определение токсичности комбикормов, сырья и кормовой муки

Федеральная научно-образовательная программа
« ЮНОСТЬ, НАУКА, КУЛЬТУРА»
РОССИЙСКИЙ ЗАОЧНЫЙ КОНКУРС
ИССЛЕДОВАТЕДЬСКИХ И ТВОРЧЕСКИХ РАБОТ
Номинация №1. Исследовательская работа
Направление науки: Экология промышленная
Название работы
Экологические аспекты безопасной продукции
животноводства и микотоксичность кормов
Автор работы
Долгашева Александра
Место выполнения работы
МОУ – средняя общеобразовательная школа №2
с углубленным изучением отдельных предметов, 9 класс,
г. Кинель Самарской области
Научный руководитель
Гниломедова Л.П., доцент, к.б.н.
2003 г.
2
Оглавление:
Введение .................................................................................................................................................................. 3
Основная часть ............................................................................................................................................... 3
Материал и методы ................................................................................................................................... 7
СХЕМА ЭКСПРЕС-МЕТОДА ............................................................................................................................ 9
Исследования и результаты .......................................................................................................... 10
Заключение........................................................................................................................................................ 11
Библиографический список .......................................................................................................... 12
3
Введение
Проблема экологии в сельском хозяйстве России является наиболее острой и
актуальной. По данным Института социально-экономических проблем
агропромышленного комплекса РАН в Самарской области отмечена корреляция
между количеством заболеваний у детей и факторами загрязнения окружающей
среды. Здоровье населения Самарской области зависит от качества потребляемой
продукции. Проблема производства экологически безопасной продукции
животноводства не является однозначной. Основную опасность в питании
представляют химические и биологические загрязнители.
К загрязнителям биологической природы относятся бактерии и бактериальные
токсины, микроскопические грибы, микотоксины, паразиты сельскохозяйственных
животных, вирусы. Помимо отрицательного воздействия на качество продукции
животноводства, различные токсины, поступающие в организм животных, наносят их
здоровью значительный ущерб, который проявляется в уродствах или
нежизнеспособности новорожденных, самопроизвольных абортах, иммунодефицитах
и других патологиях. Как следствие животноводство, в том числе и Самарской
области, несет значительные убытки, а население недополучает
высококачественные продукты питания.
Основная часть
В результате поражения грибами ежегодно у нас в стране при хранении
портится до 30% производимого зерна. Часто испорченное зерно используют на корм
скоту. Наибольшую опасность для организма животных представляют корма,
зараженные продуктами жизнедеятельности грибов – микотоксинами. По статистике
– из 56000 образцов различных кормов, исследованных в мире, 56% оказались
загрязнёнными микотоксинами. При хранении раньше и в большей степени
поражаются повреждённые зёрна. В опыте на повреждённых зёрнах грибы росли в
50% случаев, на неповреждённых – только 7,5%.
При хранении зернового продукта даже один вид микрогриба может
вырабатывать различные токсины, которые могут дать неожиданный эффект при
взаимодействии. Комбикорма как многокомпонентная смесь продуктов
4
растительного, животного, минерального и прочего происхождения являются
высокопитательным субстрактом для развития различных микрогрибов и бактерий.
Поэтому комбикорм может одновременно содержать микотоксины, бактериальные
токсины, токсины жизнедеятельности амбарных вредителей, продукты окисления
жиров, тяжелые металлы и многое другое. Микотоксикозы регистрируются в течение
всего года: одни проявляются в стойловый период, другие – пастбищный.
По месту образования грибы подразделяются на две группы:
Первая – так называемые складские грибы. Это плесени хранения,
неспособные поражать вегетирующие растения, попадающие в зерновые и грубые
корма главным образом в период их уборки, но интенсивно развивающиеся в массе
корма при нарушении режимов хранения.
Ко второй группе относятся полевые грибы. Поражают они растения в период
их вегетации, являются факультативными паразитами, способными при
благоприятных условиях к дальнейшему развитию при хранении корма. Эти грибы
включают виды рода Fusarium, токсины которых наиболее опасны для животных.
. Распространенность плесневых грибов очень велика из-за высокой
устойчивости спор. К наиболее важным факторам, благоприятствующим росту
грибов и образованию токсинов, можно отнести: температуру среды, относительно
высокую влажность воздуха, тип субстрата и продолжительность хранения.
Влажность воздуха или субстрата, необходимая для роста разных видов грибов,
неодинакова. Так, при влажности субстрата более 20% преобладает рост грибов
рода Fusarium, Alternaria, Cladosporium, при влажности 13 –20% - Aspergillus и Penicillium, однако при влажности 10% грибы обычно не растут. Но, А.flavus, например, на
семенах масличных культур растёт и образует афлатоксин даже при влажности 89%. Это указывает на то, что семена масличных культур, содержащие повышенное
количество липидов, более подвержены загрязнению афлатоксинами. С
увеличением влажности рост гриба и выработка афлатоксина усиливаются. Так,
например, только один плеснеобразующий гриб может продуцировать до 12 видов
афлатоксинов, что завит от конкретных условий продуцирования (влажности и
температуры).
Если гриб начал расти, дальнейший процесс не зависит от влажности среды (
рост не останавливается). Другим фактором, от которого зависят рост грибов и
образование токсинов, является температура. Как правило, грибы хорошо растут при
5
+250 – 350С. Многие виды Fusarium способны переносить низкие температуры.
Плесневые грибы – аэробы, но они нуждаются всего в 1% кислорода, содержание
углекислоты в воздухе равное 20%, задерживает их рост.
По действию на организмы микотоксины подразделяют на 3 группы.
К I группе относят токсины, вызывающие поражение печени, почек, селезёнки
(афлафтоксины, рубротоксины, цитринин).
Ко II группе: - поражающие нервную, кровеносную и воспроизводительную
системы (зеараленон, Т-2, трихотецены, алкалоиды, спорыньи). К III группе –
микотоксины, с недостаточно изученным или особым действием на организм
(аскладиол, цитохолазин).
Такие микотоксины подразделяются на группы по первично поражаемому
органу или патологоанатомическому признаку – на гепатотоксины, нефротоксины,
нейротоксины, дерматонекротические, треморгены и др. Многие микотоксины не
обладают ярко выраженным специфическим действием на организм. При любом
микотоксикозе могут отмечаться плохая поедаемость корма, угнетённое состояние,
понижение прироста, изменение температуры тела, понос, нервные расстройства.
При хроническом микотоксикозе, т.е. в результате длительного потребления малых
доз микотоксина проявляются их канцерогенные, мутагенные и тератогенные
эффекты. Это относится к наиболее часто определяющимся афлатоксинам.
Афлатоксин концентрируется в ядре клетки и связывается с ДНК. Он
ингибирует РНК – полимеразу, синтез информационной РНК и в целом синтез белка,
что обуславливает плохое усвоение питательных веществ корма (из-за уменьшения
активности ферментов поджелудочной железы). В результате уменьшается
продуктивность.
Афлатоксины уменьшают иммуногенную способность организма животного,
понижают специфическую устойчивость к инфекционным болезням (дизентерии,
болезни Гамборо, возбудитель маститов).
Увеличивают подверженность стрессам, нарушают механизм местного
иммунитета в кишечнике. Афлатоксины нарушают жировой обмен, препятствуют
усвоению жиров в кишечнике. С одной стороны они препятствуют усвоению жиров в
кишечнике и они выводятся с фекалиями, что уменьшает количество жира в туше, а с
другой – способствует накоплению жиров в клетках печени, что влечёт развитие
жировой дистрофии. Афлатоксины увеличивают хрупкость капилляров, снижают
6
прочность и целостность тканей, что объясняет частые кровоизлияния при
афлатоксикозах. Афлатоксины подавляют воспроизводительную функцию. Также
повреждаются нервная и мочевыводящая система, нарушается процесс
минерализации костей, особенно у птиц.
В токсикологии, в том числе и микотоксикологии, часто наблюдается эффект
синергического действия токсинов, при котором совместное действие токсинов резко
усиливается, вызывая отход птицы и сельскохозяйственных животных. Совместное
действие токсинов предугадать очень сложно, так как оно зависит не только от
сочетания отдельных видов токсинов, но и от их концентрации, причем эти факторы
никогда не повторяются.
При хроническом поступлении экотоксинов в организм животного, они
накапливаться в тканях и органах. Присутствие даже остаточных количеств
микотоксинов в продуктах животноводства представляют потенциальную угрозу для
здоровья людей, так как попадая с продуктами питания в организм могут оказывать
канцерогенное и тератогенное воздействие.
Хотя качество продуктов исследуется методами санитарно- ветеринарной
экспертизы, однако целесообразно контролировать поступление и миграцию
ксенобиотиков по всем звеньям биологических цепей ( почва- растения- животныечеловек ).
Учитывая данные анализа и клиническую картину, эпизоотические сведения
делаются выводы о безопасности агропродукции. Окончательно выводы делаются
на
основании
комплекса
лабораторных
исследований:
органолептического,
микроскопического, токсикологического, микологического анализов поражённых
кормов.
Органолептический анализ не всегда дает возможность определить
доброкачественность корма. Часто пораженные токсическими грибами корма не
имеют признаков порчи, то есть по внешнему виду не отличаются от
доброкачественных. Даже после термообработки и гранулирования, становясь почти
стерильными, они могут содержать термостабильные токсины микрогрибов,
бактерий, таким образом вызывая отравление животных и птицы.
Как же выявить наличие токсинов в кормах и комбикормах?
Проще всего скормить образец комбикорма ограниченной группе животных и
птиц, для которых эти корма предназначены, но это дорого и долго. Поэтому
7
используют модельные биологические объекты (тест-организмы), ответные реакции
которых откалиброваны по объектам. Для каждого тест-организма разработана своя
методика биоанализа:
1.метод на рыбках-гуппи.
2.кожная проба на кролике, осуществляемая при разноречивости результатов
3.метод скармливания лабораторным животным
4.метод использования простейших
Материал и методы
Определение качества кормов для крупного рогатого скота проводилось в
лаборатории животноводства зооинженерного факультета Самарской
Государственной сельскохозяйственной академии. Так же моделировались факторы
способствующие появлению микотоксинов в комбикормах.
Работа проводилась в соответствии с ГОСТом 13496.7 –92 « Зерно фуражное.
Продукты его переработки, комбикорма». Методы определения токсичности.
Анализ начинался с органолептического исследования образцов ( оценивались цвет,
запах, консистенция, т.д.).
Определялась токсичность комбикормов и кормовых добавок по следующей схеме:
Таблица1
Определялась токсичность комбикормов и кормовых добавок
№ образца
образец
1
Комбикорм К60
2
Комбикорм К60 +гороховая мука
3
Комбикорм К60+ дрожжи кормовые
Все образцы поместили в условия повышенной влажности на 3 суток.
Затем проведен анализ образцов для оценки степени токсичности в зависимости от
добавок.
Экспресс-метод определения токсичности кормов
Экспресс-методы биотестирования, требуют для исполнения нескольких часов.
Тест-организмами являются одноклеточные простейшие – инфузории стилонихии.
Инфузории
содержат
ряд
ферментов,
присутствующих
также
в
клетках
многоклеточных, в том числе и теплокровных животных, но не имеют сложных
защитных буферных систем, как у теплокровных животных или рыб. Использование
8
инфузорий объясняется легкостью введения кормового продукта внутрь клетки. Для
этого
необходимо
приготовить
мелкодисперсную
водную
взвесь
продукта
определенной концентрации и поместить в нее инфузории. У инфузорий отсутствует
избирательная пищевая способность, они поглощают все присутствующие в воде
мелкодисперсные частицы, в том числе и токсичные. Попадая внутрь организма,
токсины при достижении действующей дозы могут вызывать обездвиживание
инфузорий и их гибель (лизис).
Экспресс-метод определения токсичности кормов с использованием
простейших начинается с извлечения ацетоном из кормовой муки, сырья или
гранулированных комбикормов различных фракций токсических веществ. Затем
полученным экстрактом воздействуют на простейшие микроорганизмы. Из
простейших в настоящее время все чаще используются инфузории-стелонихии.
Для исследования применяют блок луночных микроаквариумов, сделанные
из пластин органического стекла. Анализ одного образца идет в пяти повторностях.
Пересадку инфузорий и их подсчет ведется под бинокуляром увеличени 2x8.
Параллельно, с целью определения качества раствора ацетон- воды проводят
контрольный опыт: в пять малых микроаквариумов, куда помещают то же количество
инфузорий и доводят их до половины объема( 1% раствором ацетона). Численность
инфузорий в каждой лунке регистрируется в журнале.
Для биотестирования используют суточную культуру инфузорий. Она
получается при пересадке простейших за сутки до постановки опыта на новую среду
с кормом. Инфузории-стилонихии культивируют при температуре +24-26 0С.
В суточную культуру инфузорий, распределенную по лункам, вводят экстракт
образца. Пробы корма готовится по следующей технологии: 10 грамм измельченного
корма заливается ацетоном и экстрагируется при энергичном встряхивании в течение
2-х минут. Пробирка с экстрактом помещается в штатив и отстаивается 15 минут.
Экстракт в количестве 0,5 мл отбирается микродозатором и переносится в
химический стакан с 40 мл дистиллированной стерильной воды. Проба-экстракта
вводится в лунки микроаквариума с инфузориями. Через час наблюдается реакция
простейших.
9
СХЕМА ЭКСПРЕС-МЕТОДА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ КОМБИКОРМОВ, СЫРЬЯ И КОРМОВОЙ МУКИ
ИЗМЕЛЬЧЕНИЕ ПРОБЫ

10 Г ОБРАЗЦА + 15 МЛ АЦЕТОНА ВСТРЯХИВАТЬ В ТЕЧЕНИЕ 2 МИНУТ

ОТСТАИВАТЬ В ТЕЧЕНИЕ 15 МИНУТ

0,5 МЛ АЦЕТОНОВОГО ЭКСТРАКТА + 40 МЛ СТИРИЛЬНОЙ
ДИСТИЛИРОВАННОЙ ВОДЫ, ПЕРЕМЕШАТЬ

ПОМЕСТИТЬ ИНФУЗОРИИ В БЛОК ЛУНОЧНЫХ
МИКРОАКВАРИУМОВ ПО 10 - 20 ШТ В КАЖДУЮ ЛУНКУ

В КАЖДУЮ ЛУНКУ ДОБАВИТЬ 10 КАПЕЛЬ ЭКСТРАКТА

ОПРЕДЕЛИТЬ ВЫЖИВАЕМОСТЬ ИНФУЗОРИЙ ЧЕРЕЗ 1 ЧАС ЭКСПОЗИЦИИ

РАССЧИТАТЬ ЧИСЛЕННОСТЬ ИНФУЗОРИИ ПО ФОРМУЛЕ
N = N2 N1 . 100%
ГДЕ N2 -- ОБЩАЯ ЧИСЛЕННОСТЬ ИНФУЗОРИЙ В КОНЦЕ ОПЫТА
N1 - ОБЩАЯ ЧИСЛЕННОСТЬ ИНФУЗОРИЙ В НАЧАЛЕ ОПЫТА
Определение токсичности по кожной пробе на кроликах до настоящего времени
остается основным способом.
Сущность метода заключается в постановке кожной пробы на кроликах,
основанной на дерматологическом действии микотоксинов извлеченных из кормов.
На выстриженный участок кожи кролика стеклянной лопаткой наносят экстракт.
Небольшой участок кожи остается свободным от экстракта для контроля.
Наблюдения за реакцией начинается на следующий день и продолжается в течение
10
3-5 сут. Токсичность исследуемых образцов определяют по наличию
воспалительного процесс в месте нанесения экстракта.
Исследования и результаты
Первоначально образцы проанализировали на токсичность экспресс-методом
на инфузориях стилонихиях. Выживаемость инфузорий составила 98%, что
соответствует степени - нетоксичный продукт.
В комбикорм ввели в количестве 25% кормовые добавки, повышающие
питательность корма. Все образцы поместили в условия повышенной влажности при
комнатной температуре на 3 суток.
Органолептический анализ образцов показал, что изменилась консистенция –
увеличилась комковатость, появился запах плесени, визуально наблюдалась
заплесневелость.
Экспресс-метод выявил токсичность образцов различной степени. Результаты
оформлены в таблице 2:
Табл.2
Определение степени токсичности исследуемых образцов
№
образец
Выживаемость
Степень
инфузорий %
токсичности
1
Комбикорм К60
54%
Слабо токсичный
2
Комбикорм К60 +гороховая мука
33%
Токсичный
3
Комбикорм К60+ дрожжи кормовые
40%
токсичный
Токсичность подтвердилась по кожной пробе на кроликах. Через 3 суток после
нанесения экстракта на кожу кроликов, у животных отмечалось покраснение (
гиперемия) участка кожи, повысилась температура тела, кролики отказывались от
пищи. Через 5 суток наблюдалось утолщение кожи и шелушение участка.
Анализ результатов показывает, что повышенная влажность и дополнительные
добавки ( вводимые с целью увеличения питательности) благоприятствуют развитию
плесневых грибов. Выделяемые микроскопическими грибами метаболиты
формируют токсичность агропродуктов, что делает их непригодными к применению
как кормов.
11
Отмечена прямая зависимость между питательностью кормов и степенью
токсичности образцов. Несоблюдение условий хранения ускоряет процесс порчи.
Заключение
Проведенные исследования показывают необходимость регулярного,
достоверного микотоксикологического анализа кормов на безопасность их для с/х
животных, что в свою очередь предопределяет экологическую чистоту продуктов
животноводства.
Экспресс-метод определения токсичности и безопасности кормового сырья с
использованием простейших имеет ряд преимуществ:
1. возможность получения ответа на вопрос о токсичности вещества быстро – в
течение 2-х часов,
2.относительную простоту культивирования тест-организмов,
3. небольшие экономические затраты на проведение анализа,
4. достоверность полученных результатов.
12
Библиографический список
1. Агроэкология / В.А. Черников, др. М.: Колос, 2000,-536с.
2. Аграрная Россия. Научно-производственный журнал №5. 2000
3. Асонов Н.Р. Микробиология. –М.: Агропромиздат, 1989.- 351с.
4. Ветеринарная микробиология и иммунология / Н.А.Радчук, и др. –
М., Агропромиздат,1991.
5. Кузьмин В.В. Ветеринарная микробиология. –М.: Схлит.,1985
6. Микотоксины и микотоксикозы сельскохозяйственных животных /
под ред. С.П. Качанова. –М., 1988
7. Профилактика микотоксикозов животных / Б,Н. Хмелевский, З.П.
Пилипец и д.р. . -М.:Агропромиздат, 1985, -271с.
8. Сельскохозяйственная экология / Н.А. Уразаев, др. –М.: Колос,
2000. –304 с.
9. Экология человека. УЧ. пособие. –М.: Изд-во МНЭПУ, 2001. –440с.