ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» А.Б. Узденский ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ В КЛЕТКЕ. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ И СИНТЕЗ АТФ Учебное пособие по курсу «Биоэнергетика» Ростов-на-Дону 2008 Учебное пособие написано доктором биологических наук профессором кафедры биофизики и биокибернетики физического факультета ЮФУ А.Б. Узденским Печатается в соответствии с решением кафедры биофизики и биокибернетики физического факультета ЮФУ (протокол № 5 от 12.02. 2008) Рецензент: доцент Белова Е.И. 2 ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ХЕМИОСМОТИЧЕСКАЯ ГИПОТЕЗА В результате окисления субстратов и переноса электронов по электронного транспорта (ЦЭТ) высвобождается значительная цепи энергия. Например, в случае окисления глюкозы: С6Н12О6 + 6О2 → 6СО2 + 6Н2О + 686 ккал/моль. При этом за счет гликолиза получается 4 молекулы ATP, за счет субстратного фосфорилирования в цикле Кребса - 2 молекулы ATP и за счет окислительного фосфорилирования - 34 молекулы ATP. Итого: 40 молекул ATP, минус две 2 молекулы ATP, расщеплении необходимые для запуска гликолиза. Таким образом, при одной молекулы глюкозы получается 38 молекул ATP. Стандартная свободная энергия этой реакции Go = 38∙ (-7,3) = - 277 ккал/моль к.п.д. = 277/686 ≈ 40%, В действительности, коэффициент полезного действия еще выше, так как внутриклеточные концентрации глюкозы, О2, Pi, ATP и ADP и температура организма (~ 37 оС) отличаются от принятых за стандартные (1 М и 25 оС). Если в качестве более реального значения термодинамического потенциала в реакции: ATP + H2O → ADP + Pi взять не -7,3, а -12,5 ккал/моль, то реальный к.п.д. составит (12,5*38)/686 ≈ 69 %! Но как же в результате окислительного процесса синтезируется ATP? Идею о сопряжении процессов окисления субстратов и фосфорилирования ADP, т.е. 3 окислительного фосфорилирования впервые высказал В.А. Энгельгардт в 1930 году. Но механизм синтеза ATP и сопряжения этого процесса с окислением субстратов долго оставался большой загадкой. Суммарное уравнение переноса электронов от NADH к кислороду: NADH + H + + 1/2O2 + 3Pi + 3ADP NAD+ + 3ATP + 4H2O Однако, давно известно, что процессы электронного транспорта и синтеза АТР не связаны непосредственно. Их можно разделить веществами- разобщителями окислительного фосфорилирования, при действии которых субстраты окисляются, но АТР не синтезируется. Поэтому было высказано предположение о том, что процессы окисления и фосфорилирования сопряжены с помощью некоего общего промежуточного звена Х - "первичного макроэрга" (Рис.1): NADH + H+ + 1 O2 2 NAD+ + H2O ~ X Х 3ADP + 3Pi Рисунок 1 - Гипотеза о 3ATP + 3Н2О существовании «первичного макроэрга» сопрягающего процессы окисления NADH и фосфорилирования ADP 4 Х, Предполагалось, что в этом «первичном макроэрге» Х какие-то группы приобретают дополнительную энергию, запасенную в макроэргической связи, а уже затем эта связь переносится на ATP. Однако, многолетние интенсивные поиски этого гипотетического промежуточного продукта ни к чему не привели. Это продолжалось до тех пор, пока английский биохимик П. Митчелл в 1961 году не взглянул на эту проблему с совершенно иной стороны. Он предположил векторную организацию электронного потока во внутренней мембране митохондрий. По его предположению, переносчики электронов расположены в мембране так, что поток электронов трижды пересекает ее в соответствии с числом пунктов сопряжения на уровне электронтранспортных комплексов I, III и IV. При каждом пересечении через мембрану одновременно переносятся протоны из митохондриального матрикса наружу. Именно электрохимический градиент протонов: ~ H RT [ H ]o RT ln pH F [ H ]i F и является по Митчеллу тем промежуточным источником энергии, "первичным макроэргом", за счет которого фермент ATP-синтетаза синтезирует ATP. То есть, неравновесное распределение протонов по обеим сторонами внутренней митохондриальной мембраны, создаваемое при переносе электронов по ЦЭТ, и практическая непроницаемость для протонов внутренней митохондриальной мембраны (ВММ) позволяют организовать протонный ток исключительно через молекулы ATP-синтетазы, встроенной в ВММ. Этот ток и приводит в действие молекулярную машину, синтезирующую ATP. Эта гипотеза Митчелла называется хемиосмотической. Хемиосмотическая гипотеза сразу 5 позволила объяснить многие экспериментальные факты и нашла ряд существенных экспериментальных подтверждений: 1) Несмотря на десятилетия упорных поисков, не обнаружены никакие промежуточные вещества, выполняющие роль "первичного макроэрга"; 2) Внутренняя митохондриальная мембрана непроницаема для ионов Н+, ОН─, Na+, К+, Cl─. 3) Окислительное фосфорилирование требует целостности внутренней митохондриальной мембраны, ее нарушение приводит к разобщению окисления и фосфорилирования; 4) Разобщители окислительного фосфорилирования, т.е. вещества, при действии которых на митохондрии окисление и перенос электронов по ЦЭТ сохраняются, но фосфорилирование ADP не происходит, например, 2,4-динитрофенол, являются протонофорами. Они резко повышают проницаемость внутренней мембраны митохондрий для ионов Н+; 5) За счет протонного транспорта на митохондриальной мембране генерируется электрохимический градиент: ~ H + 0 RT = ln + = H F H i + RT F pH. Измерения, проведенные разными учеными, включая самого Митчелла, показали, что протон-движущая сила ~ H , вырабатываемая митохондрией типичной клетки животного, примерно равна -220 мВ. Она складывается из разности электрических потенциалов ≈ -160 мВ и концентрационной (осмотической) компоненты в 60 мВ, соответствующей рН ≈ -1. 6 ПЕРЕНОС Н+ ЧЕРЕЗ ВНУТРЕННЮЮ МИТОХОНДРИАЛЬНУЮ МЕМБРАНУ По гипотезе Митчелла, при переносе электронов по электронтранспортной цепи ионы водорода Н+ переносятся поперек внутренней митохондриальной мембраны. Но как протоны переносятся через непроницаемую для них мембрану? Это возможно, если, например, на внутренней стороне мембраны некий акцептор протонов А присоединяет H+ из водной среды, а на внешней донор D высвобождает H+ в воду (Рис.2). Этот процесс эквивалентен переносу протонов. Рисунок 2 - Одна из гипотез создания трансмембранного градиента протонов вследствие их поглощения неким акцептором на одной стороне и сопряженного высвобождения донором на другой стороне. За счет энергии электрохимического протонного градиента ATP-синтетаза синтезирует ATP из ADP и фосфата Точный механизм создания электрохимического градиента ~ H пока не выяснен. Но сейчас уже известно, 7 что протоны переносятся через митохондриальную мембрану из матрикса в межмембранное пространство в процессе переноса электронов NADH-дегидрогеназой (комплекс I), комплексом цитохромов bc1 (III) и цитохромоксидазой (комплекс IV). Изучение протонного транспорта затруднено коротким временем жизни промежуточных соединений, малой величиной конформационных изменений, сложностью строения электронпереносящих комплексов. Более понятен и имеет существенные экспериментальные подтверждения механизм переноса протонов в комплексе III – так называемый Q-цикл с участием молекул убихинона CoQH2 (Рис.3). Он связывает перенос двух электронов коферментом Q, одноэлектронный перенос в цитохромах и перенос протонов через внутреннюю мембрану митохондрии. Этот процесс проходит в несколько этапов. Сначала молекула CoQH2, расположенная вблизи от наружной стороны ВММ (она обозначена как QH2 на рис. 3) переносит один электрон, полученный от комплекса I, через Fe-S центр на цитохром с1 (потом он переносится на цитохром с и далее по цепи). Второй электрон последовательно переносится через низко- и высокопотенциальные гемы цитохрома b (bL и bН, соответственно) на молекулу CoQ, находящуюся вблизи внутренней стороны ВММ, переводя ее в анион-радикальную форму ●Q─. При этом первая молекула убихинона высвобождает 2Н+ в межмембранное пространство. На следующем этапе ● Q─ восстанавливается на внутренней стороне ВММ протонами, потребляемыми из митохондриального матрикса. Но для этого нужен еще один электрон. Он доставляется через пару гемов bL и bН еще одной молекулой убихинона CoQH2, которая при этом высвобождает 2 протона в межмембранное пространство (рис.3). Таким образом, этот процесс эквивалентен транспорту двух протонов через ВММ и переносу двух электронов от CoQH2 на 2 молекулы цитохрома с. Суммарная реакция этого процесса: QH2 + 2 цит. с1 (окисл) + 2 H+ (внутр) → Q + 2 цит. с1 (восст) + 4 H+ (наруж) 8 В нем участвуют две молекулы CoQH2 на наружной стороне ВММ и одна молекула CoQ на внутренней стороне ВММ. Еще одна молекула CoQ, образовавшаяся при окислении CoQH2, должна мигрировать с наружной стороны ВММ на внутреннюю. Также должен пополняться запас CoQH2 на наружной стороне ВММ. Реально убихинон, видимо, не мигрирует, но за счет изгиба длинного липидного хвоста, располагающегося внутри липидной фазы мембраны, хиноновая группа может перемещаться от наружной стороны ВММ к внутренней. Предполагается, что подобные циклы существуют и в комплексах I и IV, но механизм переноса протонов в них менее ясен. В комплексе I в них участвуют Fe-S центры как переносчики электронов и молекулы FMN/FMNH2 как переносчики атомов водорода. Такой механизм транспорта протонов называется флавиновым циклом или F-циклом (Рис.4). Рисунок 3 - Q-цикл (по Nelson, Cox, 2005) 9 По В.П. Скулачеву (1989), в NADH-дегидрогеназном комплексе ионы Н+ от расположенных в матриксе субстратов цикла Кребса (АН2) переносятся на FMN. Предполагается, что FMN и FMNH2 могут мигрировать в митохондриальной мембране. Образовавшийся FMNH2 может смещаться вглубь мембраны в сторону внешней среды, где расположены FeS-центры: FeSI1a и FeSI3 (индекс I обозначает принадлежность к комплексу I). Здесь FMNH2 передает электроны на FeSI1a или FeSI3, а два протона в каждом случае уходят в межмембранное пространство. Окисленный FMN возвращается в сторону матрикса и восстанавливается электронами от FeSI1b и протонами, выделяющимися в матрикс от NADH-дегидрогеназы: FMN + 2e- + 2H+ FMNH2 , Электроны, перешедшие от FMNH2 на FeSI 3, далее переходят на FeSI 4, FeSI 2 и поступают в Q-цикл, где вместе с еще двумя протонами Н+ из матрикса восстанавливают кофермент Q. Таким образом, в F-цикле при использовании одной молекулы субстрата через мембрану переносится 4Н+. Возможно, в цитохромоксидазном комплексе IV перенос протонов происходит по механизму, называемому O-циклом. При переносе 4 электронов е─ на молекулу кислорода О2 в комплексе IV синтезируются две молекулы воды. Но при этом из митохондриального матрикса поглощаются не четыре протона Н+, а восемь, четыре из которых переносятся через мембрану. То есть перенос пары электронов по ЦЭТ сопровождается переносом двух протонов через ВММ в наружную среду. При этом подвижными переносчиками могут служить кислород O2 и перекись водорода Н2О2 (Рис.4). Молекулярные детали процесса переноса протонов в комплексе IV, пока неизвестны. 10 Рисунок 4 - F, Q и O-циклы (по Скулачеву, 1989). (На этой схеме ориентация мембраны противоположна изображенной на рис.3) Рисунок 5 - Компоненты внутренней электронпереносящие комплексы функциональных доменов F0 и митохондриальной мембраны: I-IV и Н+-АТР-синтаза, состоящая из F1 (комплекс V) 11 Н+-АТР-СИНТАЗА Долгое время было большой загадкой, как в митохондриях синтезируется АТР, и только в последнее десятилетие стали понятны принципы и механизмы этого процессы. Основная проблема при синтезе ATP4─ состоит в преодоления сильного электростатического отталкивания ADP3─ и Pi2─ при сближении. Эта проблема изящно решается ферментом Н+-АТР-синтетазой (его часто называют Н+-АТР-синтазой). Она действует за счет протонного тока, текущего по специальному протонному каналу, а протон-движущей силой служит градиент концентрации Н+ по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны. Действие этого тока передается в место синтеза ATP, на расстояние в несколько нм с помощью подвижной субъединицы Н+-АТР-синтазы. Н+-АТР-синтазу впервые "увидели" Э. Рэкер с коллегами в начале 1960-х годов с помощью функциональных электронного доменов: F0, микроскопа. встроенного Она во состоит внутреннюю из двух мембрану митохондрий, и F1, выступающего из мембраны в митохондриальный матрикс. Их вместе часто называют ферментом F0F1 или комплексом V (Рис.5). Домен F1 можно механически удалить из мембраны путем сильного перемешивания суспензии или обработки митохондрий ультразвуком. При этом он не синтезирует ATP, но сохраняет ATPазную активность. Мембранные пузырьки из внутренней митохондриальной мембраны со встроенными F0, но лишенные F1, могут переносить электроны от NADH к О2 (т.к. в них сохранились встроенные электронпереносящие комплексы) и обладают сильной протонной проводимостью. Но они также не могут синтезировать ATP. То есть для синтеза ATP необходима совместная работа F0 и F1. Выступающий из мембраны домен F1 с молекулярной массой 371 кДа состоит из 9 субъединиц: 3, 3, 1, 1 и 1. (Рис.6). Рентгеноструктурный анализ, проведенный Дж. Уолкером с коллегами, показал, что фактор F1 можно представить в виде приплюснутой сферы, 12 высотой около 8 нм и диаметром 10 нм. В ней, как апельсиновые дольки, чередуются и субъединицы (Рис.6-8). Они образуют αβ-пары, в которых субъединицы могут связывать нуклеотиды (ADP или ATP) вблизи места их контакта с субъединицами α (Рис.7,б; 8,а) и находиться в одной из трех конформаций: «пустой», связанной с ADP и фосфатом (-ADP) или связанной с ATP (-ATP) (Рис.8). Предполагается, что субъединицы участвуют в каталитическом акте. Субъединица γ представляет собой длинный изогнутый стержень из двух αспиралей, проходящий по оси эллипсоида α3β3 (Рис.6; 7). Его нижний конец выступает на 3 нм из α3β3 и погружается внутрь домена F0 (Рис.6). Центральная часть субъединицы γ гидрофобна и не содержит заряженных аминокислотных остатков, которые могли бы создавать трение при ее вращении. Рисунок 6 - H+-ATP-синтетаза. (а) Схема строения. Показано возможное направление протонного тока через субъединицы а и с домена F0. (б) Изображение с учетом молекулярной структуры домена F1. Субъединицы , и показаны в разрезе. N (негативная) сторона – отрицательно заряженный митохондриальный матрикс; P (позитивная) сторона – межмитохондриальное пространство (по Nelson, Cox, 2005) 13 Домен F0 с молекулярной массой около 120 кДа состоит из субъединиц 3 типов: 1a, 2 b и 10-12 c, встроенных в мембрану и формирующих протонный канал. Субъединицы с – небольшие трансмембранные белки (8000 Да), состоящие из двух гидрофобных α-спиралей, дважды пересекающих мембрану. Внутри мембраны они образуют два коаксиальных цилиндра с наружным диаметром 5,5 нм. В их центре помещается субъединица γ домена F1 (Рис. 6; 9,б). Субъединица а состоит из шести трансмембранных -спиральных участков. Предполагается, что она образует входной и выходной каналы для протонов, которые перемещаются по кругу в цилиндре из субъединиц с. Субъединица b пересекает мембрану один раз. Две такие субъединицы вместе с δ-субъединицы домена F1 удерживают комплекс α3β3 над внутренней митохондриальной мембраной (Рис.6). Рисунок 7 - Домен F1. (а) Вид сбоку, (б) Та же структура, но показаны только по одной субъединице , , и , а не все 3 субъединицы и 3 субъединицы , как на рис (а), чтобы отобразить места связывания ADP и ATP (по Nelson, Cox, 2005) 14 Рисунок 8 - H+-ATP-синтаза, вид сверху. (a). Показаны 3 разных состояния субъединиц и : незаполненное или пустое (-empty и -empty); со связанным ADP (-ADP и -ADP) и со связанным ATP (-ATP и -ATP). (б). Показаны переходы между этими состояниями, при которых высвобождение вновь синтезированного АТР из фермента F1 сопряжено с перемещением ионов водорода из межмембранного пространства в матрикс (по Nelson, Cox, 2005) Как работает эта конструкция? Как осуществляется энергетическое сопряжение протонного транспорта и синтеза ATP? Для преодоления электростатического отталкивания и сближения ADP3- и Pi2- в активном центре фермента должно создаваться «нулевое поле» с таким распределением зарядов, которое нейтрализует их отрицательные заряды и способствует переносу фосфата с образованием ATP. Тут возможны две ситуации: 1) Изначально в активном центре субъединицы β, находящейся в «пустой» конформации, нет никаких особых электрических полей. Для того, чтобы поместить туда ADP3- и Pi2-, в эту область нужно привлечь дополнительные 15 положительные заряды, на что нужно потратить энергию. Они втянут отрицательно заряженные молекулы ADP3- и Pi2- в активный центр, позволят их сблизить и образовать ATP4-. 2) В активном центре субъединицы β изначально, в «пустой» конформации имеются положительные заряды, которые втягивают отрицательно заряженные ADP3- и Pi2- и нейтрализуют их заряды. Это позволяет им сблизиться и образовать ATP4-. При этом не требуется энергии для входа этих субстратов в активный центр, но возникает проблема высвобождения образовавшейся молекулы ATP4-. Чтобы освободиться от нее, фермент должен затратить энергию, позволяющую преодолеть электростатическое притяжение к положительным зарядам белка. Это можно сделать с помощью внешних ионов, замещающих на время заряды белка или ATP4- в активном центре. Рисунок 9 - Домен F0 H+-ATP-синтазы. (а) Вид сбоку, показаны 12 трансмембранных -спиралей; (б) вид снизу, со стороны межмембранного пространства, видно положение субъединицы и два коаксиальных кольца из торцов субъединиц с (по Nelson, Cox, 2005) 16 Эксперименты показали, что справедливо второе предположение: энергия нужна не для синтеза ATP4-, а для ее высвобождения. Было показано, что изолированные домены F1 обратимо катализируют реакцию: ADP + Pi ↔ ATP + H2O. В присутствии ATP и воды, меченой изотопом кислорода гидролиз ATP, и 18 18 О, происходит О включается в неорганический фосфат. Тщательные измерения изотопного состава фосфата показали, что за несколько минут в него включается не один, а три или четыре атома 18О: Следовательно, за несколько минут F1 может несколько раз отщеплять и присоединять последнюю фосфатная группу в молекуле ATP, каждый раз присоединяя к ней 18 О из молекулы воды. Этот же процесс происходит и в неэнергезированном комплексе F0F1 в отсутствие протонного градиента. То есть, реакция синтеза или гидролиза ATP практически не требует свободной энергии. Мембранный потенциал митохондрий или движение протонов Н+ необходимы для такого перераспределения электрического поля в активном центре, чтобы способствовать высвобождению ATP4-, ранее прочно удерживаемому ферментом. Измерения констант связывания ATP и ADP ферментом F0F1 показали, что его сродство к ATP (Kd ≤ 10-12 M) на 7 порядков выше, чем к ADP (Kd ≈ 10-5 M). Это различие соответствует разнице свободных энергий связывания около 10 ккал/моль. 17 Когда была расшифрована пространственная структура F1, то оказалось, что в его активном центре молекулу ATP действительно окружают положительно заряженные аминокислотные остатки Lys155+, Arg182+ и Arg376+. Кроме того, в создании «нулевого поля» и связывании ATP4─ участвуют Glu181─ и ион Mg2+ (Рис.10). Рисунок 10 - Связывание ATP в активном центре Н+-ATP-синтазы. Показано положение положительно (Lys155+, Arg182+ и Arg376+) и отрицательно (Glu181─) заряженных аминокислотных остатков и ионов Mg2+ , участвующих в создании «нулевого поля» В отсутствие протонного градиента ATP так и остается связанным с F1. Но когда есть градиент, протоны движутся через F0 по каналу, сформированному субъединицами а и с, и индуцируют высвобождение ATP. Но каким образом движение протонов по каналу в домене F0 может повлиять на перераспределение зарядов в весьма удаленной субъединице домена F1 влекущее за собой высвобождение ATP? Как передается туда энергия протонного градиента? 18 Идею вращательного принципа работы Н+-АТР-синтазы впервые выдвинул П. Бойер. Суть предложенного им механизма состоит в том, что передаточным звеном между движением протонов по каналу в F0 и конформационными превращениями субъединицы β в F1 может служить вращение центральной субъединицы γ. Согласно этой модели, процесс синтеза АTР можно разделить на следующие этапы (Рис. 11): 1) Пустая β субъединица связывает АDР и Pi и переходит в конформацию β-АDР. 2) Затем быстро происходит сближение АDР и Pi и образование АТР. При этом субъединица β переходит в состояние β-АTР. 3) Под влиянием переноса протонов по круговому протонному каналу в домене F0 (Рис.9,а) происходит поворот субъединицы γ на 120о. Круговое движение фрагмента субъединицы , находящегося внутри комплекса 33, влияет на активный центр субъединицы β и способствует отсоединению АTР от нее. 4) Отсоединение АTР и возвращение β к «пустой» конформации. Эти предположения подтвердились при исследованиях молекулярной структуры F0F1. На рис. 12 показано, как меняется структура комплекса при вращении субъединицы . Более детальное рассмотрение показывает, что в субъединице можно выделить два структурных домена, верхний и нижний, которые смещаются относительно друг друга при вращении -субъединицы. Это вызывает структурные изменения в «переключающих участках» S1 и S2, контролирующих связывание и высвобождение нуклеотидов и фосфата, соответственно (Рис. 13). Поскольку в состав F1 входит 3 субъединицы β и 3 субъединицы α и все они находятся в разных состояниях, то за полный оборот субъединицы γ синтезируется 3 молекулы АТР. Есть предположение, что субъединица α, в 19 отличие от субъединицы β, которая связывает нуклеотиды и фосфат, играет вместе с субъединицей γ каталитическую роль. Действительно, в связывании АDР участвует Arg376 субъединицы α (Рис.10). Но ее роль в производстве АТР Рисунок 11 - Цикл работы H+-ATP-синтетазы: связывание ADP и фосфата субъединицей , синтез ATP, поворот субъединицы на 120о, высвобождение ATP. D – ADP; T – ATP; P – неорганический фосфат Рисунок 12 - Вращение субъединицы и связанные с ним структурные изменения субъединиц и 20 пока неясна. Также неясны строение и функции субъединиц δ и ε, которые плохо разрешаются на рентгенограммах. Предполагается, что δ связывает комплекс α3β3 с двумя субъединицами b, помогая тем самым закрепить F1 над мембраной, а субъединица ε – или участвует во вращении вместе с субъединицей γ, или располагается между F0 и F1 и регулирует вращение субъединицы γ. Рисунок 13 - (а) Изменения структуры субъединицы при переходе от «пустой» конформации (Е) к конформации, связанной с ATP (T), при вращении субъединицы отражаются в смещении верхнего и нижнего доменов. Это изменяет конформацию «переключающих участков» S1 и S2, контролирующих связывание нуклеотидов и высвобождение фосфата. (б) Механическая схема этого процесса соответствует наличию двух «пружин» между доменами S1 и S2 активной и пассивной. Вращение субъединицы приводит в движение верхнюю часть субъединицы относительно нижней (по Oster, 1998) 21 Решающим шагов в понимании принципа работы Н+-АТР-синтазы стало применение методов манипуляции с единичными молекулами. Японским ученым под руководством К. Киношита удалось прочно иммобилизовать фермент F1 на покровном стекле микроскопа (Рис.14,а). К субъединице γ они с помощью белка авидина ковалентно присоединили длинную (до 1.5 мкм) актиновую нить, меченую ярко флуоресцирующим красителем, так что ее хорошо было видно во флуоресцентном микроскопе. Поскольку фермент F1 работает обратимо и может действовать как ATPаза, расщепляя ATP, то добавление ATP в среду вызывало вращение субъединицы и «пришитой» к ней актиновой нити. Это вращение было дискретным, с шагом 120 о (Рис.14,б), что соответствует предположению о трех состояниях субъединицы β и всего комплекса F1. Максимальная скорость вращения составляла 4 оборота в секунду. За это время гидролизовались 52 молекулы ATP. По оценке авторов этой работы, этот мотор развивает вращательный момент до 45 пН∙нм. В другом эксперименте К. Киношита и сотрудники «пришивали» к покровному стеклу не только домен F1, а весь комплекс F0F1. При гидролизе ATP в нем субъединица γ вращалась вместе с субъединицей ε и всем кольцом из 12 субъединиц с комплекса F0. По этим данным, вращающимся ротором является комплекс γεс12, а статором служит комплекс ab2δα3β3. Эти данные трудней интерпретировать, т.к. нелегко представить вращение крупного белкового комплексы внутри липидной мембраны. Возможно, при изоляции комплекса F0F1 и последующем сшивании с подложкой также получались сшивки субъединицы γ с белком с. В изолированном состоянии, в отсутствие трения, которое белок с испытывает внутри мембраны, вращение субъединицы γ могло передаваться белку с, и он вращался вместе с ней. А в митохондриях, вероятно, этого не происходит и ротором служит только субъединица γ. 22 Рисунок 14 - Схема опыта Киношиты и соавторов. Сверху показана молекула H+-ATP-синтетазы (F0F1), иммобилизованная на покровном стекле. К белку c ковалентно присоединена длинная актиновая нить, меченная флуоресцентным красителем. На нижней последовательности фотографий, снятых с интервалом 133 мс, видно дискретное вращение этой нити с шагом 120о (по Noji et al., 1997) Что же заставляет крутиться субъединицу γ в Н+-ATP-синтетазе? Как еще постулировал П. Бойер, для этого процесса используется энергия электрохимического потенциала ионов водорода H+, причем все равно какой его компоненты - или pH. Предполагается, что в домене F0 протоны, 23 проходящие через мембрану, двигаются по кругу между субъединицами с и выходят по градиенту в матрикс (Рис.6,а). Этот круговой ток протонов и заставляет вращаться субъединицу γ также, как в электромоторе круговой электрический ток, текущий по неподвижному статору вращает подвижный ротор. Таким образом, H+-ATP-синтаза представляет собой самый маленький электромотор нанометровых размеров, работающий на токе, переносимом несколькими протонами. ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ Сколько ATP синтезируется при полном окислении одной молекулы глюкозы, - довольно трудно подсчитать. Суммарное уравнение процессов, происходящих при переносе электронов от комплекса I на кислород можно записать следующим образом: NADH + ½ O2 + H+ + x ADP + x Pi → NAD+ + H2O + x ATP, где х – отношение числа переносимых на ATP атомов фосфора к числу поглощенных атомов кислорода, или, так называемое, отношение P/O. Иногда говорят об отношении P/2e─. Для окисления сукцината, когда происходит перенос восстановительных эквивалентов прямо на комплекс II, можно записать: FADH2 + ½ O2 + H+ + x ADP + x Pi → FAD + H2O + x ATP. Измерить х сложно, т.к. митохондрии используют ATP во многих других 24 реакциях. Традиционно считалось, что для первого процесса х = 3, а для второго х = 2. Определить количество Н+, необходимое для производства одной молекулы ATP, тоже весьма сложно, и разные исследователи дают разные результаты. Наиболее правдоподобные, консенсусные значения числа переносимых через ВММ протонов в расчете на перенесенную пару электронов, к которым пришли разные ученые, составляют 10 H+ для окисления NAD+ (4 в комплексе I, 4 в комплексе III и 2 в комплексе IV) и 6 H+ для окисления сукцината. Обычно принимают, что для синтеза одной молекулы ATP через ВММ нужно перенести 4 протона. Три из них идут непосредственно на синтез ATP, а градиент, создаваемым четвертым протоном, нужен для переноса ADP и Pi внутрь митохондрий и сопряженного транспорта ATP из матрикса в цитоплазму. Пока точный механизм работы F0F1 не изучен во всех деталях, современные исследователи часто используют величину х = 2,5 для окисления NADH и 1,5 для окисления сукцината, а не 3 и 2, как было принято ранее. Общий подсчет числа молекул ATP, получающихся в окислительных процессах также сложен. Традиционно считали, что при окислении одной молекулы глюкозы производится 38 молекул ATP. Сейчас даются более осторожные оценки – 30-32 молекул. Из субстратов наиболее энергоемкими являются жиры. Так, при полном окислении молекулы пальмитиновой кислоты С16:0, входящей в состав многих фосфолипидов, производится 108 молекул ATP. ТРАНСПОРТНЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ В митохондрии необходимо транспортировать различные метаболиты – углеводы, аминокислоты, жиры, нуклеотиды, а также многие белки. Ряд продуктов метаболизма, например, ATP должны транспортироваться в обратном направлении из митохондрий в цитозоль. Но как это делается? Ведь 25 внутренняя митохондриальная мембрана непроницаема даже для протонов. Эти функции выполняют различные транспортные белки – транслоказы. Например, транслоказа адениновых нуклеотидов (ANT – adenine nucleotide translocase), встроенная в ВММ, точнее в участки слияния внутренней и наружной митохондриальных мембран (Рис. 15) обменивает ATP на ADP. Также в этом месте есть транслоказа фосфатов, потенциал-зависимый анионный канал (VDAC, voltage-dependent anion channel), периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR – peripheral benzodiazepine receptor), связывающий переносимые в митохондриальный матрикс порфирины, необходимые для синтеза гема, переносчики белков, органических кислот, аминокислот и т.д. Рисунок 15 - Транспортные белки, встроенные во внутреннюю митохондриальную мембрану. ANT (adenine nucleotide translocase) – переносчик адениновых нуклеотидов, VDAC (voltage-dependent anion channel) - потенциалзависимый анионный канал, PBR (peripheral benzodiazepine receptor) периферический бензодиазепиновый рецептор Для работы многих митохондриальных ферментов необходим NADH, который при переносе электронов окисляется до NAD+. Для регенерации NADH необходимы восстановительные эквиваленты. Они поставляются из цитоплазмы с помощью механизма, называемого малат/аспартатным челноком. Вот как он работает. В цитоплазме осуществляется реакция: 26 оксалоацетат + NADH + H+ → малат + NAD+. В митохондриальном матриксе идут реакции: малат + NAD+ → оксалоацетат + NADH + H+ оксалоацетат + глутамат → α-кетоглутарат + аспартат. Малат переносится челночным белком–переносчиком в матрикс в обмен на аспартат, который при этом переходит в цитоплазму. Движущей силой этих процессов служит градиент ионов H+ на митохондриальной мембране. В мозгу и мышцах восстановительные эквиваленты поставляются из цитоплазмы с помощью другого механизма, называемого глицерол-3- фосфатным челноком. В нем цитоплазматический NADH восстанавливает дигидроксиацетонфосфат до глицерол-3-фосфата, отдавая при этом два восстановительных эквивалента коферментом митохондриальной (атомы водорода) FAD, являющемуся глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, которая передает их CoQ и далее в комплекс III. Коэффициент Р/2е- при этом составляет 1,5, но производительность этого пути велика вследствие высокого числа оборотов ферментов. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ ЭНЕРГЕТИКИ Клеточная энергетика регулируется на разных уровнях: гликолиза, цикла Кребса, окислительного фосфорилирования – везде есть самые медленные звенья – «узкие места» или «бутылочные горлышки», определяющие скорость всего процесса. Их регулирование наиболее эффективно. Важнейший параметр клеточной 27 энергетики – внутриклеточная концентрация АTР. Но этот параметр не поддерживается клеткой на постоянном уровне. Клеточные нагрузки сильно варьируют, и потребление АTР может сильно возрастать, приводя к резкому падению уровня АTР. Важным параметром, характеризующим баланс процессов производства и потребления АTР и строго контролируемым клеткой является отношение [ATP]/[ADP]∙[Pi]. В норме это отношение велико, но при нагрузке оно уменьшается быстрей, чем падает концентрация ATP, т.к. при этом не только падает числитель, но еще быстрей, квадратично увеличивается знаменатель. Клетка старается поддержать это отношение на постоянном уровне путем производства АTР там и тогда, где это необходимо. Бывают экстремальные ситуации, когда окислительное фосфорилирование работает недостаточно. Например, при ишемии, возникающей в сердце при инфаркте миокарда или в мозгу при инсульте кровеносная система не обеспечивает клетки достаточным количеством кислорода. Создаются гипоксические условия. При этом прекращается электронный транспорт, не генерируется ΔμН+ и Н+-АTРаза может начать перекачивать Н+ через ВММ в обратном направлении, используя наличный запас АTР для поддержания градиента Н+. В этом случае содержание АTР в клетке катастрофически быстро падает. Для того, чтобы это не произошло, в клетках есть специальный белок IF1, который может одновременно связываться с двумя молекулами Н+-АTРсинтазы и ингибировать их работу. Этот белок активен только в виде димера (IF1)2, а димеризуется он в кислой среде при рН<6,5. При недостатке кислорода в клетке активируется анаэробный гликолиз, поставляющий АTР, хотя и не так эффективно, как окислительное фосфорилирование, но зато независимо от снабжения кислородом. При этом, однако, накапливаются продукты гликолиза – пируват и лактат, закисляющие цитозоль. Это вызывает димеризацию IF1, ингибирование Н+-АTР-синтазы и предотвращение энергетического коллапса. 28 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1) Рубин А.Б. Биофизика, т. 2. - М.: Изд. МГУ, 2000, 2004. 2) Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. – М.: Наука, 1989. 3) Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. – М.: Высшая школа, 1989. 4) Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. 2 изд. - М.: Мир, 1994. 5) Alberts B. et al. Molecular Cell Biology. 4-th edition. – Garland: New York, 2002. 6) Nelson D. L., Cox M. M. Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition. W.H. Freeman & Company, 2005. 29
