2222 2222 2222 ) ) ) ) 0,699±0,008 1,036±0,031 0,239±0,012 1,841±0,03 L- аргинин 2222 1 2222 2222 2222 ) ) ) ) ) 0,466±0,006 3,21±0,015 0,489±0,008 3,898±0,013 ЭСД + L-name 1111 1111 2222 1111 1111 ) ) ) ) ) 0,572±0,012 2,766±0,015 0,458±0,008 3,546±0,013 ЭСД + L-аргинин 1111 2 1111 1111 22 1111 ) ) ) ) ) ) 0,63±0,005 1,465±0,068 0,39±0,017 2,272±0,062 ЭСД + коэнзим Q 1111 2222 3333 1111 2222 3333 1111 2222 3333 1111 222 3333 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) 0,617±0,006 1,525±0,019 0,412±0,019 2,329±0,016 ЭСД+ L-name + коэнзим Q 1111 2222 3333 1111 2222 3333 1111 2222 3333 1111 22 333 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) 0,65±0,009 1,438±0,02 0,3±0,012 2,225±0,021 ЭСД + L-аргинин + коэнзим Q 1111 2222 3333 2222 3333 1111 2222 3333 111 2222 3333 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) 0,601±0,003 1,706±0,044 0,41±0,019 2,493±0,04 ЭСД + афобазол 1111 2222 3333 1111 222 3333 1111 2222 3333 1111 22 3333 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) 0,594±0,009 1,758±0,024 0,43±0,006 2,547±0,017 ЭСД + L-name + афобазол 1111 2222 3333 1111 22 3333 1111 2222 3333 1111 22 3333 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) 0,613±0,008 1,637±0,019 0,35±0,013 2,409±0,014 ЭСД + L- аргинин + афобазол 1111 2222 3333 1111 2222 333 1111 2222 3333 1111 2222 3333 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) 1111 111 11 1 2222 222 Примечание: ) - p<0,001; ) - p<0,01; ) - p<0,02; ) - p<0,05 – достоверность относительно нормы; ) - p<0,001; ) - p<0,01; 22) 2 3333 333 33 3 p<0,02; ) - p<0,05 - относительно ЭСД; ) - p<0,001; ) - p<0,01; ) - p<0,02; ) - p<0,05 – относительно L-name и L-аргинина. 20 ) ТАГ ммоль/л 0,246±0,011 Таблица №3 Активность ферментов сыворотки крови на фоне эндогенных регуляторов eNOS и антиоксидантов у крыс с ЭСД группы N ЭСД L-name L- аргинин ЭСД + L-name ЭСД + L-аргинин ЭСД + коэнзим Q ЭСД+ L-name + коэнзим Q ЭСД + L-аргинин + коэнзим Q ЭСД + L-карнитин ЭСД + L-name + L-карнитин ЭСД + L-аргинин + L-карнитин ЭСД + афобазол ЭСД + L-name + афобазол ЭСД + L- аргинин + афобазол М±m М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p М±m p АлАТ мкмоль/(с*л) 1,13±0,027 1,73±0,028 АсАТ мкмоль/(с*л) 1,06±0,03 1,896±0,065 ГГТП нмоль/(с*л) 535,78±52,32 1322,4±55,1 Щелочная фосфатаза нмоль/(с*л) 348,05±15,51 848,58±43,60 1111 1111 1111 1111 ) ) ) 1,141±0,011 1,09±0,012 541,59±0,96 2222 2222 2222 ) ) ) 1,107±0,012 1,041±0,012 535,31±0,885 2222 2222 2222 ) 1,818±0,014 1111 222 3333 ) ) ) 1,612±0,023 1111 222 3333 ) ) ) 1,303±0,03 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 1,552±0,011 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 1,20±0,026 2222 333 4444 555 ) ) ) ) 1,4±0,029 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 1,64±0,026 1111 22 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 1,25±0,032 111 2222 3333 4444 555 ) ) ) ) ) 1,377±0,046 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 1,597±0,02 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 1,239±0,015 111 2222 3333 4444 ) ) ) ) ) 1,995±0,018 1111 3333 ) ) 1,733±0,028 1111 2 3333 ) ) ) 1,498±0,042 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 1,611±0,012 1111 2222 3333 4444 555 ) ) ) ) ) 1,261±0,011 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 1,55±0,022 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 1,72±0,022 1111 22 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 1,38±0,027 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 1,53±0,077 1111 222 3333 4444 ) ) ) ) 1,685±0,018 1111 222 3333 4444 5 ) ) ) ) ) 1,357±0,014 1111 2222 3333 4444 5 ) ) ) ) ) ) 1331,35±14,38 1111 3333 ) ) 1198,63±20,56 1111 2 3333 ) ) ) 836,23±37,62 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 940,35±15,27 1111 2222 3333 4444 55 ) ) ) ) ) 730,66±0,80 111 2222 3333 4444 555 ) ) ) ) ) 850,7±3,57 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 968,36±2,86 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 741,5±3,077 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 844,59±36,94 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 950,54±15,04 1111 2222 3333 4444 555 ) ) ) ) ) 730,63±0,83 111 2222 3333 4444 555 ) ) ) ) ) ) 390,83±0,92 111 2222 ) ) 344,26±1,117 2222 ) 860,85±1,12 1111 3333 ) ) 740,81±0,977 1111 22 3333 ) ) ) 645,9±4,472 1111 2222 3333 4444 ) ) ) ) 757,57±1,35 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 449,72±0,81 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 697,8±2,843 1111 222 3333 4444 ) ) ) ) 789,5±1,609 1111 3333 4444 5555 ) ) ) ) 472,4±1,676 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 684,3±3,787 1111 222 3333 4444 ) ) ) ) 770,34±0,83 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) 460,4±0,87 1111 2222 3333 4444 5555 ) ) ) ) ) Примечание: 1111) - p<0,001; 111) - p<0,01; 11) - p<0,02; 1) - p<0,05 – достоверность относительно нормы; 2222) - p<0,001; 222) - p<0,01; 22) p<0,02; 2) - p<0,05 - относительно ЭСД; 3333) - p<0,001; 333) - p<0,01; 33) - p<0,02; 3) - p<0,05 – относительно L-name; 4444) - p<0,001; 444) - p<0,01; 44) - p<0,02; 4) - p<0,05 – относительно ЭСД + L-name; 5555) - p<0,001; 555) - p<0,01; 55) - p<0,02; 5) - p<0,05 – между 7/8,9; 10/11,12; 13/14,15. 21 Для оценки NО-продуцирующей функции эндотелия мы определяли уровень экспрессии eNOS в экстрактах эндотелия аорты у диабетических крыс на фоне лечения коэнзимом Q10, L-карнитином и афобазолом и их комбинации с L-аргинином и L-NAME. Представленные данные свидетельствуют о повышении уровня экспрессии фермента на фоне лечения антиоксидантами (табл.4). Сравнительный анализ результатов показал, что наибольший уровень экспрессии выявлен на фоне лечения коэнзимом Q10 (рис.3; табл.4). Анализ данных повышения доступности Lаргинина для фермента eNOS показал снижение в сыворотке крови ОХС и ХС ЛНП, а также повышение ХС ЛВП, являющихся антиатерогенными (табл.2). Рисунок 3. Экспрессия эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) (140 kDa) в аортах крыс на фоне ЭСД при терапии коэнзимом Q10. Таблица №4 Изменение уровня экспрессии eNOS под влиянием афобазола, коэнзима Q10, L-карнитина и их комбинации с L-аргинином и L-NAME Варианты исследований Аргинин (интактные крысы) стат. показатели M±m eNOS, ед 1,05±0,087 ЭСД + аргинин M±m 0,65±0,104 111) ЭСД + аргинин + коэнзим Q M±m 1,55±0,029 1111) 2222) ЭСД + аргинин + афобазол M±m 1,51±0,12 111) 2222) ЭСД + аргинин + L-карнитин M±m 1,15±0,061 2222) L-name (интактные крысы) M±m 0,567±0,088 ЭСД + L-name M±m 0,305±0,003 333) ЭСД + L-name + коэнзим Q M±m 0,84±0,081 3) 4444) ЭСД + L-name + афобазол M±m 0,753±0,199 4444) ЭСД + L-name + L-карнитин M±m 0,617±0,068 4444) Примечание: аргинина; 2222 1111 ) - p<0,001; ) - p<0,001; 111 ) - p<0,01; ) - p<0,02; 1) - p<0,05 достоверность относительно 11 ) - p<0,01; 22) - p<0,02; 2) - p<0,05 достоверность относительно ЭСД и 222 аргинина; 3333) - p<0,001; 333) - p<0,01; 33) - p<0,02; 3) - p<0,05 достоверность относительно L-name; 4444) p<0,001; 444) - p<0,01; 44) - p<0,02; 4) - p<0,05 достоверность относительно ЭСД и L-name. 22 Увеличение числа эндотелиальных клеток и уменьшение межэндотелиальных щелей и плазматического пропитывания слоев аорты, установленное гистологически, способствовало повышению уровня экспрессии фермента в эндотелии аорты. Выявлено повышение микроциркуляторной гемодинамики, что проявлялось увеличением средней и систолической скоростей кровотока, снижением упругоэластических свойств сосудов микроциркуляторного русла (плотности сосудистой стенки) - индекса Гослинга (PI) и удельного периферического сосудистого сопротивления – индекса Пурсело (RI). Эти гемодинамические изменения свидетельствуют о повышении микроциркуляторной гемодинамики, обусловленное снижением сосудистого сопротивления – реографического индекса и повышением средней и систолической скоростей кровотока на фоне введения комбинации эндогенных регуляторов с L-аргинином. На фоне L-NAME коэнзим Q10, L-карнитин и афобазол проявили свое действие, однако степень выраженности изменений микроциркуляторной гемодинамики была меньше, хотя концентрация NOx в сыворотке крови повысилась, но оставалась статистически достоверно ниже уровня монотерапии данными препаратами. Для подтверждения эффективности влияния коэнзима Q10 и L-карнитина на гемодинамику в микроциркуляторном русле провели корреляционный анализ между концентрацией NO и скоростью кровотока соответственно средней, систолической и диастолической. Данные показали, что между повышением концентрации NO и улучшением процессов микроциркуляции выявлена положительная сильная корреляционная связь (r= +0,57; r= +0,48; r= +0,46 на фоне коэнзима Q10 и r= +64; r= +0,61; r= +0,58 на фоне L-карнитина). Коэнзим Q10, Lкарнитин и афобазол улучшают доступность субстрата - L-аргинина к ферменту еNOS, тормозят влияние эндогенного ингибитора, повышают уровень экспрессии еNOS в эндотелии сосудов и концентрацию суммарных метаболитов оксида азота, способствуют восстановлению функции эндотелия, повышению микроциркуляторной гемодинамики. Угнетение ПОЛ эндогенными антиоксидантами и афобазолом способствовало активации Na,K-АТФ-азы в гомогенатах коркового и мозгового вещества почечной ткани, а также печени и миокарда. Эти данные свидетельствуют о повышении энергообразования (АТФ) в процессе окислительного фосфорилирования при более адекватном функционировании дыхательной цепи на фоне эндогенных антиоксидантов - коэнзима Q10 и L-карнитина и их комбинации с донором NO - Lаргинином. 23 Восстановление гидрофобности цитоплазматических мембран клеток внутренних органов препятствовало выходу из них трансаминаз – АлАТ, АсАТ, а также ГГТП, о чем свидетельствовало снижение активности этих энзимов в сыворотке крови. Более эффективными оказались эндогенные антиоксиданты на фоне Lаргинина. В противоположность этому их введение на фоне ингибирования eNOS вызвало менее значимый результат. Биохимические изменения, способствующие восстановлению структурнофункциональных свойств мембран клеток внутренних органов, сопровождались снижением проявлений микроангиопатии у диабетических крыс. В почках сократилось количество клубочков, подвергшихся фрагментации и фокусным некрозам. В миокарде увеличилась площадь поперечной исчерченности кардиомиоцитов за счет уменьшения дистрофических изменений. А в печени уменьшились признаки жирового гепатоза и наметилась активация процессов внутриклеточной регенерации (реституция). У больных СД-1 с диабетической нефропатией (декомпенсированная форма) имеет место увеличение спонтанного диуреза, снижение скорости клубочковой фильтрации, уровня канальцевой реабсорбции воды. При этом страдают процессы экскреции с мочой одновалентных ионов натрия и калия, т.е. натрийурез сопровождается угнетением калийуреза. Повышение экскреции натрия с мочой происходит вследствие уменьшения реабсорбции данного катиона в канальцах почек. При этом у больных с декомпенсированной формой СД-1 концентрация натрия статистически достоверно снижается, а уровень калия возрастает. Аналогичные, но менее выраженные изменения функции почек были выявлены и у больных субкомпенсированной формой сахарного диабета 1 типа. Таким образом, нефропатия сопровождалась протеинурией и нарушением функционального состояния почек у больных до лечения и на фоне лечения препаратами инсулина. Нарушения липидного обмена проявлялись повышением концентрации общего ХС, а также ХС ЛНП и снижением ХС ЛВП (рис.5). Эти данные свидетельствуют о преобладании в сыворотке крови атерогенных ЛП у больных с декомпенсированной формой СД типа 1. После проведенного курса комплексной терапии произошел значительный сдвиг в системе ПОЛ-АОЗ в пользу последней, а также повышение концентрации NOx в сыворотке крови у больных на фоне комплексного лечения. Между 24 концентрацией МДА и NOx выявлена отрицательная корреляционная связь (r=-0,71). Следовательно, коэнзим Q10, оказывая регулирующее влияние на дыхательную цепь, угнетая образование АМК, повышает энергообразование, сглаживает дисбаланс между активностью ферментов СОД и каталазы, повышая активность СОД и снижая активность каталазы (рис.5). Динамика метаболических показателей на фоне комплексного лечения отмечена более существенными изменениями со стороны углеводного, липидного и азотистого обменов. Рисунок 4. Изменения содержания общего ХС и ХС липопротеинов различной плотности у больных СД типа 1. Примечание: (д). декомпенсированная форма; (с). субкомпенсированная форма; (к). компенсированная форма. Значительно снижается уровень гликированного Hb, концентрация мочевины и креатинина, а содержание общего белка в сыворотке крови повышается. На фоне комплексного лечения с коэнзимом Q10 статистически достоверно снизилась активность в сыворотке крови органоспецифических ферментов (АлАТ, АсАТ) по сравнению 25 с базисной терапией декомпенсированной и субкомпенсированной форм СД-1. Такую же динамику дает мембранный фермент ГГТП и экскреторный – щелочная фосфатаза (рис.6). Рисунок 5. Изменение биохимических показателей сыворотки крови у больных СД с разной степенью компенсации метаболизма. Примечание: (д). декомпенсированная форма; (с). субкомпенсированная форма; (к). компенсированная форма. Все эти данные свидетельствуют о необходимости включения в комплексную терапию антиоксидантов, в частности, коэнзима Q10. 26 Рисунок 6. Изменение активности трансаминаз и ГГТП у больных СД различной степени компенсации обмена веществ. Примечание: (д). декомпенсированная форма; (с). субкомпенсированная форма; (к). компенсированная форма. Таким образом, дисбаланс в системе ПОЛ – АОЗ крови и NO-продуцирующей функции эндотелия, зависящий от гипергликемии, гликозилирования белков крови и дислипопротеинемии, характерен для больных с СД типа 1 (декомпенсированная и субкомпенсированная формы) и сопровождается системно-органными нарушениями. Применение коэнзима Q10 в течение 14-20 дней в комплексе с препаратами инсулина способствует коррекции взаимоотношений в системе ПОЛ – АОС, повышает концентрацию NOх в сыворотке крови, снижает содержание гликированного гемоглабина (Нb1С), общего ХС, ХС ЛНП, повышает ХС ЛВП, оказывает мембранотропное действие в клеточных структурах почек, печени, миокарда и клетках крови, способствуя снижению показателей протеинурии и повышению функциональной способности органов. Следовательно, в формировании нефропатии и повреждения мембран клеток внутренних органов у больных СД типа 1 значительную роль играют биохимические 27 нарушения, что делает возможной их комплексную коррекцию препаратами метаболического действия. На фоне комплексного кровенаполнения, микроциркуляции, незначительного лечения вследствие снижения повышения происходила нормализация восстановления тонуса в артериол сегментах эластичности и голени. прекапилляров Об этих пульсового сосудов или его изменениях свидетельствуют уменьшение реографического индекса и модуля упругости стенки артериол и прекапилляров. У разных больных СД тонус венозной сети частично или полностью восстановился, в соответствии с чем, объем венозного оттока уменьшился. В сегментах стопы на фоне сахароснижающих и метаболически корригирующего препарата также отмечается улучшение пульсового кровенаполнения, вследствие уменьшения сосудистого тонуса, о чем свидетельствует снижение модуля упругости. Происходит падение объема венозного оттока из-за повышения тонуса венозной сети, т.е. ликвидация венозного застоя. Одновременно повышается эластичность артериальных и микроциркуляторных сосудов и отмечается снижение артериального давления, достигающее у большинства больных СД нормального уровня. У этой категории больных угнетение ПОЛ, повышение активности СОД, концентрации суммарных метаболитов NO, снижение концентрации общего ХС и ХС атерогенных ЛНП сопровождались восстановлением эластичности сосудов микроциркуляции, снижением тонуса артериол и прекапилляров, модуля упругости и повышением пульсового кровенаполнения в сегментах голени и стопы, а также уменьшением венозного застоя. Снижение сосудистого сопротивления в микроциркуляторном русле сопровождалось нормализацией артериального давления. 28 Рисунок 7. Патогенетическая схема. 29 ВЫВОДЫ 1. Метаболические нарушения при сахарном диабете декомпенсированной формы в эксперименте проявляются стабильной гипергликемией, повышением уровня гликированного гемоглобина, способствующие развитию окислительного стресса. Формирующийся окислительный стресс приобретает системный характер. 2. Активные метаболиты кислорода и окислительный стресс приводят к нарушению метаболизма оксида азота, снижению концентрации суммарных метаболитов NO в сыворотке крови и его биодоступности, что сопровождается нарушением эндотелийзависимой вазодилятации, повышением упруго-эластических свойств (плотности) сосудистой стенки, периферического сосудистого сопротивления и снижением микроциркуляторной гемодинамики. 3. Нарушение нитрооксидпродуцирующей функции эндотелия обусловлено снижением транспорта L-аргинина в эндотелиальную клетку, повышением в крови эндогенного ингибитора eNOS – ассиметричного диметиларгинина и снижением уровня экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3) в эндотелии аорты. Введение донора оксида азота – L-аргинина способствует повышению концентрации суммарных метаболитов оксида азота, его биодоступности, уровня экспрессии эндотелиальной NO-синтазы и вазодилятации, тогда как L-нитроаргинин метиловый эфир ингибирует экспрессию эндотелиальной NO-синтазы, снижает концентрацию оксида азота и способствует повышению сосудистого тонуса. 4. Эндогенные регуляторы - коэнзим Q10, L-карнитин, а также афобазол повышают транспорт L-аргинина в эндотелиальные клетки, угнетают активность ингибитора eNOS – ассиметричного диметиларгинина и стимулируют продукцию оксида азота, вследствие повышения уровня экспрессии eNOS. Эти изменения показателей гомеостаза NO способствуют восстановлению гемодинамических нарушений. 5. Применение эндогенных регуляторов eNOS - L-аргинина, коэнзима Q10, L- карнитина, а также афобазола и их комбинация при экспериментальном сахарном диабете способствует стабилизации клеточных мембран висцеральных органов: почек, печени, миокарда и снижению активности ферментов - аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, гаммаглютамилтранспептидазы, щелочной фосфатазы в сыворотке крови при экспериментальном сахарном диабете и у диабетических больных (компенсированная форма). 30 6. В условиях выраженных метаболических изменений, сопровождающихся активацией перекисных процессов и нарушением гомеостаза оксида азота, развивается дисфункция эндотелия, являющаяся фактором риска системных полиорганных нарушений, что проявляется изменением гистологической структуры сосудистого русла и клеток внутренних органов: почек, печени, миокарда и развитием нефро-, кардио- и гепатопатии. 7. Эндогенные антиоксиданты - коэнзим Q10, L-карнитин и афобазол способствуют восстановлению гистологической картины эндотелиальных клеток сосудов и структуры внутренних органов. На фоне комплексного лечения произошло уменьшение проявлений микроангиопатии, плазморрагического повреждения базальной мембраны и количества поврежденных клубочков почек. В миокарде выявлено снижение очагов кардиомиопатии, а в печени - явлений холестаза, лимфостаза и расширения просветов тканевых пространств. 8. Комплексное лечение с коэнзимом Q10 больных сахарным диабетом типа 1 с нефропатией декомпенсированной и субкомпенсированной формами нарушения обмена веществ приводит к метаболической коррекции: угнетению окислительного стресса, повышению активности ферментов антиокислительной защиты, повышению концентрации оксида азота, снижению общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности, повышению липопротеинов высокой плотности, а также восстановлению водо-, электролито- и азотовыделительной функции почек. 9. Коэнзим Q10 в комплексе с препаратами инсулина у больных сахарным диабетом типа 1 с периферическими ангиопатиями декомпенсированной и субкомпенсированной формами, способствует уменьшению реографического индекса, модуля упругости сосудов нижних конечностей, повышению пульсового кровенаполнения и снижению венозного застоя, вследствие метаболической коррекции нарушений биохимических показателей сыворотки крови. Практические рекомендации 1. При интерпретации результатов лабораторных исследований для определения степени декомпенсации у больных сахарным диабетом с сосудистыми осложнениями необходимо учитывать состояние сопряженной системы ПОЛ-АОС, образование и содержание NOх, креатинина, мочевины, электролитов и распределение ХС в липопротеинах различной плотности, а также активность в сыворотке крови 31 органоспецифичных ферментов: АсАТ, АлАТ, ГГТП и экскреторного фермента – щелочной фосфатазы. 2. На основании полученных результатов в клинике для нормализации выявленных нарушений биохимических процессов при выраженных расстройствах микроциркуляторной гемодинамики в нефроне и периферической сосудистой системе у больных СД с нефропатией и ангиопатией рекомендуем применение средств метаболической коррекции - коэнзима Q10 и L-карнитина в комбинации с препаратами инсулина. 3. Позитивное влияние на состояние компенсации обмена веществ нового препарата анксиолитика – афобазола, выявленное в результате проведенных фундаментальных исследований, позволяет рекомендовать его к использованию для коррекции биохимических и функциональных проявлений нейроангиопатии при СД типа 1. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Дзугкоев С.Г., Хетагурова Л.Г., Дзугкоева Ф.С. Роль изменений сопряженных систем ПОЛ, АОЗ, системы гемостаза в развитии экспериментальных диабетических сосудистых ангиопатий // Вестник РУДН. – 2008. - С.179-180. 2. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С. Оксидативной стресс и иммунобиологические свойства организма при экспериментальном сахарном диабете // Аллергология и иммунология. - 2008. - С.335. 3. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., Хетагурова Л.Г. Роль метаболических изменений в механизмах нарушения гемодинамики в периферических и почечных сосудах и активности мембраносвязанных ферментов при экспериментальном сахарном диабете // Астраханский медицинский журнал (приложение). - 2008. – № 3. - С. 85-88. 4. Дзугкоева Ф.С., Дзугкоев С.Г. Гуморальные и метаболические механизмы развития диабетических ангио- и нефропатий // II съезд физиологов СНГ. – Кишинев, 2008. – С.151. 5. Дзугкоева Ф.С., Дзугкоев С.Г., Хетагурова Л.Г. Роль сопряженных механизмов метаболических и функциональных изменений в развитии диабетических ангиопатий // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием. – Новосибирск, 2008. – С.428. 6. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С. Изменение активности ПОЛ, АОС и Na,K- АТФ- азы почечной ткани под влиянием милдроната и витамина Е // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. XVI. - №3 – С.131-132. 32 7. Дзугкоева Ф.С., Гатагонова Т.М., Лолаева А.Т., Дзугкоев С.Г., Брциева З.С. Кардиоренальные микроциркуляторные нарушения при патологии висцеральных органов и их патогенетическая коррекция // Фундаментальные исследования. - 2009. - №7. - С. 46-47. 8. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М., Гусякова О.А., Дзугкоев С.Г., Сагдеев Р.Р. и др. Биологическая вариабельность содержания метаболитов, связанная с АВОпринадлежностью крови // Клиническая лабораторная диагностика. – 2009. - №11. - С. 28-32. 9. Дзугкоев С.Г., Хетагурова Л.Г., Дзугкоева Ф.С. Изменение сопряженных систем ПОЛ, АОС и гемостаза в формировании сосудистых осложнений при ЭСД и их антиоксидантная коррекция // Вестник РУДН. - 2009. - №4. – С.381-384. 10. Дзугкоева Ф.С., Гатагонова Т.М., Дзугкоев С.Г., Брциева З.С., Лолаева А.Т. Метаболические и функциональные патогенетические механизмы нарушения микроциркуляции, сопровождающие заболевания висцеральных органов. Возможные перспективы их коррекции // X юбилейная научная сессия сотрудников, аспирантов и студентов, посвященная 70-летию СОГМА. – Владикавказ, 2009. - С.167-169. 11. Гусякова О.А., Зубова И.А., Сидорова И.Ф., Рыськина Е.А., Дзугкоев С.Г., Мякишева Ю.В., Павлова И.О., Баишева Г.М. Молекулярные признаки АВОпринадлежности в обеспечении специфики ответной реакции на биологические вещества // Вестник РУДН. - 2009. - №3. - С. 28-33. 12. Дзугкоев С.Г. Роль метаболических и функциональных изменений в развитии диабетических ангиопатий и их антиоксидантная коррекция // X юбилейная научная сессия сотрудников, аспирантов и студентов, посвященная 70-летию СОГМА. – Владикавказ, 2009. - С.170-173. 13. Дзугкоева Ф.С., Дзугкоев С.Г., Можаева И.В. Влияние коэнзима Q-композитума на показатели оксидативного стресса при экспериментальном сахарном диабете // Фундаментальные исследования. - 2009. - №9. – С.39-40. 14. Дзугкоев С.Г., Метельская В.А., Можаева И.В., Дзугкоева Ф.С. Влияние комплексного гомеопатического препарата, содержащего убихинон на показатели окислительного стресса и гемодинамики при экспериментальном сахарном диабете // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2010. - №6(3). - С.376-380. 33 15. Дзугкоев С.Г., Метельская В.А., Дзугкоева Ф.С. Роль оксида азота в формировании эндотелиальной дисфункции при СД. (Обзор) // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2010. - №8. - С.63-68. 16. Гильмиярова Ф.Н., Радомская В.М., Гусякова О.А., Сидорова И.Ф., Зубова И.А., Рыськина Е.А., Кизирова О.А., Евсеева Т.Ю., Воронкова Е.Е., Мурский С.И., Габрильчак А.И., Родькина О.М., Мингачева А.А., Чинкова Ю.Д., Гамзова Е.А., Дзугкоев С.Г. Влияние малых молекул на процессы межмолекулярного взаимодействия, лежащие в основе лигандных технологий лабораторной диагностики // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №7. – С.14-18. 17. Дзугкоев С.Г., Можаева И.В., Дзугкоева Ф.С. Проявления вазоренальной патологии при экспериментальном сахарном диабете и возможные пути их коррекции // 7-ая меджународная научно-практическая конф. «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань, 2010. - №1-2010. - с.98100. 18. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С. Проявления сосудистых осложнений при экспериментальном СД и возможные пути их коррекции // Международная научнопрактическая конференция «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки». Сборник работ молодых ученых. Владикавказ - 2010г. С.52-53. 19. Дзугкоев С.Г. Козырев К.М. Дзугкоева Ф.С. Влияние убихинона-коэнзима Q10 на морфо-биохимические показатели висцеральных систем при экспериментальном сахарном диабете // Владикавказский медико-биологический вестник. 2010. - Т. ХI. - вып.18. – С.60-65. 20. Дзугкоев С.Г., Можаева И.В., Дзугкоева Ф.С. Проявления сосудистых осложнений при экспериментальном сахарном диабете и возможные пути их коррекции // Владикавказский медико-биологический вестник. 2010. – т.11. – вып.18. - С.56-59. 21. Дзугкоева Ф.С., Дзугкоев С.Г. Роль эндотелиальной дисфункции в нарушении функции висцеральных органов и патогенетически обоснованный способ коррекции // Фундаментальные исследования. 2010. - № 11. - С.42-46. 22. Дзугкоева Ф.С., Дзугкоев С.Г., Такоева Е.А., Можаева И.В., Битарова Ж.Р., Тедтоева А.И. Влияние коэнзима Q10 и афобазола на биохимические показатели эндотелиальной дисфункции при ЭСД // Конференция «Высокие технологии, 34 фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», СанктПетербург. 2010. - №3. - С. 102-103. 23. Дзугкоев С.Г., Калоева М.Б., Дзугкоева Ф.С. Влияние комплексного лечения с коэнзимом Q10 на функциональные и метаболические показатели у больных сахарным диабетом типа 1 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т.152. - №9. – С.334-336. 24. Дзугкоев С.Г., Гуманова Н.Г., Козырев К.М., Дзугкоева Ф.С. Влияние афобазола на биохимические и гистопатоморфологические показатели эндотелиальной дисфункции при ЭСД у крыс // Биомедицинская химия. - 2012. - Т.58. - Вып.4. – С. 438-445. 25. Дзугкоев С.Г. Роль эндогенного протектора КоQ10 в коррекции липидного обмена и метаболизма оксида азота при экспериментальном сахарном диабете // Х научная конференция «Молодые ученые», Владикавказ. 2011. - С.21-22. 26. Дзугкоев С.Г. Влияние композитума Q10 на эндотелиальную функцию у крыс с экспериментальным сахарным диабетом // II международная научно-практическая конференция «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки», Владикавказ. 2011. - часть 1. - С.59-63. 27. Дзугкоев С.Г., Можаева И.В., Дзугкоева Ф.С. Изменение метаболических и функциональных показателей нарушения функции эндотелия при ЭСД // Научные труды 3 съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Ялта. 2011. С.244-245. 28. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., Такоева Е.А. Нарушение липидного обмена и метаболизма оксида азота при экспериментальном сахарном диабете // Международный научный форум «Наука и общество» Физиология и медицина 21 века, 6 Петербургская встреча лауреатов Нобелевской премии. Санкт-Петербург.2011. - С.159-160. 29. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., Можаева И.В. Влияние убихинон-Q10 и афобазола на показатели окислительного стресса и гемодинамических нарушений при экспериментальном сахарном диабете // MATERIÁLY VII MEZINÁRODNI VÊDECKO-PRAKTICKA KONFERENCE «VÊDECKY POKROK NA PRELOMU NYSYACHALETY - 2011». Dil 18 Lékařstvi Praha. Publishing House «Education and Science» p.26-29. 35 30. Дзугкоев С.Г., Такоева Е.А., Можаева И.В., Дзугкоева Ф.С., Битарова Ж.Р. Биохимические маркеры дисфункции эндотелия при экспериментальном сахарном диабете // 2 международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», СанктПетербург. 2011. - Т.3,. - С.131-133. 31. Дзугкоева Ф.С., Такоева Е.А., Можаева И.В., Кочисова З.Х., Битарова Ж.Р., Тедтоева А.И., Дзугкоев С.Г. Состояние активности про- и антиоксидантной системы как факторов риска эндотелиальной дисфункции и почечной недостаточности у больных с хроническими болезнями почек (ХПН) // Успехи современного естествознания. – 2011. - №12. - С.38-39. 32. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С. Некоторые механизмы корригирующего влияния эндогенных антиоксидантов на метаболические и гемодинамические нарушения при экспериментальном сахарном диабете // Фундаментальные исследования. 2011. №11(3). - С.499-502. 33. Дзугкоев С.Г., Можаева И.В., Дзугкоева Ф.С. Влияние эндогенных регуляторов на показатели липидного обмена и метаболизма оксида азота при экспериментальном сахарном диабете // V региональная научно-практическая конференция «Новые технологии в рекреации здоровья населения», Владикавказ. 2011. - С.108-110. 34. Дзугкоев С.Г., Козырев К.М., Можаева И.В., Дзугкоева Ф.С. Влияние эндогенных регуляторов на биохимические и гистологические показатели функции эндотелия при экспериментальном сахарном диабете // Владикавказский медикобиологический вестник. – 2012. – Т.14. – вып. 22. – С.48-53. 35. Dzugkoev S.G., Kaloeva M.B., Dzugkoeva F.S. Effect of Combination Therapy with Coenzyme Q10 on Functional and Metabolic Parameters in Patients with Type 1 Diabetes Mellitus // Bulletin of Experimental Biology and Medicine: Volume 152, Issue 3 (2012), Page 364-366. 36. Дзугкоев С.Г., Мрикаева О.М. Некоторые механизмы гемодинамических нарушений у больных СД типа 1 и КПЛ // III международная научно-практическая конференция «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки». Сборник работ молодых ученых. Владикавказ 2012. - часть 1. - С.102-103. 37. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., Гуманова Н.Г., Метельская В.А. Влияние коэнзима Q10, афобазола и L-карнитина на эндотелиальную функцию у крыс с ЭСД // Кубанский научный вестник. 2012. - №3 - С.48-51. 36 38. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., Гуманова Н.Г., Метельская В.А. Влияние коэнзима Q10 , афобазола и L-карнитина и их комбинации с L-аргинином на эндотелиальную функцию у крыс с экспериментальным сахарным диабетом // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2012. - №11 С.49-53. 39. Дзугкоев С.Г., Зангиева О.Д., Дзугкоева Ф.С. Влияние комплексного лечения на биохимические и функциональные показатели при сосудистых осложнениях у больных СД типа 1 различной степени компенсации. // «Клиническая медицина». 2013. - №2. - С.14-18. 40. Дзугкоев С.Г., Никулина Д.М., Можаева И.В. Влияние L-аргинина на показатели функции эндотелия при сахарном диабете в эксперименте. // Материалы 9ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения». Астрахань, 2013. - С.83-84. 41. Дзугкоев С.Г., Метельская В.А., Дзугкоева Ф.С. Влияние эндогенных регуляторов эндотелиальной NO-синтазы на гомеостаз оксида азота и липопротеины сыворотки крови при экспериментальном сахарном диабете // Ж. Бюлл. эксп. биол. и мед., -2013,- т 156, -№8, с. -171-174. Патенты 42. Дзугкоев С.Г., Хетагурова Л.Г., Дзугкоева Ф.С. Способ лечения нефроангиопатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных. Патент на изобретение №2372898, заявка №2008138743, приоритет изобретения 29 сентября 2008г. Зарегистр. в Гос. реестре изобрет. РФ 20 ноября 2009г. 43. Программа для обработки данных биохимического, гематологического, иммунологического, гемостазиологического анализа крови человека (Гусякова О.А., Зубова И.А., Сидорова И.Ф., Мурский С.И., Рыськина Е.А., Родькина О.М., Мингачева А.А., Колесова Т.А., Дзугкоев С.Г., Сагкеев Р.Р., Радомская В.М., Гильмиярова Ф.Н.). Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2009613356, заявка №2009612224, дата поступления 12 мая 2009г. Зарегистр. в Гос. реестре изобрет. РФ 26 июня 2009г. 44. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С. Способ диагностики нефроангиопатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных. Патент на изобретение 37 №2383020, заявка №2008138815, приоритет изобретения 29 сентября 2008г. Зарегистр. в Гос. реестре изобрет. РФ 27 февраля 2010г. 45. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., Такоева Е.А. Способ диагностики и коррекции эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений сахарного диабета в эксперименте. Патент на изобретение №2455702, №2010148158 от 25.11.2010г. Зарегистр. в Гос. реестре изобрет. РФ 10 июля 2012г. 46. Дзугкоева Ф.С., Дзугкоев С.Г., Чопикашвили Л.В., Хетагурова Л.Г., Пухаева Е.Г., Руруа Ф.К. Бобылева Л.А. Способ воздействия антимутагенного средства на организм. Патент на изобретение №2449780, заявка №2010142564, приоритет изобретения 18 октября 2010г. Зарегистр. в Гос. реестре изобрет. РФ 10 мая 2012г. 38 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЭСД – экспериментальный сахарный диабет АД – аллоксановый диабет БА – брюшная аорта НПВ – нижняя полая вена ПА – почечная артерия МЦ – микроциркуляция M – средняя скорость кровотока S – систолическая скорость кровотока D – диастолическая скорость кровотока PI – пульсаторный индекс (индекс Гослинга) GD – градиент давления RI – реографический индекс АФК – активные формы кислорода СРО – свободнорадикальное окисление ПОЛ – перекисное окисление липидов АОС – антиокислительная система МДА – малоновый диальдегид СОД – супероксиддисмутаза АО – антиоксиданты КФ – клубочковая фильтрация ГП - гидроперекиси NOx – суммарные метаболиты оксида азота L-NAME – NG-аргинин метиловый эфир АДМА – ассиметричный диметиларгинин eNOS (NOS-III) – эндотелиальная NO-синтаза ОХС – общий холестерин ЛНП – липопротеины низкой плотности ЛВП – липопротеины высокой плотности ТАГ – триглицериды АлАТ – аланинаминотрансфераза АсАТ – аспартатаминотрансфераза 39 ГГТП – гаммаглутамилтранспептидаза НbC1 – гликированный гемоглобин ДН – диабетическая нефропатия ДА – диабетическая ангиопатия. 40 Подписано в печать Набор компьютерный. Гарнитура Times. Усл. П.л. 2,0 Тираж 100 экз. Отпечатано на копировально-множительной технике 41
