ФГБОУ ВПО «ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» На правах рукописи ПОНОМАРЕВА

ФГБОУ ВПО «ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
На правах рукописи
ПОНОМАРЕВА
АННА ЛЕОНИДОВНА
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ
МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ
Специальность
03.02.08 – Экология (биологические науки)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Иркутск — 2012
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный
университет» на биолого-почвенном факультете и в ФГБОУ ВПО
«Национальный
исследовательский
Иркутский
государственный
технический университет»
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор, заслуженный работник ВШ
Стом Дэвард Иосифович
научный консультант:
доктор химических наук,
профессор Калабин Геннадий Александрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Дрюккер Валентин Валерианович
доктор биологические наук, профессор
Родченко Октябрина Павловна
Ведущая организация:
ФГБОУ ВПО «Сибирский Федеральный
Университет»
Защита состоится 16 марта 2012 г. в 15:00 на заседании совета Д
212.074.07 при при ГОУ ВПО Иркутский государственный университет по
адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. проф.
М.М. Кожова (ауд. 219).
Факс (3952) 241855
Email: dissovet07@gmail.com
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского
государственного университета.
Автореферат разослан февраля 2012 г.
Учёный секретарь
диссертационного
совета, к.б.н., доцент
А.А. Приставка
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Вода является базовым компонентом любой
экосистемы, и изменение ее свойств вызывает перемены в подавляющем
большинстве элементов экологических систем. Существует труднообозримый
массив данных о зависимости влияния воды на живые организмы от
предварительного воздействия на нее различных экологических (как
биотических, так и абиотических) факторов, от ее структуры, а также от
изотопного состава (Кариманов, 2000; Лавренков, 2006; Bild, 1995; Сho, 1999;
Sessions, 2005;). Влияние изотопного состава на биологические эффекты воды
(БЭВ) в подавляющем большинстве работ изучали лишь при обогащении воды
дейтерием, и очень мало сообщений о воде с низким показателем D/H
(Помыткин, 2006; Rakovski, 1996; Knatz, 2000). Значительное число
публикаций посвящено анализу структуры воды с помощью ЯМР-, и ИКспектроскопии а также квантово - механических расчетов. К сожалению, как
правило, подобные исследования носят односторонний характер – изучается
либо только структура воды, либо ее физические или биологические свойства
(Стебновский, 2004; Габуда, 2005; Shmiter, 1992; Hoynut, 1997; Nodiche, 2000).
Серьезной трудностью при исследовании БЭВ является плохая
воспроизводимость результатов экспериментов. Одна из важнейших причин
этого кроется в том, что БЭВ и характер ее влияния на организмы после
обработки различными факторами могут меняться за очень короткие
промежутки времени, а основные биотесты, позволяющие определять БЭВ,
измененную под действием различных факторов, дают ответ через 1 – 4 и
более суток (Помыткин, 2006; Лихолат, 1999; Лехтлаан-Теннисон, 2004;
Barnes, 2004). Поэтому наиболее слабым моментом в изучении влияния воды
на организмы является отсутствие экспрессных методов определения ее
эффектов и недостаточное использование комплексного подхода при изучении
рассматриваемой проблемы.
Таким образом, изучение с помощью тест-организмов связи БЭВ с
действием на нее различных экологических факторов, ее структурой, и
изотопным составом представляется крайне важной и перспективной
областью экологии и имеет большое практическое и теоретическое значение.
Цель данной работы: с использованием приемов биотестирования
провести комплексное изучение БЭВ с разным изотопным составом и воды,
после действия ряда экологических факторов.
Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие
задачи:
1. Выяснить возможность проявления беспозвоночными животными
реакций гидропреференции по отношению к воде с разным изотопным
составом и к воде, подвергнутой воздействию различных экологических
факторов.
3
2. С использованием разных тест-организмов (бактерий, дрожжей,
водорослей, высших растений, беспозвоночных животных) и различных тестоткликов (рост, поведенческие, физиологические и биохимические реакции)
изучить динамику изменения БЭВ под действием ряда экологических
факторов, при варьировании концентрации дейтерия и при изменении
структуры воды, определенной с помощью ЯМР-анализа.
3. На
основании
проведённых
исследований
предложить
легкодоступные, технически простые пригодные для широкого применения
вне специализированных лабораторий методы и проверить возможность их
применения для оценки БЭВ при варьировании изотопного состава воды и при
действии на нее различных экологических факторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Некоторые беспозвоночные организмы (Eisenia fetida Andrei
Bouche, Drosophila melanogaster Mg., Nauphoeta cinerea Oliv.) обладают
положительной преференцией по отношению к воде с низким содержанием
дейтерия.
2. При обогащении воды дейтерием до концентрации выше
природной (136 ppm дейтерия) рост микроорганизмов: Bacillus thuringiensis,
Pseudomonas аeruginosa, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae
подавляется; лаг-фаза у исследуемых микроорганизмов удлиняется при
культивировании в средах как с повышенным, так и с пониженным
относительно природного содержания дейтерия.
3. Степень структурированности воды и БЭВ после воздействия на
нее различных экологических факторов способны довольно быстро
изменяться; они тесно связаны друг с другом и при повышении степени
структурированности талой воды ее биологические эффекты усиливаются.
4. Предложенный метод определения БЭВ, основанный на
изменении подъемной силы дрожжей позволяет фиксировать ее колебания,
относительно чувствителен, технически прост, дешев, легкодоступен, дает
возможность проводить анализ без микробиологической техники, а в качестве
тест-объекта могут быть использованы любые коммерческие препараты
дрожжей, выпускаемые для бытовых целей.
Научная новизна и теоретическое значение. Впервые обнаружена
реакция преференции дождевых червей, мраморных тараканов и мушек
дрозофил по отношению к воде с более низким содержанием дейтерия.
Показана применимость и перспективность для изучения вопросов связанных
с исследованием БЭВ ряда экспрессных методов биотестирования. Для
определения быстроизменяющихся БЭВ предложен метод оценки подъемной
силы дрожжей S. cerevisiae. Установлены закономерности между содержанием
дейтерия в воде, ее структурой и ферментативными, а также ростовыми
реакциями микроорганизмов. Показано увеличение продолжительности фазы
адаптации исследуемых штаммов микроорганизмов, при культивировании их
4
как на более легкой по сравнению с природной, так и на более тяжелой воде.
Обнаружено, что БЭВ после воздействия различных факторов (ЭМП разной
силы и частоты, размораживание при различной температуре, обработка
шумами различных диапазонов частот) способны относительно быстро
изменяться. Они тесно связаны друг с другом и при колебании показателей
степени структурированности воды БЭВ также меняются. Изучены
особенности накопления воды живыми и погибшими семенами гороха в
зависимости от соотношения D/H.
Практическое значение. Впервые предложены экспрессные дешевые
методы определения БЭВ, дающие возможность проведения анализа вне
микробиологической лаборатории (Патент РФ № 2376513 от 20.09.2009).
Проведена оценка некоторых минеральных вод, воды с различным изотопным
составом («Лангвей – 60» и «Лангвей – 100»), а также воды после воздействия
на нее различных экологических факторов. Предложена методика обогащения
пищевых продуктов легкой водой, позволяющая увеличивать вероятность
замещения в организмах дейтерия протием и, соответственно, повышать
скорость выведения тяжелого водорода (Патент РФ № 2376475 от 20.05.2009).
Выявлены диапазоны концентрации дейтерия в воде, стимулирующие и
ингибирующие рост, размножение и физиологические процессы некоторых
штаммов микроорганизмов.
Апробация работы: Материалы диссертации докладывались: на
межрегиональной
научно-практической
конференции
«Биология
микроорганизмов и их научно-практическое использование», 2004 г; на
научной
конференции
«Фундаментальные проблемы
изучения
и
использования воды и водных ресурсов», 2005 г; на Всероссийской научно практической конференции студентов и аспирантов с международным
участием «Безопасность – 05», «Безопасность – 06» (Иркутск, 2005, 2006);
на 2-ом Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным
участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ»
(Иркутск, 2007 г); на межрегиональной научно-практической конференции с
международным участием «Проблемы экологии. Чтения памяти проф. М.М.
Кожова» (Иркутск, 2010). Результаты исследований применяли при чтении
курсов лекций «Прикладная экология»; «Экотоксикология»; «Рациональное
природопользование» на биолого-почвенном факультете ИГУ и проведении
учебных практик студентов. Материалы диссертации были использованы при
подготовке отчетов по проектам РФФИ : № 05-04-97237 – Байкал – р; № 0604-39003; №08-04-98057-Сибирь_а; РФФИ - ГФЕНа № 06-04-39003. ФЦП
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: ГК №
02.740.11.0018 от 15.06.2009 г., ГК 02.740.11.0418. от 30.09.2009 г, ГК №
02.740.11.0018, П1242, задания РНП 2.1.1/1539, 2.2.1.1/5901 НОЦ «Байкал»,
ФЦП «Исследование и разработка по приоритетным направлениям развития
научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: ГК №
5
11.519.11.5016 от 28.10.11. Материалы работы включены российско-китайской
Комиссией по подготовке встреч глав правительств в «Программу научнотехнического сотрудничества № 12-35., 24.09.2008 г. Экологическая
безопасность оз. Байкал – р. Амур».
Публикации: По материалам диссертационной работы опубликовано
13 статей, 7 из них в журналах, рекомендованных к изданию ВАК, по теме
диссертации получены 2 патента на изобретение.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 141
страницах и состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы и
приложений. Работа иллюстрирована 31 рисунком и содержит 13 таблиц.
Список литературы состоит из цитированных литературных источников: 252-х
библиографических названий, из них 128 отечественных и 124 иностранных.
Личный вклад автора. Лабораторные исследования, анализ полученных
данных, обобщение и интерпретация полученных результатов, подготовка
материалов для докладов и публикаций проведены лично или при
определяющем вкладе автора. Работа проводилась на биолого-почвенном
факультете и в НИИ биологии и ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный
университет», а также в ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский
«Иркутский государственный технический университет» и в Байкальском
музее ИНЦ СО РАН.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Микроорганизмы
способны
проявлять
специфическую
чувствительность к различным воздействиям и могут быть качественными и
количественными биоиндикаторами их влияния. Многие микроорганизмы
обнаруживают высокую скорость ответа при действии на них различных
агентов. Методика содержания и культивирования микроорганизмов проста и
позволяет за короткое время получать в массовом количестве однородный
материал, не требующий разделения по возрастным, размерным, весовым,
половым и другим признакам, что существенно снижает систематические
ошибки, характерные для биологического эксперимента. В связи со всем
вышесказанным трудно переоценить перспективы микробиологического
тестирования. Важность микробиологического биотестирования связана и с
огромной ролью микроорганизмов в жизнедеятельности экосистем как в
процессах очищения, так и в качестве одного из начальных звеньев
трофической цепи и вообще в круговороте веществ. Наиболее достоверные
показатели о характере воздействия на организм получают при использовании
в качестве тест-откликов процессов роста и размножения. Но для проведения
экспрессного биотестирования больше подходят физиологические и
биохимические реакции тест-организмов, поэтому именно на них и был
сделан основной упор в работе.
6
В качестве тест-культур брали следующие микроорганизмы.
Бактериальные штаммы: P. aeruginosa (предоставлен проф. д.б.н. В.В.
Дрюккером и к.б.н. Павловой О.Н.), B. сereus (из коллекции
микроорганизмов кафедры микробиологии ИГУ), R. erythropolis (получен от
чл.-корр. РАН И. Б. Ившиной) и B. thuringiensis (предоставлен к.б.н. доц. О.
Ф. Вятчиной). Дрожжи Y. lipolytica (получены от д.б.н. проф. Борзенкова И.
А.), S. cerevisiae (предоставлен к.б.н. О. Ф. Вятчиной), водоросли - Chlorella
vulgaris (переданы проф. д.б.н. С. Е. Плехановым). В работе использовали
также сухой препарат хлебопекарных дрожжей «Саф-момент» («S.I.Lesaffre»,
Франция), изготовленный по ГОСТ 171-81 и представляющий собой культуру
хлебопекарных дрожжей (S. cerevisiae).
В качестве тест-объектов использовали беспозвоночных животных:
дрозофилы (D. melanogastres) предоставлены д.б.н. проф. Никитиным А.Я.,
мраморные тараканы (N. cinerea) – получены от к.б.н. доц. Шиленкова В. Г.,
дождевые черви – красный калифорнийский гибрид (E. fetida), дафнии
(Daphnia magna Straus), планарии (Phagocata sibirica Zabussov).
При оценке БЭВ также применяли семена растений: гороха (Pisum
sativum L.) – сорт Аксаевский усатый, и пшеницы (Triticum durim L.) –
Тулунская 12.
Лабораторные исследования проводили в соответствии с
общепринятыми в микробиологии методами (Нетрусов, 2005). При изучении
влияния содержания дейтерия на бактерии интенсивность роста культур
оценивали по накоплению биомассы клеток (в единицах оптической
плотности, регистрируемой на «Thermo Helios 298006» при λ мах = 590 нм).
Титр жизнеспособных клеток в средах определяли, используя метод серийных
разведений с последующим высевом на плотные питательные среды, а
кинетические параметры роста по (Евдокимов, 2001). Для исследования БЭВ с
использованием
тест-культур
применяли
также
метод
лунок.
Дегидрогеназную активность определяли по (Нетрусов, 2005), а уреазную – по
(Красильников,1999).
Выделение
СО2
дрожжами
оценивали
по
(Вадюнина,1986), изменение подъемной силы дрожжей – по (Зюзина, 2006).
Общее содержание белка определяли модифицированным методом Лоури
(Новиков, 2001).
Для культивирования микроорганизмов использовали рыбопептоннный агар (РПА), мясо-пептонный бульон (МПБ), пептонную воду (%)
(пептон – 1, NaCl – 0,5), среду Эндо, синтетическую среду с гексадеканом и
глюкозой (%) (KNO3 – 0,4, MgSO4 – 0,08, KH2PO4 – 0,06, Na2HPO4 – 0,14,
гексадекан или глюкоза – 1) , IEPD (г/л) (глюкоза – 20, пептон основной – 10,
автолизат дрожжевой – 5).
Изменение растворимости NaCl, KCl, CaCO3 в воде с разным
содержанием дейтерия и воде, обработанной цветными шумами, оценивали по
(Летников, 1976).
7
Легкая и тяжелая вода получена в Объединенном институте ядерных
исследований г. Дубна и предоставлена к.х.н. Тимаковым А. А. Для
исследования брали также минеральную «легкую» воду, выпускаемую под
торговой маркой «Лангвей – 60» и «Лангвей – 100», производитель «МТК
Айсберг». Общая минерализация воды «Лангвей – 100» не менее 0,2 г/дм³.
Соотношение изотопов кислорода в пробах воды относительно природной не
изменяли. Исключение составляли «Лангвей – 60 и 100» – в них содержание
тяжелой кислородной воды (О18) снижено по отношению к природному
уровню на 15%. Приготовление опытных проб воды с разной концентрацией
дейтерия (10; 13; 100; 280; 300; 1200; 1400; 1600; 2300 ppm) при природном
соотношении изотопов кислорода проводили на кафедре аналитической химии
ИГУ под руководством проф., д.х.н. Д.Ф. Кушнарева и проверяли с помощью
ЯМР - спектроскопии. В качестве контроля брали питательную среду,
приготовленную на основе природной воды (~136 ppm дейтерия).
Обработку воды проводили несколькими способами. Воду
замораживали при -18 °С в течение 12 часов. После этого оттаивали при
температурах: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 °С. Воду обрабатывали
«цветными» шумами (Яворский, 1989) в течение 30 с. Белый шум – это сигнал
с гладким спектром на всех частотах. Частотный спектр розового шума
является гладким в логарифмическом масштабе. Коричневый шум схож с
розовым шумом, однако его спектральная плотность затухает на 6 дБ на
октаву. Синий шум – вид сигнала, чья спектральная плотность увеличивается
на 3 дБ на октаву в ограниченной полосе частот, то есть его спектральная
плотность пропорциональна частоте. В спектре серого шума виден большой
«провал» на средних частотах. Воду подвергали и воздействию переменных
ЭМП различной силы и частоты. Поле создавали при помощи установки,
предоставленной д.ф.н. проф. Р. А. Рахматуллиным, основными блоками
которой были генератор сигналов специальной формы Г6-27 и
присоединенная к нему индукционная катушка.
Для исследования влияния изотопного состава водорода на связывание
воды в опытах с растениями использовали семена пшеницы и гороха. При
анализе интенсивности поглощения объекты помещали в воду с различной
концентрацией изотопов водорода. Семена инкубировали в течение 3 ч, так
как дальнейшее увеличение времени экспонирования существенно не влияло
на степень насыщения. Количество поглощенной воды определяли по разнице
масс сухого и насыщенных водой объектов, и рассчитывали в процентах на
единицу исходного сухого веса. Воду, поглощенную семенами гороха,
выделяли методом перегонки (Вадюнина,1986). Оценку содержания дейтерия
проводили методом ЯМР. Спектры ЯМР 2Н образцов регистрировали в
ампулах диаметром 5 и 10 мм. Условия измерений: резонансная частота ядер
дейтерия – 76,6 МГц, ширина развёртки – 1 500 Гц, релаксационная задержка
8 с, длительность 90° импульса — 23,5 мкс, запись спектра производилась до
8
получения соотношения сигнал/шум >100. Регистрацию спектров проводили
без стабилизации резонансного условия частота/поле при контроле
однородности и дрейфа магнитного поля Во по эталонному соединению
(Кушнарев, 1995; Калабин,1998).
При изучении возможности использования для биотестирования
способности беспозвоночных организмов выбирать более благоприятную
среду обитания, червей предварительно обезвоживали, помещая их в
физиологический раствор на 30 мин. При этом потери влаги составляли около
35±9 %. Затем червей переносили в чашку Петри, из которой они имели
полный и равноценный доступ к другим чашкам, содержащим воду с
различной концентрацией дейтерия. В каждую пробу воды добавлялось
равное количество особей (30 шт.). Опыты продолжались один час.
Для изучения степени насыщения водой с разным содержанием
дейтерия живых и погибших организмов использовали воду, содержащую 13,
1200 ppm дейтерия и минеральную воду «Лангвей – 60». В каждой пробе
использовали 20 семян гороха и 10 экземпляров червей.
Все исследования проводили не менее чем в 4-5 независимых опытах
при 3-4 аналитических повторностях. Графические материалы выполнены при
помощи программ Excel 7,0 и Microsoft Word. Результаты всех наблюдений и
экспериментов обработаны стандартными методами с использованием
корреляционного, регрессионного анализов (Поллард, 1982; Боровиков,
Ищенко, 2000). Достоверность различия определяли с помощью критерия
Стьюдента. Выводы сделаны при вероятности безошибочного прогноза
р≥0,05.
Результаты и их обсуждение
Возможность
использования
преференции
некоторых
беспозвоночных животных к легкой и тяжелой воде
Эксперименты показали, что при увеличении в воде содержания
дейтерия уменьшалось количество червей E. fetida, заползающих в чашки c
этими пробами воды. В контроле (136 ppm дейтерия) количество червей,
составляло 11,5±2,8%, а в воде – 13 ppm дейтерия и воде «Лангвей – 60» –
40,7±8,2% и 27±2,4%, соответственно (см. рис. 1).
В воде, содержащей 280 ppm дейтерия, оказалось всего 5,6±2,1% от
общего числа взятых в опыт экземпляров червей. К концу опыта (по
истечении 60 мин) самую тяжелую воду (1400 ppm дейтерия) не выбрал ни
один червь (см. рис 1).
9
Рис. 1. Количество червей E. fetida (% от общего числа особей) в чашках Петри
с различным содержанием дейтерия в воде
Не только E. fetida, но и D. melanogaster выбирали воду с меньшим
содержанием дейтерия, чем в природной. Так, к концу в садках эксперимента,
с тяжелой водой (1400 ppm дейтерия) оказалось 3,1±0,93% D. melanogaster.
Мраморные тараканы N. cinerea предпочитали воду с содержанием дейтерия
13, 60, 100, 136 ppm. Самый низкий процент потребления воды отмечали в
садках с тяжелой водой (300 и 1400 ppm дейтерия) (см. рис. 2)
Рис. 2. Количество мушек дрозофил D. melanogaster, оказавшихся через 1 ч в
садках с водой с разным содержанием дейтерия и количество воды с разным
содержанием дейтерия, поглощенной тараканами N. cinerea (по оси абсцисс –
10
содержание в воде дейтерия; по оси ординат – количество дрозофил и количество
воды поглощенной мраморными тараканами через час, в % от общего числа)
Фототаксис P. sibirica в воде, обработанной ЭМП различной силы и
частоты
В данной серии экспериментов исследовали влияние ЭМП на P.
sibirica. Воздействию ЭМП интенсивностью 5,7; 9,23; 14,56 нТл и частотой 10,
50 и 100 Гц подвергали непосредственно планарий, находящихся в воде, а
также воду, в которую затем их помещали. После непосредственной
обработки P. sibirica ЭМП частотой 10 Гц и интенсивностью 5,7 и 9,23 нТл
время ухода планарий из освещенной зоны увеличивалось (326,6±45,1 и
517,95±78,2 % относительно контроля, соответственно).
Интактные планарии, помещенные в воду, обработанную ЭМП
частотой 10 Гц и интенсивностью 5,7 и 9,23 нТл, покидали освещенную зону
за меньший период времени, чем в предыдущем опыте. При этом время ухода
червей из освещенной зоны, в варианте с водой обработанной ЭМП частотой
10 Гц и интенсивностью 5,7 нТл составляло 133,84±29,4% от контроля, а
частотой 10 Гц и интенсивностью 9,23 нТл – 86,1±18,1%. Материалы о
чувствительности планарий к обработке ЭМП приведены и у Новикова В.В.
(2002), однако в этих экспериментах не проводили сравнения влияния ЭМП
отдельно на планарий и на воду.
Влияние воды с различным содержанием дейтерия на частоту
сердцебиения D. magna
Увеличение концентрации дейтерия приводило к снижению частоты
сердцебиения дафний. При концентрации 300 ppm дейтерия остановка
сердцебиения и последующая гибель D. magna происходили в течение первого
часа эксперимента. С другой стороны в пробах с легкой водой и в контроле в
течение суток дафний
сохраняли жизнеспособность, и частота их
сердцебиения практически не менялась.
Оценка прорастания семян растений в воде с разным изотопным
составом и в воде, после воздействия на нее различных экологических
факторов
Тяжелая вода (2300 ppm дейтерий) подавляла прорастание семян
пшеницы. После инкубирования семян в этой воде их всхожесть была
существенно ниже, чем в контроле (56±11,2 % и 98,1±19,6 %, соответственно).
В этой же воде отмечали снижение размеров проростков. Так на 3-и сутки
длина стебля и корня проростков пшеницы в тяжелой воде и контроле
составляла 0,36±0,09 и 0,67±0,14 см (t 2,96, при р≥0,05), 0,8±0,13 и 1,89±0,29
см (t 4,23, при р≥0,05), соответственно.
Кроме этого, анализировали всхожесть семян и размеров проростков
пшеницы в воде (136 ppm) после воздействия на нее ЭМП различной силы и
частоты от 10-3 до 1Гц - 5,7 нТл. Длина стеблей и корней проростков пшеницы
11
в воде, после ее обработки переменным ЭМП в данном диапазоне,
практически не отличалась от таковых в контроле. Самая низкая всхожесть
семян пшеницы была в воде, подвергнутой воздействию ЭМП с частотой 10 -3
Гц и силой 5,7 нТл – 24,3±6,4% (в контроле - 48±8,1%). В воде, обработанной
ЭПМ 1 Гц 5,7 нТл и 103 Гц 5,7 нТл, всхожесть семян составляла 60±11,1% и
62±10,5%, соответственно, также как и в контроле. Это выше, чем в других
вариантах опыта с ЭМП.
Были проведены также опыты, в которых непосредственной обработке
ЭПМ подвергали сухие семена. При воздействии ЭМП с параметрами 103 Гц
39 нТл непосредственно на семена пшеницы их всхожесть составила
41,1±6,5%, а при проращивании семян в воде обработанной идентичным ЭМП
этот показатель был 67,1±16,5% по отношению к контролю. О подавлении
прорастания семян растений в воде с повышенным содержанием дейтерия
ранее сообщали и другие авторы (Балышев, 2004).
Полученные данные позволили сделать вывод, что хотя определение
всхожести семян, длины корней и стеблей их проростков позволяет оценивать
БЭВ, но из-за низкой чувствительности и длительности ответа данная
методика мало пригодна для анализа быстро меняющихся БЭВ.
Изменение степени насыщения водой с разным содержанием
дейтерия растительных и животных тканей
В экспериментах наибольший объем воды (265,8±28,5 % от сухой
массы) живые семена гороха поглощали при инкубировании в легкой воде (10
ppm дейтерия), в контроле – 176,1±21,4 %. При увеличении содержания
дейтерия происходило снижение интенсивности накопления воды живыми
семенами. Убитые нагреванием семена гороха связывали легкую воду почти на
50% слабее, чем живые. В пробах с концентрацией 60 и 280 ppm дейтерия
достоверных различий между количеством воды накопленной живыми и
погибшими семенами не наблюдали.
В воде выделенной как из живых, так и из погибших семян гороха,
экспонированных на легкой воде, содержание дейтерия было выше, чем в
инкубационной среде.
Масса живых червей, предварительно обезвоженных и затем
помещенных в воду, сильнее увеличивалась у особей, перенесённых в садки с
более низким содержанием дейтерия.
Оценка растворимости NaCl, KCl и CaCO3 в воде с различным
содержанием дейтерия и в воде подвергнутой воздействию акустических
шумов
Для таких легко диссоциируемых веществ, как NaCl и KCl, показатель
растворимости в воде с разным соотношением D/H не имел достоверных
различий. При исследовании растворимости карбоната кальция в воде с
содержанием дейтерия 13 и 60 ppm показатели растворимости были в 2 раза
выше, чем в остальных пробах (100 и 300 ppm дейтерия и контроль).
12
Обработка розовым, коричневым и белым шумом приводила к
существенному увеличению растворимости хлоридов натрия и калия. Серый
шум уменьшал данный показатель для NaCl и KCl, но значительно повышал
его для карбоната кальция.
Таким образом, можно сделать вывод, что колебания растворимости
солей хотя и позволяли оценивать влияние воды, но не всегда коррелировали с
ее способностью оказывать влияние на биологические объекты, кроме того,
обсуждаемая методика обладала высокой инерционностью.
Использование микроорганизмов для оценки БЭВ
Влияние содержания дейтерия в воде на рост микроорганизмов
В средах с повышенным содержанием дейтерия в воде (300 – 1400 ppm)
происходило подавление роста исследуемых культур микроорганизмов (B.
thuringiensis, P. аeruginosa, E. coli, S. cerevisiae).
После 24-часового инкубирования в средах с водой, содержащей 300
ppm дейтерия, у штаммов P. aeruginosa, E. coli и S. cerevisiae численность
клеток была на порядок ниже, чем в контроле (9,00±1,1×106 и 1,0±0,4×108;
1,05±0,21×107 и 1,93±0,15×108; 1,77±0,3×107 и 9,8±0,58×107 КОЕ/см3,
соответственно). Титр B. thuringiensis в средах с водой, содержащей 300 ppm
дейтерия, не столь существенно отличался от контроля (6,67±0,70×106 и
9,0±0,9×106 КОЕ/см3, соответственно; t 2,55 при р≥0,05).
Повышение концентрации дейтерия в воде до 1200 и 1400 ppm
приводило к еще большему подавлению ростовой функции. Так, численность
клеток P. aeruginosa была ниже, чем в контроле более, чем на 1,5 порядка
(3,8±0,9×106, 2,95±0,12×106 и 1,0±0,4×108 КОЕ/см3, соответственно), S.
cerevisiae – более, чем на порядок (5,57±0,61×106, 5,1±0,6×106 и 8,0±1,0×107
КОЕ/см3, соответственно), B. thuringiensis – почти на порядок (1,87±0,65×106,
1,97±0,71×106 и 9,0±0,9×106 КОЕ/см3, соответственно). При культивировании
E. coli в средах с пробами воды, содержащими 1200 и 1400 ppm дейтерия, не
происходило достоверного увеличения биомассы. Исходное количество
клеток в этих средах составляло 1,93±0,5×106 и 1,5±0,4×106, а после 24часового инкубирования – 2,0±0,6×106 и 2,7±0,8×106 КОЕ/см3, соответственно
(t 0,09 и 1,35 при р≥0,05).
Определение кинетических параметров роста микроорганизмов
показало, что удельная скорость роста снижалась при повышении
концентрации дейтерия в воде до 300 ppm. Культивирование штаммов в
средах с водой, содержащей 13 и 300 ppm дейтерия, приводило к увеличению
продолжительности их адаптивной фазы. Следует отметить, что ранее о
способности тяжелой воды ингибировать рост микроорганизмов, на примере
метилотрофных бактерий (Brevibacterium methylicum), уже сообщали Мосин
О.В. (1996) и Пшеничникова А.Б. (2004).
Влияние содержания дейтерия в воде на динамику процессов спорои кристаллообразования у штамма B. thuringiensis
13
Культивирование B. thuringiensis на средах с водой, содержащей 280 и
300 ppm дейтерия, приводило к стимулированию процессов споро- и
кристаллообразования. Выход спор уже на 1-е сутки в среде, с водой
содержащей 280 ppm дейтерия, составлял 14,9±2,5; 300 ppm дейтерия –
17,05±1,2, в то время как в контроле – 5,6±0,5 % от общего числа
вегетативных клеток, спорангиев, спор и кристаллов (t 3,1 и 6,7,
соответственно при р≥0,05). Количество кристаллов в этих средах было
14,07±0,5 и 12,6±2,1, а в контроле – 1,13±0,4 % (t 9,9 и 4,6, соответственно при
р≥0,05).
Накопление белка культурами микроорганизмов в средах с
различным содержанием дейтерия
Наиболее высокое содержание белка в культуральной жидкости было
при росте R. еrythropolis и C. vulgaris в средах приготовленных на основе воды
с концентрацией дейтерия 13 ppm (18,7±2,1 и 9,6±1,0 мг/100 см3,
соответственно). В контроле (136 ppm дейтерия) у R. еrythropolis количество
белка составляло 4,1±1,8, у C. vulgaris – 4±2,1 г/100 см3 (t 3,7 и 1,8
соответственно при р≥0,05). Увеличение концентрации дейтерия в воде до 300
ppm угнетало процесс накопления белка (у R. еrythropolis – 1,8±0,9, у C.
vulgaris – 2,1±0,2 мг/100 см3).
Оценка
БЭВ
по
изменению
активности
ферментов
микроорганизмов
Дегидрогеназная активность у штамма Y. lipolytica в пробах воды с
содержанием 13 ppm дейтерия была выше тех же показателей в контроле
(0,62±0,08 и 0,18±0,02 А, соответственно t 4,4 при р≥0,05). При высоком
содержании дейтерия (2300 ppm) дегидрогеназная активность в варианте с Y.
lipolytica не выявлялась. С другой стороны, при такой же концентрации
дейтерия в воде фиксировали наиболее высокую уреазную активность R.
еrythropolis – 0,43±0,06, а в контроле – 0,2±0,018 А.
Влияние воды с различным изотопным составом и после обработки
ее некоторыми экологическими факторами на S. сerevisiae
При увеличении содержания дейтерия в воде подъемная сила дрожжей
уменьшалась. Так в легкой воде (13 ppm дейтерия) подъемная сила составляла
9,3±2,5мин, а в тяжелой (2300 ppm дейтерия) – 50±6,9 мин (в контроле - 16±2,2
мин) (см. рис. 3) (коэффициент корреляции 0,87).
Параллельно оценивали влияние концентрации дейтерия в воде на
газообразующую способность пекарских дрожжей. Как и следовало ожидать,
наибольший выход СО2 регистрировали при использования воды, содержащей
13 ppm дейтерия (0,26±0,07 мг/мл). С увеличением концентрации дейтерия
газообразующая активность дрожжей снижалась.
14
60
подъемная сила, мин
50
40
30
20
10
0
контроль (136)13
60
100
300
1200
1400
2300
ppm
дейтерия
Рис. 3. Влияние воды с разной концентрацией дейтерия на подъемную силу
дрожжей
S. cerevisiae
Экспонирование сухих дрожжей в ЭМП с параметрами 1 Гц 9,23 нТл;
10 Гц 9,23 нТл и 10 Гц 5,7 нТл (t от 0,2 до 0,7 при р≥0,05) не оказывала
влияния на их подъемную силу. При действии ЭМП 1 Гц 5,7 нТл на сухие
дрожжи наблюдали повышение показателя подъемной силы (рис. 4).
Ниже приводятся некоторые примеры использования метода
определения подъемной силы дрожжей для оценки изменений БЭВ после
некоторых воздействий на нее. В частности определяли влияние
предварительной обработки сухих дрожжей, дрожжевой суспензии и воды
(136 ppm дейтерия), используемой для опыта, ЭМП различной частоты и силы
на подъемную силу дрожжей.
При предварительном воздействии ЭМП с параметрами 1 Гц 5,7 нТл,
10 Гц 5,7 нТл и 10 Гц 9,23 нТл только на воду, в которую затем помещали
дрожжи, показатели их подъемной силы были достоверно выше, чем в
контроле. В наибольшее степени повышение подъемной силы дрожжей
наблюдали под влиянием воды обработанной ЭМП 1 Гц 5,7 нТл. После
воздействия на воду ЭМП 1 Гц 9,23 нТл подъемная сила дрожжей достоверно
не отличалась от таковой в контроле (см. рис. 4).
Обработка дрожжевой суспензии ЭМП с параметрами 1 Гц 9,23 нТл; 10
Гц 9,23 нТл и 10 Гц 5,7 нТл приводила к снижению подъемной силы дрожжей.
После воздействия ЭМП 1Гц 5,7 нТл на суспензию дрожжей, показатель
подъемной силы дрожжей практически не отличался от соответствующего
показателя в контроле (см. рис. 4).
15
30
подъемная сила, мин
25
20
15
10
5
0
1Гц 5,7нТл
1Гц 9,23 нТл
10Гц 5,7нТл
10 Гц 9,23нТл
контроль
обработанная вода
обработанные обезвоженные клетки дрожжей
обработанная суспензия дрожжей
Рис. 4. Влияние обработки воды, сухих дрожжей и дрожжевой суспензии ЭМП
частотой 1 и 10 Гц; интенсивностью 5,7 и 9,23 нТл на подъемную силу дрожжей S.
cerevisiae
В случае, когда определяли влияние предварительной обработки воды
ЭМП различной интенсивности и частоты на пенообразование в дрожжевой
суспензии, наибольшее стимулирование процесса происходило при ЭМП 5,7
нТл 10 Гц.
При предварительной обработке воды ЭМП с частотой 10-3 – 105 Гц и
интенсивностью 14,56 нТл были получены следующие данные.
Положительный эффект на подъемную силу дрожжей был зафиксирован при
использовании ЭМП с частотой 0,01; 0,1; 10 и 100 Гц. Воздействие на воду
ЭМП с частотой 1 и 105 Гц приводило к понижению показателей подъемной
силы дрожжей.
При анализе влияния на воду цветных шумов было установлено, что
подъемная сила дрожжей увеличивалась только после воздействия розового и
коричневого шума. В остальных случаях время прохождения тест-реакции не
имело достоверных различий с контролем.
Взаимосвязь между динамикой изменения структуры воды,
размороженной при разной температуре, и ее влиянием на организмы
В талой воде подъемная сила дрожжей зависела не только от времени
прошедшего с момента оттаивания, но и от температуры размораживания
льда. ЯМР-анализ воды показал, что в зависимости от температуры
16
размораживания меняется ее структура. При увеличении структурированности
талой воды возрастала и подъемная сила дрожжей (коэффициент корреляции
0,73) (см. рис. 5).
ΔГц
160
16
140
14
120
12
100
10
80
8
60
6
40
4
20
2
0
мин
0
1
5
10
15
20
показатель структурированности воды
25
30
40
подъемная сила дрожжей
Рис. 5. Показатели степени структурированности воды и подъемной силы
дрожжей в зависимости от температурного режима оттаивания
Динамика БЭВ, определенная по изменению подъемной силы дрожжей
при действии на талую воду температурного фактора, коррелирует с
изменениями показателей степени ее структурированности значительно лучше
других использованных в работе методов биотестирования. Метод оценки
подъемной силы дрожжей, достаточно чувствителен, экспрессен, прост в
исполнении, даёт возможность проведения анализов вне микробиологической
лаборатории без специального оборудования. Важны также дешевизна метода
и легкая доступность тест-объекта, в качестве которого могут быть
использованы любые коммерческие препараты дрожжей.
Благодарности: неоценимую помощь в выполнении работы оказали
к.б.н. Вятчина О.Ф., к.б.н. Саксонов М.Н., к.б.н. Балаян А.Э., к.х.н. Тимаков А.
А., проф. д.х.н. Кушнарев Д. Ф., проф. д.х.н. Калабин Г. В., проф. д. ф.-м. н
Рахматуллин Р.А., проф. д. б. н. Никитин А. Я., проф. д.б.н. Борзенков Ю. А,
к.б.н. Приставка А.А. Автор глубоко признательна всем коллегам,
способствовавшим выполнению этой работы.
17
ВЫВОДЫ
1.
Обнаружена способность некоторых беспозвоночных животных
(дождевых червей, дрозофил, мраморных тараканов) отличать воду с разным
изотопным составом и проявлять преференцию к воде с более низким
содержанием дейтерия.
2.
Увеличение концентрации дейтерия в воде снижало частоту
сердцебиения дафний и вызывало последующую гибель рачков.
3.
При повышении концентрации дейтерия в воде происходило снижение
интенсивности накопления воды живыми семенами и дождевыми червями.
Убитые семена гороха связывали легкую воду хуже, чем живые.
4.
Предварительная обработка воды электромагнитным полем 5,7 нТл 1 Гц
стимулировала тест-реакции (подъемная сила дрожжей, всхожесть семян
пшеницы); но эти же реакции подавлялись при прямом воздействии на
исследуемые объекты электромагнитным полем с такими же параметрами.
5.
В средах с повышенным содержанием дейтерия в воде (300 – 1400 ppm)
происходило подавление роста исследуемых культур микроорганизмов (B.
thuringiensis, P. аeruginosa, E. coli, S. cerevisiae). Процессы споро- и
кристаллообразования ускорялись у B. thuringiensis при инкубировании в
средах с водой, содержащей 280 и 300 ppm дейтерия.
6.
Анализ изменения БЭВ и ЯМР-спектров выявил, что повышение
упорядоченности структуры воды сопровождается увеличением
ее
биологических эффектов. Коэффициент корреляции между показателями
степени структурированности талой воды, размороженной при разных
температурах, и подъемной силы дрожжей составлял 0,73.
7.
Для определения БЭВ предложен метод оценки подъемной силы
дрожжей; он чувствителен к достаточно слабым изменениям БЭВ; позволяет
быстро
оценивать
колебания
БЭВ;
проводить
анализы
вне
микробиологических лабораторий, без специального оборудования; не требует
постоянного поддержания тест-культуры в активном состоянии; отличается
технической простотой, легкой доступностью тест-объекта, отсутствием
необходимости приобретения дорогостоящих материалов.
СПИСОК
РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО
ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
В изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Пономарева А.Л. Влияние изотопного состава воды на рост
Pseudomonas aeruginosa и Bacillus thuringiensis / О.Ф. Вятчина, Д.И. Стом,
А.Л. Пономарева, А.А.Тимаков //Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск,
2004. – №6(38). – С. 123 – 125.
2. Пономарева А.Л. Влияние содержания дейтерия в воде на рост
микроорганизмов и поглощение воды семенами гороха / О.Ф. Вятчина, А.Л.
18
Пономарева, Д.И. Стом // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. – Иркутск, 2005. – № 5. –
С. 176-179.
3. Пономарева А.Л. Влияние воды с изменением количества
дейтерия на красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche)/
Д.И. Стом, А.Л. Пономарева, О.Ф. Вятчина // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. –
Иркутск, 2006. – № 6. – С. 167-169.
4. Стом Д.И. О возможности некоторых беспозвоночных различать
концентрацию дейтерия в воде /Д.И. Стом, А.Л. Пономарева, О.Ф. Вятчина,
А.А. Тимаков, Д.Ф. Кушнарев // Сибирский экологический журнал. – 2006. –
№ 8. – С. 561 – 563.
5. Пономарева А.Л. Измерение содержания изотопов дейтерия в
растительных и животных тканях после поглощения воды с различными
вариациями концентрации дейтерия / Д. И. Стом, А.Л. Пономарева, Н.В.
Кулагина, Д. Ф. Кушнарев // Технология живых систем. – Москва, 2009. – № 2.
– С. 127-133.
6. Пономарева А.Л. Влияние воды, размороженной при разных
температурах, на подъемную силу дрожжей /А.Л. Пономарева, Д.Ф.
Кушнарев, Д.И. Стом, Н.В. Кулагина // В мире научных открытий. –
Красноярск, 2010. – №4 (10). Часть 10. – С.66.
7. Изотопный обмен в живых и убитых растительных и животных
тканях в воде с различной концентрацией дейтерия /А.Л. Пономарева, Д.Ф.
Кушнарев, Д.И. Стом, А.А. Тимаков // В мире научных открытий. –
Красноярск, 2010. – №4 (10). Часть 10 – С.67.
8. Пономарева А.Л. О возможности красного калифорнийского
гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche), плодовых мушек (Drosophila
melanogaster) и мраморных тараканов (Nauphoet cinerea) различать
концентрацию дейтерия в воде// Д.И. Стом, А.Л. Пономарева, О.Ф. Вятчина,
А.А.Тимаков// Технология живых систем. – Москва, 2011. – № 2 – С. 145-150.
Прочие публикации:
9. Пономарева А. Л. Гидрофобно-гидрофильные свойства спор
Bacillus thuringiensis /А. Л. Пономарева // Проблемы безопасности
современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность – 02»:
Материалы докладов Х Всероссийской научно-практической конференции
студентов и аспирантов.- Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2002. –Т. 1. – С.65.
10. Пономарева А.Л. Некоторые биологические эффекты воды с
различным изотопным составом /А.Л. Пономарева, Д.И. Стом, О.Ф. Вятчина,
Д.Ф. Кушнарев, А.А. Тимаков, Е.М. Середкина // Микроорганизмы в
экосистемах озер, рек, водохранилищ. Материалы 2-го Байкальского
Микробиологического Симпозиума с международным участием. – Иркутск,
2007 г. – С. 193.
11. Пономарева А. Л. Влияние различного содержания дейтерия в
воде на жизнедеятельность микроорганизмов /А. Л. Пономарева// Проблемы
19
безопасности современного мира: способы защиты и спасения «Безопасность
– 06»: Материалы докладов Х Всероссийской научно-практической
конференции студентов и аспирантов. – Иркутск: Изд-во ИрГТУ, 2006. –Т. 1. –
С.160-161.
12. Пономарева А.Л. Влияние различного содержания тяжелого
водорода в воде на Pseudomonas aeruginosa / О.Ф. Вятчина, А.А. Тимаков,
А.Л. Пономарева // Фундаментальные проблемы изучения и использования
воды и водных ресурсов: материалы науч. конф., 2005 г. – Иркутск, 2005. – С.
64–66.
13. Вятчина О.Ф. Влияние воды с разным содержанием дейтерия на
рост культур некоторых микроорганизмов / О.Ф. Вятчина, А.Л. Пономарева,
Д.И. Стом // Биология микроорганизмов и их научно-практическое
использование: материалы межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 90-летию
со дня рождения проф. А.Г. Гриневич, 27-28 окт. 2004 г. – Иркутск, 2004. – С.
71–73.
14. Пономарева А.Л. Изменение изотопного состава воды в тканях
гороха после инкубирования в воде с разной концентрацией дейтерия / А.Л.
Пономарева, Д.Ф., Кушнарев, А.А. Тимаков, Г.А. Калабин, Д.И. Стом
//Проблемы экологии. Чтения памяти профессора М.М. Кожова: материалы
межрегион. науч. - практ. конф. с международным участием. – Иркутск, 2011.
– С.456.
15. Стом Д.И., Пономарева А. Л., Вятчина О. Ф., Тимаков А.А.
Способ экспрессной оценки биологической активности воды. – Патент РФ №
2376513 от 20.09.2009. Опубл. 20.09.2009. Бюлл. № 32.
16. Стом Д.И., Пономарева А. Л., Вятчина О. Ф., Тимаков А.А.
Способ получения продуктов, обогащенных водой с пониженным
содержанием дейтерия – Патент РФ № 2376475 от 20.05.2009. Опубл.
20.05.2009. Бюлл. № 26.
20