Отчет 1 этап по ГК № П2539 от 20.11 09 - Кабардино
advertisement
Федеральное агентство по образованию УДК 615.012.6 ГРНТИ 31.21.17; 31.21.18 Инв. № ПРИНЯТО: УТВЕРЖДЕНО: Приемочная комиссия Государственного заказчика Государственный заказчик Федеральное агентство по образованию От имени Приемочной комиссии От имени Государственного заказчика _____________________/Е.И. Лапин/ ____________________/ Е.Я. Бутко/ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П2539 от 20 ноября 2009 г. Исполнитель: Государственное профессионального образования университет им. Х.М. Бербекова». образовательное учреждение высшего «Кабардино-Балкарский государственный Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.2 Проведение научных исследований научными группами под руководством кандидатов наук. Проект: «Создание технологии получения лекарственного биопрепарата с использованием наноматериалов». Руководитель организации: __________________Карамурзов Барасби Сулейманович м.п. Руководитель проекта: ______________________Шевченко Анна Александровна Согласовано: Управление научных исследований и инновационных программ От имени Заказчика _______________________/Кошкин В.И./ Нальчик 2009 г. Список исполнителей Научный руководитель, Шевченко А.А. с.н.с. УНИИД КБГУ, к.б.н (Реферат, 24.11.2009 введение, главы 14, заключение) Исполнители С.н.с., НОЦ «Прикладная Смирнова И.П. антропология», профессор, д.б.н (Главы 1-4) 24.11.2009 С.н.с., НОЦ «Прикладная Шкинев В.М. антропология», к.х.н 24.11.2009 (Главы 1-4) Анзорова З.З. Аспирант КБГУ 24.11.2009 (Главы 1-4) Сакиева Д.Н. Аспирант КБГУ 24.11.2009 Студент КБГУ 24.11.2009 Студент КБГУ 24.11.2009 Нормоконтролер, (Главы 1-4) Борисова А.А. (Главы 1-4) Андриянова Е.В. (Главы 1-4) Кольченко Е.А. начальник ОСМО 24.11.2009 2 Реферат Отчет 90 с., 10 рис., 9 табл., 169 источников. ФЕРМЕНТ, ОКСИДАЗЫ-L-АМИНОКИСЛОТ, ТРИХОДЕРМА, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, БИОСИНТЕЗ, РЕГУЛЯЦИЯ, БИОСТИМУЛЯТОРЫ, ПРОДУЦЕНТ Фермент L-лизин--оксидаза (КФ 1.4.3.14), противоопухолевая активность которого была показана японскими исследователями Kusakaba H. и Soda К., синтезируется грибами рода Trichoderma. С целью создания отечественного биопрепарата на основе фермента L-лизин--оксидазы была разработана модификация спектрофотометрического экспресс-метод определения активности L-лизин--оксидазы с использованием ортофенилендиамина. Исследовано влияние сред разного состава на биосинтез и регуляцию оксидазы cпецифической Trichoderma L-аминокислот sp. в условиях глубинного культивирования. Показано влияние биологически активных добавок микробного происхождения на появление новых аминооксидазных активностей у штаммапродуцента и увеличение активности L-лизин--оксидазы. Подобраны лабораторных оптимальные условиях и условия предложена для биосинтеза экономичная фермента в физиологически естественная технология получения фермента с использоованием недорогих и легко доступных продуктов микробного происхождения. Осуществлён двухстадийный метод выделения и очистки L-лизин-αоксидазы штамма – продуцента и накопление фермента для дальнейших испытаний. Появление новых аминооксидазных активностей при культивирова-нии Trichoderma sp. с добавлением продуктов микробного происхождения создают условия для получения новых биопрепаратов. Предполагается создание новой технологии выделения и очистки фермента с использованием наноматериалов. 3 Содержание Введение ....................................................................................................................... 7 Глава 1 Аналитический обзор .................................................................................... 9 1.1 Регуляция биосинтеза и активности ферментов в микробной клетке ............. 9 1. 2 Обмен лизина в микробной клетке................................................................... 24 1.2.1 Общие пути обмена лизина в микробной клетке .......................................... 24 1.2.1.1 Биосинтез лизина в микробной клетке ....................................................... 26 1.2.1.2 Катаболизм лизина в микробной клетке ..................................................... 29 1.2.2 Глава L-лизин--оксидаза и ее противоопухолевая активность ....................... 32 2 Выбор и обоснование оптимального варианта направления исследований ............................................................................................................. 37 2.1 Штамм-продуцент L-лизин--оксидазы ........................................................... 37 2.2 Среды, используемые при исследовании биосинтеза L-лизин--оксидазы в культуре Trichoderma sp. .......................................................................................... 37 2.3 Факторы, влияющие на накопление L-лизин--оксидазы в культуре Trichoderma sp. ........................................................................................................... 38 2.4 Исследование биостимуляторов бактериального происхождения в качестве индукторов L-лизин--оксидазной активности ..................................................... 39 Глава 3 План проведения экспериментальных и теоретических исследований 43 Глава 4 Экспериментальные и теоретические исследования .............................. 46 4.1 Исследование биосинтеза и регуляции активности специфической оксидазы L- аминокислот грибного происхождения ............................................................. 46 4.1.1 Разработка модификации спектрофотометрического метода определения ферментативной активности L-лизин--оксидазы с помощью ортофенилендиамина ................................................................................................ 46 4.1.2 Влияние сред разного состава на биосинтез специфической оксидазы Lаминокислот грибного происхождения .................................................................. 54 4.1.3 Изучение оптимальных условий биосинтеза штаммом-продуцентом фермента L-лизин--оксидазы................................................................................. 56 4 4.1.4 Изучение влияния физико-химических факторов на динамику накопления L-лизин--оксидазы .................................................................................................. 58 4.1.5 Изучение влияния биологически активных добавок на динамику накопления L-лизин--оксидазы ............................................................................. 60 4.2 Ферментация активного продуцента Trichoderma sp. методом глубинного культивирования ....................................................................................................... 62 4.2.1 Регуляция оксидазных активностей продуктами метаболизма бактериального происхождения .............................................................................. 62 4.2.2 Регуляция ферментативной активности в зависимости от рН – среды ...... 64 4.3 Выделение и очистка L-лизин--оксидазы Trichoderma sp. .......................... 65 Заключение ................................................................................................................ 68 Список использованных источников ...................................................................... 73 5 Список сокращений БИО - Биостимулятор БИОЛИЗ - Стерильная культуральная жидкость Brevibacterium sp.- продуцентов лизина БИОЛЕЙ - Стерильная культуральная жидкость Brevibacterium flavum 32D продуцентов лейцина БИОПРО - Стерильная культуральная жидкость Brevibacterium flavum АР-1 К.Ж. - Культуральная жидкость ПААГ - Полиакриламидный гель ДДСNa - Додецилсульфат натрия МЕ - Международная единица ПФ - Пиридоксальфосфат АТФ - Аденозинтрифосфат КоА - Кофермент (коэнзим) А ФАД - Окисленный флавинадениндинуклеотид ОД - Ортодианизидин ОФД - Ортофенилендиамин П.О. - Пшеничные отруби 6 Введение Поиск средств лечения злокачественных новообразований продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины. Поиск лекарственных препаратов осуществляется по двум направлениям: синтез аналогов известных противоопухолевых лекарственных средств и поиск биопрепаратов микробного происхождения. Среди последних особое место занимают лекарственные онкологических препараты-ферменты. заболеваний человека В использование энзимотерапии их принесло определённые успехи, которые побуждают исследователей продолжать поиск ферментов, обладающих антиопухолевой активностью. Преимуществом энзимотерапии является избирательное каталитическое действие ферментов, то есть высокая специфичность их по отношению к индивидуальному субстрату. Микроорганизмы являются продуцентами разнообразных групп соединений, которые используются для самых разных практических целей (51, 52, 75, 76-78, 121, 140, 152-155). Это многочисленные антибиотики с разным спектром терапевтического действия, стимуляторы роста, витамины, аминокислоты, ферменты- продукты метаболизма микроорганизмов, грибного и бактериального происхождения. Среди испытанных препаратов в энзимотерапии активно вмешивающиеся в аминокислотный обмен и вызывающие необратимый распад незаменимых аминокислот занимают ферменты микробного происхождения (81, 84, 86-93). Такими ферментами с антиопухолевой активностью являются глутамин(аспарагин)аза (К.Ф. 3.5.1.38) и L-лизин --оксидаза (К.Ф. 1.4.3.14). Глутамин(аспарагин)аза широко используется в клинической онкологии при лечении лейкозов за рубежом (Holcenberg J.S. et al., 1981). Японскими исследователями из водного экстракта гриба Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray был выделен новый фермент, который ингибирован рост лейкемических клеток мышей in vivo и in vitro. Фермент был очищен до 7 гомогенного состояния и идентифицирован как L-лизин--оксидаза (К.Ф. 1.4.3.14). Фермент катализирует реакцию окислительного дезаминирования Lлизина с образованием -кето--аминокапроновой кислоты. Необратимое ферментативное разрушение глутамина и аспарагина лимитирует не только нормальные, но и в особенности опухолевые клетки амидным азотом, абсолютно необходимым для синтеза ряда биологически активных веществ. L-лизин--оксидаза является также одним из ферментов, разрушающих одну из важных аминокислот- L-лизин, к недостатку которой опухолевые клетки оказываются более чувствительными, чем нормальные клетки (Берёзов Т.Т., 1984). Поиск противоопухолевых ферментов, а также изучение вопроса регуляции биосинтеза и активности оксидаз L-аминокислот в культуре грибов представляет не только практический, но и большой теоретический интерес, поскольку полученные результаты будут способствовать выяснению тонких молекулярных механизмов действия ферментов. Выяснение оптимальных условий биосинтеза и регуляции активности фермента позволят получить активную субстанцию и перейти к разработке усовершенствования метода выделения и очистке её с использованием современных материалов и методов. 8 Глава 1 Аналитический обзор 1.1 Регуляция биосинтеза и активности ферментов в микробной клетке Живой организм является сложнейшей саморегулирующейся системой, вернее даже системой систем, в которой постоянно происходит множество биохимических превращений. Большинство из них осуществляется при помощи ферментов, образование и функционирование которых контролируется тонкими и эффективными механизмами. Биосинтез и активность ферментов в живой, в том числе и микробной клетке, находится под постоянным контролем. Это положение справедливо также для экзоферментов. Необходимые микробной клетке питательные вещества должны поставляться в определенное время, в необходимом количестве, наименьшими затратами энергии. К настоящему времени основными известными механизмами, используемыми организмами для регуляции биосинтеза, секреции и активности ферментов являются: - индукция и репрессия биосинтеза ферментов; - регуляция секреции экзобелков через мембраны; - постсинтетическая химическая модификация; - активация или инактивация ферментов с помощью активаторов, ингибиторов, кофакторов и других агентов, оказывающих влияние на строение, конформацию и свойства молекул ферментов; - ограниченный протеолиз; - контроль за перераспределением ферментов в клеточных органеллах (компартментализация, гормональная регуляция); - предотвращение нарушений в общей системе регуляции ферментативной активности (биосинтез изоферментов и др.); - детерминированность продолжительности жизни ферментов. 9 Знание тонких молекулярных механизмов регуляции синтеза и активности ферментов обеспечивает возможность получения с максимальным выходом полезного продукта (62, 73, 74, 97). Генотип клетки определяет ее потенциальные возможности в отношении синтеза ферментов и содержит план метаболизма клетки (Э. Уэбб, 1982 г.). Ферментный состав клетки и его функциональное состояние определяются состоянием его генотипа. Механизмы генетического регулирования клеточного метаболизма обусловлены наличием в геноме клетки определенных детерминантов, которые в норме выступают регулятором скорости биосинтеза ферментов, не оказывая влияния на их первичную структуру и участвующих в функциональную активность. Генетический контроль биосинтеза ферментов, метаболизме, осуществляется преимущественно на этапе транскрипции, так как с энергетической точки зрения клетке экономически более выгодно не образовывать транскрипты, которые могут не транслироваться. Естественно, что система управления столь сложным явлением должна быть многогранной, поэтому на последующих этапах биосинтеза белка также имеет место определенный тип регуляции. При этом факторы окружающей внешней и внутренней среды организма оказывают воздействие на реализацию генетической информации (114, 115, 126, 131). Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и К. Моно (Jacob, Monod, 1961). Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию для синтеза специфических индуцибельных и белков. В репрессибельных бактериальной ферментов клетке синтезом управляют системы положительного и отрицательного контроля, причем экспрессия гена или группы генов может контролироваться путем включения регуляторной последовательности между промотором и структурными генами. 10 Специфическими активаторами при индуцированном синтезе ряда ферментов являются субстраты этих ферментов и их аналоги. Поэтому биосинтез ферментов микробной клетки в значительной степени зависит от состава питательной среды. Образование фермента после добавления индуктора к культуре – продуценту начинается уже через несколько минут и осуществляется с повышенной скоростью (в 2-3 раза выше базальной) до тех пор, пока в среде присутствует индуктор. В большинстве случаев удаление индуктора из среды практически приводит к снижению скорости синтез индуцируемого фермента до исходного уровня (В.А. Никитин, 1981). Индуцированный синтез ферментов – процесс высокоспецифичный, причем, обнаруживается не просто очень высокая химическая специфичность, но и стереоспецифичность. Например, все эффективные индукторы β-галактозидазы обязательно обладают пирановым кольцом с расположением Н+ и ОН- - группу 3-го и 4-го углеродных атомов, характерным для галактозы (Ф. Прист, 1987 г.). Важной особенностью индукции является ее множественность и координированность, так как индуктор может одновременно индуцировать синтез группы ферментов, участвующих в превращениях одного вещества через серию промежуточных продуктов реакции. Так, например, добавление в среду β-галактозы индуцирует у E.coli синтез не только β-галактозидазы, но и галактозидацетилтрансферазы и галактозидпермеазы. Эти три фермента образуются в клетке параллельно и в постоянных соотношениях при действии различных индукторов, т.е. их синтез количественно координирован (Jacob, Monod, 1961). Еще в 50-х годах Stanier первым предложил возможное объяснение процесса «серийной индукции». По его мнению, добавленное вещество индуцирует образование фермента, который превращает это вещество в первый промежуточный продукт, этот продукт, в свою очередь, индуцирует образование другого фермента, и так до тех пор, пока не будет продуцирована 11 вся серия ферментов, катализирующих последовательные каскадные реакции в данном метаболическом пути (Stanier, 1951). Как отмечалось выше, индукторами биосинтеза ферментов часто являются субстраты или их аналоги. Например, Г.А. Никитиным (1981) было установлено, что индуктором протеолитических ферментов гриба Asp. oryzae являются органические источники азота. Для образования пектолитических ферментов плесневыми грибами в качестве индуктора необходим пектин (К.А. Калунянца и соавт., 1976). Однако, некоторые вещества могут влиять на биосинтез ферментов, не являясь при этом непосредственно субстратом их действия. Так, для фермента L-сериндегидратазы и L-треониндегидратазы показан мультивалентный характер индукции аминокислотами (В.К. Банковский, С.В. Григорьева, 1980; Yui, Watanabe, 1974). К.А. Калунянца и соавт. (1976 г.) было показано, что стимулятором образования пектиназ служит галактоза (116, 130). С практической точки зрения весьма важно, что один и тот же микроорганизм может синтезировать разные ферменты при изменении состава среды. Например, Asp. foetidas на среде с крахмалом синтезирует амилазу. Если в питательной среде крахмал заменить ксиланом, то гриб начинает продуцировать ксиланезу. При замене крахмала растительным маслом этот же гриб синтезирует липазу (Kusakabe et al., 1979). Альтернативой индуцированного синтеза является конститутивный, когда микроорганизмы образуют ферменты с относительно постоянной скоростью независимо от условий питания. К этому типу относится например, синтез экзодеполимераз у различных групп микроорганизмов. В литературе имеются данные, свидетельствующие о существовании ряда других механизмов регуляции биосинтеза ферментов на уровне транскрипции. Например, в регуляции экспрессии генов может участвовать особый ген – активирующий белок (САР), который взаимодействуя с цАМФ, образует комплекс, способствующий прикреплению РИК-полимеразы к промоторному участку генома (Т.Т. Березов, В.Ф. Коровкин, 1990 г.). Предполагают также, 12 что для индуцибельных внеклеточных ферментов возможна аттенуация – регуляция экспрессии генов посредством преждевременной терминации транскрипции (Ф. Прист, 1987 г.). Известно, что гистоны также участвуют в процессах активации и дезактивации генов, воздействуя тем самым на тонкие молекулярные механизмы передачи наследственной информации ((Т.Т. Березов, 1989). В экспериментах in vitro было обнаружено локальное ослабление прочности двойной спирали ДНК в присутствии физиологических концентраций ряда гормонов (Goldberg, Atchly, 1966). Имеются данные, что ионы металлов также способны локально «расплетать» (Cu2+) или вызывать «сверхскручивание» (Na+) двойной спирали ДНК (Kroeger, 1966). Таким образом, по-видимому, именно широкое разнообразие является характерной особенностью для механизмов, контролирующих процесс биосинтеза ферментов у различных организмов. Регуляция трансляции осуществляется в результате стимуляции и подавления функции рибосом, а также модуляции стабильности мРНК. Наиболее важным в механизме трансляционного контроля синтеза внеклеточных ферментов является дифференциальная стабильность мРНК (Ф. Прист, 1987 г.). Индуцированный синтез ферментов, так же, как и конститутивный, может быть подвержен углевод-катаболитной репрессии. Все быстро расщепляющиеся источники энергии подавляют образование ферментов, необходимых для усвоения более медленно катаболизируемых источников энергии. В результате углевод-катаболитной репрессии клетка всегда в первую очередь использует субстрат, поддерживающий наиболее высокую скорость роста. Эффективность действия какого-либо углевод-катаболитного репрессора зависит не от химической структуры, а исключительно от его эффекта, как источника углерода и энергии. Катаболитная репрессия образования целлюлаз у Tr. viride осуществляется на уровне трансляции (Kusakabe et al., 1980). У некоторых других микроорганизмов она осуществляется модуляции активности РНК-полимеразы. 13 в результате Механизмы катаболитной репрессии у различных видов микроорганизмов разные (Ф. Прист, 1987 г.), однако во всех случаях физиологическая роль их весьма важна, так как позволяет избегать излишнего синтеза ферментов, используемых для утилизации из среды относительно мало эффективных источников углерода. Репрессию ферментов, связанную с избытком легко метаболизируемых аминокислот и ионов NH4+ в питательной среде, называют азот-катаболитной репрессией. Она контролирует азотный статус клетки, координируя биосинтез ферментов, действующих на азот-содержащие субстраты. При изучении механизма азот-катаболитной репрессии на примере A. nidulans было высказано предположение и решающей роли в этом процессе белка, кодируемого локусом are A (при регуляции NH4+), действующего в качестве положительного контролирующего элемента и активирующего опероны, подверженные репрессии аммонием (Ф. Прист, 1987 г.). Помимо координированной репрессии группы ферментов в микробной клетке имеет место специфическая репрессия синтеза конкретного фермента конечным продуктом по принципу обратной связи. Часто, такой фермент катализирует первую стадию какого-либо метаболического пути (Диксон М., Э. Уэбб, 1982 г.). Регуляция именно пусковой стадии имеет значение как для поддержания относительно низких концентраций метаболитов клетки, так и для минимального потребления микроорганизмами углерода, азота и энергии (Ф. Коэн, 1986 г.). Конечный продукт может регулировать не только собственный биосинтез, но и синтез какого-либо другого соединения, к образованию которого ведет другой путь. Примером является перекрестная регуляция синтеза АТФ и ГТФ из общего предшественника – инозиновой кислоты. Эти два соединения принимают участие в синтезе друг друга – гидролиз АМФ ингибируется ГТФ, а восстановительное дезаминирование ГМФ ингибируется АТФ. 14 Репрессия во многом напоминает индукцию, являясь как бы ее зеркальным отражением. Оба явления высокоспецифичны и в их основе лежит один и тот же механизм. Так, при добавлении репрессирующего метаболита – корепрессора – угнетается образование всех ферментов, которые участвуют в его биосинтезе, и всегда в одинаковых соотношениях. Однако, для репрессии характерны некоторые особенности, несвойственные в случае индукции. Например, в некоторых случаях роль репрессора выполняют сразу несколько соединений одновременно. Это явление получило название комплексной или мультивалентной репрессии. Оно обусловлено тем, что ряд соединений синтезируется клеткой через общие предшественники. Следует указать еще на две особенности репрессии: во-первых, репрессия синтеза ферментов наблюдается лишь при достаточно высокой концентрации метаболита; вовторых, репрессируемыми обычно являются анаболические системы. Этот механизм позволяет бактериальной клетке избежать излишних затрат энергетических и пластических ресурсов. Таким образом, индукция и репрессия представляют собой два взаимодополняющих регуляторных механизма биосинтеза ферментов, функционирующих координировано и определяющих количество или уровень внутри- и внеклеточных ферментов, в отличие от процессов активирования и ингибирования, которые оказывают влияние на величину активности уже синтезированных ферментов. Хорошо известно, что скорость метаболических процессов зависит не только от количества молекул фермента, но и от каталитической эффективности участвующих в них ферментов. Регуляция образования фермента путем индукции и репрессии и регуляция распада фермента не способны осуществить быстрое изменение его количества, поэтому данные формы контроля часто дополняются регуляцией активности уже существующих молекул фермента. Особое место занимает аллостерическая регуляция активности ферментов, которая может осуществляться по принципу отрицательной обратной связи. Аллостерические ферменты являются уникальными не только с 15 точки зрения наличия аллостерического центра, но и особенностей формирования белковой структуры, выражающейся в способности этих ферментов к десенсибилизации (т.е. необратимой утрате чувствительности к действию аллостерических эффекторов). Таким образом, некоторые аллостерисексие ферменты могут существовать в виде двух конформеров: метастабильного регуляторного конформера, обладающего чувствительностью к аллостерическим эффекторам и более стабильного десенсибилизированного конформера, причем оба наделены ферментативной активностью (Б.И. Курганов, В.А. Яковлев, 1972 г.). Таким образом, ферменты могут находиться как в активной, так и в неактивной форме. Биологическая активность может появляться, например, в результате ограниченного протеолиза – высокоспецифичного необратимого процесса, который может инициировать физиологическую функцию путем превращения белка-предшественника в его биологически актичвную форму (Neurath et al, 1974). В то же время ограниченный протеолиз может служить механизмом, обеспечивающим необратимое прекращение какой-либо биологической активности, выступая регулятором широкого круга процессов у эукариот. Одним предшественников, из ферментов, является которые хитинсинтетаза, синтезируются образующая в виде полимер N- ацетилглюкозамина в растущих дрожжах. (Cabib et al, 1982). Другой путь фосфорилирование. ключевые стадии регуляции активности Циклический переход метаболизма, из ферментов ферментов, – обратимое катализирующих фосфорилированных форм в дефосфорилированные представляет собой эффективный механизм обратимого изменения их активности. В настоящее время известно, что обратимое фосфорилирование ферментов лежит в основе сложной сети сопряженных каскадов, которая обеспечивает координированный и синхронизированный контроль многих биохимических функций в ответ на биологические сигналы (гормоны, нервные импульсы и т.д.). В качестве примера можно привести 16 фенилаланинмонооксигеназу, катализирующую гидроксилирование фенилаланина и образование тирозина и аминоацил-РНК-синтетазу. Возможна регуляция ферментативной активности путем ковалентных модификаций, отличных от ограниченного протеолиза и фосфорилирования и образующихся аминокислот в результате посттранляционной в белках. Наиболее часто модификации остатков встречаются производные, образующиеся в результате гликозилирования боковых цепей, ацетилирования α-аминогруппы, аденилирования и деаденилирования боковой группы строго определенного остатка тирозина. В частности, регуляция активности глутаминсинтетазы путем аденилирования и уродилирования. Извество также, что регуляция активности цитратлиазы в анаэробных бактериях осуществляется путем ее ацетилирования-деацетилирования (Ф. Коэн, 1986 г.). Важные звенья контроля метаболизма связаны с пространственной организацией микробной клетки, так как скорость переноса метаболитов через мембраны, различающие различные субклеточные органеллы, ограничена и строго контролируется. На поверхности мембраны расположены рецепторы, являющиеся мишенями для гормональных веществ. Эти рецепторы могут подвергаться обратимой химической модификации. Кроме «классических» гормонов, известно много других химических факторов регуляции – пептиды, биогенные амины, кофакторы. Надо отметить, что гормоны не только вызывают индукцию или активацию ферментов, но и способны направленно разобщать или объединять ферменты с субстратами, что достигается путем их перемещения в клеточных органеллах (Ф. Прист, 1987 г.). Выше было указано на важную роль в регуляции метаболизма множественных молекулярных форм ферментов со сходной каталитической специфичностью, синтезируемых в пределах одного вида. Это явление может быть обусловлено кодирующих существованием определенные множественных варианты ферментного генных белка локусов, или же существованием множественных аллелей одного локуса (М. Диксон, Э. Уэбб, 17 1982). Согласно международной классификации множественных форм ферментов первые три класса относят к истинным изоферментам, синтез которых контролируется определенными участками ДНК. Наличие данной группы изоферментов обусловлено генетически детерминированными различиями в первичной структуре. Остальные три класса включают вторичные изоферменты, образующиеся в результате посттрансляционной модификации продукта трансляции одного гена. Такие изоформы могут быть обусловлены образованием разного рода молекулярных агрегатов или наличием дискретных конформационных состояний (В.З. Яаска, 1972). Изоферментный состав и активность отдельных изоформ в клетках находятся под генетическим и метаболическим контролем. Различные факторы внешней и внутренней среды организма оказывают регулирующее воздействие на состав и соотношение изоферментов, выполняющих одинаковую физиологическую роль. Например, с различиями в некоторых каталитических и физико-химических свойствах изоферментов связаны различия в чувствительности ключевых ферментов микроорганизма к ядам и лекарственным препаратам (Д. Мецлер, 1980). Продолжительность жизни ферментов детерминирована и ограничена (М. Диксон, Э. Уэбб, 1982). На практике методы регуляции биосинтеза ферментов подразделяют на генетические и физиологические. Известно, что гены микроорганизмов репрессированы на 90-95%, следовательно, путем снятия естественной репрессии можно в принципе добиться более полного выражения (экспрессии) генетического аппарата и таким образом увеличить выход ценного продукта. Изменить генетику штамма можно двумя путями: мутагенезом с последующей селекцией и отбором мутанта или применением современных рекомбинационных методов генетической и клеточной инженерии. Среди наиболее современных генетических методов ориентации метаболизма микроорганизмов в полезную сторону можно назвать следующие: 18 - слияние протопластов в целях расширения границ природного полового процесса и генной инженерии; - применении рекомбинантных ДНК для переноса природных генов и конструирования новых; - амилификации генов, заключающаяся в значительном увеличении числа копий определенного гена в микробной клетке, что в свою очередь приводит к резкому повышению производства вещества, кодируемого этим геном; - индукция мутаций в специфических участках ДНК с целью сокращения сложностей, связанных с трудоемким выделением и скринингом штаммов, получаемых при спонтанном мутагенезе (А.Сассон, 1987). Однако, все перечисленные методы весьма трудоемки, а получаемые штаммы отличаются высокой генетической лабильностью и склонностью к реверсии в низкопродуктивные формы. Наиболее нестабильными считают генноинженерные штаммы, так как в случае отсутствия селективных преимуществ клетка старается освободиться от лишнего, введенного в нее генетического материала. Это связано с тем, что синтез белка сопряжен с затратой большого количества энергии. Поэтому, если чужеродный белок составляет, например, 10% от общих белков клетки, то и скорость роста, соответственно, снижается на 10% по сравнению с исходным штаммом. Показателен такой пример: в кишечную палочку ввели гены соматостатина, присоединив их к β-галактозидазным генам (с тем, чтобы гены высших эукариот могли транскрибироваться и транслироваться в бактерии). Однако, поскольку образование кишечной палочкой сложного белка β-галактозидосоматостатина не имело для нее физиологического смысла, она перестала синтезировать полную β-галактозидазную молекулу. Выход продуктов микробного происхождения, в том числе ферментов, можно увеличить физиологическими методами, характеризующимися большой стабильностью и надежностью полученных осуществления и экономичностью. 19 результатов, быстротой Для этих целей необходимо знание оптимальных условий синтеза фермента, физиологического значения соответствующего процесса для продуцента, а также путей синтеза данного метаболита. Подбор оптимальных условий ферментации проводят обычно при статном культивировании, варьируя только один изучаемый фактор при сохранении других на постоянном уровне. Успешное управление образованием продуктов сводится к такому вмешательству в метаболизм, регуляция которого приводит к повышенному образованию желаемого продукта. Одним из наиболее распространенных методов регуляции синтеза ферментов является подбор оптимального состава питательной среды (К.А. Калунянца, 1976; В.И. Билай и соавт., 1981; И. Ташпулатов, С. Хамидов, 1983; В.М. Голубцова, 1976; С.Х. Хадуев, И.П. Смирнова, 1985; Theodoron et al, 1983). Выше уже отмечалось, что синтез некоторых ферментов происходит при условии наличия в среде культивирования микроорганизмов соответствующих субстратов или их аналогов (Г.А. Никитин, 1981). Такой тип синтеза ферментов получил название индуцированного. Например, японскими исследователями (Kusakabe et al, 1979) было установлено, что добавки в среду гистидина, глутамина и глицина вызывают значительное увеличение продуцирования L-лизин-оксидазы в культуре Tr. viride. Основные компоненты питательной среды (источники углерода и азота) также имеют важное значение для проявления той или иной ферментативной активности (Р.В. Зухбая, Г.Н. Пруидзе, 1985; С.Г. Снегирева и соавт., 1976; Н.А. Острикова, К.А. Калунянца и соавт., 1976). Например, Trichoderma sp. – продуцент L-лизин--оксидазы на средах сложного состава с использованием в качестве источника углерода соевой муки, молочной сыворотки не проявляет ферментативной активности. Высокая L-лизин--оксидазная активность отмечается только на среде с пшеничными отрубями. По данным мексиканских исследователей (Serrano et al, 1983) изучавших Trichoderma sp., как продуцент целлюлолитических ферментов, скорость роста и развития при использовании в качестве источника углерода глюкозы, 20 фруктозы, сахарозы и крахмала была одинаково высокой и стабильной. Значительное снижение роста наблюдалось при использовании лактозы, карбоксиметилцеллюлозы, целлюлозы; на этом основании был сделан вывод, что β-1,4-глюкозидные связи влияют на рост Trichoderma sp. Стимулирующее влияние некоторых источников азота на биосинтез Lлизин--оксидазы культурой Tr. viride Y 244-2 было показано японскими исследователями в 1979г. (Kusakabe et al, 1979). Был сделан вывод, что наилучшей формой для образования фермента является нитратная форма. По данным сотрудников нашей лаборатории (И.П. Смирнова, Т.Т. Березов, 1989) лучшим источником азота для синтеза аналогичного фермента в культуре Trichoderma sp. является аммонийная форма. Из литературы известно также, что присутствие в питательной среде Tr. viride аденина, аденозина или гуанозина увеличивает биосинтез L-лизин-оксидазы (Kusakabe et al, 1979). Причем, пиримидиновые нуклеотиды имеют меньший эффект. Авторы МД-кофактора L-лизин--оксидазы и считают, что данный процесс является лимитирующим для образования фермента. Выбор способа культивирования существенно влияет на величину и динамику накопления фермента. При сопоставлении величин L-лизин-оксидазной активности при различных способах культивирования было установлено (С.Х. Хадуев, И.П. Смирнова, 1985), что максимум образования фермента при глубинном способе культивирования происходит на 5-е, а не на 8-е сутки, как это имеет место при поверхностном способе выращивания. Удельная активность фермента при глубинном культивировании также выше. Однако, в литературе имеются сведения, что некоторые ферменты могут быть синтезированы лишь при определенном способе культивирования. Так, японскими исследователями было показано, что L-лизин--оксидаза в культуре гриба Trichoderma viride может быть синтезирована только при поверхностном культивировании продуцента (Kusakabe et al, 1979). Весьма важным является установление оптимальных сроков синтеза фермента; это позволяет вести накопление его в большем количестве и в более 21 ранние сроки культивирования. Максимум ферментативной активности Trichoderma sp. при поверхностном способе выращивания приходится на 8-е сутки роста культуры (И.П. Смирнова, Т.Т. Березов, 1989). Количественные и качественные параметры посевного материала существенно влияют на биосинтез ферментов. Например, было показано, что посеем вегетативным или конидиальным мицелием приводит к более интенсивному росту Trichoderma sp., а также к повышенному биосинтезу фермента L-лизин--оксидазы по сравнению с культурой, посеянной спорами. В связи с синтезом данного фермента интересным является и тот факт, что посевной материал, взятый со среды с пшеничными отрубями, по-видимому, содержит «индуктор» L-лизин--оксидазной активности и поэтому выгодно отличается при посеве на ферментационную среду минерального состава (И.П. Смирнова, С.Х. Хадуев , 1985). Таким образом, микроорганизмы осуществляют сверхпродукцию метаболитов в том случае, когда создаются оптимальные условия окружающей, питательной среды и сверхпродукция для микроорганизмов становится способом решения их физиологических потребностей (Л.И. Воробьева, 1989). Одним из важных факторов, определяющих нормальный рост Триходермы и ее биосинтетические возможности, является реакция среды. При изменении ее в неблагоприятную сторону организм перестает расти даже в тех случаях, если все остальные условия являются оптимальными. Изменение рН среды влияет на накопление конечных продуктов обмена веществ в культуральной жидкости Триходермы. Например, штамм-продуцент L-лизин-оксидазы может расти и развиваться в довольно широком диапазоне рН – от 4 до 8 (Г.Ш. Сейкетов, 1982), однако синтез фермента идет лишь при исходном значении рН – 5,6-6,0. При смещении рН среды в кислую сторону, гриб образует мощную биомассу, но величина активности фермента остается на чрезвычайно низком уровне. В связи с этим особое значение приобретает используемый минеральный источник азота. Так, применение в качестве источника азота ионов аммония приводит к подкислению среды растущей 22 культурой, уменьшению количества прорастающих спор и снижению L-лизин-оксидазной активности (И.П. Смирнова, Т.Т. Березов, 1989). Температурный фактор также оказывает существенное влияние на скорость роста, макромолекулярный состав, уровни внутри- и внеклеточных метаболитов. Из литературы известно, что температурный режим может оказывать влияние на выбор организмом того или иного метаболического пути (Г.Ш. Сейкетов, 1982; Л.И. Воробьева, 1989) Например, наиболее оптимальным температурным режимом культивирования Триходермы с целью максимального выхода L-лизин--оксидазы является 28оС. Более высокие температуры приводят к снижению величины и скорости накопления фермента (С.Х. Хадуев, И.П. Смирнова, 1985). Степень аэрации, безусловно, оказывает влияние не только на рост и развитие продуцента, но и на биосинтез L-лизин--оксидазы. Согласно данным наших сотрудников, повышение числа оборотов роторной качалки (дл 120 об/мин) при глубинном способе выращивания Trichoderma sp. приводит к сокращению длительности культивирования (И.П. Смирнова, Т.Т. Березов, 1989). Имеется и ряд других факторов, оказывающих влияние на биосинтез ферментов и величину их активности – освещенность, ионная сила жидкой среды, относительная влажность воздуха при поверхностном культивировании, использование физиологически активных веществ в качестве добавок к питательной среде (В.И. Огарков, 1982; И.Э. Калниня, 1981), регуляция и стабилизация метаболических процессов путем иммобилизации клетокпродуцентов, увеличение проницаемости мембран с помощью детергентов (Р.Р. Кучер, 1980), голодание в подходящем буфере, адаптация к использованию аминокислот в качестве единственного источника азота, добавление специфических ингибиторов некоторых ферментов (Л.И. Воробьева, 1989). Такое разнообразие методов физиологического подхода к регуляции биосинтеза и активности ферментов свидетельствует о широких возможностях научного поиска в этом направлении (167). 23 Физиологические методы управления микробным метаболизмом не только безопасны, но и естественны, так как не предполагают изменения генотипа штамма-продуцента. 1. 2 Обмен лизина в микробной клетке 1.2.1 Общие пути обмена лизина в микробной клетке В соответствии с целью и задачами работы большой интерес представляет вопрос о биологической роли лизина не только в микробной клетке, но и в живых организмах вообще. Аминокислота L-лизин (α, ε – диаминокапроновая кислота) впервые получена Эмилем Дрекселем из казеина в 1889г. ε α СН2 - (СН2)3 - СН - СООН NH2 NH2 Она образуется микроорганизмами, клетками растений и грибов, в то время как клетки организма человека и животных лишены этой способности, поэтому она является незаменимой аминокислотой. лизина в белках составляет 40-47 остатков Частота нахождения на 1000. Некоторые микроорганизмы, выделенные из нефти, синтезируют белок с большим содержание остатков лизина (Barret, 1985). Это характерно также для ряда функциональных и структурных белков, в составе которых остатки лизина и их ковалентные постсинтетические модификации присутствуют в значительных количествах. В частности, известна особая роль нуклеофильных остатков лизина в структуре гистонов и, следовательно, в нативной структуре нуклеиновых кислот и нуклеопротеинов (Rawa, 1983). Одной из характерных особенностей строения гистоно является большое число метилированных и ацетилированных остатков лизина (Д. Мецлер, 1980). В составе белков 24 соединительной ткани помимо лизина имеются его производные – δ-оксилизин, лизиналь, лизинонорлейцин, десмозин и изодесмозин. Следует указать еще одну весьма существенную роль ε– NН2-группы Lлизина – участие в механизмах энзиматического катализа, в частности в образовании фермент-субстратных комплексов (А.Е. Браунштейн, 1985) и связывании ферментов с кофакторами (Rawa, 1983), являясь составной частью активных центров. Так получены доказательства, что в молекуле РНКполимеразы на небольшом отрезке цепи (из 11 аминокислот) на долю лизина приходится 3 остатка. Предполагается, что этот участок цепи обеспечивает высокое сродство ферментов со своей молекулой. Известно также, что ε–NН2группы лизина альдолазы и трансальдолазы участвуют в ковалентоном связывании субстратов, являющихся карбонильными соединениями с образованием шиффовых оснований (альдиминов) Результаты рентгеноструктурных и кристаллографических исследований РНК-азы показывают, что Лиз-41 расположен в активном центре фермента (Gutte, 1975; Д. Мецлер, 1980). Предполагается, что положительный заряд остатка Лиз-41 используется для частичной нейтрализации отрицательного заряда на атомах кислорода фосфатной группы молекулы РНК, облегчая тем самым атаку нуклеофильным агентом (С.Х. Хадуев, Т.Т. Березов, 1987). В ПФ-содержащих ферментах, в частности у аспартатаминотрансферазы в отсутствии субстратов, ПФ находится в форме шиффова основания с ε– NН2группой остатка лизина. Образование шиффова основания ПФ с субстратом, по-видимому, происходит путем замещения NН2-группы субстрата на NН2группу лизина апофермента (А.Е. Браунштейн, 1985). Список ферментов, в каталитическом действии которых важную роль играет ε– NН2-группа лизина, можно было бы продолжить (например, карбоксилаза и пируватдекарбоксилаза, в состав которых входят биотинил по ε-аминогруппе и липоил по ε-аминогруппе соответственно и т.д.). Однако, и приведенных данных вполне достаточно для определения значимости ε–NН2-группы лизина в тонких механизмах энзиматического катализа. 25 Одной из специфических функций L-лизина считают также его участие в регуляции синтеза белка в клетках через один из факторов иниации elF-2 (Austin et al, 1981). 1.2.1.1 Биосинтез лизина в микробной клетке Описан ряд основных путей синтеза L-лизина в микробной клетке. 1. α-аминоадипиновый путь. Он открыт у низших и высших грибов и эвгленид (Vogel, 1959; Rawa, 1983). Эти микроорганизмы синтезируют лизин из глутамата (рис.1.1) в процессе тринсаминирования последней и образования αкетоглутарата. Далее следует реакция удлинения углеродной цепи. Путем гидратации и последующего окислительного декарбоксилирования цисгомоаконитовой кислоты образуется α-кетоадипиат, трансаминирование которого приводит к синтезу α-аминоадипиата и далее к α-аминоадипиат-δполуальдегиду, непосредственному предшественнику L-лизина. 2. Диаминопимелинатный путь имеет место у бактерий, высших растений и лишь у ряда низших грибов (А.А. Ивлев, 1990; Н.С. Егоров, 1989; Bryan, 1980). Это более сложный энзиматический путь, также приводящий к синтезу L-лизина, детали которого представлены на рисунке 2. 3. Следует отметить, что L-лизин может образовываться в микробной клетке из D-лизина дезаминирования с участием превращает оксидазы его в D-лизина, кетокислоту. которая после Далее путем стереоспецифического трансаминирования образуется L-лизин (Barret, 1985). 26 Рисунок 1 - α-аминоадипиновый путь биосинтеза лизина (Rawa, 1983). 27 Рисунок 2 - Диаминопимелинатный путь биосинтеза лизина. 28 1.2.1.2 Катаболизм лизина в микробной клетке Распад лизина начинается с дезаминирования и образовавшаяся жирная кислота далее подвергается β-окислению (рисунок 3). Описано около шести вариантов распада лизина, завершающихся β-окислением. Имеющиеся различия касаются путей отщепления двух аминогрупп от углеродного скелета лизина (Д. Мецлер, 1980). Согласно пути А, используемому, например, Flavobacterium fascum (Soda et al, 1968), ε – NН2-группы отщепляются в результате прямого, атипичного трансаминирования. Образующийся полуальдегид α-аминоадипиновой кислоты окисляется в α-аминоадипиновую кислоту. Последняя после трансаминирования подвергается окислительному декарбоксилированию и βокислению. Большинство организмов использует более сложные последовательности реакций распада лизина, ведущие к образованию αкетооадипиновой кислоты. Путь Б катаболизма лизина представляет собой идущий в обратном направлении аминоадипинатный путь его биосинтеза. Этот путь редко встречается у микроорганизмов, однако, считается основным у млекопитающих. Путь В установлен, например, для Pseudomonas putida (Miller et al, 1971). Он начинается с процесса трансаминирования и далее проходит через последовательные этапы восстановления и окисления. Он связан с путем А через стадию образования альдегида α-аминоадипиновой кислоты. Путь Г используется преимущественно дрожжами. Ацетилирование ε– NН2-группы предшествует трансаминированию и, таким образом, позволяет избежать образования промежуточных циклических соединений. Некоторые бактерии (Pseudomonas putida) (Soda et al, 1968) расщепляют L-лизин с помощью оксигеназы, превращая ее в β-аминовалерамид, который далее гидролизуется и окисляется в глутарил-КоА (путь А). 29 Рисунок 3 - Пути катаболизма лизина (Д. Мецлер, 1980). Укажем также, что ряд микроорганизмов (Rawa, 1983) на первом этапе катаболизма лизина используют L-лизин--оксидазу,которая переводит его в кето- ε-аминокапроат. Последний спонтанно циклизуется в '-инпоридин-2карбоксилат, подвергающийся восстановлению с помощью НАДФ Н-зависимой редуктазы. Далее флавопротеиновая дегидрогеназа переводит имин в 30 '- пиперидин-6-карбоксилат. В результате спонтанного гидролиза этого соединения образуется L--аминоадипинат-полуальдегид. Весьма важными превращениями L-лизина в микробной клетке являются реакции гидроксилирования, метилирования, декарбоксилирования и дезаминирования лизина. В результате гидроксилирования образуется 5оксилизин (Barret, 1985). Метилирование лизини является начальной реакцией синтеза карнитина через стадию образования γ-бутиробетаина. Как известно, карнитин выполняет транспорту жирных уникальные кислот биологические через функции митохондриальную способствую мембрану и, соответственно, их окислению. При декарбоксилировании L-лизина под действием специфической декарбоксилазы образуется кадаверин. Дезаминирование Для большинства аэробных микроорганизмов преобладающим типом катаболизма аминокислот является окислительное дезаминирование аминокислот (Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990). Оксидазы окислительного L-аминокислот (К.Ф. дезаминирования 1.4.3.14) катализируют α-аминогруппы реакцию L-аминокислот с образованием соответствующих кетокислот, аммиака и перекиси водорода. Они обнаружены у бактерий (Burton, 1952; Stumpf,1944; Cunin et al, 1986), дрожжей (Kamei et al, 1983; Kusakabe et al, 1983) и грибов (Kaight, 1948; Kusakabe et al, 1983; И.П. Смирнова, С.Х Хадуев, 1984) и отнесены к группе флавиновых ферментов, не содержащих металла (Meister, 1965; С.Р. Мардашев, 1975). Оксидазы L-аминокислот, источником которых является микроорганизмы Anacystis nidulans, Neurospora, Proteus mirabilis, Trichoderma sp. (Pistorius, Voss, 1980; Burton, 1952; Pelmont et al, 1972; Т.Т. Березов, 1989) содержат ФАД. Окислительное дезаминирование аминокислот протекает в две стадии. Первая стадия является ферментативной и завершается образованием неустойчивого промежуточного продукта - иминокислоты, которая на второй 31 стадии спонтанно, без участия фермента, но в присутствии воды, распадается на аммиак и α-кетокислоту. Восстановленные флавиннуклеотиды оксидаз L-аминокислот непосредственно окисляются молекулярным кислородом, образуя перекись водорода, которая может подвергаться расщеплению под действием каталазы на воду и кислород: Е-ФАД Н2 + О2 Е-ФАД + Н2О2; Н2О2 Н2О + ½ О2 По локализации α-аминооксидазы L-аминокислот микроорганизмов могут быть внутриклеточными (Rosenfeld, Leiter,1977) и внеклеточными (И.П. Смирнова, С.Х Хадуев, 1984) . Оксидаза аминокислот внутри клеток, например, у N. crassa, локализуется во внутримитохондриальном матриксе (Rosenfeld, Leiter,1977) , может быть связана с мембранными структурами, как у E. coli (Raunio Jenkins, 1973). Функции оксидаз L-аминокислот исследованы пока недостаточно. Например, считают, что внутриклеточные оксидазы L-аминокислот, являясь флавопротеидами, могут играть роль поставщиков электронов в дыхательную цепь (Г. Готтшалк, 1982). Показано, что окисление L-глутаминовой кислоты у Asotobacter vinelaudii осуществляется в мембранах сопряжено с функционированием электрон-транспортной системы (Kusakabe et al, 1983). 1.2.2 L-лизин--оксидаза и ее противоопухолевая активность Впервые L-лизин--оксидаза в культуре Триходермы была обнаружена и выделена в гомогенном состоянии японскими учеными в 1979г. (Kusakabe et al, 1979). Фермент эффективно катализирует реакцию окислительного дезаминирования L-лизина с образованием аммиака, перекиси водорода и αкето-ε-аминокапроновой кислоты по уравнению: 32 NH2 NH2 (CH2)4 + O2 + H2O (СH2)4 + NH3↑ + H2O2↑ CHNH2 C=O ← -кето--аминокапроновая COOH COOH L-лизин кислота ± H2O COOH ←-пиперидин-2- N карбоновая кислота Важной и перспективной областью практического использования L-лизин-оксидазы является онкологическая клиника. Основным постулатом ферментной терапии онкологических поражений является разная чувствительность нормальных и опухолевых клеток к недостатку незаменимых и заменимых факторов роста и развития, в том числе к недостатку аминокислот. Главная цель ферментной терапии опухолей – необратимое разрушение при помощи катаболических ферментов тех субстратов и веществ, которые оказались для раковых клеток незаменимыми факторами роста. Такими ферментами являются L-лизин--оксидаза из Tr. viride, рост-тормозящий эффект которой был впервые показан в 1979г. в лаборатории проф. Сода. К ферментным препаратам, рекомендуемым в качестве лекарственных антинеопластических средств предъявляется ряд требований. В частности, они должны быть наделены высокой активностью и стабильностью при физиологических значениях рН и температуры крови, высокой молекулярной активностью и сродством к субстрату, медленным клиренсом из циркуляции, отсутствием потребности в эндогенных кофакторах, низкой аллергогенностью и иммуногенностью, отсутствием торможения 33 продуктами распада, необратимостью энзиматической реакции, легкой проницаемостью через мембраны клеток, а также доступностью из непатогенных организмов. В таблице 1 представлены некоторые сравнительные кинетические и биологические свойства трех ферментов, используемых в опытах на трансплантируемых опухолях животных, в том числе L-лизин--оксидаза и Lаспарагиназы из E. coli, которая уже нашла применение в клинической онкологии при лечении лимфолейкозов. Таблица 1 - Сравнительные кинетические параметры и биологические свойства ряда бактериальных ферментов (по Т.Т. Березову, 1989). Фермент L-аспарагиназа L-глутамин/ аспарагиназа L-метионин-γоксидаза L-лизин-оксидаза Число Удельная Период оборотов Км активность полужизни Антиопухолевая (моль/мин, (мМ) (Е/мг) (час) активность (Е) моль/Е) 0,01 1000 200 2-4 2800 0,004 2800 160 13 150-480 1,30 700 19,1 4 0,1-1,0 0,04 7200 66,1 2 0,01 Представленные результаты свидетельствуют о том, что с точки зрения ряда кинетических и биологических свойств L-лизин--оксидаза из Trichoderma sp. является весьма перспективным ферментом (Т.Т. Березов, 1984, 1989). Исследования терапевтического эффекта L-лизин--оксидазы советскими учеными (В.Ю. Уманский и соавт., 1990; С.Х. Хадуев и соавт., 1986; О.С. Жукова и соавт., 1985) показали, что данный фермент наделен целым рядом важных биологических свойств. О.С. Жуковой и соавт., (1985) было 34 установлено, что L-лизин--оксидаза оказывает выраженное тормозящее действие на синтез ДНК, РНК и белка из меченных предшественников в культивируемых клетках тест-модельных систем карциномы яичника человека и лимфомы Беркитта (РЗН Rj) в опытах in vitro (О.С. Жукова и соавт., 1985). Подавление биосинтеза белка под действием этого фермента было менее выраженным, чем подавление синтеза нуклеиновых кислот. В данной работе показано также, что нарушение синтеза нуклеиновых кислот под влиянием Lлизин--оксидазы вызывает изменение распределения клеток по фазам цикла, что может являться одним из механизмов противоопухолевого действия этого фермента. В дальнейших исследованиях были проанализированы отдельные звенья первого этапа метастазирования – инвазии. В экспериментах in vitro установлено, что L-лизин--оксидаза ингибирует не только рост, но и инвазивную способность высокоинвазивных клеток клона ММI, вероятно, вследствие понижения уровня лизина в среде роста (С.Х. Хадуев и соавт., 1991). При изучении непосредственно антиметастатического действия этого фермента было показано, что введение мышам с карциномой легких Льюиса Lлизин--оксидазы приводит к уменьшению количества метастазов в 3,6 раза, их объема в 10 раз, по сравнению с этими показателями у нелеченных животных (В.Ю. Уманский и соавт., 1990). При этом было отмечено, что выраженное биологическое действие L-лизин--оксидазы в альвеолярных макрофагах сопровождается изменением активности ферментов пуринового обмена, регулирующих внутриклеточное содержание аденозина. Обнаруженные изменения в активности создают условия для уменьшения внутриклеточной концентрации аденозина – ингибитора функциональной активности макрофагов. В эритроцитах мышей с 3LL, получавших L-лизин--оксидазу, изменялось содержание полиаминов – уменьшалось содержание путресцина и величина отношения путресцин/спермидин, уровень которых в сыворотке и форменных 35 элементах крови можно рассматривать в качестве маркера активности опухолевого процесса и эффективности антиметастатической терапии. Таким образом, в результате терапевтического действия L-лизин-оксидазы существенно увеличивается продолжительность жизни мышей с удаленной первичной опухолью карциномы 3LL, так как применение L-лизин-оксидазы приводит к сохранению 50% животных в экспериментальной группе. Эти результаты дают основание для предположения, что L-лизин-оксидаза может быть эффективно применена не только на стадии первичного опухолевого ения организма, но и на стадии далеко зашедшей опухолевой прогрессии (В.Ю. Уманский и соавт., 1990). Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о том, что Lлизин--оксидаза и возможно другие грибные оксидазы незаменимых аминокислот смогут в будущем расширить арсенал лекарственных средств, применяемых в онкологии.(58 ,61, 70, 98, 100, 132-137). 36 Глава 2 Выбор и обоснование оптимального варианта направления исследований 2.1 Штамм-продуцент L-лизин--оксидазы В работе использовали штамм-продуцент L-лизин--оксидазы Trichoderma sp. В качестве посевного материала использовали вегетативный мицелий гриба, выращенный в течение 8-10 суток при температуре 28º С на сусло-агаре. Ферментационная среда включала: П.О. - 5г сульфат аммония - 1,3 г водопроводную воду - 100 мл рН среды 5,8-6,0. Культивирование Trichoderma sp. проводили в колбах (V=250 мл) при t=28º C в течение 5-6 суток на качалке типа 357 (Польша) при амплитуде 120 об/мин. Для поддержания культуры использовали сусло-агаризованную среду. 2.2 Среды, используемые при исследовании биосинтеза L-лизин-оксидазы в культуре Trichoderma sp. Среда 1: глицерин - 0,8 г (по углероду) NaNO3 - 0,85 г Na2HPO4 - 0,1 г водопроводная вода - 100 мл рН среды 6,0 37 Среда 2: этанол - 0,8 г (по углероду) NaNO3 - 0,85 г Na2HPO4 - 0,1 г водопроводная вода - 100 мл рН среды 6,0 Среда 3: лактоза - 0,8 г (по углероду) NaNO3 - 0,85 г Na2HPO4 - 0,1 г водопроводная вода - 100 мл рН среды 6,0. 2.3 Факторы, влияющие на накопление L-лизин--оксидазы в культуре Trichoderma sp. При изучении влияния возраста посевного материала на накопление фермента использовали 3-14-суточный мицелий, выросший на сусло-агаре. При исследовании зависимости биосинтеза L-лизин--оксидазы от продолжительности хранения посевного материала использовали культуру, возрастом 10 и 120 суток, выросшую на сусло-агаре. В качестве индуктора L-лизин--оксидазной активности изучали физикохимические факторы культивирования продуцента – освещенность (20 клюкс/см2 (Farkas et al, 1985; М.Х. Шигаева и соавт., 1977). В качестве добавок к ферментационной среде изучали ряд биологически активных веществ. Фитогормоны вносили на 3-и сутки роста культуры в следующих концентрациях (в г на 100 мл среды): -индолилуксусная кислота (ИУК) - 0,005 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 0,0005 38 гибберелловая кислота (ГК6) - 0,001 (Г.С. Муромцев и соавт., 1987). Аминокислоты и витамины вносили в ферментационную среду в следующих концентрациях (на 100 мл среды): L-лизин - 0,04 г L-лизин, L-фенилаланин, L-метионин - по 0,04г тиамин - 50 мкг биотин - 2,5 мкг тиозит - 0,3мг пиридоксин - 50 мкг. 2.4 Исследование биостимуляторов бактериального происхождения в качестве индукторов L-лизин--оксидазной активности Бактериальными биостимуляторами служили стерильные культуральные жидкости продуцентов лизина - Brevibacterium sp. (БИОЛИЗ). Биостимуляторы выращивали на среде: Среда 4 (для штаммов Brevibacterium sp.) (в г на 100 мл среды): меласса - 12 (по репродуктирующим веществам) гидролизат БВК -6 кукурузный экстракт -1 NH4Cl - 0,5 (NH4)2HPO4 - 0,1 (NH4)2SO4 -1 мел -2 рН среды 7,4-7,6 Определение активности оксидаз L-аминокислот Активность оксидаз L-аминокислот в водном растворе фермента рассчитывали по приросту Н2О2, 39 количество которой определяли спектрофотометрически ортофенилендиаминовым и ортодианизидиновым микрометодами. При этом освобождающаяся в процессе реакции Н2О2, взаимодействовала с хромагенами о-фенилендиамином (ОФД) и о-дианизидином (ОД). Для построения калибровочной кривой молярность свежеприготовленного раствора Н2О2 определяли методом перманганатометрии (Kolthoff, Sandell, 1952). Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 1 мг о-фенилендиамина (или 250 мкг о-дианизидина). Субстрат L- аминокислоты и буфер (рН 4,6 - 6,4) в каждой серии опытов добавляли в определенных концентрациях. Реакцию инициировали введение 0,1 мл раствора L-лизин--оксидазы (одной из двух концентраций: 0,072 МЕ/мл или 0,025 МЕ/мл или 0,1 мл раствора к.ж. После 8-10 минут инкубирования в термостате при 37оС реакцию останавливали добавлением 1 мл 6М соляной кислоты. птическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (Без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре USU-2P (Carl Zeiss Jena, Germany) при 495 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы) при использовании ОФД и при 540 нм при использовании ОД. Субстратами служили L- и DL-аминокислоты (фирма «Reanal», Венгрия, «Serva», Германия). В качестве катализатора пероксидазной реакции использовали пероксидазу фирмы «Reanal», Венгрия, а в качестве донатора протонов – ОФД или ОД («Serva», Германия). Применяли также 0,1М карбонатные (рН 6,4-8,0) буферы, составленные из реактивов марки ЧДА и ХЧ. За единицу активности фермента принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоля Н2О2 за 1 мин при 37оС. Удельную активность фермента выражали числом единиц активности на 1 мг белка. Активность фермента рассчитывали по формуле: А (Е/мл) = D * P *V , где: E *v *t D – оптическая плотность; P- разведение ферментного раствора; V- объем полной реакционной смеси; 40 v – объем вносимого раствора, содержащего фермент; E – коэффициент молярной экстинкции; t – время инкубации. Белок определяли по методу Лоури и соавт. (Lowry et al, 1952). Для построения стандартной калибровочной кривой использовали раствор яичного альбумина («Fluka», Швейцария). При определении максимума поглощения продуктов окисления ОФД спектр оптического поглощения изучали на кинетическом приборе Specord M-40 в интервале 410-700 нм. Методы изучения спектра оксидазных активностей под действием биостимуляторов При изучении зависимости удельной активности основных и сопутствующих оксидаз L-аминокислот культуральной жидкости продуцента от рН инкубационной смеси использовали те же концентрации компонентов реакционной среды, что и при определении ферментативной активности. Применялись следующие буферные системы: ацетатный буфер (рН 4,0); 0,05М фосфатный буфер (рН 5,8; 6,0; 6,6); натрий-фосфатный буфер (рН 8,0; 8,4; 9,0). Исследуя зависимость величин оксидазных активностей Trichoderma sp. в отношении ряда L-аминокислот от концентрации субстрата использовали концентрации соответствующих субстратов от 0 до 240 мМ. Константы Михаалиса вычисляли по методу обратных величин Лайнуивера-Бэрка (Г.А. Кочетов, 1980). При определении устойчивости оксидаз к термоинактивации пробы культуральной жидкости, объемом 1 мл, прогревали при 80 оС в универсальном ультратермостате. Исследование состава свободных аминокислот бактериального биостимулятора (БИОЛИЗ) осуществляли на аминокислотном анализаторе (ААА-Т339, фирма «Kove», Чехословакия) согласно методу К.Г. Калинкиной и соавт. (1990). 41 Материалы и методы выделения, очистки L-лизин--оксидазы Все операции по выделению и очистке фермента проводили в холодной комнате при 0-5оС. Исходным материалом служил экстракт Trichoderma sp., выращенный с добавлением БИО. На первом этапе осуществляли осаждение балластных белков сульфатом аммония (25%) с последующим удалением осадка на центрифуге Beckam B-25 при 3000 об/мин в течение 30 мин. Хроматографию надосадочной жидкости проводили на гидрофобном сорбенте – бутилсилохроме С-500/80, который был предоставлен проф. И.П. Смирновой. Колонку (5×70), содержащую 250 мл бутилсилохрома С-80 уравновешивали 0,02М натрий-фосфатным буфером (рН 6,0). Скорость нанесения и промывки фермента (25% раствором сульфата аммония) составляла 200 мл/час, скорость элюирования – 20 мл/час. Диализ активных фракций проводили в течение 20 час против 0,01М универсального буфера (рН 7,4) в целлофановых трубках («Serva»). Гомогенность фермента определяли гальэлектрофорезом (Г.А. Кочетов, 1986). 42 Глава 3 План проведения экспериментальных и теоретических исследований Описание основных планируемых работ (поэтапно): Первый этап исследований: 1. Проведение анализа состояния исследуемой проблемы. 2. Исследование биосинтеза и регуляции активности специфической оксидазы L-аминокислот грибного происхождения. 3. Изучение оптимальных условий биосинтеза штаммом – продуцентом фермента L-лизин-- оксидазы. 4. Ферментация активного продуцента триходермы методом глубинного культивирования с целью получения субстанции для проведения выделения и очистки. 5. Определение протоколов исследования. Обсуждение полученных результатов. Второй этап исследований: 1. Изучение возможности агрегирования фермента из культуральной жидкости различными осадителями, такими, как полиэтиленгликоль различной молекулярной массы, неорганическими солями и другими соединениями. 2. Выбор ролифазных экстракционных систем для последующей доочистки полученного продукта (фазообразующими компонентами таких систем будут водорастворимые полимеры типа сульфата декстрана, полиэтиленгликоля и других высокомолекулярных соединений). 3. Разработка мембранных методов для разделения сложных белковых компонентов. Апробация мембран нового поколения, полученных на основе нанотехнологий. 4. Оптимизация режимов выделения и разделения компонентов белковой смеси для очистки биопрепарата. 43 5. Получение готовой лекарственной формы в виде конъюгатов с углеродными одно- и полистеночными наночастицами 6. Создание условий масштабирования процесса выделения и очистки субстанции с целью наработки фермента в достаточном количестве для его испытаний. Третий этап исследований: 1. Анализ проведённых исследований. 2. Создание лекарственных форм биопрепарата. 3. Выбор лекарственной формы для испытаний. 4. Проведение испытаний лекарственной формы биопрепарата. 5. Рекомендации по созданию лекарственных форм нового биопрепарата. Первый этап исследования будет включать в себя проведение анализа состояния исследуемой проблемы. Исследование биосинтеза и факторов регуляции активности фермента позволят определить оптимальные условия его накопления. При выполнении в начале анализа состояния исследуемой проблемы повысится качество выполнения работ на данном этапе, в связи с наиболее осознанным подходом к разработке протокола исследования, опираясь на материалы ведущих зарубежных и российских научных журналов, монографий. Исследование биосинтеза и факторов регуляции активности фермента позволят максимально повысить его исходную активность. Второй этап работы состоит из изучения возможности агрегирования фермента из культуральной жидкости различными осадителями, такими, как полиэтиленгликоль различной молекулярной массы, неорганическими солями и другими соединениями. Выбор ролифазных экстракционных систем для последующей доочистки полученного продукта. На этом этапе будет осуществляться разработка мембранных методов для разделения сложных белковых компонентов, апробация мембран нового поколения, полученных на основе нанотехнологий, оптимизации режимов 44 выделения и разделения компонентов белковой смеси для очистки субстанции и получение готовой лекарственной формы биопрепарата в виде конъюгатов с углеродными одно- и полистеночными наночастицами, а также условия масштабирования процесса. На основе проведённых исследований будут разработаны оптимальные полифункционального условия фермента выделения и очистки нового осуществлено L-лизин--оксидазы; получение готовой лекарственной формы биопрепарата в виде конъюгатов с углеродными одно- и полистеночными наночастицами, маштабирования процесса, что позволит перейти к этапу создания лекарственных форм и проведения предклинических испытаний. Третий этап работы состоит из создания лекарственных форм очищенной субстанции фермента и выбора лекарственной формы для прохождения испытаний. На основе проведённых исследований будут разработаны практические рекомендации с целью создания нового биопрепарата. Написание научно- технического отчёта. Описание планируемых результатов В более ранних публикациях японских исследователей была показана противоопухолевая активность грибов рода триходерма. Активной субстанцией метаболитов триходермы является фермент L-лизин --оксидаза. Исследование биосинтеза фермента, выделение и очистка полученной субстанции является актуальной проблемой, поскольку в России к настоящему времени нет противоопухолевых препаратов. Исследование наноматериалов и создание нанотехнологии нового биопрепарата создадут условия для получения более дешёвого лекарственного средства. Создание и исследование лекарственных форм позволит определить перспективы использования лекарственных форм нового биопрепарата. 45 Глава 4 Экспериментальные и теоретические исследования 4.1 Исследование биосинтеза и регуляции активности специфической оксидазы L- аминокислот грибного происхождения 4.1.1 Разработка модификации спектрофотометрического метода определения ферментативной активности L-лизин--оксидазы с помощью ортофенилендиамина Исследования проблемы регуляции биосинтеза и активности L-лизин-оксидазы требовали разработки достаточно простого, быстрого, чувствительного, легко воспроизводимого и безопасного метода определения ферментативной активности. Следует отметить, что детальное изучение оксидаз L- аминокислот долгое время сдерживалось вследствие применения неспецифических, трудоемких дорогостоящих методов, основанных на измерении количества одного из продуктов реакции α-кетокилоты ( Waldman, Burch, 1963; Soda, 1968; Kusakabe et al, 1980), аммиака (Т.Т. Березов, и соавт., 1987), перекиси водорода (И.П. Смирнова и соавт., 1984), а также по поглощению кислорода ( Burton, 1951; Knight, 1948; Stumpf, 1944). В 1984 г. был разработан простой, однако достаточно чувствительный спектрофотометрический метод определения активности L-лизин--оксидазы, основанный на измерении количества образующейся в результате реакции перекиси водорода, которая ортодианизидингидрохлорид в присутствии пероксидазы окисляет (3,3-диметоксибензидингидрохлоридгидрат) с образованием интенсивно окрашенного вещества. Однако существенным недостатком данного метода является не только плохая растворимость одианизидингидрохлорида как в буферных смесях, так и в воде, но особенно его канцерогенный и мутагенный эффекты. Учитывая эти обстоятельства, ранее уже была предпринята попытка заменить о-гидроксилированное производное ароматического амина - одианизидингидрохлорид на его негидроксилированный аналог – 3,3; 5,546 тетраметилбензидин, отсутствие канцерогенного действия которого было установлено экспериментально (Holland tt al, 1974). Однако, использование тетраметилбензидина или дигидрохлорида тетраметилбензидина, также нерастворимого в буферных смесях и в воде, требовало добавок в реакционную смесь апротонных растворителей (диоксана, диметилформамида, диметилсульфоксида), а активность L-лизин--оксидазы регистрировалась при том значении рН, при котором проявлялось лишь 50% исходной каталитической активности. Таким образом, данный метод, по сравнению с уже упомянутым ортодианизидиновым, имел низкую чувствительность (Е.В. Лукашева и соавт., 1991). Поэтому одной из первостепенных задач, стоящих перед нами, была разработка модификации спектрофотометрического метода определения активности L-лизин--оксидазы, обладающего как достаточно высокой чувствительностью, так и безопасностью используемых реактивов. С этой целью в качестве донатора протонов в пероксидазной реакции мы применяли ортофенилендиамин (эмпирическая формула: C6H4(NH2)2), близкий по химическому строению к ортодианизидину, но в отличие от последнего представляющий собой значительно более безопасный реактив, чем ортодианизидин. Исследуя возможность использования ортофенилендиамина в качестве хромогена в сопряженной пероксидной реакции, первоначально изучали спектр оптического поглощения образующихся в результате реакции продуктов окисления этого соединения. Окрашенные в желтый цвет продукты окисления ортофенилендиамина имеют единственный максимум поглощения при 495 нм. Таким образом, эта длина волны была выбрана для дальнейшей работы. В следующей серии опытов исследовали зависимость оптической плотности окрашенных растворов с ортодианизидином (ОД) и ортофенилендиамином (ОФД) от концентрации перекиси водорода. Разница в углах наклона кривых на рисунке 4 свидетельствует о большей аналитической чувствительности ОФД-метода по сравнению с ОД-микрометодом. 47 2,5 2 1,5 1 D 2 1 0,5 0 -25 25 75 125 175 С Рисунок 4 - Изучение зависимости оптического поглощения растворов с ОД (1) и ОФД (2) от концентрации перекиси водорода в реакционной смеси. Далее в сравнительном плане изучали кинетику окисления L-лизина ферментом L-лизин--оксидазой в реакциях с использованием ОД- и ОФДхромогенов (рисунок 4). Как видно на рисунке 5 как в опыте с ОД, так и в опыте с ОФД кривые зависимости оптической плотности от времени инкубации реакционной смеси (при концентрациях субстрата и фермента, указанных в Главе 2) выходят на плато через 8 мин для ОФД – и через 10 мин для ОДреагентов. Следовательно, целесообразно измеренеие активности фермента с использованием ОФД проводить через 8 мин инкубации пробы. 48 0,1 ОФД(1) ОД(1) D 0,05 ОФД(2) ОД(2) 0 0 2,5 5 7,5 10 12,5 Время, мин Рисунок 5 - Сравнительное изучение зависимости L-лизин--оксидазной активности от времени инкубации реакционной смеси с ОД и ОФД (1 – активность L-лизин--оксидазы 0,072 Е/мл; 2 - активность L-лизин--оксидазы 0,025 Е/мл). На основании данных рисунка 5 можно сделать заключение, что предлагаемый метод обладает большей чувствительностью, чем ОД- микрометод. По этому показателю он также значительно превосходит разработанную ранее модификацию ортодианизидинового метода (Е.В. Лукашева и соавт., 1991). При исследовании рН зависимости (в интервале от 3,6 до 8,0) ОФДметодом, показано (рисунок 6), что в диапазоне значений рН от 5,8 до 7,0 относительная активность фермента максимальна. Необходимо отметить, что данная реакция является сопряженной и оптимум рН L-лизин--оксидазы смещен к меньшим значениям из-за присутствия пероксидазы, имеющей кислый рН-оптимум действия. 49 100 80 60 1 Е, % 2 40 20 0 3 4 5 6 7 8 рН Рисунок 6 - Изучение рН зависимости L-лизин--оксидазы ортофенилендиаминовым методом (Е-активность L-лизин--оксидазы в % к наивысшей; 1 – 0,1М ацетатный буфер (рН – 3,6-6,2); 2 – 0,1М натрий-фосфатный буфер (рН – 5,8-8,0). Хромогенные субстраты, к которым относятся ОД, ТМБ и ОФД, также способны менять интенсивность оптического поглощения в зависимости от рН (Е.В. Лукашева и соавт., 1991). Из испытанных буферных систем наиболее оптимальным оказался 0,1М натрий-фосфатный буфер. Однако, значительного влияния на величину энзиматической активности состав буфера не оказывал. Для дальнейшей работы в наших условиях использовали 0,1М натрийфосфатный буфер (рН – 5,8). При изучении наиболее оптимального соотношения компонентов инкубационной смеси при использовании ОФД-метода определения L-лизин-оксидазной активности было показано, что пероксидаза добавлена в избытке и изменения ее концентрации в сторону уменьшения или увеличения не оказывают существенного влияния на величину энзиматической активности. В тоже время (рисунок 7) увеличение концентрации ОФД в реакционной смеси приводит к увеличению оптической плотности, а уменьшение ее концентрации ниже 0,2 мг/мл приводит к снижению величины ферментативной активности. 50 Наиболее оптимальной концентрацией ОФД в реакционной смеси является концентрация 1мг/мл. 0,03 0,02 Е 0,01 0 0 0,3 0,6 0,9 1,2 С, мг/мл Рисунок 7 - Зависимость активности L-лизин--оксидазы от концентрации ОФД в реакционной смеси (Е – активность L-лизин--оксидазы, Е/мл; С – концентрация ОФД в мг на мл реакционной смеси). Отметим также, что ортофенилендиамин – достаточно лоступный химический реактив. Предложенный ранее метод (Soda et al, 1968) определения активности оксидаз L-аминокислот по накоплению в реакционной среде αкетокислот, которые дают окрашенный бензотиазолонгидразонгидрохлоридом динитрофенилгидразином не продукт (МБТГ) нашел широкого с 3-метил-2- или применения 2,4в силу труднодоступности реактивов, включая образцы α-кетокислот, которые необходимы для построения калибровочного графика. При исследовании зависимости активности L-лизин--оксидазы от концентрации L-лизина в реакционной смеси была установлена линейная зависимость в пределах концентрации субстрата в среде от 0,5∙10 -5 до 3,5∙10-5 М. Кривая, изображенная на рисунке 8, может быть использована для 51 определения начальных концентраций L-лизина в биологических жидкостях (Lukasheva, Berezov, 1988). Рисунок 8 - Изучение зависимости активности L-лизин--оксидазы от концентрации Lлизина в реакционной смеси (Е - активности L-лизин--оксидазы, Е/мл; С – концентрация L-лизина, М). В следующей серии опытов изучали стабильность водного раствора ОФД на свету. Было показано, что наиболее достоверными являются величины активности L-лизин--оксидазы, определяемые в пределах 2-х часов работы, после 8 часов показатели ферментативной активности увеличиваются. Представленные в таблице 2 данные о воспроизводимости результатов определения активности фермента с использованием ОФД свидетельствуют о том, что предложенный метод отличается не только высокой чувствительностью, но и хорошей воспроизводимостью и по этому показателю превосходит ОД-метод. Следует отметить, что данный метод в определенном смысле универсален и может быть использован не только для определения активности L-лизин--оксидазы, но и для определения активности оксидаз других Lаминокислот. 52 Таблица 2 - Сравнительная оценка воспроизводимости и чувствительности ОДи ОФД-микрометодов определения активности L-лизин--оксидазы. Показатели воспроизводимости и ОД-метод ОФД-метод Средняя арифметическая 0,270 0,310 Среднеквадратическое отклонение 0,019 0,012 Коэффициент вариации, % 7,030 3,880 Нижний 0,057 0,036 чувствительности метода предел чувствительности (t=20ºС) В этом его преимущество, например, перед микробиологическим способом определения оксидазной активности у Acrococus viridas (Г.И. Кременчуцкий, 1984), который предполагает применение 20-ти компонентного состава индикаторной среды и специфической для Acrococus viridas ростовой среды, ограничивающих возможность широкого использования этого метода. Таким образом, разработанная модификация спектрофотометрического метода определения активности L-лизин--оксидазы с помощью ОФД отличается от ранее известных методов высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов, доступностью, относительной безопасностью для исследования и быстротой проведения анализа. Получаемые данным методом значения активности фермента сопоставимы с показаниями ОД-метода. Вычислен статистически достоверный коэффициент пересчета с одного метода на другой: А(ОД) × 1,4 = А(ОФД) Данная модификация метода была применена в дальнейших исследованиях при изучении возможности управления биосинтезом L-лизин-оксидазы у Trichoderm sp. физиологическими методами. 53 4.1.2 Влияние сред разного состава на биосинтез специфической оксидазы L- аминокислот грибного происхождения Данный способ регуляции биосинтеза полезного метаболита является необходимым звеном в процессе разработки наиболее оптимальной технологии получения вещества. Учитывая то обстоятельство, что работа проводилась с продуцентом L-лизин--оксидазы, выращенным глубинным методом, позволяющим осуществить переход на непрерывный способ культивирования, а также то положение, что регуляцию биосинтеза и активности ферментов целесообразнее изучать на искусственной среде, мы предприняли попытку заменить используемый в ферментационной среде сложный источник углерода – пшеничные отруби на более простые компоненты, не потеряв при этом достигнутой величины исходной ферментативной активности. Искусственные ферментационные среды (состав указан выше) содержали все необходимые для роста и развития элементы; а в качестве источника углерода – глюкозу, этиловый спирт, глицерин, галактозу, лактозу, сахарозу или крахмал, уравновешенные по углероду (из расчета 0,8 г/100 мл среды). Показано, что в этих условиях Trichoderm sp. растет хорошо, что сопровождается значительным подкислением среды и появлением L-лизин-оксидазной активности в большинстве вариантов лишь на 8-9 сутки. Однако, среды с глицерином, этанолом и лактозой проявляли оксидазную активность в отношении L-лизина в более ранние сроки ферментации. Поэтому эти источники углерода были выбраны для дальнейшего изучения. При разработке технологии культивирования важным экономическим показателем является содержание в ферментационной среде небольшого количества легко доступных и дешевых ингредиентов; в работе удалось сократить их состав до 4–х компонентов – воды, источника углерода, азота и фосфора (рН 6,0). Результаты опыта продемонстрированы в таблице 3. 54 Таблица 3 - Влияние источников углерода на L-лизин--оксидазную активность Trichoderma sp. (глубинное культивирование). Источник углерода 0 рН-среды Белок (мг/мл) Активность (Е/мл) Сутки роста Сутки роста Сутки роста 3 4 5 6 7 0 3 4 5 6 7 0 3 4 5 6 7 Сложный источник углерода* (контроль) Глицерин 6,0 8,1 8,1 7,9 7,8 5,5 0 0,5 0,6 0,7 0,6 0,9 0 3,9 3,8 3,5 3,4 1,6 Лактоза 6,0 5,9 6,0 6,3 6,0 5,5 0 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0 1,8 1,9 2,5 2,0 0 Этанол 6,0 5,6 6,2 6,0 5,1 5,0 0 0,3 0,4 0,5 0,4 0,4 0 1,5 2,1 0,9 0 6,0 5,8 5,9 5,1 5,2 4,5 0 0,3 0,4 0,4 0,4 0,5 0 2,1 1,5 0 0 0 0 * пшеничные отруби Как видно из таблицы, среды с использованием в качестве источника углерода глицерина, лактозы, этанола не были хорошими субстратами для штамма и L-лизин --оксидазная активность проявлялась в значительно меньших количествах по сравнению с использованием в среде с пшеничными отрубями. Максимальное образование фермента на среде с трудноусвояемым субстратом глицерином происходило на третьи сутки, на среде с лактозой на пятые, на среде с этанолом на четвёртые сутки роста. Вполне очевидно, что эти среды не могут быть использованы для накопления фермента в достаточном количестве. Максимальное образование фермента происходит на среде с использованием в качестве источника углерода пшеничных отрубей на третьичетвёртые сутки роста гриба. Видно, что L-лизин--оксидазная активность во всех трех опытных вариантах значительно ниже, чем в контроле. По-видимому, пшеничные отруби, в составе которых много целлюлозы, являются подходящим источником продуцента в качестве питательного субстрата, так как в естественных условиях обитания в почве представители данного рода утилизируют целлюлозосодержащие 55 растительные остатки как бы адсорбируясь на них. Не исключено, что адгезия мицелия гриба на пшеничных отрубях способна изменять интенсивность и направленность физиологобиохимических процессов, осуществляемых Trichoderm sp. Из литературы известно, например, что в результате такой иммобилизации возможно значительное изменение проницаемости клеточных стенок (Chibata et al, 1975; Jamamoto, 1976). Из данных таблицы 3 следует также, что хотя глицерин, лактоза, этанол не являются хорошими субстратами для Trichoderm sp., все же наделены способностью индуцировать синтез L-лизин--оксидазы. Этанол, являясь промежуточным продуктом обмена продуцента (Т.Т. Астанов, Н.Н. Наплекова, 1975), вероятно, может оказывать воздействие на рост и развитие гриба. Лактоза, подвергающаяся целлюлолитического неспецифическим Неустроев и медленному комплекса индуктором соавт., 1991). расщеплению Trichoderm sp., также L-лизин--оксидазной Глицерин, как β-галактозидазой может быть активности (К.Н. известно, является для микроорганизмов чрезвычайно трудно усвояемым субстратом. В литературе имеются сведения о том, что одним из физиологических стимулов биосинтеза экзоферментов микроорганизмов является голодание, мобилизующее их экзоферментативную активность. Синтез молекул ферментов происходит за счет запасов питательных веществ в самих клетках. Например, необходимым условием образования внеклеточной протеиназы является ограничение питательной среды источниками углерода, азота и серы. Внесение в среду лимитирующего субстрата приводит к прекращению биосинтеза фермента (С.В. Устюжанина и соавт., 1985). 4.1.3 Изучение оптимальных условий биосинтеза штаммом- продуцентом фермента L-лизин--оксидазы В следующей серии опытов была предпринята попытка воздействовать на синтез и накопление L-лизин--оксидазы, используя культуру, находящуюся на 56 разных физиологических стадиях развития. Было показано (таблица 4), что использование в качестве посевного материала молодой 3-4-х суточной культуры (находящейся на стадии воздушного мицелия) и 12-14-ти суточной культуры (на стадии спороношения) дает наивысшие результаты в процессе ферментации. Эти данные хорошо согласуются с результатами литературы о том, что биосинтез ферментов обильно спороносящими грибами осуществляется наиболее эффективно при использовании в качестве посевного материала более старой культуры (В.И. Билай, 1980). Таблица 4 - Влияние возраста посевного материала на величину L-лизин--оксидазной активности в культуре Trichoderma sp. (6-е сутки роста). Возраст посевного материала (сут) 3,5 6 8 10 12 14 рН конечная 7,6 6,5 5,8 6,8 6,3 7,1 Белок, мг/мл 1,9 1,9 1,8 2,0 2,0 1,8 1,2 0,9 1,0 0,9 1,4 1,4 0,6 0,5 0,5 0,5 0,7 0,8 закономерности были Активность L-лизин--оксидазы, Е/мл Удельная активность L-лизин--оксидазы, Е/мг Интересные обнаружены при изучении зависимости динамики и величины накопления L-лизин--оксидазы от продолжительности хранения посевной культуры (таблица 5). Показано, что использование конидиального мицелия культуры, выдержанного при 4оС в течение 10 дней, позволяет получить высокую активность L-лизин--оксидазы уже на 3-4 сутки. Та культура, которая в частично обезвоженном состоянии хранилась в тех же условиях, но в течение 120 дней, на 3-4 сутки ферментации была практически неактивна, однако к 8-м суткам L-лизин--оксидазная активность возрастала и превышала контрольную почти в два раза. Это явление, видимо, связано с адаптацией Trichoderma sp. к 57 переходу клеток из состояния биологического покоя к состоянию высокой физиолого-биохимической активности. Таблица 5 - Изучение динамики накопления L-лизин--оксидазы в зависимости от продолжительности хранения посевного материала. Продолжительность хранения посевного материала 0 4 рН среды Активность L-лизин--оксидазы, Е/мл сутки роста сутки роста 5 6 7 8 0 4 5 6 7 8 - 1,9 10 суток (контроль) 6,0 8,1 8,0 7,9 5,5 7,8 0 1,9 1,8 1,8 120 суток 6,0 5,8 5,7 6,6 7,9 7,8 0 сл. 0,2 1,5 2,3 3,7 4.1.4 Изучение влияния физико-химических факторов на динамику накопления L-лизин--оксидазы Предпосылкой следующей серии опытов послужили работы отечественных и чехословацких исследователей, установивших прямую зависимость между освещенностью и вступлением спороносящих штаммов рода Trichoderma sp. в фазу спорообразования (Farkas et al, 1985; Н.С. Егоров, 1989), коррелирующую с проявляемой L-лизин--оксидазной активностью (И.П. Смирнова, Т.Т. Березов, 1989). В указанных работах была показана скоротечная (до 30 мин) фотоиндукция биосинтеза аденилатов (преимущественно АТФ) и вступление в фазу споруляции под воздействием прерывистого и постоянного освещения. Ранее было установлено, что концентрические зоны споруляции открываются на колониях грибов рода Триходерма в соответствии с чередованием светового и темного периодов (Betina and Zajacova, 1978). Поэтому было интересно изучить простой природный эффектор – свет в качестве инициатора метаболических изменений, ведущих к споруляции и синтезу L-лизин--оксидазы. Как видно из данных 58 таблица 6 постоянная освещенность культуры (20 клюкс) ведет к сокращению цикла развития продуцента и вступлению в фазу спорообразования в более ранние сроки, что сопровождается накоплением значительных величин Lлизин--оксидазной активности уже на 4-е сутки роста культуры. В литературе имеются единичные сведения о том, что электростатические поля, напряженностью 1-7 квольт/см2, используются при выращивании микроорганизмов с целью ускорения метаболических процессов (М.Х. Шигаева и соавт., 1977). Однако, электростатические поля, напряженностью 1000 вольт/см2, в значительной степени подавляли рост и развитие продуцента, как и синтез белка; об этом свидетельствует 3-х кратное снижение L-лизин--оксидазной активности в опытном варианте по сравнению с контролем. Таблица 6 - Влияние освещенности и внешнего электростатического поля на величину и динамику накопления L-лизин--оксидазы в культуре Trichoderma sp. Физико- рН среды Активность химические L-лизин--оксидазы, Е/мл факторы регуляции Контроль ( в темноте) Освещенность (20 клюкс) Напряженность (1000 В/см2) сутки роста сутки роста 4 6 8 4 6 8 8,2 7,7 8,0 3,6 3,1 4,3 8,3 7,4 7,2 4,6 3,2 2,9 6,8 6,3 7,0 1,2 0,9 1,4 59 Изучение 4.1.5 влияния биологически активных добавок на динамику накопления L-лизин--оксидазы В настоящее время часто в различных биотехнологических процессах с большим успехом используют неспецифические и специфические индукторы биосинтеза различных метаболитов. Иногда индукторы синтезируют химическим путем (Syldatk, Vagner, 1990), однако, часто в этих целях используют широко распространенные в природе биологически активные вещества. Известно, синтезируют например, -индолилуксусную что представители кислоту, которая, рода в Триходерма физиологических концентрациях способна оказывать существенное влияние на метаболизм грибов (Т.Т. Астанов, Н.Н. Наплекова, 1975). В следующей серии опытов изучено влияние добавок к питательной среде продуцента фитогормонов на величину и динамику накопления L-лизин-оксидазы. Как видно из таблицы 7 -индолилуксусная кислота и гибберелловая кислота несколько сокращают цикл развития продуцента, что позволяет получить максимум L-лизин--оксидазной активности уже на 4-е сутки роста Trichoderma sp. Цитокиннин 6-бензиламинопурин, напротив, не оказывает влияния на синтез фермента. Для Trichoderma sp. наиболее выраженным источником для биосинтеза Lлизин--оксидазы оказались пшеничные отруби, содержащие в значительных количествах витамины – тиамин, биотин, инозит, и пиридоксин (В.Ф. Голенков, Н.А. Игорянова, 1986). Известно также, что микроорганизмы, в том числе низшие грибы, могут быть крайне чувствительны к недостатку этих биологически активных веществ (З.Э. Беккер, 1963). Учитывая эти обстоятельства, были проведены опыты, в которых к питательной среде, добавляли растворы витаминов (таблица 7), однако, существенного прироста Lлизин--оксидазной активности не отмечено. 60 Таблица 7 - Влияние биологически активных добавок на L-лизин--оксидазную активность Trichoderma sp. (4-е сутки роста). Активность Биологически активная добавка L-лизин--оксидазы, Е/мл Контроль (без добавок) 3,5 β-индолилуксусная кислота 4,3 6-Бензиламинопурин 3,6 Гибберелловая кислота 3,9 L-лизин 4,8 L-лизин, L-фенилаланин, L-метионин 4,9 Стерильная культуральная жидкость Brevibacterium sp.- продуцента 9,5 L-лизина Изучали также возможность индукции биосинтеза L-лизин--оксидазы субстратом L-лизином, и рядом других аминокислот и биологической жидкостью (культуральной жидкостью продуцента L-лизина), содержащей Lлизин в количестве 40 г/л. Как видно из данных таблицы 7 энзиматическая активность возрастает примерно в 1,5-3 раза. Наиболее высокая активность фермента выявлялась при добавлении к ферментационной среде продуцента стерильной культуральной жидкости коринеформной бактерии Brevibacterium sp. штамма-86 – продуцента L-лизина. Полученные результаты представляют и определенный теоретический интерес. По-видимому, это одно из проявлений коменсолизма, когда один вид микроорганизмов продуцирует вещества, ускоряющие рост и развитие другого вида. Не исключено, что такими веществами являются бактериальные полисахариды (Andreyuk, Intinskaya, 1989), в частности пептидогликаны, содержащие следующие аминокислоты и моносахара: глюкозамин, мурамовую кислоту, лизин, глутаминовую кислоту, глицин, аланин и серин. В почве пептидогликаны подвергаются биодеградации 61 путем воздействия бактериолитических экзоферментов низших грибов и других микроорганизмов: глюкозидаз (расщепляющих связи в углеводной части пептидогликана), ацетил-глутамил-аланин-амидаз, пептидаз (гидролизующих межпептидные мостки) и оксидаз L-аминокислот и других оксидативных ферментов (А.И. Северин и соавт., 1990). Известно также, что продукты окислительного дезаминирования аминокислот, включая -кетоглуторовую кислоту, являются эссенциальными для ряда микроорганизмов активируя процессы их жизнедеятельности. В прикладном отношении полученные с биостимулятором результаты также, очевидно, не безынтересны. В последние годы стратегия и тактика поиска повышения активности биологически активных соединений из микроорганизмов была ориентирована на использование консорциумов микроорганизмов (Н.С. Егоров, Н.С. Ландау, 1982; Т.П. Яковлева, 1983; Н.Г. Рыбальский, 1989; С.П. Лях, 1989), однако чистая культура имеет множество технологических преимуществ перед смешанным культивированием. В то же время в литературе почти нет сведений о применении в процессе поиска более перспективной технологии в качестве добавок к ферментационным средам стерильных культуральных жидкостей микробного происхождения. 4.2 Ферментация активного продуцента Trichoderma sp. методом глубинного культивирования 4.2.1 Регуляция оксидазных активностей продуктами метаболизма бактериального происхождения В предварительных опытах было установлено, что среди исследуемых факторов, стимулирующих биосинтез L-лизин--оксидазы у Trichoderma sp., культивируемой глубинным способом, наиболее эффективным оказался биостимулятор бактериального происхождения (БИОЛИЗ). Он вызывал заметное повышение исходной активности, в 2,7 раза. В тоже время L62 фенилаланин--оксидазная активность в культуре продуцента возрастала в 11 раз, а L-метионин--оксидазная активность – в 80 раз. Ранее в нашей лаборатории (И.П. Смирнова, Т.Т. Березов, 1988) уже были открыты сопутствующие активности в отношении фенилаланина и метионина, однако их величины были незначительными и соответствовали полученным нами в контрольных опытах без добавления биостимулятора. Укажем также, что в варианте с биостимулятором были обнаружены, кроме того, новые, ранее невыявляемые энзиматические активности в отношении L-изомеров тирозина, аргинина, лейцина и гистидина (таблица 8). Необходимо было проводить определение сопутствующих активностей в оптимальных условиях инкубации проб, включая рН-оптимум действия и насыщающие концентрации субстрата, а также исследовать их основные физико-химические и каталитические свойства. Таблица 8 - Оксидазные активности Trichoderma sp. в присутствии продуктов метаболизма бактериального происхождения на 8-е сутки роста. Без стимулятора Субстрат L-Лизин L-Фенилаланин Удельная Удельная активность активность, по Е/мг отношению к L-лизину, % 3,0 100,0 С биостимулятором 8,3 Удельная активность по отношению к L-лизину, % 100,0 Удельная активность, Е/мг 0,3 10,0 3,4 41,0 L-Тирозин 0 0 3,3 39,7 L-Аргинин 0 0 3,2 38,5 L-Лейцин 0 0 3,1 37,3 L-Гистидин 0 0 2,6 31,3 L-Метионин 0,03 1,0 2,4 28,9 Примечание - В отношении L-аминокислот оксидазная активность не выявлена 63 4.2.2 Регуляция ферментативной активности в зависимости от рН – среды При изучении зависимости величин оксидазных активностей от рН среды (рисунок 9) установлено, что L-лизин-, L-фенилаланин- и L-тирозин-- окисдазные активности наиболее высоки в кислой зоне (рН 5,8) в то время как оксидазная активность в отношении L-метионина, L-лейцина, L-гистидина и Lаргинина оказалась максимальной в щелочной зоне (рН 8,4). Вместе с тем все 7 исследованных оксидазных активностей были стабильными и достаточно высокими при физиологических значениях рН среды. Рисунок 9 - Изменение оксидазной активности в отношении ряда L-аминокислот в зависимости от рН инкубационной смеси: 1. L-лизин--оксидазная активность; 2. L- фенилаланин --оксидазная активность; 3. L-тирозин--оксидазная активность; 4. L-аргинин--оксидазная активность; 5. L-метионин--оксидазная активность; 6. L-лейцин-оксидазная активность; 7. L-гистидин--оксидазная активность. 64 4.3 Выделение и очистка L-лизин--оксидазы Trichoderma sp. С целью осуществления выделения и очистки специфической оксидазы L-лизина была осуществлена ферментация Trichoderma sp. в лабораторных условиях в оптимальных условиях для накопления фермента с учетом влияния факторов, указанных ранее. Ферментацию осуществляли глубинным культивированием. Реализованный в данной работе метод выделения и очистки фермента отличается от ранее предложенных меньшим числом стадий очистки и применением отечественных сорбентов. На первой стадии очистки исходным материалом для работы служила культуральная жидкость Trichoderma sp., полученная глубинным способом выращивания продуцента с использованием БИО. После фильтрования добавляли сульфат аммония 25% насыщения. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием. На этой стадии очистки удалось избавиться от значительного количества балластных веществ и подготовить центрифугат культуральной жидкости для сорбции на гидрофобном сорбенте (таблица 9). Таблица 9 - Выделение и очистка индуцированной биостимулятором L-лизин--оксидазы Стадия очистки Культуральная жидкость Осаждение сульфатом аммония Хроматография на бутилсилохромовом сорбенте Белок, мг Удельная Абсолютная активность, активность Е/мг Выход, % Степень очистки 13683 21483 1,57 100,0 0 5873 19850 3,38 92,4 2,2 399 15854 39,7 73,8 25,3 На второй стадии выделения и очистки была проведена хроматография Lлизин--оксидазы на бутилсилохроме С-80. Отметим, что гидрофобная 65 хроматография приобретает в последние годы все большее распространение в целях фракционирования белковых веществ (Н.П. Головченко и соавт., 1991). Бутилсилохромовые сорбенты позволяют проводить сорбцию и десорбцию Lлизин--оксидазы без заметной инактивации белка. В процессе эксперимента было установлено, что наиболее подходящей концентрацией бутиловых радикалов в силохроме 500/80 является 80 мкМ/г и размер частиц 0,1 мм. На стадии хроматографии L-лизин--оксидазы (см. таблицу 9) на бутилсилохроме С-80 удельная активность фермента превысила исходную в 25,3 раза. Выход L-лизин--оксидазы составил 73,8%. На основании результатов второго этапа очистки были построены кривые зависимости удельной активности фермента от номера фракции при десорбции в отношении L-изомеров лизина, фенилаланина, лейцина, тирозина, аргинина, метионина и гистидина (рисунок 10). При этом другие L-аминокислоты под действием ферментов активных фракций окислительному дезаминированию не подвергались. Как видно из рисунка 10 кривые элюции каждой из семи выявленных оксидазных зависимостей имеют сходный характер и приблизительно равные соотношения между собой по отдельным фракциям. Например, основная Lлизин--оксидазная активность сосредоточена во фракциях с 3 по 10, в 17 раз превышая наиболее высокую из сопутствующих - L-фенилаланин-- оксидазную активность. Наименьшими значениями удельной активности, меньше единицы, во фракциях с 4 по 10 обладали L-метионин-, L-аргинин- и Lгистидин--оксидазные активности. 66 № фракции Рисунок 10 - Динамика десорбции L-лизин--оксидазы с бутилсилохрома С-80: 1. L-лизин--оксидазная активность; 2. L- фенилаланин --оксидазная активность; 3. L-лейцин--оксидазная активность; 4. L-тирозин--оксидазная активность; 5. L-метионин-оксидазная активность; 6. L-аргинин--оксидазная активность; 7. L-гистидин--оксидазная активность. 67 Заключение Исследование практически механизмов важного регуляции фермента является биосинтеза и необходимым активности условием для успешного управления метаболизмом соответствующего продуцента. В литературе почти нет сведений о механизмах регуляции биосинтеза и активности оксидаз L-аминокислот из грибов, за исключением единичных работ ( Kusakabe et al, 1980; И.П. Смирнова, Т.Т. Березов, 1989). Решая основную задачу исследования – увеличение исходной активности противоопухолевого фермента L-лизин--оксидазы в культуре гриба Trichoderma sp. в данной работе был применен физиолого-биохимический подход. Он заключался в том, что подбор индуктора L-лизин--оксидазной активности осуществлялся с учетом физиологических потребностей продуцента в том или ином синтез-стимулирующем факторе внешней среды. При этом повышение биосинтеза экзофермента L-лизин--оксидазы должно стать способом решения продуцентом своих физиологических проблем в ответ на изменение условий культивирования. В процессе исследования вопросов регуляции биосинтеза L-лизин-оксидазы в культуре Trichoderma sp. необходимо было использовать простой, чувствительный, легко воспроизводимый и безопасный метод определения ферментативной активности. Для этого была разработана модификация ранее предложенного спектрофотометрического метода определения активности фермента, заключающаяся ортодианизидина на в замене значительно канцерогенного более хромогена безопасный реактив ортофенилендиамин. Кроме того, было сокращено время проведения анализа, увеличена чувствительность метода и воспроизводимость результатов. Следует отметить, что продуцент L-лизин--оксидазы Trichoderma sp. является весьма сложным объектом исследования, так как его цикл развития достаточно продолжителен 12-14 суток и в значительной мере зависит от сезонности, целого ряда других факторов внешней среды и физиологического 68 состояния гриба. В то же время, хорошо известно, что лишь микроорганизмы могут быть использованы в качестве надежных и дешевых источников ферментов. Так, хотя оксидазы L-аминокислот открыты в печени, почках, аорте млекопитающих, птиц и в яде ряда змей (Struck, Siser, 1960; Siegel et al, 1983; Han, Tanzer, 1979; Kagan, Swillivan, 1982; Singer, Kearney, 1950; Wellner, Meister, 1960; Arie de Kok, Rawitch, 1969), однако эти источники не могут быть использованы для получения этих ферментов в больших количествах (146, 156,157, 159, 161, 162). Среди оксидаз микробного происхождения наиболее высокоспецифичными в отношении L-лизина являются ферменты грибов рода Триходерма. Работы последних лет свидетельствуют о внимании исследователей к этому роду, продуценты которого являются источником биологически активных соединений (129, 138, 139, 147, 148, 151, 164, 166). Подбор индуктора L-лизин--оксидазной активности в культуре продуцента мы проводили с учетом тех немногих данных, которые имеются в литературе, а также принимая во внимание то, что испытываемый синтезстимулирующий фактор должен быть достаточно доступным, чтобы быть рекомендованным для совершенствования технологии получения L-лизин-оксидазы в производственных условиях. Нами в данной работе были изучены такие физиолого-биохимические факторы регуляции ферментативной активности, как модификация питательной среды, использование в процессе ферментации посевного материала различного возраста и физиологического состояния, физико-химические факторы культивирования (освещенность и электростатическое поле), а также биологически активные добавки к ферментационной среде. Было показано, что многие из изученных факторов оказывают в той или иной степени влияние на величину и динамику накопления противоопухолевого фермента в культуре Trichoderma sp., однако наиболее высокая активность фермента (в 2-3 раза превышающая контрольные величины), выявлялась при добавлении в ферментационную среду стерильной культуральной жидкости 69 Brevibacterium sp. - продуцента L-лизина. Обнаруженный синтез- стимулирующий эффект представлял интерес не только в прикладном отношении, но и в теоретическом плане, поэтому был изучен более подробно в последующих исследованиях. Оказалось, что биостимулятор бактериального происхождения вызывает не только повышение L-лизин--оксидазной активности у Trichoderma sp. в среднем в 2,7 раза, ни и L- фенилаланин --оксидазной активности в 11 раз, Lметионин--оксидазной активности в 80 раз. Не менее интересно, что под действием биостимуляторов обнаруживаются новые, ранее неоткрываемые оксидазные активности в отношении L-изомеров тирозина, аргинина, лейцина и гистидина. Для каждой из изучаемых оксидазных активностей, выявляющихся при добавлении биостимулятора, были определены оптимальные значения рН инкубационной смеси. При этом было показано существование двух оптимальных значений рН для их проявления – 5,8 и 8, 4. Механизм действия биостимуляторов вероятнее всего является комплексным: он включает ряд биохимических и физиологических аспектов, в частности, индукцию биосинтеза L-лизин--оксидазы L-аминокислотами и другими продуктами жизнедеятельности бактерий, связанную с удовлетворением трофических потребностей гриба в низкомолекулярных азотсодержащих соединениях и проявлением его антагонистических свойств, стимулирование процессов роста, развития гриба и вступление продуцента в фазу конидиеобразования, связанную с автолизом мицелия и увеличением активности L-лизин--оксидазы. В прикладном отношении наиболее важным результатом проведенных экспериментов является увеличение исходной L-лизин--оксидазной активности в 2,7 раза с помощью дешевых и легко доступных ингредиентов питательной среды. Метод выделения и очистки фермента включал всего две стадии: 5%-ное насыщение сульфатом аммония, хроматографию на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме С-80. При этом удельная активность по сравнению с исходной 70 увеличилась в 25,3 раза, выход фермента составил 73,8%. Необходимо отметить также, что предлагаемый метод характеризуется не только применением новых сорбентов, но и высокой производительностью. Таким образом, в результате проделанной работы был исследован биосинтез и способы биологической регуляции фермента L-лизин--оксидазы Trichoderma sp. Однако, выделение и очистка перспективного биопрепарата на основе Lлизин--оксидазы требует синтеза сорбента бутилсилохрома С-80. В связи с этим предполагается продолжить поиск методов выделения и очистки перспективного фермента с использованием наноматериалов с целью получения простого и дешевого способа получения биопрепарата. Выводы 1. Показана возможность использования ортофенилендиамина в ферментативном методе определения активности L-лизин-α-оксидазы. 2. Исследован биосинтез и регуляция активности специфической оксидазы L-аминокислот Trichoderma sp. Показано регулирующее действие биостимуляторов бактериального происхождения на синтез ряда оксидаз Lаминокислот и существование двух оптимальных значений рН для их проявления (5,8- 8,4). 3. Изучены оптимальные условия биосинтеза штаммом-продуцентом Lлизин-α-оксидазы. Добавление бактериальных биостимуляторов к культуре Trichoderma sp. приводит к увеличению удельной активности фермента в 2-3 раза и появлению сопутствующих оксидазных активностей. 4. Осуществлены предварительные две стадии выделения и очисти Lлизин-α- оксидазы штамма-продуцента с использованием осаждения сульфатом аммония и хроматографией на бутилсилохромовом сорбенте. Исследована динамика десорбции L- лизин-α- оксидазы с бутилсилохрома С80. 71 5. Предложена экономичная физиологически естественная технология получения фермента с использованием недорогих и легко доступных продуктов микробного происхождения. 6. Появление новых оксидазных активностей при культивировании штамма-продуцента может быть использовано для создания разных форм биопрепаратов. 72 Список использованных источников 1 Астапов Т.Т., Наплекова Н.Н. Ауксины и ауксиноподобные вещества, синтнзируемые целлюлозоразрушаемыми грибами // Образование физиологич. активных веществ микроорганизмами.- Новосибирск, 1975.-С. 7 2 Бабицкая В.Г., Лобанок А.Г.. Костина А.М, и др. Синтез протеина некоторыми микроскопическими грибами // Биологически активные вещества микроорганизмов.- Минск, 1975.-С. 56 3 Банковский В.К., Григорьева СВ. Регуляция синтеза L- сериндегидратазы у E. Coli 412 аминокислотами // Биосинтез аминокислот и ферментов.- Рига, 1980.-С. 130 4 Беккер З.Э. Физиология грибов и их практическое использование. - М., 1963.- С. 269 5 Безбородов А.М. Ферменты микроорганизмов и их применение// Биотехнология,- М., 1984.-С. 91 6 Березов Т.Т. Проблема энзимотерапии опухолей // Вестн. АМН СССР.- 1971,- №11.- С. 35-46 7 Березов Т.Т. Ферментная терапия опухолей // Вестн. АМН СССР.- 1984.- №8.- С. 11-24 8 Березов Т.Т., Лукашева Е.В., Смирнова И.П. К вопросу об определении активности оксидаз L-аминокислот // Вопр. мед. химии.- 1987.Т.ЗЗ, №1.- С.127-132 9 Березов Т.Т, Биохимические основы энзимотерапии опухолей// Актовые речи ученых Университета,- М., 1989.- С. 3-15 10 Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М., 1990,- С. 543 11 Билай В.И. Основы общей микологии.- Киев, 1980.- С. 395 73 12 Билай В.И., Закордонец Л.А., Билай Т.И. и др. Образование белка мезо- и термофильными грибами при выращивании их на целлюлозу- крахмал-содержащих субстратах // Микробиол. ж. 1981.- Т.43.- № 3.- С. 336-341 13 Браунштейн А.Е. Процессы и ферменты клеточного метаболизма.М., 1987.- С. 546 14 Голенков B.Ф., Игорянова Н.А. Белки и витамины различных мельничных отрубей // Вопр. питания.- 1986,- №4.- С. 68-71 15 Головченко Н.П., Катаева И.А., Бухтиярова М.Г. и др. // Выделение и некоторые свойства термостабильной эндоглюканазы из E.Coli С 600/pK E102/, кодируемой геном Clostridium Thermocellum// Биохимия.- 1991.-Т.56, №1.С. 49-54 16 Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Степанов В.М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы Bacillus aubtilis, шт. 72 // Биохимия.-1991,- Т.56, №1.- С. 33-40 17 Готтшалк Г. Метаболизм бактерий.-М., 1982.- С. 310 18 Диксон У., Уэбб Э. Ферменты.-М., 1982.- С. 1117 19 Егоров Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов // Прикл. биох. и микроб.- 1982.-Т.18.-№ 6,- С. 835 20 Жукова О.С., Хадуев С.Х., Добрынин Я.В., и пр. Влияние L- лизин-αоксидазы на кинетику клеточного цикла культивируемых клеток лимфомы Беркитта // Эксперим. онкология.- 1985.- Т.7- № 6.-С. 42-43 21 Калниня И.Э. Исследование проблемы множественности моноаминооксидаз и модификация их каталитических свойств с помощью некоторых ингибиторов моноаминооксидаз; Автореф. дисс. канд., биол. наук Рига, 1981.- С. 16 74 22 Калунянца К.А., Фениксова Р.В., Ваганова М.C. и др. Влияние различных источников азота на биосинтез целлюлаз при глубинном культивировании гриба Tr. viride // Прикл. биох. и микроб. - 1976,- Т.12.- №3.С. 345 23 Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- М., 1980С. 272 24 Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности.- М., 1986.- С. 144 25 Краняускас В.И., Ралис Э.В. Инструментальная методика определения концентрации L -лизина с применением L- лизин-α- оксидазы и анализатора ПЛАГ-11 // Тез.4-го Всесоюзн. симпоз. по инжинерн. знзимол.Вильнюс, 1988.- С. 137 26 Кременчуцкий Г.Н. Способ определения оксидазной активности. Авторск. свид. № 1253145 - 1984 27 Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г. Мицелиалънне грибы как продуценты белковых веществ.- Минск, 1981 - С. 104 28 Лукашева Е.В., Хадуев С . Х . , Смирнова И.П. и др. Определение концентрации L-лизина реакцией окислительного дезамини- -аминогруппы // Тез. Всесоюзн. конф. по применению рования ферментов в биох. анализах.- Паланга, 23-25 мая, 1984,- С. 102-103 29 Лукашева Е.В., Жуковский А.П., Сода К. и др. Термостабильность из L-лизин-α-оксидазы Triсhoderma sp. //Биохимия,- 1991.- Т.56.- № 6.-С. 1069-1075 30 Лукашева Е.В., Спектрофотометрический Веса метод В.С., определения Корпела Т.К. концентрация и др. L-лизина с помощью L-лизин-α-оксидазы из Triсhoderma sp.// Вопр. мед. химии,- 1991,Т.37,- № 3.-C. 68-70 31 Мецлер Д. Биохимия: химические реакции в живой клетке.- М., 1980,- С. 606 75 32 Никитин Г.А. Биохимические основы микробиологических производств,- Киев, 1981.- С. 311 33 Неустроев К.Н., Крылов А.С., Аброскина О.Н. и др. Выделение и свойства -галактозидазы из Aspergillus awamori // Биохимия.- 1991. Т.56.- № 3.-С. 447-456 34 Острикова М.А., Коновалов С.А. Влияние источников азота на биосинтез целлюлаз мутантным штаммом Tr. viride 1И // Прикл. биох. и микроб..- 1983.- Т.19, №4.-С. 498 35 Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов.- M., 1987- С. 117 36 Рыбальский Н.Г., Лях С.П. Консорциумы микроорганизмов// М., Важнейш. изобретения года. Сер. Биотехнология /ВНИИПИ.-1990.-С. 284 37 Северин А.И., Ильченко В.Я., Кулаев И.С. Гидролиз пептидогликана клеточных стенок Staphylococcus aureus 209 Р лизоамидазой // Биохимия.1990.- Т.55, Л 11.- С. 2078-2089 38 Смирнова И.П., Хадуев С.Х. L-лизин-α-оксидазная активность некоторых видов Trichoderma /Микробиол.- 1984 - Т. 53, №1 - С. 163-165 39 Смирнова И.П., Березов T.Т. L-Метионин-α-оксидаза Trichoderma, при глубинном культивировании // Микробиол. – 1988 -Т.57, №3 -С. 514-516 40 Смирнова И.П., Березов T.Т., Ортодианизидиновый микрометод определения активности L-Фенилаланин-α-оксидазы // Вопр. мед. химии,- 1988 - Т.30, № 2 -С. 129-131 41 Смирнова И.П.. Продуценты оксидаз L-аминокислот и возможные области их практического применения // Биотехнол.-1991- № 3- С 3-7 42 Тарунина Т.А. Использование грибов- антагонистов для борьбы с болезнями растений // Микол. и фитопат.- 1983.- Т.17, №1.- С. 86 76 43 Уманский В.Ю., Хадуев С.Х., Залеток С.П. и др. Антиметастический эффект L-лизин-α-оксидазы // Бюлл. эксперим. биологии медицины.- 1990.Т.С1Х, №5.- С. 458-459 44 Хадуев С.Х., Лукашева Е.В., Смирнова И.П. и др. Выделение и очистка L-лизин-α-оксидазы из Triсhoderma sp.// Вопр. мед. химии.- 1985.-Т.31, №5.- С. 130-134 45 Хадуев С.Х., Смирнова И.П. Зависимость образования антиопухолевого фермента L-лизин-α-оксидазы Triсhoderma sp. от условий культивирования//Энзимология опухолей. - М., 1985 - С. 73-77 46 Хадуев С.Х., Березов T.Т. Новые данные о лизине как незаменимой аминокислоте // Вопр. питания.- 1987 - №2 -С. 8-11 47 Янкевич Н.Б., Лаугалене Н.Ф., Веса B.C. и др. Усовершенствованная схема очистки L-лизин-α-оксидазы гриба Triсhoderma sp.// Вопр. мед. химии.1989 -Т.35, №2- С. 84-86 48 Яковлева Е.П. Совместное культивирование продуцентов биологически активных веществ с другими микроорганизмами // Прикл. биох. и микроб..- 1983 - Т.19, №3 - С. 330 49 Andreyuk E.I., Iretinskaya G.A. Soil microorganisms and transformation of bacterial polysaccharides in soil // Proc. Int. Symp. Interrel. between microorganisms and plants soil.- June 22-27, Liblice, 1987.- P. 323-328 50 Arie de Kok and Rawitch A.B. Studies on L-Amino Oxidase II Dissociation and Characterisation of its Subunits // J. Biochem. -1969.- Vol.8, N4. P. 1405-1411. 51 Ait-Lahsen H. An antifungal Exo-u-l,3glucanase (AGN13.1) from the biocontrol fungus Trichoderma harzianum / H. Ait-Lahsen. A. Soler, M. Rey, J, De La Cruz, E.Monte, A. Llobell//Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67. P. 5833-5869 52 Antal Z. Colony growth, in vitro antagonism and secretion of extracellular enzymes in cold-tolerant strains of Trichoderma species / Z. Antal, L. Manczinger, 77 G. Szakacs. R.P [engerdy, L. Ferency // Mycol. Res. - 2000. - Vol. 104. - P. 545549 53 Antal Z. Complete DNA Sequence and analysis of a mitochondrial plasmid in the mycoparasitic strain Trichoderma harzianum T95 / Z. Antal, L. Manczinger, LKredics, F. Kevei, E. Nagy//Plasmid. - 2002. - Vol 47. -P. 148-152 54 Arora D.K. Handbook of applied mycology / D.K. Arora, R.P. Elander. KG. Mukerji. Fungal Biotechnology, vol 4 New York: Marcel Dekker, 1992 55 Arst J.H.N. pH regulation in Aspergillus and parallels with higher eukaryotic regulatory systems / J.H.N. Arst. M.A. Penalva // Trends Genet. - 2003. - № 19-P. 224-231 56 Bailey B.A. Direct effects of Trichoderma and Gliocladium on plant growth and resistance to palogens /B.A. Bailey, R.D. Lumsden // Harman G.E., Kubicek C.P. (eds.) Trichoderma and Gliocladium. Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial application. London: Taylor and Francis Ltd., 1998. -P. 185-204 57 Barrett G.C. Chemistry and biochemistry of Amino Acids- London-N.Y.1985.- P. 671 58 Beresov Т.Т., Khaduev S.Kh., Lukashova E.V. et al. The mechanisms of cytostatic effect of L-lisine--oxidase from Trichoderma sp. XIV Intern Cancer Cong August 21-27, Budapest, 1986; P. 933. 59 Belandger R.R. Chronological events associated with the antagonistic properties of Trichoderma harzianum against Bolrytis cinerea: indirect evidence for sequental role of antibiosis and parasitism / R.R. Belandger. N. Dufour. J. Caron, N. Benhamou// Biocontrol Set Technol. - 1995. - Vol. 5. - P. 4 I -53 60 Benitez T. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains / T. Benitez, AM. Rincur rfmon. AC. Codon // International Microbiology. - 2004. - № 7. - P. 249260 61 Berezov T.T., Khadyev S.Kh. Abstracts of 9 th Joint Symposium of the Biochemical Societies of the GDR and USSR ‘Metabolic Regulation of 78 the Cellular and Molecular Level’, Jena, GDR, 5-7 September. Jena, 1987. – P. 21 62 Biе1у P. Enzymology of hemicellulose degradation / P. Biely, M. Tenkaner. // Harman G.E., Kubicek C.P. (eds). Trichoderma and Gliocladium. Vol. 2. Enzymes biological control and commercial application. London: Taylor and Francis Ltd.. 1998 P. 25-47 63 Betina V., Zajacova J. Regulation of periodicity and intensity of photo induced conidiation of Trichoderma viride // Microbiol.- 1978.- Vol.23, N6.- P. 453459 64 Blumnthal C. Z. Production of toxic metabolites in Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, and Trichoderma reesei: justification of mycotoxin testing in food grade enzyme preparations derived from the three fungi // Regulatory Toxicology and Pharmacology 2004.,-№ 39. -P. 214-228 65 Bolar J.P. Expression of endochitinase from Trichoderma harzianum in transgenic apple increases resistance to apple scab and reduced vigor / J.P. Bolar, J.L. Norelli, K.-W. Wong C.K. Hayes, G.E. Harman, H.S. Aldwinckle // Phytopathology. 2000. - V. 90. - P. 72-77 66 Brigs Y. Biosensors// Nature.- 1987.- Vol. 329, N 6139.- p. 565-566. 67 Brunner K. A G protein alpha subunit negative mutant of Trichoderma atrovinde shows enhanced growth inhibition of plant pathogens and upregulation of a pepetaibol synthetase / K. Brunner, В Rethner, R.L. Mach, N. Stoppacher, R. Schuhmacher, S. Zeilingcr //9th International Workshop on 'Trichoderma and Gliocladium, Vienna, Austria. – 2006 68 Bryan J.K. Biochemistry of Plants – N.Y., 1980.- P. 525 69 Buchcrt J. Application of Trichoderma reesei enzymes in the pulp and paper industry / Buchert, T. Oksanen, 1. Pere, M. Siika-aho, A. Suumakki, L. Viikari. // Harman G.E., Kubicek C.P. (eds). Trichoderma and Gliocladium, Vol. 2. Enzymes, biological control and.comniercial application. London: Taylor and Francis Ltd., 1998. - P. 343-363 79 70 Burton K. The L-amino acid Oxidase of Neurospora // J. Biochem. -1952.Vol.50, N2.-P. 258 71 Cabib E., Roberts R., Bowers B. Synthesis of the yeast-cell wall and its regulation // Ann. Rew. Biochem/- 1982.- Vol.51, -P. 763-793 72 Carsolio C. Role of the Trichoderma harzianum endochitinase gene, ech42, in mycoparasitism / С Carsolio. N. Benliamou, S. Haran, С Cortes, A. Gutierrez. I. Chet, A. Herrera-Estrella // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65. P. 929-935 73 Chellappan M., Dunn-Coleman V, Hillian A., Houfek G., Mitchell Т., Solingen P.V. Teunnissen P. D., Wang D., Ward M.. Vao J., Dean R. A. Durable resources for discovery and development of new gene products from Trichoderma reesei. Phase I cDNA and BAC end sequencing. XXI Fungal Genetics Conference Asilomar, California. -2001 74 Chen X. PCR-based genotyping of epidemic and pre-epidemic Trichoderma isolates associated with green mold of Agancus bisporus / X. Chen, C.P. Romaine. Q Tan. B. Schlagnhaufer, M.D. Ospina-Giialdo, D.J Royse, D.R. Huff// Appl. Environ. Microbiol. -1999.- V.65.- P. 2674-2678 75 Chet I. Mycoparasitism and lytic enzymes /I. Chet, N. Benhamou, S. Haran // Harman G.E, Kubicek С P. (eds.) Trichoderma and Gliocladium. Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial application. Taylor and Francis Ltd., London, 1998. - P. 153-171 76 Chibata J., Tosa T., Sato T., Mori T. et al. Immobilized enzyme technology –N.Y., 1975.- P. 111 77 Chinshuh C. Purification and characterization of a xylanase from Trichoderma longibrachiatum for xylooligosacchande production / С Chinshuh, J. Chen, T. Lin// Enzyme and Microbial Technology. - 1997. - V. 21. - Issue 2. - P. 91-96 78 Cobos A. Effect of polyhydroxylic cosolvents on the thermostability and activity of xylanase from Trichoderma reesei QM 9414 / A. Cobos, P. Estrada // Enzyme and Microbial Technology. - 2003.-V. 33.-P. 810-818 80 79 Cotxarrera L. Use of sewage sluge compost and Trichoderma asperellum isolates to supress Fusarium wilt of tomato / L. Cotxarrera, M.I. Trillas-Gay, С Steinberg, С Alabouvette // Soil Biology and Biochemistry. - 2002. - № 34. - P. 467476 80 Darmono T.W. Large scale application of growth promoting Trichoderma with biofungicidal activity / T.W. Darmono, A. Purwantara // 9 th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, Vienna, Austria. —2006 81 De la С ruz J. Isolation and characterization of three chitinases from Trichoderma harzianum / J. De la Cruz, A. Hidalgo-Gallego, J.M. Lora. T. Benitez, J.A. Pintor- Того. A. Llobell // European J of Biochem. -1992. -Vol. 206. - P. 859867 82 Delgado-Jarana J. Glucose uptake in Trichoderma harzianum: role of gttl I J. Delgado-Jarana, M.A. Moreno-Mateos. T. Benitez// Euk Cell.-2003. -№2. - P. 708717 83 Djonovic S. Functional Characterization of -l,6-gIucanase from Trichoderma virens and enhanced antifungal activity of transformants constitutively co-repressing -1,6-glucanase and -1,3-glucanas / S. Djonovic, Herrera, A. Mendoza- C.M. Kenerly // 9lh International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, Vienna, Austria. - 2006 84 Donzelli B.G.G. Response surface modeling of factors influencing the production of chitinolytic and -l,3-glucanolytic enzymes in Trichoderma alroviride strain PI / B.G.G. Donzelli, K.J. Siebcrt. G.E. Harman // Enzyme and Microbial Technology. -2005. -№37. -P. 82-92 85 Ezzi M.I. Biodegradation of cyanide by Trichoderma spp. and Fusarium spp / M.I Ezzi, J.M. Lynch // Enzyme and Microbial Technology. - 2005. - Vol. 36 - P. 849-854 86 Farkas V., Jalamko A., Kolarova N. - Characterization of cellulose complexes from Trichoderma reesei GM 9414 and its mutants bу means of analytical isoelectrafocusing in polyacrylamide gels. - Biochimica et Biophysika Act. 1982, 706, P. 105-119 81 87 Farkas V., Sulova Z., Lekotsky J. Effect of light on the concentration of Adenine Nucleotides in Trichoderma viride // J. of General Microbiol.- 1985.- Vol. 131.-P. 317-320 88 Foreman P. Transcriptional regulation of biomass-degrading enzymes in the filamentous fungus Trichoderma reesei / P. Foreman, D. Brown, L. Dankmeyer, R. Dean, S. Diener, N. Dunn-Coleman, F. Goedegebuur, T. Houfck, G. England, A. Kelley, H. Meerman, T. Mitchell, С. Mitchinson, H. Olivares, P. Teunissen, J. Yao. M. Ward// J. Biol. Chem.-2003. - Vol. 278. - P. 31988-31997 89 Franco P.F. Production and characterization of hemicellulase activities from Trichoderma harzianum Strain T4 / P.F. Franco, H.M. Ferreira, EX. Filho // Biafcjchnol Appl. Biochem. - 2004. Feb 6 [Epub ahead of print 90 Galante Y.M. Application of Trichoderma enzymes in the food and feed industry/ Y.M. Galante, A. De Conti, R. Monteverdi // Harman G.E., Kubicek C.P. (eds ) Trichoderma and Gliocladium, Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial application. London: Taylor and Francis Ltd., 1998. - P 327-342 91 Garcia I. Cloning and characterization of a chitinase (chii42) cDNA from the mycoparasitic fungus Trichoderma harzianum / I. Garcia, J.M. Lora, J. de la Cruz, T. Benitez, A. Llobell, J.A. Pintor-Toro // Current Genetics. - 1994. - Vol. 27. -P. 83-89 92 Giese E.C. Botryosphaeran, a new substrate for the production of -l,3glucanases by Bolryosphaeria rhodina and Trichoderma harzianum Rifai / EC. Giese, E.G. Covizzi, D Fjarsato, R.F.H. Dekkera, M.L.C. Silva, A.M. Barbosa // Process Biochemistry. - 2005 93 Goldberg M.L., Atchley W.A. The effect of hormones on DNA // Proc. Nat. Acad. Sci.- 1966. -Vol. 55, N 4.-P. 989-996 94 Gomez I. Genetic diversity and vegetative compatibility among Trichoderma harzianum isolates /1. Gomez. I. Chet, A. Herreraestrela // Molecular and General Genetics. - 1997. – Vol.256. - P. 127-135 95 Gusakov A. A comparative study of different cellulase preparations in the enzymatic treatments of cotton fabrics / A. Gusakov, A. Berlin. N. Popova, O. 82 Okunev, O. Sinitsyna, A. Sinitsyn // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2000. - Vol. 88. P. 119-126 96 Gutierrez S. Biocontrol applications: keynote on antimicrobial activivties. The case of terpene biosynthesis / S. Gutierrez, RE. Cardoza J.A. Vizcanno, MR. Hermosa. E Monte // 9lh International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, Vienna, Austria. - 2006 97 Haapala K. Production of endo-l,4--glucana.se and xylanase with nylon-web immobilized and free Trichoderma reesei / R. Haapala, E. Parkkinen, P. Suominen, S. Linko // Enzyme and Microbial Technology. - 1996. - Vol 18. - P. 495501 98 Hafner E.W., Wellner D. Demonstration of imino acids as products of the reactions catalyzed by D- and L-amino acid oxidases // Proc. Nat. Acad. Sci. US1971. -Vol. 68, N 5.-P. 987-991 99 Hador J., Chef I., Henis J. - Biological control of Rhizoctonia solam damping off with wheat Bran culture of Trichoderma harzianum - phythopathology. 1979. N 1, P. 64-68 100 Han S., Tanser M. L-amino acid oxidase from mammalian aorta // J. Biol. Chem.- 1979.- Vol. 254, N 20.-P. 1038-1042 101 Harman G.E. Plant genomic environmental factors that affect the abilities of Trichoderma spp, to induce plant resistance and increased growth /G.E. Harman, D. Custis, M. Shoresh // 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, Vienna, Austria. -2006 102 Harman G.E. Combination of fungul cell degrading enzyme and fungul cell membrane affecting compound/ G.E. Harman, M. Lorito, A Di Pietro, C.K. Hayes, F. Scala, C.P. Kubicek//US Patent 6.512,166, issued Jan.28, 2003 103 Harman G.E. Myths and dogmas of biocontrol Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T22 // Plant Dis. - 2000. - Vol. 84. - P. 377-393 83 104 Harman G.E. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts / G.E Harman. C.R Howell, A Viterbo. I. Chet, M. Lorito // Nature Reviews. - 2004. - Vol. 2. -P 43-56 105 Hashimoto S., Muramatsu T., Funatsu M. - Agr.biol.chem. 1971, 35, 4, P. 501 106 Hayashia N. Enzymaticafly produced nano-ordered short elements containing cellulose 1 crystalline domains / N. Hayashia, T, Kondob, M. Ishihara // Carbohydrate Polymers. -2005 -Vol. 61 -P. 191-197 107 Henrissat B. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolase / B. Henrissat, A. Bairoch // Biochem. J. - 1996. - Vol. 316. - P. 695-696 108 Нėrаuх F.M.G. Combining Trichoderma virens-inoculated compost and a rye cover crop for weed control in transplanted vegetables / F.M.G. Heraux, S.G. Hallett, S.C. Weller // Biological Control. - 2005. - Vol. 34. - P. 21-26 109 Hermosa M. R., Grondona I., Iturriaga E. A., Diaz-Minguez J. M., Castro C, Monte E., Garcia-Acha I. Molecular characterization and identification of biocontrol isolates of Trichoderma spp. // Appl Environ Microbiol. - 2000. - № 66. P. 1890-1898 110 Hernandez-Onate M. Induction of conidiation by mycelial injury in Trichoderma reesei / M. Hernandez-Onate, A. Herrera-Estrella // 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, Vienna, Austria. – 2006 111 Hilden L. Surface character of pulp fibres studied using endoglucanases / L. Hilden, P. Valjamae, G. Johansson // Journal of Biotechnology. - 2005. - Vol. 118. - P. 386-397 112 Hofmann K. Oxidation of triphenyiarsine to triphenylarsincoxide by Trichoderma harzianum and other fungi //' K. Hofmann, E. Hammer, M. Kohler, V. Eiruser //Chemosphere -2001. – Vol. 44 - P. 697-700 113 Holland V.R., Saunders B.C., Rose F.L. et al A safer substitute for benzidine in the detection of blood // Tetrahedron/- 1974.- Vol. 30, N18.-p.32993302 84 114 Howell C.R. A study of the characteristics of «P» and «Q» strains of Trichoderma virens to account for differences in biological control efficacy against cotton seedling diseases / C.R. Howell , L.S. Puckhaber // Biological Control. 2005. - Vol. 33. - Issue 2. -P. 217-222 115 Howell C.R. Induction of terpenoid synthesis in cotton roots and control of Rhizoctonia solani by seed treatment with Trichoderma virens / C.R. Howell, L.E Hanson, R.D. Stipanovic, L S. Puckhaber // Phytopathology. - 2000. - Vol. 90. - P. 248-151 116 Howell C.R. The role of antibiosis in biocontrol. Harman G.E. Kubicek C.P (eds). Trichoderma and Gliocladium Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial application. London: Taylor and Francis Ltd. 1998. - P. 173-184 117 Iwasaki T., Hayashi K., Funatsu M. - Puification and characterization of types of cellulase from Trichoderma koningii. - J.biochem. 1964, 55, p.209-212. 118 Jacob F.A., Monod J.J. Genetic regulatory mechanism in the synthesis of proteins // J. Molec. Biol. – 1961.- Vol. 3.-P. 318 119 Jänis J. Thermostability of endo-I,4--xylanase II from Trichoderma reesei studied by electrospray ionization Fourier-transform ion cyclotron resonance MS, hydrogen/deutenum-exchange reactions and dynamic light scattering / J. Jänis, J Rouvinen. M. Leisola, O. Turunen, P. Vainiotalo // Biochem. J. - 2001. - Vol. 356. P. 453-463 120 Juhasz T. Characterization of cellulases ал(1 hemicellulases produced b\ Trichoderma reesei on various carbon sources / T. Juhasz, Z. Szengyel, K. Reczey, M. Siika-Aho. L. Viikari // Process Biochemistry. - 2005. - № 40. - P. 3519-3525 121 Kaiarova H., Farkas V. - Laminarinases, xylanases and Amylases in the crude cellulolytic enzyme coplex from Trichoderma reesei .Biologia (Bratislava) 1983, 38, 8 P. 72I-725 122 Kagan H.M., Sullivan K.A. Lysyl oxidase: preparations and role in elastin biosynthesis // Methods Enzymol. – 1982.- Vol. 82.-P. 637-650 123 Knight S.G. The L-amino acid oxidase of molds // J. Bact.- 1948.- Vol. 85 55.-P. 401-407 124 Koivula A. Structure-function relationships in Trichoderma cellulolytic enzymes A. Koivula, M.Linder and T.T.Teeri // Harman G.E , Kubicek C.P. (eds). Trichoderma and Gliocladium, Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial application. Taylor and Francis Ltd , London, 1998. - P. 3-23 125 Kolthoff A.M., Sandell B.B.- In: Textbook of Quantitative Inorganic Analysis. New York, 1952, P.574 126 Kovacs K. Fermentation and hydrolysis experiments with new Trichoderma mutants in comparison with Trichoderma reesei Rut C30 / K. Kovacs, L. Megyeri, G. Szacs. M Galbe, G. Zacchi // 9th International Workshop on Trichoderma arid Gliocladium. Vienna. Austria - 2006 127 Kredics L. Taxonomical aspects of Trichoderma as a an opportunistic human pathogen / L Kredics, Z Antal, A. Szekeres, L. Hatvani, M. Komon. L. Manczinger. C. Vagvolgyi, E. -Nagy, C.P. Kubiceck. IS. Druzhinina // 9th International Workshop on Tricljoderma and Gliocladium, Vienna, Austria - 2006 128 Kredics L. Trichoderma Strains with Biocontrol Potential / L. Kredics. Z. Anta. L, Manczinger, A. Szekeres, F. Kevei. E Nagy//Food Technol. Biotechnol. 2003. -№ 1. -Vol. 41.-P. 37-42 129 Krishna S.H. Studies on the production and application of cellulose from Trichoderma reesei QM-9414 / S.H. Krishna, K.C.S. Rao, J.S. Babu, D.S. Reddy // Bioprocess Engineering. -2000. -№ 22. - P. 467-470 130 Kubicek C.P. Regulation of production of plant polysaccharide degrading enzymes by Trichoderma I C.P. Kubicek. ME Penttila // Harman G.E, Kubicek C.P. (eds.) Trichoderma and Gliocladium, Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial application. Taylor and Francis Ltd., London. 1998. - P. 49-72 131 Kubicek C.P. Trichoderma: from genes to biocontrol / C.P. Kubicek, R.L. Mach. C.K. Petcrbauer, M. Lorito // J of Plant Pathology. -2001. - Vol. 83. -№ 2. P. 11-23 86 132 Kusakabe С., Kodamak К., Rununaka A., Yoshino H., Soda K. Extracellular production of L-lysine-α-oxidase in wheat bran culture of a strain of Trichoderma viride. - Agric.Biol.Chem. 1979, 43, 12, P. 2531-2533 133 Kusakabe H., Kodama K., Kununaka A., Yoshino H., Soda K., Misono H.134 A new antitumor enzyme L-lysine-α-oxidase from Trichoderma viride J. Bio. chem. 1980, Vol.255, N 3, P. 976-981 135 Kusakabe H., Kodama K., Machida H., Midorikawa J., Kuninaka A., Misono H., Yoshino H. and Soda K. – Occuerence of a nowel enzyme, 136 L-lysine-α-oxydase with antitumor activity in cultural extract of Trichoderma viride. – Agr. Biol. Chem., 43, №2, 1979, P. 976-981 137 Kusakabe H., Kodama K., Kuninaka A., Yoshino H. and Soda K. – Effect of L-lysine-α-oxydase on youth of mouse lencemic cells. – Agr. Biol. Chem. 44, №2, 1980. 138 Kusakabe H., Kodama K., Kuninaka A. et а1 //-A NEW ANTITUMOR Enzime L-lysine- α-oxydase from Trichoderma viride.-J. Biol. Chem. - 1980.- V. 255. - Р. 976-981 139 Kusakabe H., Midorikawa Y., Fujishima T. et al. Purification and properties of new enzyme, L-glytamate oxidase from Streptomyces sp. X-119-6 grown on a wheat bran // Agric. Biol. Chem/- 1983 - Vol. 47, N6.- P. 1323-1328 140 Lees-Haley P.R. Toxic mold and mycotoxins in neurotoxicity cases: Stachybotrys, Fusarium, Trichoderma, Aspergillus, Penicillinum, Cladosporium, Alternaria, Trichothecenes // Psychol. Rep/- 2003/- Vol. 93/- №2.-P. 561-84 141 Leon A. Analysis of the expression of the Trichoderma harzianum ech42 gene in two isogenic clones of Escherichia coli by surface response methodology / A. Leon, H. Jimenez-Islas, M. Gonzales-Cuevas, A.P.B. de la Rosa // Process Biochem.2004.-Vol. 39.-P. 2173-2178 142 Limón M.C. Increased antifungal and chitinase specific activities of Trichoderma harzianum CECT 2413 by addition of a cellulose binding-domain / M.C Limon, M.R, Chacon, R. Mejias, J.Delgado-Jarana, A.M. Rincon, AC. Codon, T. Benitez// Appl. Microbiol. Biotechnol - 2004. - № 64. - P. 675-685 87 143 Liu Pi-g. Identification of genes with a biocontrol function in Trichoderma harziamim mycelium using the expressed sequence tag approach / Pi-g Liu, Q Yang // Res. Microbiol. - 2005. - Vol. 156 - Issue 3. - P. 416-423 144 Lorito M. Genes from mycoparasitic fungi as a source for improving plant resisilahce to fungal pathogens / M. Lorito, S.L. Woo, I.G. Fernandez, G. Colucci, G.E. Harman, J.A. Pinter-Того. E. Fillipone. C.B. Lawrence, A. Zoina, S. Tuzun, F. Scala // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. - 1998. - Vol. 95. - P. 7860-7865 145 Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. – J. biol. chem. 1951, Vol.193, P. 265-275 146 Lowry O.H., Roserbrough N.Y., Farr A.L., Randall R.Y. – Protein measurement with the Folin phenol reagent – Y. Biol. Chem., 1954, 193, №1 147 Lowry O.H., Rosenbrought M.J., Farr A.L. et al/ Protein measurement with the Folin Phenol reagent // J. Biol. Chem.- 1952.- Vol. 195.-P. 637 148 Miller D.L., Rodwell V.W. Metabolism of basic amino acid in Pseudomonas putida. Catabolism of lysine by cyclic and acyclic intermediates // J. Biol. Chem.- 1971.- Vol. 246.-P. 2758-2764 149 OkudaY., Fujiwara A., Fujiwara M. – Correlation between species of Trichoderma and production Patterus of Isonitrile Antibiotics. - Agr. Biol. Chem. 46, №7, 1983 150 Pardovitz-Kedmi E. Development and gene expression in Trichoderma virens: insights' into biocontrol-relaied signaling pathways / E. Pardovitz-Kedmi, M. Mukherjee. R. Hadar, N. Trushina, A. Viterbo, f, Chet, В A, Horvvitz, P.K. Mukherjee // 9^ International Workshop on Trichoderma and Gliociadium, Vienna, Austria. - 2006 151 Reithner B. The G protein a subunit Tgal of Trichoderma atroviride is involved in chitir.ase formation and differential production of antifungal metabolites / B. Reithner. K. Brunner, R. Schuhnacher, I. Peissl. V. Seidl. R. Krska, S. Zollinger // Fungal Genetics and Biology. - 2005. -42. - P. 749-760 152 Rey M. Improved antifungal activity of a mutant of Trichoderma harzianum CECT 2413 which produces more extracellular proteins / M. Rey, J. 88 Delgado-Jarana. T Benitez//Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2001. - Vol. 55. - P. 604608 153 Ross A., Schugerl K., Scheiding W. - Cellulase production by Trichoderma reesei. Europ.J. Appl.Microbiol.biotechnol., 1983.- Vol.18, p.29-37. 154 Ross А. - Die production von cellulasen mit Trichoderma reesei. Dissertation. University of Hannover, 1982 155 Samejima H., Kimura K., Ado Y - Recent development and future direction of enzyme technology in Japan. - Biochimie, 1980, Vol.62, P. 299-315 156 Serrano V. Cellulase production by Trichoderma reesei // Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1983.- Vol. 18.-P. 29-37 157 Siegel R.C., Fu J.C., Uto N. et al. Collagen cross-linking: lysyl oxidase dependent synthesis of pyridinoline in vitro: confirmation that pyridinoline is derived from collagen // Biochem. Biophys. Res. Comm. – 1983.- Vol. 108, N 4.-P. 15461550 158 Smirnova I.P., Berezov Т.Т., Denis G.Y. 8th International Biotechnology Symposium. Paris, July 17—22,— Paris, 1988.- Р. 161 159 Soda K., Tanaka H., Tanisava K. et al. Termoresistent enzymes: opportunities and application // 8th Int. Biotechnol. Simp. Paris, July, 17-22, 1988.- P. 34 160 Stanier R.Y., Hayashi O., Tsuchida M. The bacterial oxidation of tryptophan. I. A gentral survey of the pathways // J. Bact.- 1951.- Vol. 62.-P. 355 161 Stoppacher N. Screening for atroviridins and harzianins in culture samples of Trithoderma airoviride using LC-MS/MS / N. Stoppacher, B. Rethner. S. Zeilinger, K. Brunner, R.L. Mach, R. Krska, R Schuhmacher // 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium. Vienna, Austria. - 2006 162 Struck J., Sizer I. Oxidation of L- -amino acids by chiken liver microsomes // Arch. Biochem. Biophys. .- 1960.- Vol. 90, N 1.-P.22-30 163 Stumpf P.K., Green D.E. L- Amino acids oxidase of Proteus vulgaris // J. Biol. Chem.- 1944.- Vol. 153.-P. 387-399 89 164 Syldatk C., Wagner F. Biotechnological production of D- or L- Amino acids from 5-mono-substituted hydantoins // Food Biotechnol. .- 1990.- Vol. 4, N 1.P. 87-95 165 Szwajcer E., Brodelins P., Mosbah K. // Enzyme and Microb. Technol. - 1982 - N 4 - Р. 409-413 166 Takahashi T. Cyclosporin A promote hair epithelial cell proliferation and modulates protein kinase С expression and translocation in hair epithelial cells / T. Takahashi. A. Kamimura//J Invest Dermatol. -2001. -Vol. 117. -P. 605-611 167 Theoderou N.K., Basin M., Trinel J. - Growth of Trichoderma reesei en glucose — mineral salts media containing ammonium sulphate or urea sale of nitrogen. Great Britain (Cambridge). Microbiol, 1983,36, P. 157-167 168 Vizcańno J.A. CH1T101, a new high-molecular-weight chitinase from Trichoderma airoviride T II / J.A. Vizcańno, R.E. Cardoza, MR. Hermosa, M. Rev, E. Monte, S. Gutierrez // 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, Vienna. Austria. - 2006 169 Vizcańno J.A. Detection of putative peptide synthetase genes in Trichoderma species": Application of this method to the cloning of a gene from T. harzianum CECT 2413 / J A. Vizcańno , L Sanz . R E. Cardoza, E. Monte a, S. Gutierrez // FEMS Microbiology Letters. 2005. - Vol. 244. - P. 139-148 90
