Практикум - Мордовский государственный университет

ПРАКТИКУМ
ПО МИКРОБИОЛОГИИ
ДЛЯ СТУДЕНТОВ СПЕЦИАЛЬНОСТИ: «АГРОНОМИЯ»
2010
2
УДК 623.934 (076.5)
ББК П84
Б 431
Авторы – составители: Н.А. Замотаева
Компьютерная верстка: Н.А. Замотаева
Рецензенты:
Доцент
М.П. Наумова
кафедры
морфологии
и
физиологии
животных
Практикум по микробиологии/ Сост. Н.А. Замотаева. Саранск,
2010. 32 с.
В практикум включены задания для выполнения лабораторных работ и методические указания к ним.
Предназначен для студентов 2 курса дневного и заочного отделений специальности: «Агрономия».
Печатается по разрешению учебно-методической комиссии Аграрного
института
Мордовского
государственного
университета
им. Н.П. Огарева
3
СОДЕРЖАНИЕ
с.
Предисловие
4
Тема 1. Устройство светового микроскопа и правила работы с ним
5
Тема 2. Оборудование микробиологической лаборатории. Морфология
микроорганизмов, простой метод окрашивания
6
Тема 3. Сложные методы окрашивания микробов, окраска по Граму, по
Пешкову
9
Тема 4. Исследование микробов в живом состоянии
11
Тема 5. Методы стерилизации
12
Тема 6. Питание микроорганизмов, приготовление питательных сред 15
Тема 7. Методы микробиологического исследования почвы
18
Тема 8. Учет результатов посева почвы
21
Тема 9. Методы и техника выделения чистой культуры
22
Тема 10. Определение чувствительности почвенных микроорганизмов к
различным классам пестицидов
24
Тема 11. Азотфиксирующие клубеньковые бактерии
25
Тема 12. Определение общей биологической активности почвы по
интенсивности почвенного дыхания
26
Тема 13. Эпифитная микрофлора
26
Список использованной литературы
28
Приложения
29
4
ПРЕДИСЛОВИЕ
Микроорганизмы и микробиологические процессы играют важную
роль в плодородии почвы и питании растений. Микроорганизмы определяют биологические свойства почвы, а множественные химические и
биохимические реакции между соседствующими физиологическими
группами почвенных микробов связывают почвенные процессы в некое
единство, обладающие внутренней устойчивостью при воздействии на
нее факторов внешней среды. Трансформация органического вещества
– его синтез и разложение – определяется деятельностью растений и
микробов. В то же время растения избирательно поглощают из почвы
элементы минерального питания, а микробы минерализуют растительные остатки, превращая связанный азот и зольные элементы пищи в доступную для растений форму.
Изучение микробиологической составляющей почвы позволяет
определять направленность и интенсивность агрохимических процессов,
происходящих в пахотном слое при внесении средств химизации. Это
позволяет правильно определить дозы, сроки и способы внесения минеральных удобрений, пестицидов, а также прогнозировать различные
уровни урожайности сельскохозяйственных культур.
Данное издание способствует приобретению знаний и навыков по
указанной дисциплине, а также освоению методов изучения состава и
численности почвенного микронаселения.
5
ТЕМА 1. УСТРОЙСТВО СВЕТОВОГО МИКРОСКОПА И
ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ
Цель занятия: изучить устройство светового микроскопа, особенности работы с иммерсионной системой, рассмотреть готовые микробиологические препараты и зарисовать уведенное.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Микроскоп – это оптический прибор,
предназначенный для изучения микроорганизмов. Микробиологические
лаборатории чаще всего оснащены световыми микроскопами типа Биолам Р-1, МБР-1, МБР-3 и др.
Световой микроскоп способен давать увеличение объектов более
чем в тысячу раз. Он состоит из двух основных систем: механической и
оптической.
К механической системе относится штатив с подковообразной
или прямоугольной ножкой. К нему прикреплен подвижный столик, который может перемещаться в разных направлениях при помощи двух винтов, расположенных по бокам штатива. К верхней его части прикреплена трубка – тубус, которая передвигается вверх или вниз при помощи
винтов. Для грубой наводки служит макрометрический винт, для более
точной – микрометрический. Полный оборот микровинта перемещает
тубус на 0,1 мм. В нижней части штатива расположено револьверное
устройство с гнездами для ввинчивания объективов.
Оптическая часть микроскопа включает осветительное устройство, объективы и окуляры. К осветительному устройству относятся зеркало и конденсор, находящиеся под предметным столиком. Одна сторона зеркала плоская, другая вогнутая. Плоским зеркалом пользуются при
естественном, а вогнутом – при искусственном освещении и в отсутствии конденсора. Объектив представляет собой систему линз, заключенных в металлическую оправу и определяют оптическую мощность
микроскопа. Все объективы по способу употребления делят на сухие (когда между объективом и препаратом находится воздух) и иммерсионные
или погруженные (между объективом и препаратом находится иммерсионное масло). В качестве иммерсионного масла используют терпеновое
или кедровое масло. Сухие объективы (х7, х8, х10, х15, х20, х40) используют при увеличении от 56 до 600 раз для рассмотрения макрообъектов (гиф грибов, дрожжей и др.). При работе с иммерсионным объективом (х90) на препарат предварительно наносят каплю иммерсионного
масла, затем опускают тубус и погружают в масло объектив. Между
предметным стеклом и линзой объектива устанавливается гомогенная
среда, устраняющая возможность рассеивания лучей, что обеспечивает
хорошую видимость изучаемых микроорганизмов.
Окуляр находится в верхней части тубуса и состоит из двух линз.
Линза, обращенная к глазу, называется глазной, к объективу – собирательной. Окуляры (в зависимости от увеличения) обозначаются х10, х20.
Общее увеличение микроскопа равно показанию увеличения объектива,
6
умноженному на показание увеличение окуляра.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Порядок работы с микроскопом.
Освещение поля зрения устанавливают при малом увеличении
микроскопа с помощью зеркала и конденсора, а также регулированием
открытия диафрагмы. Настроив освещение, на предметный столик микроскопа помещают предметное стекло (препарат должен быть расположен со стороны объектива), закрепляют его зажимами и приступают к
изучению. Исследование всякого объекта следует начинать с объектива
сухой системы, дающего малое увеличение. При этом находят наиболее
прокрашенный, четкий участок препарата. Объективами с малой увеличительной способностью (х7, х8, х10, х15, х20) пользуются при рассмотрении дрожжевых клеток и плесневых грибов. При микроскопировании
более мелких объектов (бактерий и их структур) обычно употребляют
иммерсионный объектив с увеличением в 90 раз. При работе с иммерсионной системой поднимают тубус; на препарат, закрепленный на
предметном столике двумя зажимами, капают каплю кедрового масла и,
глядя сбоку, опускают макровинтом объектив в масло до соприкосновения с ним. Затем, наблюдая в микроскоп, макровинтом медленно поднимают или опускают тубус до появления в поле зрения изучаемого
объекта. В дальнейшем более точную наводку на резкость осуществляют микрометрическим винтом. По окончании работы поднимают тубус,
убирают препарат и снимают масло с объектива сначала сухой марлей,
а затем марлей, смоченной в спирте. На предметный столик помещают
сухую марлю, переводят микроскоп на объектив с малым увеличением и
опускают тубус до соприкосновения его с марлей, затем микроскоп
накрывают чехлом.
Вопросы для самоконтроля:
1. Какие части микроскопа относятся к механической системе?
2. Что относится к оптической системе?
3. Что такое иммерсионная система и для чего используют иммерсионное масло?
4. Как определить общую увеличительную способность микроскопа?
ТЕМА 2. ОБОРУДОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ.
МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГИНИЗМОВ.
ПРОСТОЙ МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ
Цель занятия: научиться готовить и окрашивать простым методом
препараты из микробных культур.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Оборудование микробиологической
лаборатории.
Для проведения лабораторных занятий используются микробиоло7
гические наборы, которые состоят из большой и малой кювет, микробиологического мостика, спиртовой горелки, двух чашек Петри, в одной
из которых лежат полоски фильтровальной бумаги, а в другой – чистые
обезжиренные предметные стекла, штатив с микробиологической петлей, спички и карандаш по стеклу (стеклограф).
Все эти предметы помещаются в большую кювету. Микробиологический мостик представляет собой две стеклянные трубочки, соединенные резиновым шлангом. Его кладут на малую кювету, для того чтобы
при окрашивании препарата предметные стекла можно было положить
на микробиологический мостик и не держать в руках. По завершении работы содержимое малой кюветы, в которую помещают все использованные материалы и растворы (спички, марлю, растворы красителей, полоски фильтровальной бумаги) выбрасывают в специальное ведро, кювету промывают водой и помещают обратно в большую. Кроме микроскопов и наборов с красителями и иммерсионным маслом, в микробиологической лаборатории имеются баночки с 10 %-ным раствором фенола, куда помещаются использованные предметные стекла. Работа в
микробиологической лаборатории требует аккуратности и четкости исполнения указаний преподавателя.
Морфология бактерий. По внешнему виду различают 3 основные
формы бактерий: шаровидные (кокки); палочковидные (бактерии, бациллы и клостридии), извитые (вибрионы, спириллы, спирохеты).
Микроорганизмы микроскопируют в живом и неживом состоянии.
Исследование микробов в живом состоянии нашло практическое применение при определении их подвижности (активности движения).
Для изучения морфологии микробов (их формы, структурных элементов), в лабораторной практике применяют их окрашивание в неживом состоянии. Неокрашенные бактерии при проходящем свете в микроскопе почти сливаются с общим фоном и становятся невидимыми. В неживом состояний микробы окрашиваются лучше. Для микроскопирования применяют различные методы окрашивания, которые требуют красителей разного цвета. В лабораторно-диагностической практике обычно используют ограниченный их набор: кристалл-, метил- или генцианвиолетовые красители, имеющие в растворе интенсивно фиолетовый
цвет, фуксин (основной), сафранин, нейтральный красный - все красного
цвета с разными оттенками, метиленовый синий - синий, малахитовая и
бриллиантовая зелень - зеленые красители.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Приготовление окрашенных препаратов. Самым распространенным методом изучения морфологии микробов является микроскопия окрашенных мазков из исследуемого материала. Для этого вначале готовят мазок, высушивают его, фиксируют, а затем окрашивают. Мазки готовят на совершенно чистых, хорошо обезжиренных предметных стеклах. Обезжиривают стекла этиловым спиртом
или прокаливают над пламенем горелки.
Приготовление мазка. Мазок готовят на предметном стекле при
8
помощи микробиологической петли или пастеровской пипетки из культур
микробов, тканей, крови, гноя, выращенных на плотной или жидкой питательной среде. Петлю нагревают до покраснения, над пламенем горелки открывают пробирку, внутрь ее вводят петлю, охлаждают, после
чего петлей прикасаются к культуре, которую затем тонким слоем распределяют на поверхности предметного стекла. При изготовлении мазков из плотных субстратов или агаровых культур на поверхность стекла
сначала наносят каплю стерильного изотонического раствора натрия
хлорида или воды, затем пастеровскими пипетками наносят мазки из
жидкостей и бульонных культур. Пипетка должна быть стерильной. Над
пламенем горелки отламывают запаянный конец пипетки и набирают
материал. После нанесения капли культуры на предметное стекло и ее
распределения пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Мазок высушивают при комнатной температуре или держа предметное стекло высоко над пламенем горелки.
Фиксация мазка. Высушенный мазок фиксируют. Фиксация преследует следующие цели. 1) убить микробов, что делает препарат безопасным при дальнейшей работе; 2) прикрепить микробов к стеклу, чтобы они не смылись при окраске и промывке водой; 3) сделать клетки более восприимчивыми для краски, так как мертвый белок поглощает краситель более интенсивно, чем живой. Существует несколько методов
фиксации мазка. Наиболее простой и распространенный - над пламенем
горелки. Для этого предметное стекло с мазком берут большим и указательным пальцами или пинцетом и проводят 3-4 раза над пламенем горелки, прикладывая стекло к коже руки. Ощущение жжения свидетельствует о том, что мазок фиксирован. Этот способ нельзя применять при
исследовании строения клетки.
При изучении структуры клеток используют химические фиксаторы.
1. Этиловый спирт (96 %) - в течение 10-15 мин.
2. Смесь разных объемов этилового спирта и этилового эфира
(серный эфир и диэтиловый эфир) - в течение 10-15 мин.
3. Ацетон - в течение 5 мин.
4. Метиловый спирт (метанол) - 2 - 3 мин.
Простой метод окрашивания. Различают простые и сложные
(дифференциальные) методы окрашивания. Окрашивание простым методом осуществляется быстрее. Используется один краситель водный
раствор фуксина или метиленового голубого, поэтому его применяют
чаще. Сущность этого метода, как и сама техника, очень проста. Он
представляет собой физико-химический процесс, при котором происходит адсорбция (поглощение) красителя микробной клеткой. Чем выше
концентрация адсорбата (красителя), тем выше скорость адсорбции.
Окрашивание проводят следующим образом. На фиксированный
мазок пипеткой наносят несколько капель красителя, водным раствором
фуксина окрашивают 1 - 2 мин, метиленовым голубым -2-3 мин. Краситель смывают водой, мазок высушивают фильтровальной бумагой и
9
рассматривают под иммерсионной системой микроскопа. Данный метод
окрашивания позволяет увидеть форму микроорганизмов и их расположение.
Вопросы для самоконтроля:
1. Из чего состоит микробиологический набор?
2. Приготовление мазка.
3. Для чего проводят фиксацию мазка?
4. Какие красители используют при простом методе окрашивания.
ТЕМА 3. СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ МИКРОБОВ.
ОКРАСКА ПО ГРАМУ И ПО ПЕШКОВУ
Цель занятия: приготовить мазки из почвенной суспензии, окрасить по Граму и по Пешкову с последующей микроскопией и зарисовкой
обнаруженных форм.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Сложные методы окрашивания. Химический состав и строение клеточной стенки микробов различны и поэтому при окрашивании одними и теми же красителями цвет получается
неодинаковый. Части микробной клетки избирательно реагируют на воздействие красящих растворов. На этом свойстве основаны сложные
(дифференциальные) методы окрашивания микробов. Для сложного
окрашивания используют несколько красителей и при использовании
сложных методов окрашивания можно разглядеть элементы внутреннего строения клеток (спору, оболочку, капсулу) В лабораторной практике
из сложных методов окрашивания применяют метод Грама, Пешкова, и
другие.
Сущность метода Грама. Впервые этот метод окрашивания микробов был описан в 1884 г. датским ученым Христианом Иоахимом Грамом и сохранился до наших дней. Метод дифференциации микробных
клеток, основанный на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность метода заключается в том, что в клетках одних видов
микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода
с основным красителем, у других видов это соединение появляется
временно и после обработки спиртом растворяется. Первые микроорганизмы называются грамположительными, вторые - грамотрицательными.
У грамположительных микробов содержание РНК примерно в 8 раз
больше, чем ДНК. Цитоплазма имеет кислую реакцию (рН = 2 - 3). У грамотрицательных микробов в состав многослойной клеточной стенки
входят ароматические, серосодержащие и другие аминокислоты. Цитоплазма имеет менее кислую реакцию (рН = 5) и примерно одинаковое
количество ДНК и РНК. В стенке грамположительных микробов много
(до 80 % от сухой массы клеток) пептидогликана - муреина, поры которо10
го при обработке этиловым спиртом сужаются и препятствуют выходу
комплекса, образуемого при взаимодействии красителя генцианового
фиолетового с компонентами клетки в присутствии йода. Кроме того, в
поверхностном слое этих микробов находится магниевая соль РНК, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение
с основными красителями (генциановым и метиловым фиолетовым), поэтому грамположительные микробы прочно удерживают краситель и
окрашиваются в фиолетовый цвет.
Грамотрицательные микробы не образуют прочного соединения с
основными красителями, легко обесцвечиваются этиловым спиртом и
смываются. Такие клетки дополнительно окрашивают другим красителем - фуксином Пфейффера.
Окрашивание спор. Споры бактерий по сравнению с вегетативными клетками обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным
условиям внешней среды. Они представляют собой округлые, овальные
или эллипсовидные образования. Если диаметр споры не превышает
диаметра клетки, в которой образуется спора, клетка называется бациллярной, если превышает, то в зависимости от расположения споры (в
центре или на конце клетки) - клостридиальной или плектридиальной. В
бациллярной клетке спора может размещаться и в центре клетки (центральное положение) и на конце (терминальное), и ближе к одному из
концов (субтерминальное).
Споры окрашивают сложным методом, поскольку они имеют плотную оболочку. Предварительно окрашиванием изменяют порозность
оболочки спор путем протравливания хромовой, соляной кислотами или
раствором фенола при их подогревании. Оболочка при этом размягчается, что увеличивает порозность. Краситель хорошо адсорбируется,
споры при кратковременном воздействии кислотой не обесцвечиваются.
Вегетативные же тела микробных клеток в этом случае обесцвечиваются и становятся видимыми только при дополнительном окрашивании
контрастным красителем.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Техника окраски по Граму.
Предметное стекло с фиксированным мазком помещают на микробиологический мостик. На препарат наносят несколько капель Генцианвиолета и оставляют на 1 - 2 минуты, затем аккуратно стряхивают в
малую кювету. После этого на стекло наносят раствор Люголя и также
оставляют на 1 - 2 минуты, после чего стряхивают. Следующим этапом
окраски по Граму является обесцвечивание препарата 96 %-ным спиртом в течение 20 с, который смывается водой по прошествии этого времени. Затем на препарат наносят фуксин Пфейффера и оставляют на
1 -2 минуты. Окрашенный препарат промывают водой, высушивают
фильтровальной бумагой и микроскопируют иммерсионной системой.
Грамположительные бактерии окрашиваются в синий цвет, а грамотрицательные - в красный.
Окраска спор по Пешкову. На фиксированный над пламенем го11
релки препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его
до кипения и кипятят на протяжении 15 - 20 с, держа над пламенем горелки, промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят раствором фуксина 1 - 2 мин., затем промывают водой и высушивают. Споры получаются голубые или синие, цитоплазма розовая.
Вопросы для самоконтроля:
1. Чем отличаются простые и сложные методы окрашивания?
2. Для чего используют окрашивание по Граму?
3. Чем отличаются грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы?
4. Порядок окрашивания по Граму.
5. Порядок окрашивания по Пешкову.
ТЕМА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБОВ В ЖИВОМ СОСТОЯНИИ
Цель занятия: приготовить препарат висячей и раздавленной капли из суточной бульонной культуры почвенных микробов, исследовать
микробы в живом состоянии и определить характер их движения.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Исследование микробов в живом
состоянии. Многие микроорганизмы в живом состоянии способны передвигаться. Скорость и характер движения зависят от возраста культуры,
окружающей среды и вида микроба. Хорошо выражена подвижность у
молодых особей, у старых она замедлена или совсем отсутствует. Подвижность прекращается с накоплением продуктов жизнедеятельности.
Наличие или отсутствие движения - одно из признаков при определении
вида микробов.
Органами передвижения являются жгутики, которые осуществляют
вращательные движения и по-разному располагаются на теле микробной клетки. В зависимости от их расположения все микробы делятся на
монотрихи (один полярный жгутик), амфитрихи (жгутики имеются на
обоих концах - по одному или несколько), лофотрихи (пучок жгутиков
расположен на одном из концов микробной клетки) и перитрихи (жгутики
находятся на всей поверхности микробной клетки).
Монотрихи и лофотрихи имеют поступательное движение. Амфитрихи и перитрихи передвигаются беспорядочно. Для определения подвижности у микробов берут молодые (12 - 24-часовые) культуры. Исследования проводят путем приготовления висячей или раздавленной
капли.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Приготовление препарата «висячая
капля». Висячую каплю готовят на предметном стекле с углублением
(луночкой). Край луночки смазывают тонким слоем вазелина, на покровное стекло наносят микроорганизмы. Если они выращены в жидкой среде, берут одну каплю культуры. Если на плотной, то сначала на покров12
ное стекло наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида, а
затем вносят в нее культуру микробов. Предметное стекло переворачивают и аккуратно опускают на покровное так, чтобы капля оказалась в
центре углубления, после чего его ставят в прежнее положение. В таком
препарате капля «подвешена» с внутренней поверхности покровного
стекла и находится в герметической влажной камере. Это позволяет
наблюдать за движением микробов в течение длительного времени.
Препарат рассматривают в затемненном поле (сужают диафрагму), что
увеличивает контрастность неокрашенных форм.
Приготовление препарата «раздавленная капля». Препарат готовят на обычном предметном стекле. Для этого на его поверхность
наносят каплю культуры микробов, покрывают покровным стеклом и
рассматривают при тех же условиях, что и висячую.
Вопросы для самоконтроля:
1. Как подразделяются микроорганизмы по расположению жгутиков?
2. Порядок приготовления препарата «висячая капля».
3. Порядок приготовления препарата «раздавленная капля».
ТЕМА 5. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ
Цель занятия: овладеть навыками и правилами подготовки посуды и материалов к стерилизации, а также ознакомиться с приборами для
каждого метода.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Чистота и стерильность - одно из основных условий работы в микробиологической лаборатории. Стерильные среды, посуда и предметы, используемые при посевах, являются
залогом получения чистых культур.
Стерилизация - это уничтожение всех видов микроорганизмов в
средах или на предметах, подвергающихся стерилизации.
Дезинфекция – обеззараживание, т.е. уничтожение только болезнетворных микроорганизмов. Когда производят дезинфекцию, то выбирают такое дезинфицирующее средство, которое в первую очередь действует именно на данный возбудитель, который необходимо обезвредить.
Методы стерилизации.
Стерилизация проводится путем прокаливания на огне, или
фламбированием. Этот метод применяют для стерилизации предметов, которые не портятся под действием огня (микробиологические петли, пастеровские пипетки и др.).
Стерилизация кипячением выполняется в специальных стерилизаторах, куда заливают дистиллированную воду, добавив 1 % натрия
гидрокарбоната. При отсутствии дистиллированной воды можно исполь13
зовать кипяченую водопроводную воду. На дно стерилизатора кладут
ровным слоем марлю или вату, на которой раскладывают шприцы, иглы,
ножницы, скальпели, и другие инструменты. В зависимости от степени
загрязнения инструментария стерилизация длится от 10 до 40 мин.
Стерилизация сухим нагретым воздухом осуществляется в специальных сушильных шкафах (печи Пастера) с двойными стенками.
Снаружи шкаф облицован теплонепроницаемым материалом, внутри
имеются металлические стенки. В верхней части шкафа находится термометр, а на дне - автоматический электронагревательный элемент. В
печи Пастера стерилизуют чистую стеклянную посуду. Колбы закрывают
пробками, накрывают бумажными колпачками и завязывают. Режим стерилизации при температуре 155 - 160 °С - 2 ч, 165 - 170 °С -1 -1,5 ч,
180 °С -1 ч.
Стерилизация текучим паром в аппарате Коха. Аппарат Коха это металлический цилиндр, покрытый снаружи теплоизоляционным материалом. Внутрь цилиндра до уровня подставки наливают воду, на
подставку ставят металлические емкости с отверстиями, в которые помещают стерилизуемый материал. Источником энергии может быть газ
или электричество. При включении аппарата в сеть вода быстро закипает. Температура в нем не превышает 100 °С.
Текучим паром стерилизуют среды, состав которых изменяется под
действием температуры выше 100 °С (среды с углеводами, желатином).
Стерилизацию проводят дробно. Сущность ее заключается в следующем. В первый день стерилизуют 30 мин. При этом погибают вегетативные формы микробов, споры же сохраняются. Ко второму дню большинство спор прорастает. Повторную стерилизацию проводят в течение 20
мин. При этом погибают вегетативные клетки, образовавшиеся в результате прорастания спор, и прорастают ранее не проросшие споры. На
третий день материал стерилизуют также 20 мин, чтобы погибли оставшиеся вегетативные формы. При такой обработке достигается стерилизация не только аспорогенного, но и спорового материала.
Автоклавирование - это стерилизация паром под давлением с
высокой температурой. Осуществляют его в специальном аппарате - автоклаве. В основе этого метода лежит нагревание помещенного в автоклав материала, герметически закрытого крышкой, чистым насыщенным
паром под давлением выше атмосферного. При встрече насыщенного
пара с более холодным материалом пар конденсируется, превращаясь в
воду, в результате чего выделяется большое количество тепла, и температура стерилизуемого материала быстро повышается. Кроме того,
при конденсации пара происходит, уменьшение его объема, что способствует проникновению пара во внутренние части стерилизуемого материала. Обязательным условием является поступление насыщенного пара, чтобы его соприкосновение с холодным предметом обусловило немедленную конденсацию и нагревание, но вода при этом не должно
удаляться из стерилизуемого материала. При повышении давления па14
ра соответственно повышается и температура в автоклаве: 0,5 атм
(50,65 кПа) - 110 - 112 °С, 1 атм (101,3 кПа) - 120 - 121 °С, 1,5 атм (151,95
кПа) -124 -126 °С, 2 атм (202,6 кПа) - 132 - 133 "С.
Современные автоклавы электрические. Промышленность выпускает вертикальные и горизонтальные автоклавы. Горизонтальный автоклав отличается от вертикального конструкцией, но принцип действия
тот же.
В автоклаве стерилизуют питательные среды, выдерживающие
нагревание выше 100 °С (суслопептонный агар, мясопептонный бульон
(МПБ), физраствор), стеклянную посуду, завернутую в бумагу, перевязочный материал, халаты, заложенные в металлические бюксы. Кроме
того, в автоклаве обеззараживают использованные бактериальные культуры, посуду. В этих случаях давление пара и экспозиция стерилизации
должны быть продолжительнее (при 1,5 атм, или 151,95 кПа, - 1 ч), чем
при стерилизации чистого материала (при 0,5 атм, или 50,65 кПа, - 30 40 мин).
Тиндализация (предложена J. Тиндалем) - это дробная стерилизация, которая проводится при температуре ниже 100 °С. Материал выдерживают по часу при 60 - 65 °С в течение пяти дней или при 70 - 80 °С
также по часу три дня. В промежутках между стерилизацией споры прорастают, образуются вегетативные формы, которые при последующих
нагреваниях погибают. Так достигается стерилизация питательных сред,
свойства которых изменяются при более высокой температуре.
Пастеризация. Те среды, которые изменяются под действием высоких температур (т.е. теряют свои полезные свойства), частично можно
обеззараживать методом пастеризации, предложенным Луи Пастером.
Пастеризацию проводят при 70 - 90 °С. При температуре 70 °С материал
нагревают в течение 30, при 90 °С - 15 мин. Поскольку при пастеризации
температура невысокая, погибают только вегетативные формы микробов, а спорообразующие микробы и споры сохраняются.
Пастеризацию применяют в хозяйствах для обеззараживания молока, полученного от животных, больных бруцеллезом и туберкулезом, а
также в промышленности для производства молочных консервов, соков,
пюре, детского питания, слабоалкогольной продукции (пиво, вино).
Ультрастерилизация - нагревание продукта до 150 °С в течение
1 с. Проводится она в трубчатых аппаратах путем введения в них химически чистого пара. Ультрастерилизация используется для обеззараживания молока. При этом подавляются окислительные процессы, приводящие к разрушению витамина С, и удаляются некоторые летучие вещества кормового и стойлового происхождения. Такое молоко сохраняет
свои свойства длительное время, что особенно важно для южных районов страны.
Ультразвук, являясь физическим стерилизующим фактором, может быть использован, например, для обеззараживания воды, молока,
некоторых продуктов кожевенного сырья. Стерилизующее действие уль15
тразвука связано с возникновением в цитоплазме бактерий кавитационных пузырьков, заполненных парами, что повышает давление до
10 000 атм, вследствие чего разрушаются внутренние структуры бактериальных клеток.
Стерилизация фильтрованием через пористые фильтры. К пористым фильтрам относят свечи Шамберлена, Беркефельда, ФСФ, асбестовые фильтры Зейца. Фильтрованием отделяют бактерии и крупные
частицы. Вирусы и фильтрующиеся формы бактерий проходят через
фильтр, а бактерии остаются на его поверхности. Фильтрацию проводят
под давлением или созданием разреженного пространства (вакуума)
ниже фильтра. Разделение микробов проводят в том случае, если применение других методов исключено.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Завернуть чашки Петри, пипетки и пробирки с колбами в бумагу, поместить их в автоклав. Изготовить ватные
пробки для пробирок. Ознакомиться с работой автоклава.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что такое стерилизация?
2. Какие методы используют для стерилизации стеклянной посуды?
3. Какие методы используют для стерилизации питательных сред?
ТЕМА 6. ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ
ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Цель занятия: освоить основные методики приготовления искусственных питательных сред, наиболее широко применяемых в лабораториях.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Питание микроорганизмов. Для осуществления всех жизненных процессов микробной клетки (рост, развитие, размножение) необходимы определенные условия, в первую очередь питательные вещества, из которых синтезируются составные части
микроорганизмов. Из питательных веществ, поступивших в клетку, синтезируются белки, углеводы, липиды, ферменты, токсины и другие соединения. Процессы питания тесно связаны с дыханием. При питании
клетка получает строительный и энергетический материал, а в процессе
дыхания образуется энергия, необходимая для ее жизни.
В целях получения в лаборатории культуры микробов в чистом виде (чистую культуру), прибегают к искусственному выращиванию. Микробов выращивают (культивируют) на питательных средах в термостате.
Микробы для своего питания используют как органические, так и неорганические вещества, и поэтому среды, употребляемые ля культивирования их, бывают разные.
По консистенции: 1) жидкие и 2) плотные.
16
По составу: 1) белковые, 2) безбелковые, 3) минеральные (растворы).
По происхождению среды подразделяются на естественные (натуральные) и искусственные.
Естественными обычно называют среды, которые состоят из
продуктов животного .или растительного происхождения, имеющих
сложный химический состав. Их основа - различные части растений, животные ткани, солод, дрожжи, навоз, почва, вода морей, озер и минеральных источников. Большинство из них используется в качестве экстрактов или настоев (пивное сусло, обезжиренное молоко, дрожжевая
вода, дрожжевой экстракт, бобовый отвар и т. д.). На естественных питательных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как
есть все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако среды
с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии
обмена веществ микроорганизмов.
Искусственные питательные среды подразделяют на полусинтетические и синтетические. В состав многих полусинтетических питательных сред входят как естественные компоненты так и различные добавки
в виде, солей содержащих элементы питания микроорганизмов.
Мясная вода служит основой многих полусинтетических сред. Ее
готовят из доброкачественной говядины или конского мяса. Кости, сухожилия, фасции и жир удаляют. Мясо пропускают через мясорубку, взвешивают, заливают двойным количеством водопроводной воды и оставляют на 18 - 24 ч в прохладном месте. Затем фарш отжимают, а Мясной
экстракт кипятят на слабом огне в течение 30 - 40 мин, после чего его
пропускают через ватно-марлевый, а затем бумажный фильтр и доливают водой до первоначального объема. Разливают по колбам и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 °С. Готовая мясная вода
имеет слабокислую реакцию (рН = 6,8).
Мясопептонный бульон (МПБ) готовят на мясной воде. К ней добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистого натрия хлорида от общей
массы. Кипятят до растворения пептона, помешивая. Величину рН
определяют колориметрическим методом или потенциометром. Реакцию
среды доводят до 7,4 - 7,6, подщелачивая децинормальным раствором
натрия гидроксида или насыщенным раствором натрия гидрокарбоната
(пищевая сода). После добавления щелочи бульон еще раз кипятят в
течение 5 -10 мин и фильтруют через увлажненный дистиллированной
водой бумажный фильтр. Затем среду разливают по пробиркам и стерилизуют 20 мин при температуре 120 °С.
По консистенции различают жидкие; полужидкие и плотные
(твердые) среды. Жидкие состоят из воды и растворенных в ней веществ (мясная вода, мясопептонный и бобово-пептонный бульон). Плотные искусственные среды готовят путем добавления к жидкой среде
уплотняющих веществ - желатина (10 -15 %), агар-агар (1 - 2 %). Полужидкие среды содержат те же уплотняющие вещества, но в меньшем
17
количестве.
По назначению питательные среды делятся на обычные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические, селективнодиагностические, среды накопления и синтетические среды.
Обычные среды применяются для выращивания большинства
микроорганизмов. К ним относятся бобово-пептонный и мясопептонный
агар.
Специальные среды применяются для выделения и культивирования определенных групп или видов микробов. Например, среда Омелянского используется для выделения возбудителей анаэробного разложения клетчатки, среда Чапека - для культивирования грибов. В эту
группу сред входят мясопептонный печеночный агар, мясопептонный
печеночный бульон, сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ,
сывороточный МПА, кровяной МПА, бульон и агар Мартена, бульон Хоттингера и т. д.
Элективные среды пригодны для развития одного вида микробов, приспособившегося к данным условиям существования. Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах или развитие их сильно задерживается. К ним относятся накопительные среды С.
Н. Виноградского для большинства почвенных микроорганизмов, среды
Шустовой, Рапопорта, Коллиана.
Дифференциально-диагностические среды применяются для
научения биохимических свойств микробов и выделения чистых культур
некоторых из них. Они позволяют выявить выделяемые микробами энзимы, одни из которых расщепляют в различной степени белки и углеводы. Сюда относятся жидкие среды Гисса с углеводами, плотные среды с индикаторами - Эндо, Левина, Плоскирева и т. д.
Селективные среды - это такие среды, на которых ведется селекция микробов против какого-то признака. Например, среда с примесью пенициллина селективна для пеницилустойчивых бактерий. К ним
относятся сухой висмут-сульфитный агар, молоко (обезжиренное).
Синтетические среды готовят из химически чистых, растворимых в воде веществ - различных солей, углеводов, витаминов и других в
строго определенных количествах. Синтетические среды бывают жидкие, полужидкие, плотные: Сюда относят среды Ван-Интерсона, Сабуро,
агар Литмана.
Краткое описание некоторых компонентов питательных сред.
Агар-агар получают из некоторых морских водорослей путем экстракции водой при кипячении. Образуемая масса представляет собой
студень. Высококачественный агар-агар изготавливают из красных морских водорослей. По составу это сложное органическое соединение, в
котором преобладают полисахариды (70 - 80 %). Готовый агар-агар слабожелтого цвета, имеет вид шнуров, пластинок или порошка. Плавится
при температуре примерно 100 °С, застывает при 40 °С. При добавлении к среде придает ей плотность.
18
Пептон - продукт неполного распада белков, происходящего под
действием ферментов в кислой среде. По составу это смесь полипептидов и некоторых аминокислот. Содержит вещества, необходимые для
жизни многих микроорганизмов. Получают пептон из рубца крупного и
мелкого рогатого скота. Препарат легко растворяется в воде, при нагревании не свертывается, не выпадает в осадок при добавлении в раствор
солей.
Желатин - животный клей, состоящий из белка. Получают его путем варки хрящей, костей и сухожилий. Внешне он напоминает листочки
светло-коричневого цвета, не имеет запаха и вкуса. Плавится при температуре 32 - 34 °С, застывает при 16 °С.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. На аптекарских весах необходимо отвесить 2 грамма сухого агара. Для приготовления питательной среды нужна колба Эрленмейера емкостью 250 мл. В колбу налить 50 мл дистиллированной воды, поместить в нее агар и размешать стеклянной палочкой. Колбу поставить на плитку и выдержать 1 - 2 минуты после появления первых пузырьков. Затем берется вторая колба того же объема, в
нее помещается стеклянная воронка, в которую по необходимости вкладывается небольшой кусок марли сложенной вдвое. Разогретую среду
фильтруют через эту марлю и разливают по чашкам Петри.
Разливку питательной среды лучше производить, когда она имеет
температуру около 50°, так как при этом на крышках чашек не образуется капель воды в результате конденсации пара. После застывания агара
чашки помещают в сушильный шкаф и подсушивают при 70 - 80° до появления муарового рисунка на поверхности агара. Появление рисунка
свидетельствует о том, что пленка воды с поверхности агара удалена и
при размножении на ней колонии бактерий не будут расплываться.
После застывания чашки оборачивают бумагой и ставят в холодильник.
Вопросы для самоконтроля:
1. Для чего используют питательные среды?
2. Как подразделяются питательные среды по происхождению?
3. Какие компоненты используются для приготовления питательных сред?
ТЕМА 7. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ПОЧВЫ
Цель занятия: ознакомиться с правилами отбора проб почвы.
Провести исследование количества микроорганизмом в 1 грамме почвы
путем посева в чашки Петри со средой приготовленной на предыдущем
занятии, используя метод разведения.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Количественный учет микробов в
19
почве. Почва является наиболее благоприятной средой для развития
микроорганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава для
учета численности микроорганизмов в ней с исследуемого участка берут
среднюю почвенную пробу, получаемую смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа (ровный, волнистый, склон и т. д.) и площади. С площади 100 м2 пробу берут из трех
точек, более 100 м2 - из пяти, с 1 га и более - из 15 точек. При исследовании пашни пробу берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний двухсантиметровый слой с помощью стерильного бура, лопаты и
ножа, помещают в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую
стерильную банку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной ватой, либо в стерильные полиэтиленовые мешки. На пакеты и
банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, горизонта и
других сведений.
При подготовке почв к микробиологическому анализу необходимо
произвести следующие операции: 1) разрушить почвенные агрегаты;
2) десорбировать микроорганизмы с поверхности почвенных частиц и из
органоминерального геля; 3) дезагрегировать микроколонии микроорганизмов. Все эти процессы вызываются одинаковыми или близкими приемами. Образцы почв подвергают механическим и химическим воздействиям. Механические воздействия более эффективны. Кроме того, часто бывает нежелательным внесение химикатов в среду для культивирования микроорганизмов и химических обработок лучше избегать.
При отсутствии ультразвуковой установки или нежелательности ее
применения (например, в случае выделения из почвы грибов) используют метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния
в течение 5 мин в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке. Используется также метод обработки почвенной суспензии на электрической пропеллерной мешалке
(микроизмельчителе тканей) (2 - 3 тыс. об/мин 5 -10 мин).
Почвенные образцы анализируют в первые сутки. В случае необходимости допускается хранение их в холодном помещении в течение
двух дней. Для большей однородности среднего образца его тщательно
перемешивают, вынимают корни растений, различные включения, соблюдая правила асептики.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Техника посева. Перед посевом влажную или сухую почву хорошо перемешивают, высыпают на часовое
стекло, предварительно протертое спиртом, освобождают от посторонних включений. Берут навеску в 1 г и после соответствующей обработки
почвы растиранием или другим способом переносят ее в колбу с 99 мл
стерильной водопроводной воды. Установлено, что значительно больше
микроорганизмов выявляется в том случае, если навеску предварительно поместить в стерильную фарфоровую ступку, увлажнить 0,4 - 0,8 мл
воды на 1 г почвы и 5 мин растирать стерильным резиновым пестиком
до пастообразного состояния.
20
Готовят разведения почвенной суспензии, для чего 1 мл почвенной
суспензии из колбы (разведение 1 : 100) последовательно переносят в
ряд пробирок с 10 мл стерильной водопроводной воды или в колбу с 99
мл воды (1 : 10 000).
Посев почвенной суспензии на плотные среды производится из
разведении 1 : 10; 1 : 100; 1 : 1000 и т. д. в зависимости от группы учитываемых микроорганизмов, типа почвы, ее влажности и т. д. В случае засева плотных сред разведение подбирают таким образом, чтобы на
чашке развивалось 50 - 200 колоний бактерий и актиномицетов и 30 - 50
колоний грибов.
При слишком густом или разреженном посеве подсчет количества
микроорганизмов будет очень неточным. Из каждого образца почвы берут не менее 3 - 5 повторных навесок и каждую высевают на 3 - 5 чашек
с различными средами.
Для этого из нужного разведения пипеткой берут 1 мл суспензии и
помещают в чашку Петри, равномерно распределяя по поверхности агара круговыми движениями. Засеянные чашки подписывают, переворачивают вверх дном и помещают в термостат на 5 – 7 дней.
Вопросы для самоконтроля:
1. Методика отбора проб почвы для микробиологического анализа.
2. Как готовят почву для приготовления суспензии и последующего
высева на плотные питательные среды?
3. Техника проведения посева на плотные питательные среды методом разведений.
21
ТЕМА 8. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПОСЕВА ПОЧВЫ
Цель занятия: подсчитать количество колоний, выросших в чашках Петри, определить количество микроорганизмов в 1 г почвы.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Учет числа бактерий в почве. Число
микробов в почве можно определить прямым подсчетом. Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Так как есть медленно
растущие формы микробов, окончательный подсчет делают на 5-е сутки.
Чтобы установить количество микробных клеток в 1 г сырой почвы,
число колоний в чашке Петри умножают на степень разведения. Иногда
клеток так много, что развившиеся колонии микроорганизмов сливаются.
Это часто наблюдается в чашках при разведении 1 : 100. При высоких
разведениях вырастают единичные колонии (менее 10), которые могут
образоваться из случайно попавших из воздуха клеток при внесении в
чашку суспензии или питательной среды. Учет в этом случае недостоверен. Для правильного определения числа клеток подсчитывают только
те, количество колоний в которых свыше 10, но не более 250 - 300 (в последнем случае при условии, что колонии очень мелкие).
При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете
и, чтобы дважды не учесть одни и те же колонии, помечают их чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой.
Иногда в последнем разведении число колоний более 300. Такой
посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если это невозможно, подсчет проводят с учетом того, что он дает представление
лишь о минимальном количестве микроорганизмов в почве. Большое
число колонии (более 300) подсчитывают с помощью камеры Вольфюгеля. Перевернутые вверх дном чашки помещают под подставу камеры и накрывают стеклянной пластинкой, на которую нанесена сетка.
Стороны образованных ею квадратов могут измеряться в сантиметрах
или миллиметрах. Число колоний подсчитывают в разных местах чашки
(в 20 - 25 квадратах) и делают пересчет на общую площадь чашки.
Для сравнения количества бактерий в разных почвах необходимо
подсчитать их число на 1 г абсолютно сухой почвы. С этой целью одновременно со взятием навески почвы для приготовления разведений в
отдельном бюксе, высушенном до постоянной массы, берут навеску (510 г), определяют ее влажность, сушат почву при 105 °С до постоянной
массы. Для подсчета числа клеток микроорганизмов в 1 г сырой почвы
определяют разность между массой сырой и сухой почвы, делят на массу навески и умножают на 100.
Расчет количества микроорганизмов в 1 г абсолютно-сухой почвы
ведут по следующей формуле:
22
m
a    100
, где
100  W 
а - среднее количество микроорганизмов в одной чашке Петри;
μ - степень разведения;
W - влажность почвы.
Сроки учета микроорганизмов зависят от состава питательной
среды и группы учитываемых микроорганизмов. На МПА обычно, на
2 - 3-е сутки роста учитывают споровые и неспоровые формы бактерий.
На среде Чапека на 5 - 7-е сутки роста учитывают колонии актиномицетов, на сусло-агаре на 5 - 7-е сутки роста - колонии грибов и дрожжей.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что представляет собой колония?
2. Как проводят подсчет выросших колоний при небольшом их количестве?
3. Как проводят подсчет выросших колоний при значительном их
количестве?
Тема 9. МЕТОДЫ И ТЕХНИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ
Цель занятия: изучить способы посева и пересева микроорганизмов на питательных средах.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Культуры только одного вида или разновидности микроорганизмов, выросшие на плотных или жидких питательных средах, носят название чистых культур.
Изолирование отдельных видов микроорганизмов из естественной
среды обитания - это один из важнейших приемов микробиологического
исследования почв. Выделение микробов в чистые культуры предшествует изучению как морфологии и цикла развития, так и физиологических и биохимических процессов осуществляемых микроорганизмами.
Такое изучение в конечном итоге дает возможность установить видовую
принадлежность исследуемых микробов.
Выделение чистой культуры бактерий. Выделение чистой культуры включает получение накопительной культуры, выделение чистой
культуры и определение ее чистоты. Для получения накопительной
культуры определенного вида бактерий сначала подбирают элективные
условия среды, обеспечивающие преимущественное развитие данных
бактерий. Затем из мест их обитания делают посев на соответствующую
селективную среду. Для выделения чистой культуры существуют разные
методы.
Метод Коха. Чистую культуру получают из одной клетки или отдельной колонии накопительной культуры, из которой после ее разведения делают высев на плотную среду. Каждую образовавшуюся колонию
считают развившейся из одной клетки.
23
Из накопительной культуры петлей отделяют колонию и переносят
ее в чашку Петри с чистой питательной средой и осторожно растирают
стерильным стеклянным шпателем, после чего этим же шпателем протирают поверхность следующих 3-4 чашек. Чашки выдерживают до 7 суток.
Высев из накопительной культуры факультативных анаэробов или
факультативных аэробов для получения изолированных колоний делают
методом глубинного посева в пробирки со столбиком стерильного агара.
Стерильной петлей берут чистую культуру из колоний, одновременно
обжигают края пробирки и иглой делают прокол до дна. Выделение чистой культуры анаэробов по методу Коха возможно только при ограничении доступа кислорода.
Метод выделения бацилл. В используемом материале могут
быть как споровые, так и аспорогенные формы микробов. Разделить их
можно нагреванием материала до 70 - 80 °С в течение 10 - 15 мин. При
этом погибают вегетативные формы, а бациллы и споры сохраняют
жизнеспособность.
Химический метод заключается в том, что химические вещества
в определенной концентрации добавляют, к питательным средам. Действие этих веществ на разные виды микробов неодинаковое; одни погибают, другие задерживаются в развитии, третьи не реагируют. На этом
принципе основано применение селективных и элективных сред.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Техника посева. Петлю или пипетку
прокаливают над пламенем горелки, берут в правую руку, пробирку - в
левую. Вынимают пробку, прижимают ее мизинцем правой руки к ладони
и держат в руке. Петлю вводят в пробирку, материал на плотной среде
распределяют зигзагообразно, а в жидкой - вращательными движениями. При пересеве из одной пробирки в другую петлю после введения
внутрь охлаждают, прикасаются к культуре, а затем извлекают из пробирки так, чтобы она не касалась пламени горелки. Если петля сделана
из вольфрамовой или другой медленно охлаждающейся проволоки,
сначала нужно коснуться стерильной среды, а затем культуры. Тонкий
слой среды на петле не только охлаждает ее, но и предохраняет микроорганизмы от гибели.
По окончании посева петлю фламбируют и ставят в штатив, чашки
переворачивают и помещают в термостат.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что такое чистая культура?
2. Для чего выделяют чистые культуры?
3. Выделение чистых культур методом Коха.
4. Метод выведения бацилл.
ТЕМА 10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПОЧВЕННЫХ
24
МИКРООРГАНИЗМОВ К РАЗЛИЧНЫМ КЛАССАМ ПЕСТИЦИДОВ
Цель занятия: изучить влияние гербицидов, фунгицидов и инсектицидов на чистые культуры почвенных микроорганизмов методом бумажных дисков.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Пестициды представляют собой химические соединения различной природы, которые используют при производстве сельскохозяйственной продукции. По своему назначению пестициды подразделяют на несколько групп. Так, химические соединения,
используемые для уничтожения сорняков называются гербицидами, для
защиты растений от болезней - фунгицидами, от вредителей - инсектицидами.
Различные пестициды в различной степени действуют на микрофлору почвы. Основной закономерностью является то, что наиболее
сильно подавляется почвенная биота от применения фунгицидов, в
меньшей степени от действия гербицидов и практически не какого влияния на почвенную микрофлору почвы не оказывают инсектициды. Конечно же, из этого правила есть исключения. Например, некоторые пестициды не только не угнетают почвенные микроорганизмы, но и стимулируют их жизнедеятельность.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Метод определения чувствительности
почвенных микроорганизмов к пестицидам с помощью бумажных дисков
пропитанных различными видами химических соединений наиболее
прост и демонстративен. Чашки Петри в которых выделена чистая культура почвенных микроорганизмов в начале занятия рассматривают и
описывают колонии микроорганизмов выросших на плотной питательной
среде. Затем, аккуратно приоткрыв верхнюю часть, в чашку приливают
1 мл стерильной водопроводной воды так, чтобы она полностью покрыла поверхность чашки. Оставляют на 5 минут, затем излишки воды удаляют. По четырем сторонам чашки размещают диски, предварительно
пропитанные различными пестицидами и оставляют для прорастания
колоний. Чувствительность микроорганизмов к тому или иному препарату определяют по величине зоны угнетения роста, которая образуется
вокруг дисков.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что такое пестициды?
2. Как влияют различные классы пестицидов на почвенные микроорганизмы?
3. Техника определения чувствительности микроорганизмов к пестицидам.
Тема 11. АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ
25
Цель занятия: Приготовить препарат клубеньковых бактерий и
рассмотреть форму клеток под микроскопом.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Симбиотическая азотофиксация.
Фиксация атмосферного азота микроорганизмами имеет важное значение в общем балансе азота в почве. Особая роль в этом процессе принадлежит бактериям, которые усваивают элементарный азот атмосферы в симбиозе с растениями. Симбиотические отношения, устанавливающиеся между бобовым растением и проникшими в его корневую систему клубеньковыми бактериями заключаются в том, что бактерии питаются органическими соединениями синтезированными растением, а
растение получает из клубеньков ассимилированный из воздуха азот в
виде доступных соединений.
В зрелой клубеньковой ткани бактериальные клетки превращаются
в бактероиды. В отличие от бактериальной клетки, имеющей форму палочки, бактероиды - грушевидные, сферические или ветвистые образования в 3 - 4 раза более крупных размеров. Зона клубенька с клетками
как бактериальной, так и бактероидной формы получила название бактероидной. В клубеньке развивается собственная сосудистая система,
примыкающая к сосудистым пучкам центрального цилиндра корня; по
сосудам происходит обмен веществ между клубеньковыми бактериями и
растением. Растения снабжают клубеньковые бактерии углеводами и
минеральными солями, а ризобии 70 % ассимилируемого или азота отдают бобовым растениям. Форма и размеры клубеньков разных бобовых
растений неодинаковы. У клевера они продолговатые и мелкие, у гороха
и вики - округлые и крупные, у фасоли и сои их диаметр достигает 1 см.
У люпина клубеньки крупные (иногда достигают величины грецкого ореха).
Строение клубеньков бобовых изучают на срезах, которые делают
острой ботанической бритвой или готовят на микротоме. Тонкий срез,
продольный или поперечных, помещают на предметное стекло и просматривают в раздавленной капле при разных увеличениях. В сухой системе просматривают структуру клубенька, обнаруживают бактероидную
ткань, а затем при достаточной тонкости среза препарат исследуют в
иммерсионной системе объектива.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Для знакомства с формами разных видов клубеньковых бактерий готовят фиксированные и окрашенные препараты из бактероидной ткани клеток клубенька. Если клубенек достаточно крупный, его разрезают бритвой на две части и поверхность среза
многократно прокалывают стерильной иглой, вызывая возможно большее механическое разрушение клеток клубенька. Из механически поврежденной части клубенька отжимают каплю на предметное стекло и
готовят фиксированный и окрашенный препарат.
Вопросы для самоконтроля:
26
1. Какое значение имеет микробиологическая фиксация азота?
2. Сущность симбиоза бобовых растений и клубеньковых бактерий.
3. Приготовление препарата клубеньковых бактерий.
ТЕМА 12. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПОЧВЫ ПО ИНТЕНСИВНОСТИ ПОЧВЕННОГО ДЫХАНИЯ
Цель занятия: Заложить опыт по определению интенсивности
почвенного дыхания.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Почвенное дыхание является результатом деятельности микроорганизмов, корней растений и химических
процессов. Но все же основная роль в продуцировании почвой углекислого газа принадлежит микроорганизмам. Выделение углекислоты - одна из важнейших функций почвы. Происходящая в ней минерализация
органических веществ, обеспечивает потребность растений в углекислом газе. Энергия дыхания может дать представление об интенсивности
биологического обмена прежде всего потому, что обмен веществ у всех
гетеротрофов сопровождается выделением С02. К тому же углекислый
газ только в очень небольших количествах связывается почвой
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Дыхание почвы (интенсивность выделения С02) можно определить объемным методом по связыванию его щелочью. Делается это следующим образом: в сосуды объемом 500 мл с
двадцатью миллилитрами титрованной щелочи (NaOH) подвешивают в
марлевом мешочке 10 г почвы. Предварительно почву увлажняют до
60 % ПВ влагоемкости, плотно закрывают резиновыми пробками. Через
5 дней количество оставшейся щелочи оттитровывают кислотой и по
формуле рассчитывают количество выделившегося С02 мг/сутки:
(20хС -АхД)х2200, где
С - титр щелочи;
А - количество кислоты пошедшей на титрование (мл);
Д - титр кислоты.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что такое почвенное дыхание?
2. Методика определения интенсивности почвенного дыхания.
Тема 13. ЭПИФИТНАЯ МИКРОФЛОРА
Цель занятия: Рассмотреть в микроскоп препараты, приготовленные из микроорганизмов обитающих на поверхности зерна.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Эпифитными следует считать микроор27
ганизмы, способные жить на поверхности здоровых, живых растений - на
их корнях и надземных органах. К этой особой экологической группе
микроорганизмов относятся, по последним данным, более 70 различных
видов, принадлежащих к различным систематическим группам.
Они способны переходить с семян на корни и надземные органы
растений. Если на стерильные семена нанести, например, Вас. mycoides
или азотобактер, то листья и корни развивающихся из этих семян растений остаются стерильными.
Эпифиты выносят более высокие концентрации фитонцидов, чем
другие микроорганизмы. Это свойство их обычно используют для учета
количества и видового состава эпифитных микроорганизмов в почве посредством высева на питательные среды с фитонцидами. Эпифитные
микроорганизмы выдерживают периодические колебания влажности и
силы света, которые имеют место на поверхности растений.
Микроорганизмы, обладающие этими тремя свойствами, могут
жить, питаться и размножаться на растениях, пользуясь продуктами растительного экзоосмоса.
Среди эпифитных микроорганизмов есть продуценты физиологически активных веществ - антибиотиков, стимуляторов роста растений,
витаминов, аминокислот, гербицидов.
Эпифитные микроорганизмы не являются специфическими для
определенных видов растений. Любой вид эпифитов может жить на любом виде растений и возможно произвольное выращивание растений с
определенными видами эпифитных микроорганизмов. Эпифиты могут
быть использованы и как продуценты физиологически активных веществ
для повышения урожая растений и защиты их от болезней. Эпифитные
микроорганизмы являются причиной такого явления как термогенез при
неправильном хранении зерна и сена.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Для ознакомления с эпифитной микрофлорой зерна, небольшую навеску замачивают в таком же объеме воды
и выдерживают сутки при температуре 25 °С. Затем делают мазок, фиксируют, окрашивают простым методом.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что называют эпифитной микрофлорой?
2. Чем отличаются эпифитные микроорганизмы от других?
3. Что такое термогенез?
4. Положительные аспекты термогенеза.
28
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Авраменко И. Ф. Микробиология. М.: Колос, 1970.
2. Ежов П.И. Руководство к практическим занятиям сельскохозяйственной микробиологии. Учебное пособие для студентов агрономических специальностей. М.: Высшая школа, 1974.
3. Емцев В.Т. Микробы, почва, урожай. М.: Колос, 1980. 126 с.
4. Заварзин Г.А. Литотрофные микроорганизмы. М.: Наука, 1972.
323 с.
5. Лабораторный практикум по микробиологии / Авт.-сост.:
М.П. Сардаева. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2000. 36 с.
6. Леонов Н. Р. Микробиология. М.: Колос, 1980.
7. Леонов Н. Р. Практикум по микробиологии. М.: Агропромиздат,
1988.
8. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Учеб. пособие / Под
ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд. МГУ, 1991. 304 с.
9. Методы изучения почвенных микроорганизмов и их метаболитов/Под. ред. Д. Г. Звягинцева. М.: Изд. МГУ, 1966.
10. Пошон Ж., Бержак де Г. Почвенная микробиология. М., 1960. 560 с.
11. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии./ Пер. с венг. И.Ф. Куренного. Под ред. Г.С. Муромцева. М.: Колос. 1983. 296 с.
12. Теппер Е. 3. и др. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер,
В.К. Шильникова, Г. И. Переверзева. М.: Колос, 1979.
29
ПРИЛОЖЕНИЯ
Контрольные вопросы по курсу:
«Общая микробиология»:
1. Эукариоты и прокариоты. Сходство и отличия.
2. Строение прокариотической клетки.
3. Рост и размножение микроорганизмов.
4. Схема метаболизма у микроорганизмов.
5. Влияние воды на рост и развитие микроорганизмов.
6. Влияние температуры на рост и развитие микроорганизмов.
7. Влияние рН среды на рост и развитие микроорганизмов.
8. Взаимоотношения микроорганизмов.
9. Спиртовое брожение.
10. Молочнокислое брожение.
11. Маслянокислое брожение.
12. Разложение целлюлозы.
13. Разложение лигнина.
14. Разложение пектиновых веществ.
15. Роль микроорганизмов в разложение клетчатки.
16. Превращение микроорганизмами соединений фосфора.
17. Превращение микроорганизмами соединений серы.
18. Превращение микроорганизмами соединений железа.
19. Классификация органических веществ по растворимости их в почве.
20. Цикл превращений азота в почве.
21. Аммонификация белков.
22. Разложение нуклеиновых кислот.
23. Нитрификация.
24. Иммобилизация азота.
25. Денитрификация.
26. Открытие микроорганизмов, фиксирующих азот.
27. Азотобактер хроококкум. Его морфология и роль в почвенном плодородии.
28. Клубеньковые бактерии.
29. Свободноживущие азотфиксирующие бактерии.
30. Бактериальные препараты (ризоторфин, нитригин).
31. Влияние радиации на рост и развитие микроорганизмов.
32. Влияние химических веществ на рост и развитие микроорганизмов.
33. Влияние гидростатического давления на рост и развитие микроорганизмов.
34. Предмет микробиологии, цели и задачи.
35. Два этапа развития микробиологии.
36. Роль ученых в становлении итоги как самостоятельной дисциплины.
37. Теория возникновения жизни на Земле.
38. Классификация микроорганизмов.
30
39. Форма и строение микроорганизмов.
40. Актиномицеты, форма, строение, классификация.
41. Грибы, форма, строение, классификация.
42. Вирусы, форма, строение, классификация.
43. Бактерии, форма, строение, классификация.
44. Сущность простого метода окрашивания, используемые красители.
45. Какие части микроскопа относят к механической системе?
46. Порядок окрашивания по Пешкову.
47. Порядок окрашивания по Граму.
48. Какие части микроскопа относят к оптической системе?
49. Стерилизация кипячением.
50. Стерилизация сухим нагретым воздухом.
51. Автоклавирование.
52. Сущность метода фламбирования.
53. Принцип приготовления препарата «раздавленная капля».
54. Принцип приготовления препарата «висячая капля».
55. Отбор почвенных образцов для микробиологического анализа.
56. Подготовка почвенного образца к анализам.
57. Принцип метода почвенных разведений.
58. Приготовления питательных сред.
59. Амфитрихи и лофотрихи.
60. Перитрихи и монотрихи.
Контрольные вопросы по курсу:
«Сельскохозяйственная микробиология»:
1. Факторы, влияющие на формирование почвы (по В.В. Докучаеву).
2. Распространение микроорганизмов в почве.
3. Методы определения общего количественного анализа микроорганизмов в почве.
4. Методы определения суммарной биохимической активности.
5. Факторы среды, определяющие развитие микробного ценоза почвы.
6. Зимогенная микрофлора почвы, ее характеристика и представители.
7. Автохтонная микрофлора почвы, ее характеристика и представители.
8. Олиготрофная микрофлора почвы, ее характеристика и представители.
9. Автотрофная микрофлора почвы, ее характеристика и представители.
10. Влияние обработки почвы на деятельность микроорганизмов.
11. Влияние мелиорации почвы на деятельность микроорганизмов.
12. Влияние минеральных удобрений на деятельность микроорганизмов.
13. Влияние органических удобрений на деятельность микроорганизмов.
14. Способы хранения навоза.
15. Микробиологические процессы, происходящие при хранении навоза
холодным способом.
31
16. Микробиологические процессы, происходящие при хранении навоза
горячим способом.
17. Процессы, происходящие при сушке кормов.
18. Термогенез.
19. Силосование как способ консервирования кормов.
20 .Холодный способ силосования.
21. Горячий способ силосования.
22. Гомоферментативные формы молочнокислых бактерий.
23. Гетероферментативные формы молочных бактерий.
24. Фазы созревания силоса.
25. Получение сенажа.
26. Метод выведения чистой культуры по Коху.
27. Химический метод выведения чистой культуры.
28. Что такое чистая культура?
29. Что представляет собой колония?
30. Как проводят подсчет колоний?
31. Метод выведения бацилл.
32. Что такое гербициды?
33. Что такое симбиотическая азотофиксация?
34. Что такое фунгициды?
35. Что такое пестициды?
36. Что такое инсектициды?
37. Что такое несимбиотическая азотофиксация?
38. Как влияют различные классы пестицидов на почвенные микроорганизмы?
39. Приготовление препарата клубеньковых бактерий.
40. Чем отличаются эпифитные микроорганизмы от других?
41. Что такое почвенное дыхание?
42. Методика определения почвенного дыхания.
43. Что называют эпифитной микрофлорой?
44. Для чего увлажняют почву при определении почвенного дыхания?
45. Техника определения чувствительности почвенных микроорганизмов
к пестицидам.
46. Сущность симбиоза бобовых растений и клубеньковых бактерий.
47. Какое значение для сельского хозяйства имеет микробиологическая
фиксация азота?
48. Что называют эпифитной микрофлорой?
49. Положительные аспекты термогенеза.
50. Приготовление «бурого» сена.
51. Цикл превращений азота в почве.
52. Аммонификация белков.
53. Разложение нуклеиновых кислот.
54. Нитрификация.
55. Иммобилизация азота.
56. Денитрификация.
32
57. Открытие микроорганизмов, фиксирующих азот.
58. Азотобактер хроококкум. Его морфология и роль в почвенном плодородии.
59. Клубеньковые бактерии.
60. Свободноживущие азотфиксирующие бактерии.
33