Проект «Белой книги» Получение гибридом человека - продуцентов специфических моноклональных антител.
advertisement
Номинация: Проект «Белой книги» Тема проекта: Получение гибридом человека - продуцентов специфических моноклональных антител. Организация: Общество с ограниченной ответственностью «Пронко» Руководитель проекта: Афанасьев Виктор Михайлович, Ген. директор ООО «Пронко», к.б.н. Аннотация Начало современного этапа использования моноклональных антител в клинической онкологии было положено работами D.Pressman, L.Korngol. Авторами была обоснована идея использования антител для воздействия на опухолевые клетки, в том числе определения локализации метастазов остеогенной саркомы. Широкое использование этого метода было затруднено в связи с технологическими трудностями в получении моноклональных антител в достаточных количествах. Широко масштабное применение антител стало возможным только после революционных работ G. Kohler и C. Milstein, которые разработали в 1975 году гибридомную технологию получения моноклональных антител. И уже в 1979 г. L. Nadler. были использованы моноклональные антитела для лечения больных пациентов. На Рисунке 1 представлена схема получения моноклональных антител мыши. Так как применение моноклональных антител мыши в терапии заболеваний человека ограниченно (мышиные антитела являются чужеродным белком для организма человека), то аналогичный методологический подход был применен для получения моноклональных антител человека. В качестве исходных клеток – продуцентов специфических антител – использовались лимфоциты периферической крови пациентов, имеющих различные заболевания, в том числе и рак. Эти лимфоциты гибридизовали с клетками линии перманентно растущей плазмацитомы мыши или человека. Полученные гибридные клетки (гибридомы) клонировали и отбирали клоны обладающие двумя нужными свойствами: они могли беспредельно долго расти на питательной среде, сохраняя при этом способность синтезировать и секретировать в эту среду специфические антитела. Эти антитела были способны связываться с раковыми клетками или с инфекционными агентами (в зависимости от какого больного брались лимфоциты), и при введении в организм пациента активировали защитные механизмы иммунной системы. Не смотря на то, что базовые технологии получения моноклональных антител были созданы многие годы назад, с ростом рынка компании все больше модифицировали эти методы. К настоящему времени многим зарубежным компаниям удалось получить продуценты антител, обладающие стабильными биомедицинскими характеристиками и выгодными технологическими свойствами, позволяющими создать на их основе крупномасштабное производство лекарственных препаратов (Janice M. Reichert, Antibody-based therapeutics to watch in 2011. mAbs 3:1, 76-99; January/February 2011). На сегодняшний день рынок моноклональных антител является наиболее быстро развивающимся сегментом фармацевтической индустрии. В 2007 году терапевтические моноклональные антитела принесли биотехнологическим компаниям США больше 26 миллиардов долларов, основная часть которых приходилась на терапию онкологических и аутоиммунных заболеваний. По данным экономических экспертов, объем продаж лекарственных препаратов, основанных на моноклональных антителах человека, каждый год растет более чем на 20%. К сожалению, можно сказать, что на рынке лекарственных препаратов этого сегмента фарминдустрии, отечественные препараты практически отсутствуют. Моноклональные антитела, полученные с помощью гибридом человека по своей структуре и биохимическим характеристикам максимально идентичны природным антителам человека. Это ставит их на первое место в пассивной иммунотерапии различных заболеваний человека, если сравнивать данные антитела с различными химерными и гуманизированными антительными аналогами, полученными методами генной инженерии. В представляемом проекте предлагается освоить технологию получения гибридом человека - продуцентов специфических моноклональных антител, и разработать на их основе производство отечественных лекарственных препаратов, пригодных для лечения широко распространенных заболеваний человека (рак, вирусные и аутоиммунные заболевания). На сегодняшний день многие вышеперечисленные заболевания не поддаются эффективному излечению методами и медикаментозными средствами традиционной терапии. Применение лекарственных средств на основе моноклональных антител человека в таких случаях является безальтернативным способом добиться выздоровления больного и возврата его к полноценной жизни. антиген клетки селезенки клетки плазмоцитомы с HGPRT слияние культивирование на HAT среде и отбор растущих клонов клонирование позитивных клонов тестирование питательной среды на присутствие специфических антител рост клеток гибридом сбор и очистка специфических моноклональных антител Рисунок 1 Информация о заявителе Проект подается от ООО «Пронко». Юридический адрес: 142380 Московская область, Чеховский р-н, п. Любучаны, ул. Спортивная 11, к. 59 E-mail адрес: pronco2000@gmail.com Web site в интернете находится в стадии разработки. Генеральный директор ООО «Пронко»: Афанасьев Виктор Михайлович, Тел. 89263001221 Основное направление деятельности ООО «Пронко» - разработка научноисследовательских и технологических проектов в области медико-биологической и фармакологической индустрии. Сотрудники ООО «Пронко» принимали участие в различных проектах, поддержанных РФФИ (№ 06-04-08335, «Получение и исследование новых блокаторов фактора некроза опухолей альфа на основе моноклональных антител и мутантных форм ФНО») и зарубежными фондами. ООО «Пронко» было создано в конце 2010 года . В настоящее время в деятельности организации принимает участие 5 человек. Из них один доктор биологических наук (спец. иммунология и аллергология), кандидат биологических наук (спец. иммунология и аллергология), кандидат медицинских наук, кандидат химических наук. Руководитель проекта: Афанасьев Виктор Михацлович, к.б.н., ген. директор ООО «Пронко», тел. 89263001221. e-mail: pronco2000@gmail.com Основные публикации рук. проекта: 1.V. Afanassiev, V. Hanemann and S. Wölfl. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose film. Nucleic Acid Research, 2000, Vol. 28, No.12.(e66) 2.V. Afanassiev, M. Sefton, Th. Anantachaiyong, G.Barker, R. Walmsley, S. Wölfl. Application of yeast cells transformed with GFP expression constructs containing the RAD54 or RNR2 promoter as a test for the genotoxic potential of chemical substances. - Mutation Research, 464, 2000, pp 297-308. 3. V. Afanassiev, J. Trooppmair, M. Schuler, Ch. Weber, and U.R. Rapp. Production and characterization of monoclonal antibodies against human BAD protein. - Hybridoma, 1998, V. 17, N.4,pp.383-387. 4. Verbitsky,M.Sh., Fidler,R., Matevosyan,K.Sh., Serebryakov,S.N., Tsomik, M.I., Iglin, G.V., Goroshko,O.G., Romanova,L.F., Bitkulova,I.I., Afanasyev, V.M. Monoclonal antibodies (Mab) to antigens and hormones of the reproductive system: usage in reproductive immunology.Immunology (Russia), 1994, N4, pp.26-30. 5. I.L. Goldman, L.K. Ernst, P.A. Gogolevskii, V.M. Afanasyev et al. Exploration of expression of the gene responsible for cattle growth hormone in rabbits transgenic by mMT1/bGHatt construction containing MAR (Matrix Attachment Region ) element.- Russian Agricultural Sciences. 1993. No1. pp.58-72. 6. M.Sh. Verbitsky, V.M. Afanasyev, G. Iglin, R. Fiedler, N. Kochenova. Production of highly purified specific Zona pellucida antigen.- Journal of Immunology and Immunopharmacology. 1992. VXII, N 2, p. 150. 7. V.M. Afanasyev, V.S.Khlebnikov, S.S.Vetchinin, L.A.Denisov. Application of Monoclonal Antibodies for Testing and Purification of Recombinant TNF- and Human gamma-Interpheron. - Proceeding of The 1th All Union Congress of Immunology, Sochy, 1989,V 1,p.135. 8. N.I.Rasskazov, V.M. Afanasyev, O.V.Rubalskij, V.S.Khlebnikov. Contain of Factor of Necrosis of Tumors in Blood of Patients with Basaliomas. Proceeding of The 1st All Union Congress of Dermatologists and Venerologists, Cheljbinsk,1989, p.242. 9.V.M. Afanasyev, S.A.Chuvpilo, R.L.Turezkaj, V.G. Korobko, S.A.Nedospasov. Strain of Hybrid Cultivated Cells of Animals MUS MUSCULUS, Used for Producing of Monoclonal Antibodies to Factor of Necrosis of Human Tumors.- The copyright Certificate of the USSR N 4403361/30- 13(048932) from April 1,1988. 10.V.M. Afanasyev, V.S.Khlebnikov. Purification of Recombinant Factor of Necrosis of Human Tumors on Immunosorbent, Obtained on The Basis of Monoclonal Antibodies.- Proceeding of The 1th All Union Conference for Preparative Chromatography, Leningrad, 1988,p.21. 11.V.M. Afanasyev, S.S. Vetchinin, V.S. Khlebnikov. Obtaining of Hybridoma Producing of Monoclonal Antibodies, Specific to Recombinant Factor of Necrosis of Human Tumors.Proceeding of The 5th Conference of Young Scientists of Socialistic Countries for Bioorganic Chemistry - Puschino, 1988, p.127. 12.V.M. Afanasyev, S.S. Vetchinin. Production of Monoclonal Antibodies to Recombinant Human Interpheron . Proceedings of The 5th Conference of Young Scientists of Socialistic Countries for Bioorganic Chemistry - Puschino, 1988, p.127. 13.V.M. Afanasyev, S.S.Vetchinin, V.S. Khlebnikov. Strain of Hybrid Cultivated Cells of Animals MUS MUSCULUS, Used for Producing of Monoclonal Antibodies to LPS of FRANCISELLA TULARENSIS.- The copyright Certificate of the USSR N 3164014/162/116 from January 2, 1987. Современное состояние исследований и разработок в области реализации проекта. Новизна предлагаемого подхода по сравнению с известными. Современные технологии получения моноклональных антител человека используют несколько основных методологических подходов, а именно: получение гибридом – прдуцентов специфических антител [1,2,3]; использование трансгенных животных (мыши или крысы), имеющих экспрессирующийся локус иммуноглобулиновых генов человека [4,5]; получение так называемых гуманизированных моноклональных антител, путем создания генно-инженерных конструкций, кодирующих легкие и тяжелые цепи молекулы антитела, с последующей экспрессией этих конструкций в клетках эукариотических линий (CHO, HEK293, COS) [6,7,8]. Все эти подходы, в основном, хорошо разработаны и используются зарубежными биотехнологическими компаниями. В России данные технологии практически не используются или находятся в начальной стадии развития. Белковые молекулы антител имеют сложную трехмерную структуру и в процессе сборки внутри клетки подвергаются различным пострансляционным модификациям. На Рисунке 2 представлено схематическое изображение молекулы антитела, принадлежащего к IgG классу иммуноглобулинов человека. Биосинтез таких сложных мультимерных белков, имеющих несколько полипептидных цепочек с пришитыми полисахаридными группами, предъявляет определенные требования к клеточным системам экспрессии, в которых происходит сборка и «созревание» молекул антител. В лимфоциты периферической крови человека и гибридомы, полученные с их использованием, являются природными и наиболее оптимальными клеточными системами, в которых происходит корректный биосинтез специфических моноклональных антител. Системы экспрессии, основанные на клетках микроорганизмов, дрожжей, растений и эукариот (не лимфоидной дифференцировки) не могут гарантированно обеспечить корректный синтез, сборку и пострансляционные модификации молекул антитела, что существенно снижает эффективность иммунотерапии такими белками . Рисунок 2 Нужно отметить, что создание генно-инженерными методами конструкций, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител, - достаточно трудоемкий и дорогостоящий методологический подход, отдельные этапы которого запатентованы (создание фаговых библиотек антигенсвязывающих участков антител). Использование гибридомной технологии получения моноклональных антител позволяет обойти эти препятствия. К сожалению, в России отсутствуют трансгенные животные по локусу иммуноглобулиновых генов человека. Поэтому использование данного подхода для производства моноклональных антител требует покупки лицензии на использование таких животных или предварительной многолетней технологической работы по их созданию. Разрабатываемые в последние годы системы иммунизации in vitro, используемые клетки периферической крови человека [9], позволяют существенно упростить гибридомную технологию получения антител, так как устраняется необходимость иметь больного (или вакцинированного) пациента – источник В лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела. Сотрудники ООО «Пронко» имеют большой опыт по получению гибридом – продуцентов моноклональных антител мыши. К настоящему времени освоены методы выделения клеток иммунной системы из периферической крови человека для разработки системы иммунизации in vitro. Ссылки 1,Brian Drozdowski et al. 2010.Generation and characterization of high affinity human monoclonal antibodies that neutralize staphylococcal enterotoxin B Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, V.8 pp1-:9 2 Scott K. Dessain 2004. High efficiency creation of human monoclonal antibody-producing hybridomas Journal of Immunological Methods V.291 pp109– 122 3 Jian Li et al. et al.2006. Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology PNAS. vol. 103. pp.3557–3562 4 Teresa J. Broering et al. 2009 Identification and Characterization of Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibodies Directed against the E2 Envelope Glycoprotein of Hepatitis C Virus J. Virol. doi:10.1128/JVI.01138-09 5. Lonberg, N.2005 Human antibodies from transgenic animals. Nature Biotech. V.23, 1117– 1125 . 6. Tsuguo Kubota et al..2009 Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions. ..Cancer Sci. vol. 100. pp1567-1572 7 M. Webchof et al. 1995.Amino acid sequence based PCR primers for amplification of rearranged human heavy and light chain immunoglobulin variable region genes Journal of Immunological Methods V.179,pp 203-214 8 Sergey M. Kipriyanov et al.2004. Generation and Production of Engineered Antibodies MOLECULAR BIOTECHNOLOGY Volume 26, pp 39-60 9. Makiko Yamashita et al.2007 Recent advances in the generation of human monoclonal antibody Cytotechnology V.55:pp55–60 Сущность предлагаемой разработки В процессе выполнения предлагаемого проекта будет разработана технология получения гибридом человека – продуцентов специфических моноклональных антител. Для получения первоначального источника специфических антител – В лимфоцитов - будет разработана система иммунизации in vitro, основанная на клетках периферической крови человека. В дальнейшем, на основе очищенных и охарактеризованных препаратов антител, будет разработана технология крупномасштабного производства лекарственных субстанций. Будет организованы предклинические и клинические испытания полученных субстанций, что позволит в дальнейшем создавать лекарственные формы антительных препаратов, пригодных для иммунотерапии соответствующих заболеваний человека. Применение таких лекарственных средств отечественного производства позволит существенно повысить эффективность лечения распространенных заболеваний и значительно увеличит среднюю продолжительность жизни населения. Права на интеллектуальную собственность Полученные в ходе выполнения проекта гибридомные линии клеток – продуценты специфических антител - будут запатентованы на территории Российской Федерации. В случае необходимости, данные линии могут быть запатентованы на территории других государств, что обеспечит защиту авторских прав участников проекта и патентообладателей на использование моноклональных антител в дальнейшем медикобиологическом применении. Конкурентные преимущества К настоящему времени многим зарубежным компаниям удалось получить продуценты антител, обладающие стабильными биомедицинскими характеристиками и выгодными технологическими свойствами, позволяющими создать на их основе крупномасштабное производство лекарственных препаратов (Janice M. Reichert, Antibody-based therapeutics to watch in 2011. mAbs 3:1, 76-99; January/February 2011). Однако, большинство разработанных препаратов основано на рекомбинантных белках, полученных методами генной инженерии. При этом часто используются клеточные системы экспрессии (синтеза и сборки рекомбинантных белков) отличные от В лимфоцитов человека. Таким образом, не смотря на то, что подобные белки обладают нужной специфичностью, по своим биохимическим характеристикам и структуре они отличаются от природных антител человека. Это существенно снижает их эффективность в иммунотерапии, так как может вызывать аллергические реакции и быстрый антительный ответ, блокирующий применяемый препарат. Моноклональные антитела, полученные с помощью гибридом человека по своей структуре и биохимическим характеристикам максимально идентичны природным антителам человека. Это ставит их на первое место в пассивной иммунотерапии различных заболеваний человека, если сравнивать данные антитела с различными химерными и гуманизированными антительными аналогами, полученными методами генной инженерии. Рынок сбыта Потенциальными потребителями лекарственных препаратов на основе моноклональных антител человека будут медицинские клиники, специализированные клиники и больные, которым будет назначен курс иммунотерапии соответствующего заболевания. Не исключено использование полученных препаратов и зарубежными медицинскими учреждениями. В зависимости от специфичности антител, входящих в состав лекарственного препарата, иммунотерапия будет эффективно применяться для лечения широкого спектра онкологических заболеваний, инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии, аутоиммунных заболеваний. На сегодняшний день многие вышеперечисленные заболевания не поддаются эффективному излечению методами и медикаментозными средствами традиционной терапии. Применение лекарственных средств на основе моноклональных антител человека в таких случаях является безальтернативным способом добиться выздоровления больного и возврата его к полноценной жизни. Порядок коммерциализации результатов разработки. После получения гибридом человека – продуцентов специфических моноклональных антител - будут проведены предклинические и клинические исследования очищенных белков с целью установления их эффективности в иммунотерапии соответствующих заболеваний. В дальнейшем, планируется разработка технологии крупномасштабного производства очищенного белка антител, обладающего эффективными иммунотерапевтическими характеристиками. Для выполнения этой задачи планируются совместные исследования с учреждениями или компаниями, имеющими соответствующее оборудование и опыт. Планируются работы по получению документов, разрешающих применение субстанции очищенного белка антител в клинике. После получения соответствующих документов, будут организованы работы по разработке лекарственной формы соответствующих специфических моноклональных антител. Для выполнения этой задачи руководство ООО «Пронко» планирует привлечение отечественной или зарубежной компании, имеющей опыт в данной области фарминдустрии. Организация работ. В процессе выполнения данного проекта будет создана лаборатория, обеспечивающая проведение научно-исследовательских и технологических работ в GLP формате. В случае возникновения необходимости проведения работ, выходящих за пределы возможностей ООО «Пронко», планируется совместные договорные исследования с такими компаниями, как «Биопроцесс», «Биокад» и др. В настоящее время для выполнения работ по предлагаемому проекту будут вовлечены 4 сотрудника ООО «Пронко», а именно: 1. Афанасьев Виктор Михайлович, к.б.н., спец. иммунология и аллергология. 2. Радченков Виктор Петрович, д.б.н. спец. иммунология и аллергология 3. Соболева Галина Михайловна, к.м.н., спец. медицинская микробиология 4. Логинова Татьяна Петровна, к.х.н., спец. орг. синтез. Состояние и источники инвестирования в реализацию проекта Для работы по предлагаемому проекту закуплено оборудование (~90%). Закуплены расходные материалы, реагенты и препараты (~60%), необходимые для проведения технологических разработок. Освоены методы получения и культивирования клеток человека, используемые для получения гибридом. Выбраны "мишени", против которых будут получены специфические моноклональные антитела человека. На сегодняшний день все оборудование и расходные материалы были закуплены на средства, предоставленные ООО «Пронко». Есть предварительная договоренность о дальнейшей совместной работе по данному проекту с Филиалом эксперементальной эмбриологиии репродуктивной биотехнологии ВНИТИ биологической промышленности РАСХН. Идет активный поиск инвесторов, способных оказать финансовую поддержку предлагаемого проекта. Предстоящие затраты по проекту В ближайшее время будет закуплено недостающее оборудование и расходные материалы для дальнейшего проведения научно-исследовательских и технологических разработок по данному проекту. Предполагаемые суммы затрат: 1300000 рублей. 1. Ламинарный бокс – 250000руб 2. Ридер для иммунологических планшетов (метод ELISA) – 150000руб 3. Расходные материалы (пластик, среды, сыворотки) – 150000руб 4. Накладные расходы – 150000руб. 5. Зарплата сотрудников – 600000руб
