На правах рукописи Шестаков Андрей Геннадьевич УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ
advertisement
На правах рукописи Шестаков Андрей Геннадьевич УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат ветеринарных наук, доцент Богданов Ильгизар Исмаилович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук Селянинов Юрий Олегович Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, г. Москва Защита диссертации состоится « 25 » ноября 2010 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал. С диссертацией можно ознакомиться в научной ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова». библиотеке Автореферат диссертации разослан « » октября 2010 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор 2 Л.В. Карпунина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa вызывают заболевание «псевдомоноз» к которому восприимчивы: крупный рогатый скот, свиньи, овцы, птица, пушные звери, пчёлы, рыбы, из лабораторных животных чувствительны белые мыши, морские свинки и кролики (Lipej et al., 1993; Прунтова и др., 1995; Покровский 2002). Диагноз ставят на основании лабораторных исследований на P. aeruginosa. Источник возбудителя, больные животные, выделяющие его с различными выделениями, калом, мочой, молоком, со спермой. Факторы передачи возбудителя – инфицированные корма, пищевое сырьё, вода, почва, окружающая среда (Сидоров, 1995; Красильников, 1999). По существующим данным в окружающей среде P. aeruginosa паразитирует в простейших (Ряпис, 1994; Бухарин, Розенберг, 2007). На особом месте стоит водный ареал распространения P. aeruginosa (Смирнов, Киприанова, 1990; Афонин, 1999). Отмечена высокая резистентность бактерии к антибиотикам и антимикробным веществам (Nikaido, 1978; Илюхин, 1985). P. aeruginosa вызывает порчу белковых пищевых продуктов (в первую очередь мясомолочных) (Стефанов, 1997). Сообщается, что P. aeruginosa вызывает деструкцию нефтепродуктов и углеродсодержащих веществ (Al-Hadhrami, Lapin-Scott, Ficher, 1995). Несмотря на то, что потребность в диагностике синегнойной инфекции очевидна, существующие бактериологические параметры схем, методов выделения, идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах не совершенны. Трудности диагностики P. aeruginosa связаны с беспигментными штаммами и ассоциативной микрофлорой (Шуляк, 2003). В связи с этим исследования, посвященные методам быстрого и точного обнаружения P. aeruginosa в объектах окружающей среды, пищевом сырье и пищевых продуктах являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение. 3 Цель работы - совершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий вида P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Задачи работы: 1. Изучить основные биологические свойства штаммов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. 2.Усовершенствовать среды для выделения и идентификации атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa. 3. Усовершенствовать схему бактериологической идентификации и дифференциации P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и тестов. 4. Выделить из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов специфические бактериофаги бактерий P. aeruginosa и изучить их основные биологические свойства; отобрать наиболее оптимальный специфический бактериофаг для конструирования биопрепарата. 5. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат и технологию его изготовления для индикации и идентификации бактерий вида P. aeruginosa. 6. Усовершенствовать схему индикации бактерий P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4, методом реакции нарастания титра фага. Научная новизна. Проведены комплексные исследования по выделению и из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов штаммов P. aeruginosa. Получены новые данные о биологических свойствах атипичных и беспигментных штаммах, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструирована новая специфическая среда накопления. Усовершенствована селективная среда с цетримидом для выделения атипичных и беспигментных штаммов P. aerugino4 sa. Отобран ряд наиболее информативных тестов и разработаны дополнительные тесты, позволяющие проводить видовую дифференциацию бактерий рода Pseudomonas с учётом существующих беспигментных штаммов. Усовершенствована схема выделения и бактериологической идентификации бактерий вида P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. Выделены и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги P. aeruginosa, и отобран наиболее оптимальный специфический бактериофаг УГСХА-Р.а.№4 для создания диагностического биопрепарата. Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического биопрепарата и усовершенствована схема индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов c применением специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4. Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема бактериологической идентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать атипичные, беспигментные штаммы P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Использование сконструированной усовершенствованной селективной нами среды бактериологической идентификации, среды и накопления, подобранных тестов позволяет выделять и типировать бактерии P. aeruginosa до вида в течение 75 часов. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе специфичного бактериофага и усовершенствована схема индикации бактерий P. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 19-20 часов. Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, а также возможность использования диагностического биопрепарата специфичного бактериофага УГСХА-P.a.4 в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА от 22 января 2010г. 5 По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 феврвля 2010г) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий P. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага УГСХА-P.a.№4», а так же «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида P. aeruginosa в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации разработаны для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических микробиологии, занятий студентов, вирусологии, работы аспирантов эпизоотологии и ВСЭ на кафедре Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Среда накопления (УГСХА-Р.а.1) способствует избирательному росту и размножению P. aeruginosa, при первичном посеве исследуемого материала. Плотная селективная среда (УГСХА-Р.а.2) является специфичной и обеспечивает преимущественный рост P. aeruginosa, угнетая рост возможных ассоциантов. 2. Использованные среды УГСХА-Р.а.1 и УГСХА-Р.а.2, а также подобранные тесты в усовершенствованной схеме бактериологической дифференциации дают возможность за 75 ч идентифицировать P. aeruginosa. 3. Отобран штамм специфического бактериофага для целей идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. 4. Разработаны биотехнологические параметры по созданию диагностического биопрепарата специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4. 6 5. Усовершенствованная схема идентификации бактерий вида P.aeruginosa с применением диагностического биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4 ускоряет определение видовой принадлежности P. aeruginosa. Работа выполнена эпизоотологии и на кафедре микробиологии, ветеринарно-санитарной экспертизы вирусологии, ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия». Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научнопрактических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2005; 2008; 2009), Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009). Публикации По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения и двух глав: обзора литературы; собственных исследований, состоящих из объектов, материалов и методов исследований; результатов исследований и их обсуждения; заключения; выводов; списка использованных литературных источников; приложений. Материалы диссертации изложены на 155 страницах, включают 33 таблицы и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 203 наименования, в том числе 111 зарубежных. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований Штаммы: в работе было использовано 4 референс-штамма бактерий P. aeruginosa 128, 1677, 381, 453, полученные из музея кафедры 7 микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ при ФГОУ ВПО Ульяновской ГСХА, а также 35 штаммов, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Кроме того, для определения специфичности сконструированных сред, а также изучения специфичности бактериофагов использовали 16 штаммов бактерий: Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Stenotrophomonas maltophila из музея вышеназванной кафедры. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами. Объектами исследования так же являлись семь штаммов бактериофагов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды. Питательные среды и реактивы: МПА (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), МПБ (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Левина (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Плоскирева (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда висмут-сульфит агар (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург), среда АГВ для определения антибиотикочувствительности, диски с антибиотиками (НИЦФ Санкт-Петербург), хлорид бария, хлорид натрия, ацетамид, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, ферментативный, магния глюкоза, диметилпарафенилендиамин, сульфат, нитрат сукцинат перекись калия, натрия, водорода, пептон сухой L-аргинин, N-N- индикатор феноловый красный, индикатор бромтимоловый синий, фурадонин, цетримид, агар-агар, желатин, трихлорметан, ТТХ, набор для окраски по Граму. Методы: В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения, идентификации и индикации бактерий (Васильев и др., 8 2004; Лабинская, 2004). Основные биохимические свойства штаммов P. aeruginosa исследовали экспресс методом с использованием тест системы для ускоренной идентификации микроорганизмов, разработанной в НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург. Оксидазный тест проводили с применением 1% р-ра N-N-диметилпарафенилендиамина. Тест на каталазную активность проводили с применением 3% р-ра перекиси водорода. Исследования с использованием бактериальных штаммов проводили согласно ГОСТ Р 5144699, ГОСТ Р 51426-99, ГОСТ Р 26670-91. Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным Д.М. Гольдфарбом (1961), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловичем (1973), С.Н. Золотухиным (2007). Литическую активность фагов определяли по Аппельману и Грациа (Гольдфарб, 1961). Реакцию нарастания титра фага для индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1962), В.Я. Ганюшкиным (1984). Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным методикам (Ашмарин, Воробьев, 1962; Бейли, 1970). Обработку результатов осуществляли с помощью программы SPSS statistics 17.0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Рост референс-штаммов Pseudomonas aeruginosa на стандартных средах и образование пигментов Нами исследованы тинкториальные и культуральные свойства 4-х референс-штаммов P. aeruginosa для определения стабильности свойств и их обоснованного использования при составлении бактериологической схемы выделения и идентификации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. Все референс-штаммы P. aeruginosa, окрашенные по методу Грама, были представлены мелкими грамотрицательными палочками. Подвижность клеток 9 P. aeruginosa, отмечали у всех референс-штаммов. Мы изучили характер роста колоний референс-штаммов P. aeruginosa на стандартных средах. Эти бактерии образовывали, в основном, плоские колонии, или мелкие выпуклые в центре, края ровные или бахромчатые, поверхность гладкая, а так же складчатая. Поскольку однотипных колоний не было, то использовать морфологию колоний как дифференциально-диагностический признак, по нашему мнению, не целесообразно. Далее мы провели изучение сравнительной характеристики пигментов у референс-штаммов бактерий P. aeruginosa. Образование пигментов бактериями P. aeruginosa рассматривается рядом авторов, как ключевой и видообразующий признак при внутриродовой дифференциации. В связи с этим мы попытались охарактеризовать пигменты, продуцируемые референс-штаммами P. и aeruginosa, установили вариабельность этого признака при росте P. aeruginosa на МПА. Основными пигментами референс-штаммов были пиоцианин и флюоресцеин (от бледножелтого до зеленого), классического сине-зеленого оттенка не образовывалось. Наиболее интенсивная пигментация у штаммов P. aeruginosa проявлялась в течение 3-х суток после культивирования, и особенно сильно при аэрировании среды. В результате пигментообразование исследований у P. мы aeruginosa пришли можно к выводу, что рассматривать как дифференциально-диагностический признак, но только как дополнительный, не определяющий. Морфология клеток при окраске по методу Грама и подвижность клеток P. aeruginosa были использованы нами в схеме выделения и идентификации псевдомонад в дальнейших исследованиях. Показана возможность усовершенствования или замены существующих стандартных сред в схемах выделения и идентификации бактерий P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Биохимические свойства и антибиотикочувствительность референс-штаммов Pseudomonas aeruginosa Характеристика биохимических свойств референс-штаммов P. aeruginosa и определение их антибиотикочувствительности, позволили нам использовать 10 полученные данные в подборе тестов бактериологической идентификации P. aeruginosa из внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Из полученных данных мы сделали вывод, что окисление глюкозы является характерным признаком для всех штаммов. Следовательно, этот признак можно использовать для дифференциации P. aeruginosa от бактерий, защелачивающих глюкозу. Оксидазный и каталазный тесты были также положительны у всех референс-штаммов P. aeruginosa. Установлено, что эти штаммы имеют ферменты аргининдегидролазу, нитратредуктазу, способны утилизировать цитрат натрия и ацетат натрия. Определили антибиотикочувствительность гентамицину, амикацину, ампициллину, доксициклину, левомицитину, штаммов P.aeruginosa цефазолину, тетрациклину, фурадонину к эритромицину, и фурагину. Отмечена устойчивость P. aeruginosa к нитрофурановым препаратам, что согласуется с данными литературы. Конструирование накопительной среды для Pseudomonas aeruginosa На основании анализа данных литературы для клеток P. aeruginosa в среде накопления в качестве источника углерода и энергии был выбран сукцинат натрия, а предпочтительным источником азота − L-аргинин (Weyant, 1996; Покровский, 2002). Соли KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, NaCl обеспечивают биохимические процессы и стабилизируют осмотическое давление в клетках P. aeruginosa. В качестве ингибитора посторонней микрофлоры в среде накопления, на основании антибиотикочувствительности был выбран фурадонин, в концентрации 150 мг/л. Все компоненты среды, кроме аргинина и фурадонина смешивали в 1л. дистиллированной воды, автоклавировали при 1,1 атм 120 оС в течение 15 мин. Затем в остывшую до 45 оС вносили навески аргинина и фурадонина. Концентрации компонентов среды накопления подбирали экспериментально. Состав среды накопления: вода дистиллированная – 1000мл, сукцинат натрия – 20,0г, KH2PO4 – 0,5г, K2HPO4 – 1,5г, MgSO4 – 0,5г, NaCl – 5,0г, L-аргинин – 2,0г, фурадонин – 150мг. ph готовой среды 11 накопления – 7,0. Для определения чувствительности среды накопления мы засевали штамм P. aeruginosa в концентрации 10м.к./мл. Через 24ч термостатирования при температуре 37 оС мы определяли количество живых клеток P. aeruginosa в среде накопления. Количество КОЕ на МПА составило 4196. Результаты свидетельствуют о высокой чувствительности среды. Фурадонин ингибирует широкий спектр ассоциантов. Рост P. aeruginosa происходит по всей высоте среды и характеризуется помутнением поверхностной пленкой, придонным ростом. Выраженность придонного роста зависит от концентрации клеток P. aeruginosa. Таким образом, была сконструирована и зарегистрирована среда накопления УГСХА-P.a.1, для выделения P. aeruginosa в концентрации 10м.к./мл. Усовершенствование плотной селективной среды с цетримидом По результатам анализа роста P. aeruginosa на плотных средах, из нескольких селективных агентов (ТТХ, ЦПХ, цетримид) наиболее оптимальным компонентом в составе плотной селективной среды, включенной в схему идентификации P. aeruginosa, был выбран цетримид. Концентрацию цетримида подбирали экспериментально. Состав плотной селективной среды: вода дистиллированная – 1000 мл, МПБ – 20 г, агар микробиологический – 15г, цетримид – 0,3 г. Способ приготовления: Все компоненты смешивали в холодной воде, доводили до кипения и автоклавировали при 121 оС 20 минут. Цвет среды серо-желтый. Колонии штамма №128 P. aeruginosa средние, круглые с волнистым краем, гладкие, слабо пигментированы. Пигмент бледнозеленый. Специфичность селективной среды определялась сравнительным высевом чистых суточных культур бактерий P. aeruginosa, Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Stenotrophomonas maltophila на селективную среду. Культивировали при 37 оС в течение 96 часов. Контролем жизнеспособности 12 являлся посев указанных бактериальных культур на МПА и культивирование при 37 оС в течение 96 часов. Отмечено, что на селективной среде растут P. aeruginosa, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis. По результатам наших опытов, более высокие концентрации цетримида в среде угнетают рост P. aeruginosa. Эта модифицированная селективная среда использована как среда второго порядка в схеме выделения и идентификации P. aeruginosa и зарегистрирована как селективная среда УГСХА-P.a.2. Конструирование и подбор тестов бактериологической дифференциации Pseudomonas aeruginosa Для целей бактериологической дифференциации псевдомонад были сконстркированы следующие тесты: тест «А», тест «B», тест «С», тест «D». Тест «А» − основан на использовании ацетамида в качестве источника углерода в анаэробных условиях. Тест «A» содержит неорганические соли и ацетамид в качестве единственного источника углерода. Ацетамид (амид уксусной кислоты) дезаминируется бактериями, проявляющими ациламидазную активность. P. aeruginosa способна к восстановлению нитратов (денитрификация) до свободного азота, что можно использовать как полезный диагностический признак. Мы поставили перед собой задачу установить возможность использования ацетамида бактериями в P. aeruginosa в анаэробных условиях в присутствии нитрата калия. Для исследования способности к денитрификации и утилизации ацетамида в анаэробных условиях использовали тест А по прописи: вода дистиллированная – 1000мл, ацетамид 10г., KH2PO4 – 0,5г, K2HPO4 – 1,5г, MgSO4 – 0,5г, NaCl – 5,0г, KNO3 – 2г., феноловый красный 0,012г., агар-агар – 15г. Все компоненты среды смешивали в 1000 мл дистиллированной воды и нагревали до полного растворения компонентов. После стерилизации в автоклаве при 1,1 атм. пробирки подвергали резкому охлаждению под струей холодной воды, с целью уменьшения в среде парциального давления кислорода. Часть исследуемой колонии с селективной среды захватывали бактериологической петлей и 13 уколом вносили в нитратно-ацетамидную среду. Культивирование проводили в термостате при 37 ºС 24ч. Положительной реакцией считали изменение окраски среды с желтой на красную или малиновую, а также образование пузырьков N2 в толще среды или разрывов среды. Тест «В» − основан на отсутствии роста P. aeruginosa на агаре с 2г/л хлорида бария. Мы поставили перед собой задачу изучить возможность применения МПА с добавлением хлорида бария, в схеме идентификации бактерий P. aeruginosa. Для решения поставленной задачи необходимо было изучить рост штаммов бактерий P. aeruginosa на вышеупомянутой среде тест «В». В МПА, добавляли хлорид бария из расчета 2 г/л. Среду стерилизовали в автоклаве при 1,1 атм 121 ºС. Суточную бульонную культуру P. aeruginosa штрихом засевали на поверхность скоса и помещали в термостат на 24 ч при температуре 37 ºС. Через указанное время проводили учет результатов. Рост ингибировался у всех штаммов P. aeruginosa. Тест «С» основан на окислении глюкозы в аэробных условиях с использованием модифицированной нами среды Хью-Лейфсона. Этот тест использован в бактериологической схеме для дифференциации P. aeruginosa от бактерий не способных к окислению глюкозы, либо защелачивающих ее (например Alcaligenes faecalis). Предложенный нами состав теста «С»: Вода дистиллированная 1000мл, агар-агар 20г., D-глюкоза 10г., пептон 2г., хлорид натрия 5 г., сульфат магния 0,5 г., гидрофосфат калия 1,39г., дигидрофосфат калия 0,73г., бромтимоловый голубой 0,03г. Все компоненты среды смешивали и нагревали до полного растворения, кроме глюкозы. Глюкозу добавляли в последний момент, среда разливалась по пробиркам и автоклавировалась при 0,5 атм. 20 мин. Пробирки остужали для формирования скоса. Посев производят бактериологической петлей на поверхность косяка. Положительной реакцией считается изменение цвета индикатора с зеленого на желтый на поверхности скоса. Для целей идентификации P. aeruginosa мы включили тест «D», основанный на разжижении желатина. В рамках исследований, связанных с 14 разработкой тестов идентификации бактерий P. aeruginosa, мы изучили протеолитическую активность выделенных штаммов бактерий P. aeruginosa. Тест «D» содержал МПБ, с добавлением 150 г/л сухого желатина. Расплавленную среду автоклавировали при 0,5 атм., в течение 15 мин и разливали в пробирки по 5 мл. Штаммы бактерий P. aeruginosa уколом засевали в столбик желатина и помещали в термостат при 37 ºС на 24ч. Параллельно ставили контрольные не засеянные пробирки. После извлечения засеянных пробирок с желатином и контроля из термостата, все пробирки помещали в холодильник с температурой +6 ºС на 15 мин. Спустя указанное время проводили учет результатов. Среда с желатином в засеянных пробирках оставалась жидкой, в то время как контрольная не засеянная среда застывала столбиком. Протеолиз желатина наблюдался у всех штаммов бактерий P. aeruginosa. Усовершенствование бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов При усовершенствовании бактериологической схемы нами были выбраны следующие свойства P. aeruginosa: отношение P. aeruginosa к окраске по Граму, наличие у P. aeruginosa ферментов цитохромоксидазы, каталазы, аргининдегидролазы, желатиназы, способность к окислению глюкозы в аэробных условиях, способность к утилизации ацетамида, денитрификация, чувствительность к хлориду бария, чувствительность к специфическому бактериофагу. Усовершенствованная схема выделения и идентификации бактерий P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов представлена на рисунке 1. Исследуемый материал Среда УГСХА-P.a. 1 24 ч + окраска по Граму колонии Гр каталаза 37 ºС УГСХА-P.a.2 24 ч + 37 ºС МПБ 3 ч 37 ºС пигментация оксидаза 15 + +/- + тест A Дорожка лизиса 24 ч 37 ºС на сплошном газоне суспензии 24ч + + тест B тест C тест D 24 ч 37 ºС 24 ч 37 ºС 24 ч 37 ºС - + + 37 ºС Рис. 1. Схема выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов Таким образом, предложенная схема выделения и идентификации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах позволяет выделять и идентифицировать бактерии до вида, исключая возможных ассоциантов. С использованием разработанной схемы из сточных вод города Ульяновска, проб молочных продуктов, проб мяса с рынков города Ульяновска, без органолептических признаков порчи, нами было выделено 35 штаммов из которых 4 штамма не образовывали пигменты. Беспигментные «полевые» штаммы P. aeruginosa №Д888, №17, №91, №5 лизировались диагностическим биопрепаратом специфического бактериофага и давали характерные реакции на разработанных нами тестах. Характеристика выделенных фагов Pseudomonas aeruginosa Следующим этапом наших исследований стало выделение бактериофагов P. aeruginosa из объектов внешней среды. Материалом для выделения являлись сточные воды и реки Ульяновской области. Всего исследовано 129 проб. Морфологию негативных колоний бактериофагов изучали с помощью метода агаровых слоев по Грациа. Бактериофаг УГСХА - P.a.№1 и бактериофаг УГСХА - P.a.№4, имели диаметр 3-4мм с четким прозрачным центром и мутным ореолом по периферии. Бактериофаги УГСХА - P.a.№18, УГСХА - P.a.№35, УГСХА - P.a.№44 имели диаметр негативных колоний 2мм и были прозрачны. Бактериофаги УГСХА - P.a.№9 и УГСХА- P.a.№52 имели диаметр колоний 4мм и характеризовались наличием прозрачного центра с мутной периферией. Дальнейшим этапом изучения биологических свойств 16 выделенных бактериофагов было определение их литической активности. Изучили литическую активность 7 выделенных бактериофагов P. aeruginosa методами предложенными Аппельманом и Грациа (Гольдфарб, 1961). Определили количество фаговых корпускул в 1 мл, для каждого выделенного бактериофага. По результатам полученных данных, нами было решено в дальнейших исследованиях использовать наиболее активные бактериофаги УГСХА - P.a.№1 и УГСХА - P.a.№4, характеризовавшиеся максимальным количеством активных корпускул фага в 1мл. Титр селекционированных бактериофагов УГСХА- P.a.№1 и УГСХА- P.a.№4 по Грация: 2х1010, 4х1010 соответственно, фаговых корпускул в 1 мл. Титр бактериофагов УГСХА P.a.№1 и УГСХА- P.a.№4 по Аппельману: 10-8, 10-10 соответственно. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения фага на газон бактериальных культур. Установлено, что наиболее широким спектром литической активности по отношению к исследуемым культурам обладал штамм фага УГСХА- P.a.№4, который лизировал 37 из 39 штаммов P. aeruginosa (94.8%). Фаг УГСХА - P.a.№1 лизировал 30 из имеющихся у нас 39 штаммов P. aeruginosa (76.9%). Поэтому фаг УГСХАP.a.№4 был выбран для конструирования диагностического препарата. Результаты определения специфичности бактериофага УГСХА-P.a.№4, показали, что он строго специфичен по отношению к P. aeruginosa и не лизировал другие виды и роды бактерий. Определение чувствительности бактериофага УГСХА-P.a.№4 проводили путем обработки фаговой суспензии хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Бактериофаг УГСХА - P.a.№4 проявил выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 60 минут. В рамках диссертационного исследования также изучили устойчивость бактериофага УГСХА - P.a.№4 к температуре. Выяснено, что бактериофаг УГСХА - P.a.№4 инактивировался при температуре 75 ºС в течение 30 минут. Разработка технологических параметров изготовления и контроля 17 биопрепарата для диагностики Pseudomonas aeruginosa Результаты определения культивирования оптимальных свидетельствуют о температурных том, что показателей оптимальной является температура культивирования специфического бактериофага УГСХА-P.a.№4 30 ºС − 37 ºC. Нами решено инкубировать систему специфического бактериофага УГСХА-P.a.№4 с клетками P. aeruginosa при температуре 37 ºС. Установлено оптимальное УГСХА-P.a.№4 соотношение специфического бактериофага и культуры 1:5, т.е. 0,2 мл фага х 1 мл индикаторной культуры, оптимальное время пассажа при температуре 37 специфического бактериофага о С для УГСХА-Р.а.№4 составляет 6 часов. За это время происходил лизис индикаторной культуры (просветление среды по сравнению с контролем), литическая активность специфического бактериофага УГСХА-P.a.№4 составляла 10-10 по Аппельману и 7 х 1010 по Грациа. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага с применением диагностического биопрепарата При исследовании оптимальных условий постановки РНФ с применением диагностического биопрепарата специфического бактериофага мы установили количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение и оптимальное время РНФ. По результатам проведенных опытов было установлено, что количество фаговых частиц в опытных пробирках более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах, при контаминации МПБ клетками P. aeruginosa в концентрации 102 м.к/мл. Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным является временной режим РНФ при 7 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом без подращивания. Такой режим позволяет провести индикацию бактерий P. aeruginosa в количестве 102 м.к./мл, в течение 19-20 часов. Однако увеличение времени инкубирования до 16 часов повышает чувствительность метода на порядок и позволяет выявлять бактерии вида P. aeruginosa при наличии их в исходном исследуемом материале 10 18 м.к./мл. Схема постановки РНФ с применением диагностического препарата представлена на рисунке 2. Таким образом, проведенные нами исследования позволили выявить особенности атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов; усовершенствована схема выделения и идентификации P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов; создан диагностический биопрепарат, на основе специфичного бактериофага, позволяющий в короткие сроки проводить индикацию P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. исследуемый материал 9,0мл 9,0мл диагностический биопрепарат 1,0мл 1,0мл МПБ 1,0мл 9,0мл пробирка №1 пробирка №2 7 ч 37 ºС 7 ч 37 ºС 7 ч 37 ºС 0,25мл 0,25мл 0,25мл Пробирка с 4,5 мл МПБ хлороформ 1:10; 30 мин 1,0мл Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной пробирка №3 Пробирка с 4,5 мл МПБ хлороформ 1:10; 30 мин Пробирка с 4,5 мл МПБ хлороформ 1:10; 30 мин 1,0мл 1,0мл Пробирка с 2,5мл Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной 19 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры культуры чашка Петри №1 культуры чашка Петри №2 1,5% МПА 1,5% МПА 12ч 37 ºС 12ч 37 ºС чашка Петри №3 1,5% МПА 12ч 37 ºС Реакция считается положительной, если количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №1 превышает количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №3 в 5 и более раз Рис. 2. Cхема постановки реакции нарастания титра фага с диагностическим биопрепаратом Выводы 1. Показано, что сконструированная накопительная среда с сукцинатом натрия, аргинином и фурадонином и усовершенствованная селективная среда с цетримидом, в комплексе обладают высокой специфичностью, позволяют выделять атипичные и беспигментные штаммы P. aeruginosa, из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. 2. Усовершенствованая дифференциации P. бактериологическая aeruginosa, включающая схема выделения специфичные среды и и подобранные бактериологические тесты, основанные на утилизации ацетамида в анаэробных условиях, ингибировании солями бария, окислении глюкозы, разжижении желатина, позволила из внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов выделить и идентифицировать 35 штаммов P. aeruginosa, в течение 75 часов. 3. Выделено 7 бактериофагов бактерий вида P. aeruginosa и изучены их изоляты, которые имели два типа колоний: с прозрачным центром и мутной переферией и мелкие прозрачные; литическая активность варьировала от 10 -7 до 10-10 по методу Аппельмана и от 2 х 107 до 2 х 1010 по методу Грациа. 20 Изоляты бактериофагов проявляли устойчивость к хлороформу в течение 60 минут и инактивировались при температуре 75 ºС в течение 30 минут. 4. В результате изучения биологических свойств бактериофагов, выбран один бактериофаг УГСХА – Р.а.№4 имеющий оптимальные для конструирования диагностического биопрепарата свойства: титр бактериофага составляет 10-10 по методу Аппельмана и 2 х 1010 по методу Грациа; спектр литической активности 94.8 %. 5. Разработаны параметры постановки реакции нарастания титра фага для ускоренной индикации бактерий вида P. aeruginosa с использованием биопрепарата из бактериофага УГСХА-Р.а.№4, позволяющие обнаружить в исследуемом материале указанные бактерии в концентрации от 10 2 м.к. в 1г (1мл) в течение 19-20 часов. 6. Оптимальными технологическими показателями для изготовления специфического биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4 с высокой литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида P. aeruginosa 1:5, оптимальное время инкубирования при температуре 37 ºС – 6 часов, обработка фаголизата хлороформом в соотношении 1:10 в течение 30 минут. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Шестаков, А.Г. Токсины как основа патогенности Pseudomonas aeruginosa / Э.А. Афонин, А.Г. Шестаков, Т.А, Елантьева, И.Р. Насибуллин, Д.А. Васильев // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Ульяновск, 26-28 апреля 2005. – Ч.5. – С. 236-239. 2. Шестаков, А.Г. Тесты по идентификации Pseudomonas aeruginosa и Aeromonas hydrophilia / Д.А. Васильев, Э.А. Афонин, Т.А. Елантьева, А.Г. Шестаков, И.Р. Насибуллин // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно- практической конференции, Ульяновск, 26-28 апреля, 2005. – Ч.5. – С. 230-233. 21 3. Шестаков, А.Г. Фаги Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков, Э.А. Афонин, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Ульяновск, 26-28 апреля 2005. – Ч.5. – С. 227-229. 4. Шестаков, А.Г. Анализ роста Pseudomonas aeruginosa на ацетамидном агаре с добавлением нитрата калия в анаэробных условиях / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, Ульяновск, 20-22 мая 2008. – С. 114-116. 5. Шестаков, А.Г. Культивирование Pseudomonas aeruginosa в анаэробных условиях / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: Материалы Международной научнопрактической конференции, Москва, 9-10 октября 2008. – С. 289-290. 6. Шестаков, А.Г. Результаты разработки схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев //Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: Материалы Международной научнопрактической конференции, Ульяновск, 26-28 мая 2009. – С. 120-123. 7. Шестаков, А.Г. Особенность роста бактерий Pseudomonas aeruginosa на среде с сукцинатом натрия, аргинином, фурадонином и минеральными солями / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения, 3-4 декабря 2009. – Покров 2009. – С. 46-49. 8. Шестаков, А.Г. Формирование струвитов на среде с сукцинатом, аргинином и мнеральными солями, как диагностический признак при идентификации бактерий Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков, И.И. 22 Богданов, Д.А. Васильев // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения, 3-4 декабря 2009г. – Покров 2009. – С. 133-135. 9. Шестаков, А.Г. Схема выделения и идентификации бактерий Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Естественные и технические науки. – 2009. – №6(44). – С. 118-120. 23
