частная бактериология
advertisement
РАЗДЕЛ 2 ЧАСТНАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Лабораторное занятие №8 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФТЕРИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КОКЛЮША МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА Цель: Ознакомиться с возбудителями дифтерии, коклюша и легионеллеза у людей и методами микробиологической диагностики этих инфекций. Возбудитель дифтерии Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции Дифтерия — острое инфекционное заболевание, характеризующееся воспалительным процессом слизистых оболочек ротоглотки, верхних дыхательных путей, реже других органов с образованием фибринозных налетов и интоксикацией. Возбудителем дифтерийной инфекции являются токсигенные Corynebacterium diphtheriae. Морфологические и тинкториальные свойства Возбудитель дифтерии представляет собой тонкие, слегка изогнутые или прямые полиморфные палочки размером 1-12x0,3-0,8 мкм с зернами волютина на концах, грамположительны. Спор и капсул не образуют, на поверхности имеют фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки. Для С. diphtheriae характерен значительный полиморфизм — разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, овода и т.д. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры X, V. При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина. Описано сродство волютина к метиленовому синему, и при обработке этим красителем гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. Для окраски мазков обычно применяют щелочной метиленовый синий по Леффлеру, ацетат толуидинового синего, кристаллический фиолетовый, метод Нейссера. Биологические свойства Коринебактерии дифтерии — факультативные анаэробы, хорошо растут при температуре 36-37оС, рН 7,4-8,0 на питательных средах с добавлением крови или сывороток. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры к среде добавляют теллурит (калия или натрия), не оказывающий влияние на рост дифтерийных бактерий. Обычно колонии микроорганизмов из рода коринебактерий на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеют серовато-белую или желтоватую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, округлой формы, диаметром 1-3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода коринебактерий могут образовывать шероховатые R-колонии. Коринебактерии дифтерии сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин, способность разлагать крахмал и гликоген варьирует у различных штаммов. Восстанавливают нитраты в нитриты, продуцируют цистиназу, каталазу, гиалуронидазу, нейраминидазу, но не образуют индол, уреазу, желатиназу. Различные биовары существенно различаются по культуральным и биохимическим свойствам; Возбудитель дифтерии продуцирует экзотоксин — термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный белок, состоящий из фрагментов — А и В. Способность к токсинообразованию проявляют только лизогенные штаммы, инфицированные бактериофагом, несущий ген tox. Токсин теряет активность и переходит в анатоксин при добавлении формалина (0,3-0,4%) и выдерживании при температуре 40°С в течение 4 недель. Антигенная структура дифтерийных коринебактерии представлена термосталабильным полисахаридным О-антигеном и термолабильным белковым Кантигеном, обладающим выраженной иммуногенностью и видовой специфичностью. По К-антигенам дифтерийные бактерии разделяют на серологические варианты (58): биовар gravis включает 14 сероваров, mitis — 40, intermedius — 4. По форме колоний и некоторым биохимическим свойствам С. diphtheriae подразделяют на культуральнобиохимические варианты — gravis, mitis, intemedius. Через 48-72 ч роста вариант mitis образует колонии S-типа — гладкие, диаметром 1—2 мм; R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2-3 мм; колонии варианта intermedius R-S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1 мм. Далее описываются только два культурально-биохимических.; варианта — gravis и mitis, так как биовар intermedius встречается редко и по биохимическим свойствам не отличается от биовара mitis. На кровяных теллуритовых средах через 48 ч роста колонии С. diphtheriae варианта gravis черные, матовые имеют радиальную исчерченность. Колонии С. pseudodiphtheriticum имеют характерный светлый ободок. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55% и 14,5% случаев соответственно), когда используется учет только морфологических признаков. При идентификации С. diphtheriae необходимо использовать комплекс тестов, в первую очередь, определение патогенности (токсигенности), основного признака возбудителя дифтерии. Определение токсигенных свойств проводится бактериологами в первые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичного посева материала. Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий, необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний с чашек первичного посева. При соблюдении описанных ниже методик можно изучить токсигенность более чем у 20 подозрительных колоний из одного анализа. Нельзя изучать материал при множественном росте подозрительных колоний только в одной-двух бляшках. Ферментативная активность микроорганизмов изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу, крахмал. Учитывая, что при идентификации возбудителя дифтерийной инфекции ведущим элементом является определение наличия токсина, оценки других свойств имеют вспомогательное значение. Использование «длинного» углеводного ряда является излишним при идентификации С. diphtheriae. Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции и наблюдения за распространенностью токсигенных коринебактерии дифтерии. Взятие и доставка материала 1. Успех бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного и правильного взятия материала. 2. Взятие материала должны производить специально обученные медицинские работники лечебно-профилактических учреждений. 3. При исследовании на дифтерию обследуют ротоглотку и нос. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище) помимо пораженных участков следует брать материал также с миндалин и из носа. 4. Взятие материала осуществляют с помощью стерильных ватных сухих тампонов. Для их приготовления используют деревянные или металлические (из нержавеющего металла) палочки, на один из концов которых плотно накручивается слой гигроскопической ваты (примерно 120 мг ваты на тампон). Тампоны должны иметь форму «капли», а не «веретена». Тампоны монтируют в пробирки с корковыми или ватными пробками так, чтобы конец тампона не касался дна и стенок пробирки. Стерилизуют тампоны в сухожаровом шкафу при температуре 140°С в течение часа или в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин. 5. Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через два часа после еды, при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с пораженных участков ротоглотки — миндалин, а при необходимости — с дужек мягкого неба, небного язычка или задней стенки глотки. При наличии налетов материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи. 6. При ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. Материал с пораженных участков кожи следует собирать сухим тампоном после удаления корочек или струпа. 7. Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов с момента взятия материала. При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах рекомендуется засевать материал на чашки с питательной средой или использовать транспортную среду. 8. В случае использования транспортной среды материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокла. 2 Следует учитывать, что применение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки. 9. Чашки (или пробирки с транспортной средой) с посевом исследуемого материала можно поместить для подращивания в термостат при ЗТС на 15-18 ч, после чего доставить в лабораторию. 10. При транспортировке на дальние расстояния также можно использовать тампоны, предварительно пропитанные раствором глицерина. Тампон пропитывают 5%-ным раствором глицерина в дистиллированной воде, отжимают о стенки сосуда с раствором, укрепляют в пробирке так же, как сухой тампон и автоклавируют при 0,5 атм. в течение 30 мин. 11. В холодное время года исследуемый материал доставляют в баклабораторию в сумкахтермосах во избежание его замерзания. 12. В случае необходимости проведения постмортальных исследований на коринебактерии дифтерии, материал целесообразно брать с миндалин, гортани и полости носа, поскольку во внутренних органах возбудитель обнаруживается редко. 13. Каждой пробирке с исследуемым материалом (зев, нос или другая локализация) придается номер. В прилагаемом списке указывается номер пробирки, фамилия, имя (или инициалы), возраст, название учреждения, направляющего материал, или домашний адрес обследуемого, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование), дата и время взятия материала. Микробиологические исследования на дифтерию 1-ый день 2-ой день (24ч) 3-ий день (48 ч) Посев материала на питательные среды в чашках Петри (от одного больного на одну чашку одной из сред – Клауберга II, кровяной теллуритовый агар, сывороточный агар) 1. Через 24 ч - просмотр и отбор чашек с колониями, похожими на дифтерийные – светло-серого цвета, выпуклые, с ровными краями. Мазки делают из «сомнительных» колоний. Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то их отбирают для идентификации по всем тестам. 2. В случае роста подозрительных однотипных колоний приступают к изучению их токсигенных свойств. Их изучают не менее чем у двух изолированных колоний. Одну половину каждой колонии засевают на среду для определения токсигенности и необожженной петлей – на среду Пизу для определения цистиназной активности, а другую половину – пробирку со скошенным сывороточным агаром, если материала мало – только на среду Пизу. Так как колонии через 24 ч малы, объединяют в одну бляшку при посеве на среду для определения токсигенности, смешивая по 5-7 однотипных колоний. 3. Если вырастает только одна колония, ее можно засеять на среду для определения токсигенности, и не обжигая петли, в среду Пизу. Для дальнейшей идентификации можно использовать культуру со среды Пизу или с бляшки через 48 ч, или через 24 ч роста при выявленных токсигенных свойствах культуры. 4. Для предварительного ответа в случае множественного роста подозрительных колоний – посев нескольких колоний в жидкую питательную среду для постановки РНГА, выполнить дополнительную пробу Заксе (3-5 однотипных колоний, учет через 30 мин инкубации) и пробу Пизу (5-6 однотипных колоний, учет через 3 ч инкубации). Предварительный ответ об обнаружении культуры – по характерной морфологии колоний, морфологии клеток при микроскопии, отрицательной пробе Заксе, положительных результатах пробы Пизу, РНГА – через 48 ч с момента первичного посева материала. 1. Через 24 ч идентифицируют культуру по линиям преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу. При отсутствии специфических линий среду инкубируют еще 24 ч 2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу, засевают на среды с сахарозой, глюкозой и крахмалом и мочевиной 3. Чашки с первичным посевом просматривают через 36-48 ч. При наличии «подозрительных» колоний изучают их токсигенность, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенный сывороточный агар (см. 2-ой день, п.2) При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены. 3 4-5-ый день (72-96 ч) 1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 ч инкубации пробы на токсигенность 48-ч роста первичного посева), положительной пробе на цистеназу выдают документированный ответ о выделении токсигенной культуры коринебактерий дифтерии. 2. Чистую культуру засевают на среды для изучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой, крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной. 3. Повторно (через 48 ч) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во 2-ой день исследований. Учитывают сахаролитические свойства, уреазную активность в пробах поставленных в 3-ий день. При отсутствии специфических линий преципитации через 48 ч после постановки пробы на токсигенность, но положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных на уреазу и сахарозу культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии нетоксигенные с указанием биохимического варианта. При выделении токсигенных коринебактерий дифтерии дополнительно выдают ответ о биохимических свойствах (через 72 или 96 ч с момента первичного посева исследуемого материала) Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации в геле В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, просходит их взаимодействие преципитата в виде белой линии или усов. Токсигенность определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Для постановки пробы необходимо иметь: 1. стерильные чашки Петри с ровным дном 2. питательную среду – агар Мартена или сухую коммерческую среду 3. нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота 4. стерильные полоски фильтровальной бумаги 1,5х8 см 5. очищенный ферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин 6. противодифтерийную антитоксическую свыоротку или готовые бумажные диски с нанесенным на них антитоксином 7. контрольный токсигенный штамм коринебактерий дифтерии 24-48 часового роста К 10 мл расплавленного питательного агара добавляют 2 мл нормальной сыворотки и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность застывшего агара обожженным пинцетом помещают полоску из фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксином или антитоксической сывороткой. Подсушивают чашки в термостате при 37 оС в течение 15-20 мин, повернув ее вверх дном. Постановка пробы Культуру засевают в виде «бляшек» диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7 – 0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку засевать следует не более 10 «бляшек». Из них 6 «бляшек» испытуемой культуры, 4 – контрольного штамма. Если материала мало – засевают 6 контрольных и 4 – испытуемых. Учет результатов – через 18-24 и 48 ч роста. Следует иметь ввиду, что преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Критерий оценки специфичности – слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного 4 штамма. Специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 ч. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции. Оценка результатов 1. Культуры являются токсигенными, если, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. 2. Культуры являются нетоксигенными, если: Линии преципитации у культуры отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма; Линии преципитации не могут сливаться со специфическими линиями преципитации у контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии); Линии преципитации у культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма; Линии преципитации у культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма При использовании очищенного антитоксина неспецифические линии не образуются. Культуры 1 и 2 – нетоксигенные коринебактерии дифтерии, 3-6 - токсигенные Таким образом, выделенный микроорганизм является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами, определенным спектром ферментативной активности (расщепление глюкозы, крахмала, отсутствие разложения сахарозы, наличие фермента цистиназы, отсутствие фермента уреазы) и характерными морфолого-культуральными признаками (образование колоний черного или серого цвета на кровяно-теллуритовых средах, с учетом (при необходимости) морфологии клеток — полиморфные, не образующие спор палочки). 5 Возбудитель коклюша К роду бордетелл относятся Bordetella pertussis (возбудитель коклюша), Bordetella parapertussis (возбудитель паракоклюша) — бактерии 3-й группы патогенности и Bordetella bronchiseptica, которые иногда вызывают острые воспалительные процессы в верхних дыхательных путях человека (чаще профессиональное заболевание). Из-за большого числа стертых форм и сходства симптомов этих заболеваний особую значимость в клинической диагностике приобретают лабораторные методы исследования. «Золотым стандартом» в диагностике является выделение и идентификация возбудителя. Бактериологическое исследование. При бактериологической диагностике коклюша и паракоклюша производят посев мокроты методом «кашлевых пластинок». Для этого в момент приступа кашля перед ртом больного на расстоянии 8—12 см помещают открытую чашку Петри с питательной средой (картофельно-глицериновый агар по Борде, молочно-кровяной или казеиново-угольный агар) и выдерживают в течение 6 — 8 кашлевых толчков. Чашку закрывают и помещают в термостат при 37 оС. Если кашель отсутствует, отделяемое слизистой оболочки с задней стенки глотки собирают клювовидным тампоном через рот или тампоном через нижние носовые ходы и сеют на чашки с указанными выше питательными средами. При взятии материала следует избегать попадания на тампон материала (микрофлоры) со слизистой оболочки щек, языка, миндалин (для этого используют шпатель). Следует учитывать также, что на сухом ватном тампоне бордетеллы быстро отмирают в результате высушивания и действия токсичных для них компонентов ваты. Если нет возможности немедленно посеять материал, его берут тампоном, смоченным в ИХН. Материал доставляют в лабораторию как можно быстрее и засевают на селективные среды в течение 2 ч после взятия. При посеве взятый тампоном материал тщательно растирают по поверхности агара (от периферии к центру чашки) для получения хорошо изолированных колоний. Такое исследование проводят дважды. Наибольшая высеваемость приходится на первую неделю болезни, затем количество положительных результатов уменьшается. Картофельно-глицериновый агар по Борде. Сварить 100 г мелко нарезанного картофеля с 200 мл 4%-го глицерина; растворить 5 г агара в 150 мл 0,6%-го хлорида натрия; к 150 мл агара прибавить 50 мл отвара и стерилизовать. Накануне посева расплавить и остудить до 50 °С среду и прибавить 30 — 50% дефибрированной крови кролика. Для подавления сопутствующей флоры в готовую среду рекомендуют добавлять 15 — 25 ЕД пенициллина. Мазки из клинического материала или изолированных колоний для индикации возбудителя можно обрабатывать специфическими люминесцирующими сыворотками (прямая РИФ). Ответ получают через 2 —6 ч. Хорошие результаты дает индикация нуклеиновых кислот возбудителей коклюша и паракоклюша с помощью ПЦР. На 3 — 5-е сут после посева на агаре появляются типичные мелкие колонии В. pertussis — выпуклые, влажные, блестящие, серые, напоминающие капли ртути. Колонии паракоклюшных бордетелл несколько крупнее. Из колоний делают мазки и окрашивают их по Граму. Возбудитель коклюша имеет вид мелких овоидных грамотрицательных палочек. При положительном результате остатки колоний используют для проведения РА на стекле с коклюшной и паракоклюшной сыворотками, разведенными 1:10. Затем выделяют чистую культуру и идентифицируют ее по ряду признаков. Типирование возбудителя проводят в РА на стекле с факторными (монорецепторными) диагностическими сыворотками. Серологическое исследование. Серодиагностику проводят при отрицательных результатах других исследований. Для этого начиная со 2 —3-й недели заболевания можно исследовать сыворотку крови в РСК или РА. В связи с массовым проведением прививок, приводящих к появлению в крови здоровых людей специфических антител, необходимо исследовать парные сыворотки. Нарастание титра антител в динамике заболевания подтверждает диагноз. Антигеном в серологических реакциях служит взвесь живых культур бордетелл. В качестве дополнительного контроля рекомендуется при проведении реакций использовать коклюшную и паракоклюшную иммунные сыворотки. Диагностическим титром у непривитых и ранее не болевших считается разведение сыворотки 1: 80. Наиболее чувствительной и удобной для выявления коклюша является РНГА. Для оценки иммунологической перестройки организма детей, вакцинированных АКДС-вакциной, проводят реакцию нейтрализации антигена с коклюшным эритроцитарным антительным диагностикумом. Эта реакция более чувствительна, чем РА. 6 Дифференциально-диагностические признаки бордетелл Тест Вид микроорганизмов В. pertussis В. parapertussis В. bronchiseptica В. avium Время появления колоний, сут Размеры колоний (в мм) через 72 ч после посева Рост на МПА 3-6 2-3 1-2 1-2 1-2 2-4 2-4 2-4 - + + + Изменение цвета питательной среды Оксидаза - + - - + - + + Наличие уреазы - + + - Подвижность - - + + Восстановление нитратов в нитриты Утилизация цитрата - - + - - - + + Образование пигмента из тирозина Видовой агглютинин - + - - 1 14 12 10 Примечание. «-» — отрицательная реакция; «+» - положительная реакция. С целью серологической диагностики можно также использовать ИФА. Этот метод позволяет дифференцировать антитела, образовавшиеся в острый период заболевания от поствакцинальных. Возбудитель дегионеллеза Легионеллез — сапронозная инфекционная болезнь, передаваемая с водными аэрозолями и характеризующаяся развитием специфической пневмонии, поражением других органов и систем, а также высокой летальностью. Основной возбудитель — Legionella pneumophila — относят к микроорганизмам 2-й группы патогенности. Причиной легионеллеза могут быть и другие виды легионелл (чаще Legionella micdadei, реже Legionella bozemanii или Legionella dumoffii). Диагностика базируется на клинико-эпидемиологических данных и лабораторном исследовании. Основным методом диагностики является бактериологический (его чувствительность составляет 70 %, специфичность — 100 %). Для подтверждения диагноза используют также выявление специфических антител в сыворотке крови (серодиагностику). Ввиду тяжелого течения заболевания и часто массового характера заболеваемости применяют экспресс-диагностику. Материалом для исследования от больных людей служат мокрота, бронхолегочный аспират, кусочки из пораженных участков легких, взятые при биопсии или аутопсии, сыворотка крови, по показаниям — моча. Исследование по выделению возбудителя рекомендуется проводить сразу после взятия материала или в течение 1 ч после него. Микроскопия материала имеет невысокую диагностическую ценность, однако обнаружение в окрашенных препаратах полиморфных грамотрицательных палочек при соответствующих клинико-эпидемиологических данных позволяет заподозрить легионеллез. Бактериологическое исследование. Биопсийный и другой материал засевают на специальные среды (например, угольно-дрожжевой агар с L-цистеином и пирофосфатом железа, селективные среды с антибиотиками, шоколадный агар и др.). Питательной основой этих сред, как правило, является дрожжевой экстракт и α-кетоглютарат. Активированный уголь необходим для связывания токсических продуктов, образующихся в процессе роста культур, и оптимизации показателя поверхностного натяжения. Для придания селективных свойств в состав сред для легионелл обычно вводят 3 антибиотика (полимиксин В, анизомицин и ванко7 мицин или цефомандол), которые задерживают рост грамположительных бактерий, грибов и грамотрицательных бактерий соответственно. Посев желательно делать одновременно на селективную и неселективную среду, так как встречаются чувствительные к антибиотикам штаммы возбудителя. Засеянные чашки инкубируют во влажной атмосфере 2—14 сут при 35 °С. Наличие 2 — 5 % СО2 в атмосфере стимулирует рост легионелл. Обычно на 2 —3-и сут на плотных средах вырастают колонии легионелл. На неселективных средах они значительно мельче, чем на селективных, так как их рост могут подавлять сопутствующие микроорганизмы, особенно дрожжевые грибы. Колонии округлые ровные, под микроскопом имеют пятнистую поверхность, в косопроходящем свете дают красно-сине-зеленое свечение; для них характерна липкая консистенция («тянутся» за петлей). При идентификации и дифференциации выделенных культур учитывают их тинкториальноморфологические, антигенные и другие свойства. При окраске по Граму вместо сафранина лучше использовать фуксин (в этом случае лучше видны тонкие бледно-розовые палочки). Возбудители легионеллеза, как правило, не дают флюоресценции при облучении длинноволновым ультрафиолетом, подвижны. В отличие от других возбудителей легионеллеза, L. pneumophila гидролизует гиппурат натрия, a L. micdadei не разжижает желатин и не имеет коричневого пигмента. Возбудители отличаются также по антигенной структуре и по составу жирных кислот. Идентификацию по антигенной структуре проводят чаще методом прямой РИФ с поликлональными люминесцирующими сыворотками. Определение состава жирных кислот, как и геноидентификацию, проводят только в специализированных лабораториях. Методы индикации возбудителя (экспресс-диагностика). Для быстрого обнаружения патогенных для человека легионелл в исследуемом материале применяют прямую РИФ (исследование мокроты), а также ИФА, РИА и реакцию агглютинации латекса (исследование мочи). Чувствительность этих методов составляет 25 — 90 %, специфичность — более 85 %. Результаты исследования получают через несколько часов; недостатком является ограниченное количество выявляемых серогрупп легионелл. Для выявления ДНК легионелл разработано несколько вариантов ПЦР, основанных на амплификации гена mip (кодирует поверхностный макрофаг-индуцирующий белок), гена цитолизина и ряда других маркеров. Наиболее широко применяется двухэтапная ПЦРдиагностика: вначале — предварительное определение легионелл с универсальными для семейства праймерами (чувствительность — 30 — 50 клеток в образце), а затем проводят внутривидовую идентификацию L. pneumophila с использованием высокоспецифичных праймеров. Использование ПЦР позволяет также обнаруживать легионеллы в объектах внешней среды и изучать их связи в различных микробиоценозах. Серологическое исследование. Для серодиагностики, как правило, используют непрямую РИФ (в динамике). При этом в качестве антигена используют клетки убитых нагреванием или формалином легионелл эталонного штамма. Чувствительность метода составляет 70—80%, специфичность — более 95%. Этот метод является вспомогательным ввиду перекрестных реакций и позднего нарастания титра антител. Сероконверсия обычно отмечается в течение 3 нед, но до 15 % сероконверсий приходится на срок 3 — 6 нед. Для повышения специфичности реакции исследуемую сыворотку адсорбируют взвесью перекрестно-реагирующих антигенов. ПРОВЕДЕНИЕ ЗАНЯТИЯ 1. Изучение схем микробиологического исследования при дифтерии, коклюше и легионеллезе 2. Зарисовать в тетради схему микробиологического исследования при дифтерии и таблицу дифференциально-диагностичсеких признаков бордетелл 3. Дать в тетради ответы на вопросы для самоконтроля Вопросы для самоконтроля 1. Объясните, на каком принципе основано определение токсигенности коринебактерий дифтерии 2. В чем заключается метод «кашлевых пластинок» посева мокроты при исследовании на коклюш? 3. Для чего необходим активированный уголь, добавляемый в питательные среды для исследования на легионеллез? 8
