загрузить - ПЦР лабораторное оборудование, ПЦР тест

Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК
возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией
Оглавление
Принцип метода.
Меры предосторожности.
Взятие и хранение образцов.
Обеззараживание.
Проведение анализа.
ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.
Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для выделения (с указанием фирм-производителей /
поставщиков)
Необходимые реактивы.
Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-АМ».
Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-А».
ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР C ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ.
Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для проведения ПЦР-анализа (с указанием фирмпроизводителей / поставщиков).
А. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (при
использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP)
Б. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального
времени» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT).
Учёт результатов.
А. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP.
А1. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «Джин».
А2. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «АЛА-1/4».
Б. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT.
Б1. Учет результатов при работе с прибором «Rotor-Gene 3000» или «RotorGene 6000».
Б2. Учет результатов при работе с прибором «iQ iCycler» («Bio-Rad», США)
Возможные ошибки при учете результатов, полученных при использовании прибора «IQ Icycler»
(модель 4) и меры по их устранению.
ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ВОЗБУДИТЕЛИ
Бактериальные инфекции:
·
·
·
·
·
·
·
·
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
Mycoplasma genitalium
Ureaplasma spp.
U.parvum / U.urealyticum
Mycoplasma hominis
Gardnerella vaginalis
Treponema pallidum
Вирусные инфекции - герпесвирусы:
· CMV
· HSV I, II
· HSV-typing
Грибковые инфекции:
· Candida albicans
Протозойные инфекции:
· Trichomonas vaginalis
ПРИНЦИП МЕТОДА
В предлагаемых наборов реагентовах для выявления ДНК возбудителя используется метод ПЦР-амплификации
ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продукта реакции.
В основе гибридизационно-флуоресцентной (ГФ) детекции лежит принцип гибридизации флуоресцентномеченого олигонуклеотидного зонда с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате
которой происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Присутствие такого зонда в реакционной смеси
позволяет регистрировать накопление продуктов амплификации непосредственно в ходе полимеразной цепной
реакции (детекция в режиме «реального времени», «Real-time PCR») или по ее окончании (детекция по
«конечной точке», «End-point analysis») путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала. В обоих
случаях детекция результатов ПЦР осуществляется без извлечения продуктов реакции из пробирок, что
позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами ПЦР. Дополнительным преимуществом данной
модификации метода ПЦР является возможность автоматизировать учет результатов анализа, снизить
субъективизм в интерпретации результатов.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Исследование разделяется на два этапа и проводится в двух помещениях (ЗОНАХ), согласно МУ
1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного
патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности».
В ЗОНЕ 1 проводится первичный разбор, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и выделение ДНК
из клинического материала.
В ЗОНЕ 2 проводится подготовка пробирок для постановки ПЦР и проведение ПЦР и гибридизационнофлуоресцентной детекции.
Анализ результатов и введение готовых результатов в журнал проводится аккредитованным
врачом-лаборантом.
1.
Необходимо строго соблюдать СП 1.2. 731–99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп
патогенности и гельминтами».
2.
Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые
наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером. Одноразовую пластиковую посуду (пробирки,
наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 0,2 %-ный
раствор ДП-2Т.
3.
При работе с включенным трансиллюминатором пользоваться защитным экраном или специальной
защитной маской.
4.
Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие
растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое.
5.
Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после
завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению.
ВЗЯТИЕ И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка,
хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора
(Москва, 2006 г.).
Для проведения анализа используется следующий клинический материал:
1. У женщин: соскобы (мазки) из цервикального канала, заднего свода влагалища, уретры, помещенные в 300
мкл транспортной среды, осадок клеток первой порции утренней мочи.
2. У мужчин – соскобы из уретры, помещенные в 300 мкл транспортной среды, осадок клеток первой порции
утренней мочи, секрет предстательной железы – 300-500 мкл.
3. У детей – осадок клеток первой порции утренней мочи, мазок с конъюнктивы, помещенный в 300 мкл
транспортной среды.
Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой
фирмой-производителем наборов реагентов.
Хранить материал можно не более суток при температуре от 2 до 8 °С и в течение года при температуре не выше
минус 68 °С (или ниже). Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Доставка проб
осуществляется в специальном контейнере с охлаждающими элементами.
Для проведения исследования на наличие ДНК определенного микроорганизма анализируется
следующий клинический материал:
· для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas
vaginalis, Ureaplasma spp., U.parvum / U.urealyticum, Mycoplasma hominis, Candida albicans и
Gardnerella vaginalis - соскобы (мазки) со слизистых оболочек урогенитального тракта, клеточный осадок
мочи;
· для выявления ДНК Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae возможно также использовать мазки с
конъюктивы, синовиальную жидкость;
· для выявления ДНК HSV I,II, HSV-typing - соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта,
отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний);
· для выявления ДНК CMV - соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта, клеточный осадок
мочи, слюна;
· для выявления ДНК Treponema pallidum – отделяемое (серозный экссудат) эрозивно-язвенных элементов,
везикул, соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта.
При использовании секрета предстательной железы для анализа на наличие возбудителей ИППП ( Chlamydia
trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma spp., Mycoplasma
hominis) для выделения ДНК рекомендуется использовать набор реагентов «ДНК-сорб-B».
ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ
Обеззараживание биоматериала и реагентов следует проводить на каждой стадии отдельно, помещая
одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) в специальные контейнеры, содержащие
дезинфицирующий 0,2 % раствор ДП-2Т.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА.
Объем подготовленного клинического материала для анализа – 0,1 мл. Проводится в ЗОНЕ 1 - комнате для
обработки клинического материала.
Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для
выделения (с указанием фирм-производителей / поставщиков)
1. Стерильный ламинарный шкаф (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
3. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например,
ОМ-1, г.Ульяновск, Россия).
4. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс g (например, «Elmi», Латвия, «Hettish»,
Германия).
5. Вортекс (например «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл
(например, «Axygen», США).
8. Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например,
«Axygen», США).
9. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 100 мкл, до 200 мкл и
до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
10. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл и до 1000 мкл (например, фирмы
«Ленпипет», Россия).
11. Емкость с дезинфицирующим раствором.
12. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
13. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.
Необходимые реактивы
Для выделения ДНК из клинического материала использовать набор реагентов «ДНК-сорб-АМ» или «ДНК-сорб-А»
в соответствии с инструкцией к комплекту реагентов.
Набор реагентов «ДНК-сорб-АМ» или «ДНК-сорб-А»
Реактив
Описание
Объем (мл)
Кол-во
Лизирующий раствор
Прозрачная бесцветная жидкость
30
1 флакон
Отмывочный раствор
Прозрачная бесцветная жидкость
100
1 флакон
Сорбент универсальный
Суспензия белого цвета
1,0
2 пробирки
ТЕ-буфер для элюции
ДНК
Прозрачная бесцветная жидкость
5,0
2 пробирки
Дополнительно к комплекту «ДНК-сорб-АМ» или «ДНК-сорб-А» прилагаются следующие реактивы:
Реактив
Описание
Объем
(мл)
Кол-во
Транспортная среда для
мазков
Прозрачная жидкость желтого
цвета
30
1 флакон
ВКО комплексный
Прозрачная бесцветная жидкость
1,0
1 пробирка
Прозрачная бесцветная жидкость
1,0
1 пробирка
Прозрачная бесцветная жидкость
1,2
1 пробирка
ВКО-FL
ОКО
2)
1)
1)
Препарат ВКО комплексный используется при выделении ДНК для амплификации с электрофоретической
детекцией.
2)
Препарат ВКО-FL используется при выделения ДНК для амплификации с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией.
Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-АМ»
Объем клинического материала для выделения ДНК - 0,1 мл.
1. Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) прогреть, перемешивая при 65 °С до
полного растворения кристаллов.
2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок 1,5 мл (включая отрицательный контроль
выделения) и, используя наконечник с аэрозольным барьером, внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО-FL.
3. Ресуспендировать сорбент универсальный до гомогенной консистенции, внести в каждую пробирку по 20
мкл сорбента универсального и по 300 мкл лизирующего раствора, используя наконечники с
аэрозольным барьером. Промаркировать пробирки.
4. В пробирки согласно маркировке внести по 100 мкл клинического образца, используя для каждой пробы
отдельный наконечник с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100
мкл ОКО.
5. Пробы тщательно перемешать на вортексе и инкубировать 5 мин. при 65 °С в термостате. После окончания
инкубации перемешать на вортексе и поставить в штатив на 2-3 минуты. Еще раз перемешать содержимое
пробирок на вортексе и оставить в штативе на 5 минут.
6. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 10 тыс. об/мин в течение 30 сек.
Не захватывая сорбент универсальный, удалить супернатант в колбу-ловушку с помощью вакуумного
отсасывателя, используя для каждой пробы отдельный наконечник без аэрозольного барьера.
7. Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования
сорбента универсального.
8. Повторить п.6.
9. Поместить пробирки в термостат 65 °С на 5-10 мин. для подсушивания сорбента универсального. При этом
крышки пробирок должны быть открыты.
10. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в
термостат 65 °С на 5 мин.
11. Центрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин. на микроцентрифуге. Супернатант
содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при
температуре не выше минус 16 °С.
Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-А»
Объем клинического материала для выделения ДНК - 0,1 мл.
1. Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при 65 °С до полного
растворения кристаллов.
2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный контроль выделения).
Внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО-FL и по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать
пробирки.
3. В пробирки с лизирующим раствором и ВКО-FL внести по 100 мкл проб, используя наконечники с
аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля выделения (ОК) внести 100 мкл ОКО.
4. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65 °С. Процентрифугировать 5 с при 5 тыс.
об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на
микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс. об/мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость,
перенеся ее в новую пробирку.ку.
5. Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным
наконечником добавить по 20 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе,
поставить в штатив на 2 минуты, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 минут.
6. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удалить
супернатант в колбу-ловушку, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
7. Добавить в пробы по 500 мкл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного
ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин на
микроцентрифуге. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой
пробы.
8. Повторить отмывку еще раз, следуя пункту 7, удалить супернатант полностью.
9. Поместить пробирки в термостат 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом
крышки пробирок должны быть открыты.
10. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в
термостат 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
11. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Супернатант
содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при
температуре не выше минус 16 °С.
ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР C ГИБРИДИЗАЦИОННОФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
Общий объем реакции – 25 мкл, объем ДНК-пробы – 10 мкл. Проводится в ЗОНЕ 2 – комнате для подготовки и
проведения ПЦР-амплификации.
Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для
проведения ПЦР-анализа (с указанием фирм-производителей /
поставщиков)
1. Для наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP: флуоресцентный ПЦР-детектор «Джин» («ДНК-Технология»,
Россия) или «АЛА-1/4» («BioSan», Латвия).
2. Для наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP: амплификатор (термоциклер), например, «Терцик» («ДНКТехнология») при работе с ПЦР-детектором «Джин»; «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems»);
«Gradient Palm Cycler» («Corbett Research») или «Терцик» («ДНК-Технология») при работе с ПЦР-детектором
«АЛА-1/4».
3. Для наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT: амплификатор с детекцией в режиме «реального времени»
«Rotor-Gene 3000» или «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) или «iQiCycler» («Bio-Rad», США).
4. ПЦР-бокс (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
5. Вортекс (например, «ТЭТА-2», фирмы «Биоком», Россия).
6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
7. Одноразовые наконечники для микропипеток до 200 мкл (например, «Axygen», США).
8. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 100 мкл в штативах (например, «Axygen», США).
9. Штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и микропробирок на 0,2 мл (например,
«ИнтерЛабСервис», Россия).
10. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных ДНК.
11. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
12. Емкость для сброса наконечников.
А. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационнофлуоресцентной детекцией по «конечной точке» (при
использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP)
Необходимые реактивы
Комплект реагентов «АмплиСенс» вариант FEP включает
Реактив
Описание
ПЦР-смесь-1-FEP
Прозрачная бесцветная жидкость
0,008
110 пробирок
ПЦР-смесь-2-Flu
Прозрачная бесцветная жидкость
0,77
1 пробирка
ПЦР-смесь-Фон
Прозрачная бесцветная жидкость
0,5
1 пробирка
Минеральное масло для
ПЦР
Бесцветная вязкая жидкость
4,0
1 флакон
ПКО ДНК
Прозрачная бесцветная жидкость
0,2
1 пробирка
ДНК-буфер
Прозрачная бесцветная жидкость
0,5
1 пробирка
Количество реакций (в 25 мкл)
Объём (мл) Кол-во
110
Для проведения всех тестов для выявления инфекционных агентов, вызывающих ИППП, при использовании
наборов реагентов семейства «АмплиСенс» используется единый (универсальный) режим амплификации и
детекции. Поэтому можно одновременно в одном приборе проводить все эти тесты или любое их сочетание.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР
1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP для амплификации исследуемых и
контрольных проб.
2. В пробирки с ПЦР-смесью-1-FEP на поверхность застывшего воска раскапать по 7 мкл ПЦР-смеси-2-Flu,
при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP. При использовании
пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP объемом 0,6 мл (амплификатор без подогреваемой крышки) на поверхность
добавить каплю минерального масла для ПЦР.
3. Приготовить контрольный образец «Фон». Для этого в пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP на поверхность
застывшего воска внести 17 мкл ПЦР-смеси-Фон, при этом она не должна проваливаться под воск и
смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP. При использовании пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP объемом 0,6 мл на
поверхность добавить каплю минерального масла для ПЦР. Рекомендуется приготовить и использовать 2
контрольных образца «Фон».
4. В готовые пробирки внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из клинических или контрольных проб.
5. Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНКбуфера.
б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК.
Примечание. Не используемые в данный момент пробирки с ПЦР-смесью-1-FEP следует хранить в защищенном от
света месте.
Проведение ПЦР
Для проведения всех тестов для выявления инфекционных агентов, вызывающих ИППП при использовании
наборов реагентов семейства «АмплиСенс» используется единый (универсальный) режим амплификации и
детекции.
1.
Запустить на амплификаторе соответствующую ему программу «65-60-45». Когда температура в ячейках
достигнет 95 °С (режим паузы) поставить пробирки* в ячейки амплификатора и нажать кнопку продолжения
программы.
*Рекомендуется перед постановкой в амплификатор пробирок объемом 0,6 мл осадить капли со стенок пробирок
кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).
Программа «65-60-45» для амплификатора «Терцик».
95 °С – 5 мин
35 циклов: 95 °С – 10сек/ 65 °С – 10 сек / 72 °С – 10 сек
9 циклов: 95 °С – 15сек/ 60 °С – 25 сек / 72 °С – 10 сек
1 цикл: 95 °С – 15сек/ 60 °С – 25 сек
хранение – 10 °С
Программа «65-60-45» для других амплификаторов.
2.
По окончании выполнения программы амплификации приступить к детекции. (Детекцию можно проводить и
позже в течение суток после окончания амплификации, если пробирки после окончания амплификации хранить в
защищенном от света месте при температуре не более 28 °С).
Б. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (при
использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT).
Необходимые реактивы
Комплект реагентов «АмплиСенс» вариант FRT включает
Реактив
Описание
ПЦР-смесь-1-FRT
Прозрачная бесцветная жидкость
Объём (мл) Кол-во
0,008
110 пробирок
ПЦР-смесь-2-Flu
Прозрачная бесцветная жидкость
0,77
1 пробирка
ПКО ДНК
Прозрачная бесцветная жидкость
0,2
1 пробирка
ДНК-буфер
Прозрачная бесцветная жидкость
0,5
1 пробирка
Количество реакций (в 25 мкл)
110
Подготовка пробирок для проведения ПЦР
1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FRT для амплификации исследуемых и
контрольных проб.
2. В пробирки с ПЦР-смесью-1-FRT на поверхность застывшего воска раскапать по 7 мкл ПЦР-смеси-2-Flu,
при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FRT.
3. В готовые пробирки внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из клинических или контрольных проб.
4. Поставить контрольные реакции амплификации:
5. а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНКбуфера.
6. б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК.
Примечание. Не используемые в данный момент пробирки с ПЦР-смесью-1-FRT следует хранить в защищенном
от света месте.
Проведение ПЦР
Б1. Порядок работы при использовании прибора «Rotor-Gene 3000» или «RotorGene 6000».
1. Программирование прибора Rotor-Gene 3000 («Corbett Research») для выполнения программы «65-60-45
RG» (универсальной программы для всех тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью наборов
«АмплиСенс») и создание шаблона теста. Для программирования и создания шаблона следует выбрать в окне
New Run режим программирования Advanced.
В окне Temperature Profile следует задать программу «65-60-45 RG» для амплификатора «Rotor-Gene
3000»:
95º С – 5 мин
10 циклов: 95 ºС – 20 сек/ 65 ºС – 20 сек / 72 ºС – 20 сек
35 циклов: 95 ºС – 20 сек/ 60 ºС – 30 сек / 72 ºС – 15 сек
детекция флуоресценции по каналам FAM и JOE на 2-м шаге
(60 ºС) второго блока циклирования
1.2 Задать автоматическую калибровку для выбора параметра «gain». Для этого в окне Channel Setup выбрать
кнопку Calibrate. В открывшемся окне Auto Gain Calibration Setup нажать кнопку Calibrate Acquiring, пометить
галочкой бокс в строке Perform Calibration Before 1-st Acquisition. Для канала FAM/Sybr нужно указать в графе Min
Reading значение 10, а в графе Max Reading значение 12. Для канала JOE нужно указать в графе Min Reading
значение 1, а в графе Max Reading значение 5. В графе Tube position указан номер пробирки, по которой будет
автоматически выбран параметр «gain», по умолчанию это 1-я пробирка в роторе. Поэтому в указанной (1-ой)
позиции в роторе должна находиться пробирка с реакционной смесью (любой) *. Закрыть окно Auto Gain
Calibration Setup.
*Примечание. При одновременном проведении различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП для
автоматической калибровки по параметру «gain» можно использовать пробирку с любой из соответствующих
реакционных смесей, помещенную в 1-ю позицию в роторе. Нельзя использовать в 1-й позиции пустую пробирку
или пробирку, которая уже прошла амплификацию при предыдущих запусках (пробирки после амплификации
удаляют из ротора и утилизируют).
1.3 Сохранить запрограммированный шаблон выполнения теста. Для этого запустить его выполнение кнопкой
Start Run и в появившемся окне запроса о сохранении файла выбрать тип файла Template. Сохранить файл
шаблона под любым удобным именем (например, «ИППП») в папку: Programm files / Rotor-Gene 6 /
Templates и закрыть окно New Run Wizard. После этого запограммированный шаблон теста появится в списке
шаблонов в окне New Run.
2. Запуск выполнения программы теста с использованием готового шаблона.
Для запуска с использованием готового шаблона выбрать в меню New, вверху окна New Run выбрать Quick
Start, затем в списке шаблонов в этом окне выбрать нужный, запрограммированный согласно пункту 1 шаблон.
В окне Sample Setup задать последовательность расположения образцов в роторе, указать для каждого образца
тип Unknown (таблица образцов открывается кнопкой Edit Grid). При этом в 1-ой позиции в роторе должна быть
помещена одна из пробирок с реакционной смесью (любой) *
Установить пробирки в ротор в соответствии с таблицей, прикрепить ротор, закрутить фиксирующий винт,
установить фиксирующее кольцо, закрыть крышку прибора.
Запустить выполнение программы прибором с помощью кнопки Start Run в нижней части окна и задать имя
файла, в котором будут сохранены результаты.
3. После окончания реакции можно приступить к учету результатов.
Б2. Порядок работы при использовании прибора «iQ iCycler».
1. Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного сигнала во всех
пробирках по каналам FAM и HEX в окне Edit Plate Setup модуля Workshop. Сохранить ее. Назначить
использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol
2. Запустить на амплификаторе iQ iCycler программу «65-60-45 iQ»: выбрать или создать эту программу в модуле
View Protocols и запустить ее c заданной схемой планшета, нажав кнопку Run with selected plate setup.
Программа «65-60-45 iQ» для амплификатора «iQ iCycler»:
(универсальная программа для всех тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП
с помощью наборов «АмплиСенс»)
95º С – 3 мин 30 сек
10 циклов: 95 ºС – 20 сек/ 65 ºС – 20 сек / 72 ºС – 25 сек
35 циклов: 95 ºС – 20 сек/ 60 ºС – 30 сек / 72 ºС – 25 сек
детекция флуоресценции на 2-м шаге (60 ºС) второго блока циклирования.
ВНИМАНИЕ! Необходимо, чтобы протокол dynamicwf.tmo в списке протоколов (модуль View
Protocols) соответствовал стандартному, показанному на рисунке. Если этот протокол был изменен и
не соответствует указанному, его необходимо исправить.
3. Перед запуском выполнения программы в окне Run Prep модуля Workshop следует проверить правильность
выбранного имени протокола и имени схемы планшета. Выбрать для измерения факторов лунок вариант
Experimental Plate под строкой Select well factor source. Задать объем реакционной смеси – 25 мкл. Для запуска
нажать кнопку Begin.
4. После того, как температура реакционного блока достигнет 95ºС, открыть крышку и поместить реакционные
пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета.
Закрыть крышку прибора и нажать кнопку Continue Running Protocol в окне блока Run-Time Central, ждать
окончания реакции.
5. После окончания программы приступить к учету результатов.
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
А. Учет результатов при использовании наборов
реагентов«АмплиСенс» вариант FEP
А1. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «Джин»
Работа с флуоресцентным ПЦР-детектором «Джин» проводится согласно «Паспорту ПЦР- детектора
флуоресцентного «Джин».
Для детекции и учета результатов используются стандартные настройки тестов программы «Джин», заданные по
умолчанию: пороговые значения равны для «-» 1,75; для «+» – 2,1; для «ВК» – 2,5.
Настройки теста можно просмотреть выбрав меню «Настройки», «Список тестов» в главном меню программы.
Если значения изменены, требуется восстановить начальные значения, указанные выше, и сохранить изменения
при выходе из программы.
1. Включить прибор и запустить программу «Джин» на компьютере, присоединенном к прибору.
2. Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов (включая фоновые пробирки), выбрать
нужную инфекцию в списке тестов в графе «Тест», кликнуть «OK» и ввести последовательность детектируемых
образцов (в колонке «Образец»).
3. В качестве образцов, обозначенных «ФОН» использовать контрольные образцы «Фон».
4. Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной последовательностью
(группами по 12 образцов) и запустить измерение, кликнув кнопкой мыши значок цветной призмы в панели
активных кнопок (вверху экрана). По окончании измерения вынуть пробирки и кликнуть кнопкой мыши кнопку
«OK».
5. Сохранить полученные результаты, выбрав в меню значок сохранения файла (или выбрав вкладку Протокол,
затем Сохранить), и задав имя файла.
6. Полученные данные интерпретируются программой автоматически (колонка «Результат» на экране).
Положительные образцы, в которых обнаружена ДНК анализируемого возбудителя, обозначаются знаком «+» на
красном фоне; отрицательные образцы – знаком «―» на зеленом фоне; образцы, для которых получен сигнал,
который нельзя однозначно интерпретировать, требующие повторного анализа, обозначены знаком «?» на
желтом фоне; и образцы, в которых не детектируется (не превышает фона) как специфический сигнал, так и
сигнал ВКО, требующие повторного анализа, обозначены знаком «нд» на желтом фоне.
7. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных
контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.
Оценка результатов анализа контрольных точек
Контроли
ОК
К-
Контролируемый этап ПЦР-анализа
Выделение ДНК
ПЦР
К+
ПЦР
ПРИМЕР ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результат
«─» (отрицательный)
«нд» (отрицательный)
«+» (положительный)
Вывод: образцы 1-3, 5, 6, 9-11 и к+ - положительные, образцы 7, 8, 12 – отрицательные,
образец 4 – не валидный результат (не детектируется ВКО), требует повторного анализа.
А2. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «АЛА1/4»
Работа с флуоресцентным ПЦР-детектором «АЛА-1/4» проводится согласно «Паспорту ПЦР-детектора
флуоресцентного «АЛА-1/4».
Для детекции и учета результатов используются следующие настройки тестов программы «АЛА-1/4», заданные
по умолчанию: пороговые значения для канала FAM 1,9 и 2,4; для ВКО указана детекция по каналу HEX и
пороговое значение 3,0.
Настройки теста можно просмотреть и изменить, выбрав закладки «Настройки», «Список тестов» в главном меню
программы. (Для этого введя указанные выше значения, следует нажать кнопку «Сохранить»).
1.
Включить прибор и запустить программу «АЛА-1/4» на компьютере, присоединенном к прибору.
Задать протокол измерения, выбрав в верхнем меню «Протокол», «Создать новый». Выбрать тип ротора: 36
х 0,5 при использовании пробирок объемом 0,5 мл или 48 х 0,2 при использовании пробирок объемом 0,2 мл.
2.
Выбрать нужный тест в списке тестов в меню. Ввести последовательность детектируемых образцов и фоновых
образцов в колонке «Образец». Закрыть окно редактирования протокола детекции.
3. В качестве образца (образцов), обозначенного «ФОН» использовать контрольный образец (образцы) «Фон».
Для того, чтобы обозначить образец «ФОН» в графе «Образец», используется сочетание клавиш «Ctrl» + «F».
4. Поставить пробирки в ячейки предварительно снятого ротора прибора «АЛА-1/4» в соответствии с заданной
последовательностью, установить ротор в модуль прибора, закрепив его фиксатором и закрыть крышку.
Запустить измерение с помощью значка детекции в панели активных кнопок (вверху экрана) или выбрав в меню
пункт «Протокол», затем «Детекция». По окончании детекции на экран будет выведена таблица результатов.
Примечание: Если в одном протоколе проводится детекция большего числа образцов, чем число ячеек в роторе,
то после окончания детекции первой группы образцов (36 или 48) необходимо извлечь ротор, поместить в его
ячейки следующую группу образцов, поместить ротор в прибор и для продолжения детекции нажать кнопку
«Продолжить» в окне программы. Если пробирки, относящиеся к одному тесту, не помещаются в один ротор, то
нужно ставить пробирки «Фон».
5. По окончании измерений сохранить полученные результаты, выбрав в меню Файл, затем Сохранить как и
задав имя файла.
6. Полученные данные интерпретируются программой автоматически (колонка «1» на экране). Для образцов, в
которых обнаружена ДНК анализируемого возбудителя, в соответствующей графе указано «обнаружено» (на
лиловом фоне). Для образцов, в которых не обнаружена ДНК данного возбудителя, в соответствующей графе
указано «не обнаружено» (на голубом фоне). Для образцов, для которых получен сигнал, который нельзя
однозначно интерпретировать (возможно, положительный), указан результат «сомнительно». Для таких
образцов требуется повторное проведение анализа для получения достоверного результата. Образцы, в которых
не детектируется (не превышает фона) как специфический сигнал, так и сигнал ВКО, требующие повторного
анализа, обозначены знаком «нд» на желтом фоне.
7. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.
Оценка результатов анализа контрольных точек
Контроли
ОК
К-
Контролируемый этап ПЦР-анализа
Выделение ДНК
ПЦР
К+
ПЦР
Результат
«не обнаружено»
«нд» (отрицательный)
«обнаружено»
ПРИМЕР ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Б. Учет результатов при использовании наборов
реагентов«АмплиСенс» вариант FRT
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализируются с помощью
программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме реального времени.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с
установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Это соответствует наличию (или отсутствию)
значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов. Анализ и учет результатов
проводится согласно описанию в инструкции соответствующей используемому прибору.
Анализируют результаты амплификации участка ДНК возбудителя и ДНК ВКО. Накопление продукта
амплификации участка ДНК возбудителя детектируется по каналу FAM, а накопление продукта амплификации
ДНК ВКО - по каналу для детекции флуорофора JOE (или HEX).
Б1. Учет результатов при работе с прибором «Rotor-Gene 3000»
или «RotorGene 6000»
1. Выбрать в главном меню значок меню «Analysis», в ниспадающем меню выбрать вкладку «Quantitation».
Выполнить эту операцию для данных канала FAM, выбрав в поле «Cycling A FAM», затем для данных канала JOE,
выбрав в поле «Cycling A JOE».
2. Анализ результатов амплификации ДНК возбудителя, детектируемых по каналу FAM. Щелкнуть кнопкой
мыши на графике нормализованных кривых флуоресценции по каналу FAM. В меню над графиком должна быть
включена кнопка «Dynamic Tube» (включена по умолчанию). Кнопка «Slope correct» должна быть выключена
(выключена по умолчанию). Задать уровень пороговой линии - ввести в текстовом поле «Threshold» значение,
указанное в Таблице 1 для данного теста. Нажав кнопку «More Settings», ввести в текстовом поле значение,
указанное в Таблице 1 для данного теста. Внизу под графиком появится таблица результатов с указанием
значения порогового цикла Ct по каналу FAM для каждого образца («Quant. Resultes – Cycling A. FAM»).
Параметры учета результатов при использовании прибора «Rotor-Gene 3000».
Тест для выявления возбудителя
«Threshold»
«More Settings», %
Chlamydia trachomatis
0,05
0
Neisseria gonorrhoeae
0,05
0
Trichomonas vaginalis
0,1
5
Mycoplasma genitalium
0,05
0
Treponema pallidum
0,1
5
Ureaplasma spp.
0,05
0
U.parvum / U.urealyticum
0,05
5
Mycoplasma hominis
0,05
0
HSV I, II
0,1
5
HSV-typing
0,1
0
CMV
0,05
0
Gardnerella vaginalis
0,1
5
Candida albicans
0,05
5
3. Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, детектируемых по каналу JOE. Щелкнуть кнопкой мыши на
графике нормализованных кривых флуоресценции по каналу JOE, включить в меню над графиком кнопку
«Dynamic Tube» (включена по умолчанию), затем кнопку «More Settings» и ввести в текстовом поле значение
5 (5 %). Задать уровень пороговой линии - ввести в текстовом поле «Threshold» значение 0,1. Внизу под
графиком появится таблица результатов с указанием значения порогового цикла по каналу JOE для каждого
образца («Quant. Resultes – Cycling A. JOE»).
4.
Результаты интерпретируются следующим образом:
А) Образец считается положительным, если в таблице результатов пороговых циклов по каналу FAM («Quant.
Resultes – Cycling A. FAM») для него определено значение Ct. При этом кривая флуоресценции данного образца
должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
Б) Образец считается отрицательным, если в таблице пороговых циклов по каналу FAM для него не
указывается значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице пороговых
циклов по каналу JOE («Quant. Resultes – Cycling A. JOE») для него пределено значение Ct, не превышающее 28.
В) Для образцов, для которых отсутствует значение Ct по каналу FAM, и по каналу JOE значение Ct также
отсутствует или превышает 28, требуется повторное проведения анализа, начиная с этапа выделения ДНК.
5. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.
Оценка результатов анализа контрольных точек
ОК
Контролируемый
этап ПЦР-анализа
выделение ДНК
Значение Сt по
каналу FAM
нет значений
Значение Сt
по каналу JOE
< 28
К-
ПЦР
нет значений
нет значений
отрицательный
К+
ПЦР
< 30
нет значений
положительный
Контроли
Результат
отрицательный
Возможные ошибки:
1. Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о
неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В
таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
2. Если в отрицательном контроле (ОК или К-) детектируется положительный сигнал, значит, произошла
контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются
недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению и устранению
источника контаминации.
3. Пересечение c пороговой линией кривой флуоресценции, зафиксированное для кривой, у которой
отсутствует участок характерного экспоненциального подъема флуоресценции (кривая представляет собой
наклонную прямую линию) свидетельствует о неправильно заданном уровне пороговой линии или других
параметров учета результатов. Такой результат не должен рассматриваться как положительный. Проверьте
правильность всех параметров учета результатов, в соответствии с п.2 и таблицей.
ПРИМЕР ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Данные по каналуJOE-детекция ДНК ВКО.
Данные по каналу FAM – детекция ДНК возбудителя (Chlamydia trachomatis).
Вывод: образцы 20f-23f – отрицательные, образцы 24f и 28f – положительные.
Б2. Учет результатов при работе с прибором «iQ
iCycler» («Bio-Rad», США)
Выбрать в окне модуля PCR Quantification данные по каналу FAM (значок канала FAM-490 в окне Select a
Reporter). Задать уровень пороговой линии - ввести в текстовом поле Threshold Position значение 40 (40.0) и
нажать кнопку Recalculate Threshold Cycles. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base
Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию).
1.
2.
Выполнить аналогичную операцию для данных канала HEX (значок канала HEX-530 в окне Select a Reporter).
Задать уровень пороговой линии - ввести в текстовом поле Threshold Position значение 30 (30.0) и нажать кнопку
Recalculate Threshold Cycles. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted
Curve Fit (выбирается по умолчанию).
3.
Результаты интерпретируются следующим образом:
А) Образец считается положительным, если в таблице результатов пороговых циклов по каналу FAM (при
выбранном значке канала FAM-490 в окне Select a Reporter) для него определено значение Ct. При этом кривая
флуоресценции данного образца должна пересекать пороговую линию на участке характерного
экспоненциального подъема флуоресценции. Следует оценить визуально полученные кривые флуоресценции,
просматривая их по группам по 3-6 образцов, чтобы избежать ошибок при интерпретации (См. Приложение1).
Б) Образец считается отрицательным, если в таблице пороговых циклов по каналу FAM в графе Сt для него
указывается значение N/A (не детектируется пересечение кривой флуоресценции с пороговой линией), а в
таблице пороговых циклов по каналу HEX (при выбранном значке канала HEX-530 в окне Select a Reporter) для
него определено значение Ct, не превышающее 30;
В) Образцы, для которых отсутствует значение Ct по каналу FAM, и по каналу HEX значение Ct также
отсутствует или превышает 30, требуют повторного проведения анализа, начиная с выделения ДНК. (Если для
этого же образца ДНК в другом ПЦР-FRT тесте ВКО детектировался нормально, то для него повторяют ПЦР без
повторного выделения).
4. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.
Оценка результатов анализа контрольных точек.
ОК
Контролируемый
этап ПЦР-анализа
выделение ДНК
Значение Сt по
каналу FAM
нет значений
Значение Сt по
каналу HEX
< 30
К-
ПЦР
нет значений
нет значений
отрицательный
К+
ПЦР
< 30
нет значений
положительный
Контроли
Результат
отрицательный
Возможные ошибки.
1. Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о
неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В
таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.
2. Если в отрицательном контроле (ОК или К-) детектируется положительный сигнал, значит, произошла
контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются
недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению и устранению
источника контаминации.
3. Положительный результат, пересечение c пороговой линией, зафиксированное для кривой флуоресценции, у
которой отсутствует участок характерного экспоненциального подъема (кривая представляет собой
приблизительно прямую линию). Это может свидетельствовать о неправильно заданном уровне пороговой линии
или параметров расчета базальной линии. Такой результат не должен рассматриваться как положительный. Если
он получен при правильном уровне пороговой линии, требуется провести повторно ПЦР с детекцией в режиме
«реального времени» для этого образца. (См. Приложение 1.)
4. Отсутствие пересечения с пороговой линией (результат N/A) для кривой у которой есть характерный
экспоненциальный подъем флуоресценции (кривая характерной S-образной формы повернутая вниз) может
свидетельствовать о некорректной обработке данной кривой программой «iCycler» (см. Приложение 1). Данный
результат не должен интерпретироваться как отрицательный. Необходимо отдельно проанализировать
полученную кривую и (или) провести повторно ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» для этого
образца.
ПРИМЕР ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Данные по каналу FAM – детекция ДНК возбудителя (Chlamydia trachomatis).
Данные по каналу HEX – детекция ВКО.
Вывод: проба 10 (B3) – положительная; пробы 9, 11-15 и «B-»- отрицательные; K+ (B10) – положительный
контроль ПЦР; K- (B11)– отрицательный контроль ПЦР.
Приложение 1
Возможные ошибки при учете результатов,
полученных при использовании прибора «iQ
iCycler» (модель 4) и меры по их устранению.
При учете результатов с помощью программного обеспечения прибора «iQ iCycler» необходимо сначала
внимательно просмотреть кривые флуоресценции по каналу FAM группами по 3-6 образцов, чтобы избежать
возможных ошибок, связанных с наблюдаемой в отдельных случаях некорректной обработкой программой
кривых флуоресценции.
Примеры возможных ошибок приведены ниже.
1. Отсутствие пересечения с пороговой линией для кривой у которой есть участок характерного
экспоненциального подъема флуоресценции. Кривая характерной S-образной формы повернута вниз в
результате некорректной обработки данной кривой программой – см. образцы D5 и C4 (Рис.1).
Данный результат для этих двух образцов нельзя интерпретировать как отрицательный, хотя в таблице
результатов значение Ct для них отсутствует, т.к. в этих образцах содержалась ДНК возбудителя в высокой
концентрации.
Рис.1
В случае такой ошибки для образца может быть зафиксировано значение Ct менее 5, которое также является
ошибочным, на основании такого значения Ct нельзя считать образец положительным.
При изменении установки параметра Baseline Cycles (режим User Defined) при анализе тех же данных эти образцы
адекватно фиксируются как положительные (Рис. 2).
Рис. 2
2. Пересечение c пороговой линией кривой флуоресценции, зафиксированное для кривой, у которой отсутствует
участок характерного экспоненциального подъема флуоресценции (кривая представляет собой приблизительно
прямую линию). Это может свидетельствовать о неправильно заданном уровне пороговой линии или о
некорректной обработке данной кривой программой. Такой результат не должен рассматриваться как
положительный.
В приведенном ниже примере (Рис.3) 7 ложно-положительных результатов получены по причине неправильно
установленного уровня пороговой линии. Вместо указанного в инструкции уровня = 40 стоит предлагаемый по
умолчанию уровень, рассчитанный автоматически, оказавшийся здесь равным 15,5. Действительно
положительными здесь являются 2 образца: K+ (A11) и образец 54 (А9).
Рис.3
При правильно установленном уровне пороговой линии (40) получен правильный результат.
В случае такой ошибки чаще всего фиксируются значения Ct либо превышающие 28, либо менее 5. Значение Ct
менее 5 не может быть результатом специфического накопления флуоресцентного сигнала, поэтому на
основании такого значения Ct не может регистрироваться положительный результат.
Примечание: Если при установке уровня пороговой линии в соответствии с инструкцией Вы получаете
ошибочные результаты, сообщите об этом производителю наборов. Возможно, калибровка шкалы Вашего
прибора отличается от средней, и требуется корректировка уровня порога.