Экспериментальное изучении механизма

Экспериментальное изучении механизма действия иммуномодулятора
актинолизата.
Т.П. Егорова
Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им.
Е.И.Марциновского, Москва
Experimental study action of immunomodulate drug – Actinolysati.
T.P.Egorova
E.I. Marcinovsky Institute of medical parasitology and tropical medicine, Moscow.
Аннотация
С целью изучения механизма действия актинолизата на течение гнойновоспалительного актиномикотического процесса у морских свинок создана
экспериментальная
модель
актиномикоза;
изучена
клиническая
и
патологоанатомическая
картина
экспериментального
актиномикотического
воспаления в зависимости от его локализации и стадий развития. Исследована
динамика изменений в актиномикотической гранулеме и ее обратное развитие под
действием лечебного препарата – актинолизата.
Summary.
Action of actinolysati in animal model purulent actinomycotic inflammatory process
were studied and discussed.
Ключевые слова
Экспериментальная модель актиномикоза, механизм действия актинолизата в
эксперименте.
Key words: animal model, actinomycosis, actinolysati.
Практическая медицина располагает некоторым арсеналом иммуномодуляторов,
которые обладают способностью воздействовать на гуморальный и клеточный
иммунитет. Эти препараты готовят из грибов, бактерий, тканей растительного и
животного происхождения, химических элементов и др. В 1940-50х годах в СССР
группой ученых Ордена Трудового Красного Знамени Института медицинской
паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского впервые из
определенных штаммов самолизирующихся актиномицет разработан лекарственный
препарат АКТИНОЛИЗАТ, который за счет иммуномодулирующего и
противовоспалительного действия оказался высоко эффективным в медицинской
практике (1, 2, 6, 7, 8).
Для доказательства этих характеристик, подтверждения эффективности препарата
и изучения механизма действия проведено исследование на экспериментальных
животных.
Цель исследования.
Изучить действие актинолизата на актиномикотический гнойно-воспалительный
процесс у экспериментальных животных.
Задачи исследования.
I.
Создание экспериментальной модели актиномикоза.
II.
Сравнительное изучение клинической и патологоанатомической картины
экспериментального актиномикотического воспаления у морских свинок в
зависимости от локализации процесса.
III. Проведение патоморфологических исследований в динамике развития
актиномикотической гранулемы у животных.
IV. Изучение механизма действия актинолизата в процессе лечения животных
с экспериментальной актиномикотической инфекцией.
Материалы и методы
I. Создание экспериментальной модели актиномикоза.
Создание экспериментальной модели инфекции, воспроизведение актиномикоза
различными видами актиномицет проводилось путем заражения животных
внутрибрюшинно и внутримышечно взвесью испытуемых культур в полужидком
мясопептонном агаре в концентрации около 10 млрд клеток (3).
Было использовано 241 животное, из них – 226 морских свинок (весом 150-170) и
15 хомяков (весом 100-110). Морским свинкам вводили 1 мл взвеси, хомякам – 0,5
мл.
У хомяков, зараженных указанным способом, возникали только локализованные
поражения, т.е. развивались лишь единичные абсцессы брюшной стенки в области
введения инфекта. Процесс протекал доброкачественно и не получал дальнейшего
распространения. Поэтому хомяков сочли неподходящими животными для создания
экспериментальной модели и дальнейшие исследования проводили только на
морских свинках.
226 морских свинок были заражены 17 аэробными штаммами актиномицет,
выделенными от больных актиномикозом, принадлежащими к 12 видовым группам:
Act. albus – 2 штамма;
Act. griseus – 1 штамм;
Act. chromogenes – 2 штамма;
Act. violaceus – 1 штамм;
Act. globisporus – 1 штамм;
Act. candidus – 1 штамм;
A. albus sterilis – 1 штамм;
Proact. hominis – 1 штамм;
Proact. asteroides - 3 штамма;
Proact. species – 1 штамм;
Micr. monospora – 2 штамма;
Micr. parva – 1 штамм;
анаэробные штаммы Proact. Israelii – 4 штамма
В качестве контроля пяти свинкам внутрибрюшинно была введена питательная
среда (МПА), другим пяти – взвесь убитой культуры Act. albus в вышеупомянутой
среде. Проводили одно-, двух-, трех-, четырех- и пятикратные повторные заражения
животных с интервалом 7 дней между инъекциями. Животных забивали через
неделю после последнего заражения.
Положительным результатом являлось развитие специфических патологических
актиномикотических изменений в органах и тканях животного, подтвержденное
результатами микробиологического или гистологического исследований, а именно:
обнаружение друз в гное и тканях из очагов поражения, выделение ретрокультуры.
У 217 из 226 животных получены положительные результаты прививок: развитие
актиномикотических инфильтратов и абсцессов .
У 10 контрольных животных патологических изменений в органах и тканях не
обнаружено.
Отработанная методика троекратного заражения животных с недельными
интервалами была использована в дальнейшем для получения экспериментального
актиномикоза.
II. Сравнительное изучение клинической и патологоанатомической картины
экспериментального актиномикотического воспаления у морских свинок в
зависимости от локализации процесса.
При заражении морских свинок актиномицетами по разработанной методике
получались характерные, довольно однотипные, поражения (3, 4).
Наиболее часто (74% случаев) у животных возникали абсцессы в брюшной стенке
на месте введения или в непосредственной близости от места введения инфекта.
Чаще образовывались единичные абсцессы, реже – множественные. Единичные
абсцессы на месте введения имели, как правило, мощную соединительно-тканную
капсулу. Располагались они чаще всего на внутренней поверхности брюшной
стенки, реже – в толще брюшной стенки, еще реже – под кожей. Множественные
абсцессы всегда были тонкостенными. Пораженная поверхность брюшной стенки
чаще всего была рыхло спаяна с петлями кишечника.
Размеры абсцессов на месте введения инфекта были самыми разнообразными.
Единичные инкапсулированные абсцессы достигали значительных размеров – до
2х2 см, множественные, более мелкие, имели размер от 0,1 до 0,5 см, чаще всего
0,3х0,3 см.
Иногда абсцессы на месте инокуляции не возникали. В таких случаях брюшная
стенка на этом участке представлялась отечной, приобретала студнеобразный вид;
изредка отек имел геморрагический характер.
Второе место по частоте (47% случаев) занимало поражение большого сальника.
Лимфатические узлы его увеличивались в размерах, абсцедировали. Сальник был
инфильтрирован, резко утолщен, укорочен и подтянут к большой кривизне желудка.
Нередко он был рыхло спаян с желудком, петлями кишечника, селезенкой, левой
почкой и левой стороной брюшной стенки. Такой «слипчивый» воспалительный
процесс в брюшной полости очень характерен для экспериментального
актиномикоза. На вовлеченных в этот процесс органах нередко обнаруживались
единичные тонкостенные абсцессы размером 0,1 – 0,3 мм. Абсцессы возникали на
селезенке (в 18%) и левой почке (лишь 1 раз – на правой) даже в случаях, когда они
не были спаяны в единый конгломерат с большим сальником. Преимущественно
левосторонняя локализация поражений объяснялась, по-видимому, тем, что инфект
вводили в левую каудальную часть живота, при этом инфекционный материал в
первую очередь адсорбировался регионарными лимфатическими узлами, где
развивались поражения.
При обширных поражениях в актиномикотический процесс нередко вовлекались
лимфатические узлы брыжейки (в 35%), чаще всего мезентериальные. В таких
случаях они были увеличены в размере, абсцедировали.
Нередко наблюдалось поражение диафрагмы (в 21%). На ней были видны
фибринозные наложения, иногда тонкостенные мелкие абсцессы, напоминавшие
пузырьки. Достаточно характерными были поражения в тазовой полости, когда
процесс распространялся на расположенные здесь ткани и органы. Мелкие
тонкостенные абсцессы обнаруживались на стенках рогов матки, на мочевом
пузыре, в тазовой клетчатке.
Из прочих, встречавшихся в наших опытах, актиномикотических поражений
можно назвать актиномикоз печени, малого сальника, надколенного и подколенного
лимфатических узлов (регионарных по отношению к месту введения инфекта) и др.
При использованном нами способе заражения животных генерализации
актиномикотического процесса не происходило. Процесс ограничивался только
брюшной полостью и брюшной стенкой.
Актиномикотические абсцессы при экспериментальном актиномикозе были
заполнены характерным гноем: гной густой, крошковатый, по консистенции
напоминающий творог, иногда слоистый, светло-желтого цвета, без запаха. По
цвету и консистенции отличается от гноя из очагов поражения при актиномикозе
людей и больше всего напоминает гной из актиномиком крупного рогатого скота.
Друзы актиномицетов в гное видны невооруженным глазом, размер их от 0,3 до 1
мм; расположены друзы в зоне разрежения лейкоцитов и поэтому легко извлекаются
из гноя.
Микроскопическая картина гноя у экспериментальных животных была также
своеобразной: друзы не видны невооруженным глазом (средний размер их составлял
60 – 80 мк), плотно окружены детритом, а не расположены в зоне разрежения
лейкоцитов, как это имело место у людей, имели вид плотных рыжеватых, с чуть
коричневатым оттенком глыбок. Радиальная структура их различалась с трудом по
сравнению с типичными друзами в гное из очагов поражения человека. Часто
наблюдали в гное зараженных актиномикозом морских свинок ранние стадии
формирования друз в виде четко ограниченных просветлений в плотной массе
детрита; в центре или у края этих зон были расположены радиальные сплетения
характерного актиномикотического мицелия, обычно соответствующего по
характеру мицелию исходной культуры.
III. Проведение патоморфологических исследований в динамике развития
актиномикотической гранулемы у животных (стадии).
Изучение динамики актиномикотического процесса по стадиям выполнен на 109
морских свинках. Модель актиномикоза, позволявшая изучить специфический
гранулематозный процесс на всех стадиях его развития, в опытной группе получена
при одномоментном введении в мышцы бедра морских свинок культуры аэробного
актиномицета Act. albus, выделенной из гнойного экссудата больного челюстнолицевым актиномикозом (4).
В контрольную группу вошло 36 животных, которые разделены на две группы:
1). 18 морским свинкам была введена убитая актиномицетная культура,
2). 18 другим – стерильная питательная среда.
Две морских свинки были вскрыты без предварительного заражения для
контрольного изучения гистологического строения внутренних органов.
На основе патоморфологических исследований при экспериментальном
актиномикозе было показано, что актиномикотический воспалительный процесс в
своем развитии проходит три стадии:
I – экссудативная стадия, не имеет специфических признаков,
II – стадия формирования специфической гранулемы, начинается на 2-е сутки и
заканчивается к 5-6м суткам. К этому времени гранулема имеет характерное
строение: в центре располагается возбудитель актиномикоза либо в виде друз,
имеющих лучистое строение, либо в виде сплетений мицелия; вокруг возбудителя
находится зона частично разрушенных полиморфно-ядерных лейкоцитов и
лимфоцитов. Молодые клетки соединительной ткани образуют по периферии
гранулемы клеточный вал, переходящий в соединительнотканные волокна,
образующие капсулу, которая ограничивает очаг воспаления. На 2-й неделе после
заражения отмечается активизация фагоцитарной деятельности макрофагов и
многоядерных гигантских клеток, но фагоцитоз носит незавершенный характер, что
обусловливает распространение воспалительного процесса путем образования
вторичных очагов. На третьей неделе в течение актиномикотического воспаления
у лабораторных животных происходит заметный сдвиг в сторону продуктивного
характера воспаления и процесс переходит в III стадию.
III – стадия регресса, характеризующаяся гибелью возбудителя и постепенным
уменьшением размеров основных гранулем, гибелью «дочерних» гранулем,
интенсивным развитием соединительной ткани, замещением гранулемы
соединительной тканью в сроки от 2 до 3 мес.
Таким образом, в развитии актиномикотической гранулемы были четко
выделены 3 стадии патологического процесса. Установление этого факта позволило
использовать данную модель для изучения изменений, наступающих в гранулеме
под действием актинолизата.
IV. Изучение механизма действия актинолизата в процессе лечения животных с
экспериментальной актиномикотической инфекцией.
Были использованы 63 морские свинки с массой тела 200-220 г. Опытная группа,
на которой изучалось действие актинолизата, состояла из 39 морских свинок;
контрольную группу составили 24 животных.
Использованная для заражения культура аэробного актиномицета Actinomyces
albus, формирующая необходимую для опытов экспериментальную модель, была
выделена из очага поражения у больного актиномикозом челюстно-лицевой
области. Культуру выращивали на мясопептонном бульоне (МПБ) и мясопептонном
агаре (МПА) в течении 6 суток при температуре 37˚С, затем стерильно готовили
взвесь культуры в МПБ в концентрации 1 млрд. микробных тел в 1 мл по
бактериальному оптическому стандарту мутности. Взвесь культуры вводили всем
животным трехкратно с интервалом 7 дней. Первые 2 раза взвесь в количестве 0,5
мл вводили в мышцу бедра одной лапы, в 3-й раз 1 мл вводили в мышцу бедра
второй лапы морской свинки.
Через 7 суток после 3-го заражения начинали лечение животных актинолизатом,
который вводили в соответствии с существующей схемой лечения актиномикоза 2
раза в неделю с интервалом 3-4 дня в количестве 0,2 мл под кожу спины. На 1, 2, 3,
4-е сутки после каждого введения актинолизата убивали по 2-3 свинки опытной
группы с обязательным вскрытием и убитых контрольных животных. Для
патоморфологических исследований брали мышцы бедра, куда инокулят вводили в
3-й раз. Патологический материал помещали в 10 % раствор нейтрального
формалина, затем заливали в парафин и готовили серию срезов. Срезы окрашивали
гематоксилином и эозином (9).
Результаты.
Накануне введения актинолизата – на 6-е сутки в очаге поражения определялись
гранулемы с вполне сформированными колониями лучистого гриба, окруженными
широкой зоной полиморфно-ядерных лейкоцитов и лимфоцитов, находящихся в
состоянии некробиоза, далее следовали плазматические и эпителоидные клетки.
Гранулема была ограничена от окружающих тканей соединительной капсулой
(рис.1).
1-я инъекция актинолизата.
Через сутки - в контрольной и опытной группах животных были видны хорошо
сформированные гранулемы с друзами лучистого гриба в центре. Сплетения
мицелия и друзы находились в центре частично разрушенной лейкоцитарной зоны,
далее следовали лимфоциты и плазматические клетки. Однако у животных опытной
группы на периферии гранулемы были видны группы макрофагов и единичные
гигантские клетки, которые отсутствовали у животных контрольной группы.
Через 2 суток - в опыте лейкоцитарная зона не уменьшалась, но макрофаги были
видны уже среди лейкоцитов, разрушенные фрагменты которых они
фагоцитировали. Увеличивалось количество гигантских многоядерных клеток на
периферии гранулемы. Морфология друз не изменялась, сплетения мицелия не
уплотнялись в друзы (рис.2).
У контрольных животных изменений в клеточном составе гранулемы и в друзах
не отмечено (рис.3).
Через 3 суток строение гранулемы в опыте практически не изменилось.
В контроле отмечалось увеличение зоны разрушенных лейкоцитов около друз
лучистого гриба, что свидетельствовало об активной жизнедеятельности
возбудителя.
2-я инъекция актинолизата.
Через сутки - у животных опытной группы колонии актиномицетов в размерах не
увеличивались и не уплотнялись. Лейкоцитарная зона была вдвое меньше, чем в
предыдущем опыте (3-и сутки после 1-й инъекции), что свидетельствует об
уменьшении воспалительных явлений. За лейкоцитарной зоной были видны поля
макрофагов и гигантских многоядерных клеток, фагоцитирующих лейкоциты
(рис.4).
На 2-е сутки - макрофаги и гигантские многоядерные клетки располагались
ближе к друзам.
На 3-и сутки - друзы утрачивали лучистую структуру, распадались на отдельные
фрагменты, вокруг которых были видны узкие полоски лейкоцитов. Макрофаги и
гигантские клетки были «нагружены» фагоцитированными лейкоцитами и
находились вплотную около друз.
У контрольных морских свинок на 1, 2, 3-и сутки зона лейкоцитов была широкой,
друзы не фрагментированы. Фагоцитоз отмечался только на периферии гранулемы.
3-я инъекция актинолизата.
Через сутки - у животных опытной группы от гранулем оставались только
отдельные фрагменты друз, окруженные плотным кольцом гигантских клеток,
фагоцитирующих эти фрагменты.
На 2-е и 3-и сутки - остатки друз почти полностью были фагоцитированы. На
периферии гранулем шло формирование соединительнотканных волокон.
У контрольных морских свинок колонии возбудителя были компактными,
сохраняли лучистость и были окружены лейкоцитарным валом. Наблюдалась
начальная стадия фагоцитоза разрушенных лейкоцитов макрофагами и гигантскими
клетками.
4-я инъекция актинолизата.
Через сутки - в опытной группе животных были видны остатки гранулем с
фагоцитированными друзами (рис.5).
На 2 и 3-и сутки - среди соединительнотканных волокон были видны лишь
отдельные гигантские клетки с фрагментами погибших друз.
У контрольных морских свинок гранулемы были хорошо сформированы, с
жизнеспособными друзами, о чем свидетельствовали выраженная лучистость,
отсутствие распада друз и их интенсивная окраска гематоксилином (рис.6).
Отмечена начальная стадия фагоцитоза возбудителя гигантскими клетками, причем
частично фагоцитоз был незавершенным.
Для характеристики актиномикотического процесса определяли количество
гигантских клеток в очаге поражения у животных в опытной и контрольной
группах. Гигантские клетки характерны для специфического воспалительного
процесса и активно участвуют в фагоцитозе актиномицетов. Статистическая
обработка материала показала, что среднее количество гигантских клеток в опыте,
т.е. у животных получивших актинолизат, составило 7,63±1,05, что значительно
больше такового в контроле – 1,56±0,39 (Р<0,999), где лечение актинолизатом не
проводилось. Особенно большая разница обнаружена в числе гигантских клеток,
фагоцитировавших возбудителя: в опыте 2,77±0,45 по сравнению с контролем
0,29±0,99 (Р<0,999) (4, 5,9).
Обсуждение результатов.
Актинолизат стимулировал активность фагоцитов, что проявлялось в более
быстрой мобилизации макрофагов и гигантских многоядерных клеток. Это доказано
статистической обработкой полученных результатов (см. выше). Стимулирующее
действие актинолизата было выражено уже через сутки после 1-й инъекции
препарата. Оно заключалось в увеличении количества макрофагов в очаге
поражения в опыте по сравнению с контролем и дальнейшей активизации этих
клеток. Быстрее появлялись гигантские многоядерные клетки, фагоцитарная
активность которых по отношению к друзам у подопытных животных была
выражена через сутки после 2-й инъекции препарата, в то время как в контрольной
группе отмечалась лишь начальная фаза фагоцитоза макрофагами на периферии
гранулемы.
В то же время актинолизат угнетал развитие возбудителя в ткани, так как
актиномикотический мицелий, являющийся основой вводимой культуры не
трансформировал в друзотканевую форму возбудителя. Об угнетающем действии
актинолизата на возбудителя свидетельствовали завершенный фагоцитоз элементов
лучистого гриба и отсутствие распространения инфекции, что приводило к
стабилизации воспалительного процесса с его последующим регрессом, тогда как у
животных контрольной группы фагоцитоз оказался не завершенный, и происходило
быстрое распространение актиномикотической инфекции, воспалительный процесс
прогрессировал.
Выводы.
1. Актинолизат является активным стимулятором фагоцитарного процесса в
актиномикотической
гранулеме
у
лабораторных
животных
с
экспериментально
вызванной
актиномикотической
бактериальной
инфекцией.
2. Под действием актинолизата происходит угнетение развития друз в
актиномикотической
гранулеме
при
экспериментальном
гнойновоспалительном процессе.
3. В процессе лечения актинолизатом экспериментальных животных,
зараженных
актиномицетами,
в
актиномикотическом
гнойногрануламатозном очаге поражения незавершенная форма фагоцитоза
переходит в завершенную, что обуславливает стабилизацию процесса с
последующим регрессом.
Список литературы к статье Т.П. Егоровой
«Экспериментальное изучение механизма действия иммуномодулятора
актинолизата».
1. Бебрис Н.К., Сутеева Т.Г., Егорова Т.Т. Способ приготовления актинолизата.
Авт. свидет. на изобретение, № 1584952, М., 1990.
2. Дмитриев С.Ф. Явления диссоциации и лизиса в культуре актиномицет.
Журнал микробиол., иммунолог., 1934, № 15, Т. II, с. 289-298.
3. Деревлева Т.А., Сутеева Т.Г. Экспериментальная модель актиномикоза. В сб.
«Проблемы глубоких микозов», М., 1969, вып. 1, с. 436-445.
4. Егорова Т.П. Патоморфология экспериментального актиномикоза. Дисс…
канд. мед. наук, М., 1973.
5. Свинкина
Н.В.
оптимальных
К
механизму
сроков
лечения
действия
актинолизата.
актинолизатом
при
Определение
экспериментальном
актиномикозе. В сб. «Проблемы глубоких микозов», М., 1976, вып. 3, с. 76-78.
6. Сутеев Г.О., Дмитриев С.Ф., Аснин Д.И., Фирюкова М.В. Способ
приготовления иммунобиологического препарата для диагностики и лечения
актиномикоза. Авт. свидетельство на изобретение № 81396, 1949.
7. Сутеев Г.О, Аснин Д.И. Роль актиномицетов в этиологии легочных нагноений.
Тер. Архив, 1950, № 22, Т. 6, с. 40.
8. Сутеев
Г.О,
Дмитриев
С.Ф.
Опыт
применения
«актинолизата»
для
иммунодиагностики и терапии актиномикоза. Мед. паразитол., 1936, № 5, с.
275-281.
9. Сутеева Т.Г., Егорова Т.П. Изучение механизма действия актинолизата в
процессе
лечения
этим
препаратом
животных
с
экспериментальной
актиномикотической инфекцией. Мед. паразитол. и паразит. болезни, 1985, №
5, с. 64-67.
Рисунки к статье Т. П. Егоровой
«Экспериментальное изучение механизма действия иммуномодулятора
актинолизата».
Рис.1. Актиномикотический очаг: друза со сплетением мицелия в центре, вокруг
зона полиморфноядерных лейкоцитов (до лечения актинолизатом).
Окраска гематоксилином и эозином. х 400
Рис.2. Первая инъекция актинолизата. На периферии гранулемы появились
отдельные гигантские клетки, участвующие в фагоцитозе.
Окраска гематоксилином и эозином. х 200
Рис.3. Первая инъекция актинолизата. В контрольной группе отсутствовали
гигантские клетки и макрофаги в зоне воспаления.
Окраска гематоксилином и эозином. х 180
Рис.4. После второй инъекции актинолизата наблюдали обилие гигантских клеток,
окружающих воспалительный очаг.
Окраска гематоксилином и эозином. х 200
Рис.5. После четвертой инъекции актинолизата гигантские клетки с наличием в
цитоплазме частиц погибших друз.
Окраска гематоксилином и эозином. х 200
Рис.6. В контрольной группе без лечения актинолизатом в сформированнорй
актиномикотической гранулеме признаков регресса не наблюдалось.
Окраска гематоксилином и эозином. х 135