Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование
advertisement
Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей. Пособие для врачей Автор: д.б.н. А.Е.Платонов, Г.А.Шипулин, Е.Н.Тютюнник, О.В.Платонова Организация: ФГУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва Утвержден: Председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого Совета Минздрава России акад. РАМН Покровским В.И. Дата утверждения: 2 марта 2001 г. АННОТАЦИЯ ВВЕДЕНИЕ ГЕНОДИАГНОСТИКА Общие сведения и принципы Материально-техническое обеспечение метода Организация работы ПЦР-лаборатории Взятие и хранение образцов биологического материала Выделение ДНК Праймеры и процедуры амплификации Условия амплификации для определения родовой принадлежности возбудителя Условия амплификации для определения серогрупповой принадлежности менингококков Анализ и учет результатов Метрологические понятия и терминология Результаты испытаний предлагаемых методик Испытания в модельных экспериментах на бактериальные штаммах Испытания с использованием клинических образцов спинномозговой жидкости: определение родовой принадлежности возбудителей ГБМ Определение серогруппы менингококка, вызвавшего ГБМ Ожидаемый эффект от внедрения метода ГЕНОТИПИРОВАНИЕ Задачи Классические серологические методы типирования Генотипирование по одному гену Генотипирование по всему геному Мультилокусное секвенирование-типирование (МЛСТ) Целевое типирование по нескольким генам Применение генотипирования для характеристики менингококков в Москве Ожидаемый эффект от внедрения метода ЗАКЛЮЧЕНИЕ ЛИТЕРАТУРА АННОТАЦИЯ В пособии рассматриваются современные методы диагностики гнойных бактериальных менингитов и типирования их возбудителей, основанные на применении полимеразной цепной реакции для многократной амплификации генетического материала бактерий, содержащегося в исследуемом образце, и последующей его идентификации и классификации. Пособие адресовано врачам лечебно-профилактических учреждений, врачам-инфекционистам, микробиологам и эпидемиологам. Пособие подготовлено сотрудниками Центрального Научно-исследовательского института эпидемиологии МЗ РФ: д.б.н. А.Е.Платоновым, Г.А.Шипулиным, Е.Н.Тютюнник, О.В.Платоновой. ВВЕДЕНИЕ Современные методы генодиагностики гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) основаны на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип ПЦР заключается в многократной амплификации генетического материала, содержащегося в исследуемом образце, с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. При генодиагностике ГБМ в качестве образца используются исходно стерильные жидкости организма человека, в первую очередь, спинномозговая жидкость (СМЖ). Размножению и идентификации подвергают фрагменты генома возбудителей ГБМ, то есть менингококков, пневмококков, гемофильной палочки. Генотипирование предполагает более детальную характеристику амплифицированных участков генома с помощью ряда методик. По сравнению с традиционными методами диагностики, генодиагностика с использованием амплификационных технологий отличается высокой чувствительностью и позволяет использовать для диагностики образцы, в которых не содержится живых возбудителей, но только фрагменты их генетического материала. Результаты генотипирования характеризуются большей однозначностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами классификации микроорганизмов и предоставляют непосредственную информацию для выяснения эволюционных и эпидемиологических связей различных изолятов бактерий. Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) – группа тяжело протекающих инфекционных заболеваний, характеризующихся повсеместной распространенностью. Заболеваемость менингококковой инфекцией и другими видами ГБМ в России превышает 5000 случаев в год при летальности от 5 до 20%. Основными возбудителями ГБМ являются бактерии видов Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. Относительный вклад того или иного вида бактерий в заболеваемость ГБМ зависит от многих факторов: эпидемической обстановки, региона, возрастной группы больных и др. В ходе многолетних (1980-2000 гг.) исследований ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ было установлено, что около 65% случаев ГБМ в Москве были менингококковой этиологии (N.meningitidis), 20% - пневмококковой этиологии (S.pneumoniae), 10% случаев были вызваны гемофильной палочкой типа b (Haemophilus influenzae типа b или Hib) и 5% - прочими бактериями. Клиника и лечение ГБМ, а также профилактические и противоэпидемические мероприятия подробно описаны в методических документах и приказах Министерства здравоохранения РФ [Приказ № 375 от 23.12.1998 "О мерах по усилению эпидемологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов"], а также в ряде монографий и учебников [ Покровский 1976, Черкасский 1993, Медицинская микробиология 1998]. В этих же документах достаточно полно рассмотрены классические микробиологические методы диагностики ГБМ, такие как метод культивирования микроорганизмов из образца СМЖ и другие. Поэтому обсуждение вопросов, выходящих за рамки собственно генодиагностики и генотипирования будут в данном кратком пособии минимальным. Большинство лечебных учреждений России, в которые госпитализируются больные ГБМ, располагают возможностями для "классической" диагностики, но не для ПЦР-диагностики. В современных условиях для генодиагностики необходимы соответствующее оборудование и помещения, обученный персонал. Поэтому генодиагностика проводится в специализированных лабораториях, в том числе в ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ. Цель данного пособия – дать представление о принципах современной генодиагностики и генотипирования ГБМ, преимуществах, показаниях к применению и ограничениях метода, конкретных особенностях созданных нами тест-систем для генодиагностики ГБМ, результатах их практического применения, сравнительной эффективности генодиагностики и правилах клинической интерпретации ее результатов. Таким образом, мы намерены способствовать более широкому использованию генодиагностики ГБМ в здравоохранении, как путем сотрудничества лечебных учреждений со специализированными лабораториями ПЦР-диагностики, так и путем создания подобных лабораторий и групп в составе инфекционных клиник. Типирование возбудителей ГБМ в настоящее время не имеет клинического значения. Так, например, менингококки могут быть подразделены на серогруппы в соответствии с составом их капсульных полисахаридов, на серотипы и субтипы в соответствии с составом белков наружной мембраны и т.д. Имеются определенные эпидемиологические особенности в заболевании, вызываемом менингококками разных серогрупп - в большинстве стран менингококковая инфекция, вызываемая менингококками серогруппы В, более типична для детей до 5 лет, а случаи заболевания, вызываемого менингококками серогрупп С и А, часто наблюдаются в возрастной группе от 15 до 25 лет. Однако, течение менингококковой инфекции и ее лечение практически не зависит от серогруппы штамма-возбудителя. Частное, но существенное исключение из этого правила - заболевание, вызванное менингококками "редких" серогрупп (W135, Y, X) может указывать на наличие у пациента врожденного дефицита терминальных компонентов комплемента, резко пониженную резистентность к менингококковой инфекции и возможность повторных заболеваний [Платонов 1999а, Платонов 1999б, Приказ № 375]. Тем не менее, типирование возбудителей ГБМ критически важно для эпидемиологического надзора, проведения противоэпидемических мероприятий, краткосрочного и долгосрочного эпидемиологического прогноза. В данном пособии будут рассмотрены основные принципы современных методов генотипирования и первые результаты их применения в России, а также специфика генотипических подходов, необходимых врачам-эпидемиологам различных уровней. ГЕНОДИАГНОСТИКА Общие сведения и принципы Геномная ДНК возбудителей ГБМ представляет собой достаточно крупную кольцевую хромосому, так, например, генома N.meningitidis состоит из 2.3 миллиона пар оснований и около 2160 генов. Функции многих генов еще неизвестны, однако среди них можно выделить уникальные участки, специфичные для данного рода, вида иди подвида микроорганизмов. Собственно генодиагностика и заключается в том, чтобы размножить и опознать подобный участок, что может быть сделано с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип ПЦР был описан в 1986 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК. Комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой специально синтезированнные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20-30 оснований, называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает между ними. Процесс амплификации заключается в повторениии циклов, состоящих из денатурации ДНК, отжига праймеров и синтеза фрагмента ДНК, проходящих при различной температуре, и проводится на приборе с программным контролем температурного режима - термоциклере. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n - число циклов амплификации. После 30-35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагмента - ампликонов, что делает возможным определение и визуализацию их электрофоретической подвижности в агарозном или акриламидном геле. Праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды микроорганизмов. Показания к применению метода. Показания к применению нового метода начинаются там, где возникают противопоказания к применению классических методов. Идентификация патогена путем микробиологического культивирования из образцов спинномозговой жидкости (СМЖ) или крови больного, оставаясь "золотым стандартом" диагностики, имеет серьезные ограничения, обусловленные применением антибиотиков на догоспитальном этапе. Согласно Приказу № 375 МЗ РФ "…на дому следует ввести разовую дозу пенициллина, а при тяжелой менингококцемии предпочтительнее введение левомицетина-сукцината". Подобная практика улучшает прогноз заболевания, но резко снижает число образцов СМЖ, пригодных для микробиологического и последующего эпидемиологического анализа. В последние годы около половины больных ГБМ, поступавших во 2ую инфекционную клиническую больницу г.Москвы получали антибиотики на догоспитальном этапе; при этом в группе больных, получавших антибиотики на дому, летальность была менее 5%, а культуру бактерий из СМЖ (или крови) удавалось получить лишь в 30% случаев; напротив, в группе больных, не получивших антибиотики, летальность была выше 10%, а культуру бактерий получали как минимум в 60% случаев. По доступным нам сведениям, процент положительной бактериологической диагностики в других лечебных учреждениях России еще ниже. Кроме того, бактериологическая диагностика занимает не менее суток. Таким образом, ситуация требует разработки и применения "некультуральных" методов идентификации возбудителей ГБМ. Известным "некультуральным" методом выявления антигенов возбудителей ГБМ является метод латексагглютинации (ЛА) с применением соответствующих коммерческих тест-систем. Латексные частицы, покрытые специфическими антителами к антигенам Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae или Haemophilus influenzae, агглютинируют в присутствии бактериальных антигенов, содержащихся в СМЖ; результат агглютинации оценивается визуально. Постановка всей реакции занимает около 10 мин, реакция не требует наличия живых бактерий в СМЖ. Опыт работы ЦНИИ эпидемиологии в 1995-2000 гг. показывает, что диагностика ГБМ методом ЛА с тест-системами фирмы BioMerieux, Франция, позволяет довести лабораторное подтверждение ГБМ до 60-70%. Однако чувствительность метода ЛА сравнительно невысока, порядка 70% [Платонов 1999г], что не удивительно, поскольку минимально определяемая концентрация бактерий в СМЖ методом ЛА составляет, по нашим и литературным данным от 105до 5*106 бактерий/мл или от 1 до 50 нг антигена/мл. При этом стоимость тест-систем фирмы BioMerieux (и аналогичных наборов фирм Sanofi-Pasteur, Becton-Dickinson, Murex) в пересчете на одну диагностическую реакцию не менее $8. Основные достоинства ПЦР - возможность выявления даже нескольких копий генома бактерий в образце и, как следствие; максимальная диагностическая мощность; чувствительность и специфичность, достигающие 100%, высокая воспроизводимость; сжатые (в течение нескольких часов) сроки исследования; умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость (от 100 рублей на одну реакцию). Поэтому показаниями к генодиагностике ГБМ являются: отрицательные результаты диагностики иными методами; использование для диагностики образцов СМЖ, взятых после антибиотикотерапии или на поздних стадиях болезни; необходимость срочного диагностического результата; замещение дорогостоящих иммунологических методов. Прямых противопоказаний к применению генодиагностики ГБМ не существует. Однако, с одной стороны, ПЦР способна выявить малейшее бактериальное загрязнение тестируемого образца и рабочих растворов; с другой стороны, в ряде биологических жидкостей, в том числе, СМЖ возможно присутствие ингибиторов ПЦР. Поэтому только использование при постановке реакции положительных и отрицательных контролей, высокое и периодически проверяемое качество всех используемых реагентов, аккуратность выполнения исследования позволяют избежать как ложно-положительных, так и ложно-отрицательных результатов. Материально-техническое обеспечение метода Стандартное оборудование биохимической и иммунологической лабораторий. Амплификатор ДНК многоканальный "Терцик" (ТУ-9642-001-46482062-98, сертификат соответствия № РОССRU.ИМО2.И06033, производитель ЗАО "НПФ ДНК-Технология", Москва.) Организация работы ПЦР-лаборатории ПЦР-лаборатория должна располагать персоналом, помещениями, оборудованием и расходными материалами, необходимыми для выполнения трех основных этапов диагностики: выделения ДНК из культуры клеток и клинического материала, постановки реакции амплификации, анализа результатов амплификации, а также для приготовления необходимых реагентов. Для исключения контаминации настоятельно рекомендуется проводить отдельные этапы в отдельных, специально оборудованных помещениях (зонах), один и тот же сотрудник не должен быть задействован в разных этапах работы в один и тот же день [Методические рекомендации 1995]. Более подробно этапы работы, необходимое оборудование и реактивы будут описаны на конкретных примерах ниже. Указаны определенные марки оборудования (входящего в состав оборудование биохимической и иммунологической лабораторий) и их производитель, однако методики позволяют их замену на другое оборудование аналогичного назначения, представленное на российском рынке. Взятие и хранение образцов биологического материала Взятие образцов проводится с соблюдением стандартных правил стерильности и биологической безопасности при работе с инфекционным материалом [СП 1.2.731-99, СП 1.2.036-95, Практическое руководство 1994]. Приготовленный из биологических образцов чистый препарат ДНК не считается инфекционным. Работают только в одноразовых перчатках, используют и меняют при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б. Для приготовления ДНК используется свежая культура бактерий, выросших на чашке Петри до стадии одиночных колоний. (В однородности генетического материала можно быть более уверенным, если сама эта культура была выращена из одиночной колонии.) Необходимое количество, как правило, одна или несколько колоний, переносится стерильной одноразовой петлей в стерильную одноразовую пробирку с очищенной стерильной водой или физ-раствором, не содержащим даже следовых количеств бактериальной ДНК. Непосредственно для целей ПЦР-диагностики препараты из выделенных культур используются редко, поскольку в этих случаях возможна диагностика стандартными микробиологическими методами. Тем не менее, подобные препараты могут быть использованы для генотипирования (см. ниже), проверки специфичности и чувствительности праймеров и тест-систем в целом, а также в качестве положительного или отрицательного контроля. Образцы СМЖ забираются у больных ГБМ, желательно при поступлении в стационар, в рамках обычной диагностической спинномозговой пункции. Рекомендуется использование одноразовых пункционных игл и стерильных одноразовыхпробирок (типа “Эппендорф”), в противном случае возможно появление ложноположительных результатов. Для ПЦР-диагностики обычно достаточно от 0.1 до 0.5 мл СМЖ. Использование иных стерильно взятых образцов (кровь, аутопсийные материалы) возможно, но при ГБМ имеет меньшее значение и в данном пособии не рассматривается. Приготовленные подобным образом бактериальные суспензии или образцы СМЖ могут быть исследованы немедленно, сохраняться в течение 1-3 дней при 4оС или быть подвергнуты глубокой заморозке. При –200С образец может храниться несколько месяцев, при –700С практически неограниченно. Следует избегать нескольких циклов замораживания-оттаивания образца, поэтому, если образец планируется исследовать неоднократно, аликвоты должны быть разлиты в отдельные пробирки. Выделение ДНК Основное необходимое оборудование и расходные материалы: 1) настольный бокс с бактерицидной лампой ("Циклотемп", СП "РТС"); 2) термостат для пробирок типа “эппендорф” на 25-1000С ("Биоком"); 3) микроцентрифуга до 12-16 тыс. g. ("Elmi", "Hettish"); 4) центрифуга /вортекс (“"Биоком"); 5) набор автоматических пипеток переменного объема (“Биоком”); 6) одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для пипеток переменного объема, одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки на 1,5 мл (“Биоком”, “Хеликон”); 7) отдельный халат и одноразовые перчатки. Аналогичное оборудование и материалы общелабораторного назначения понадобится и на следующих этапах. ДНК из бактериальной суспензии выделяется стандартными методами лизиса/сорбции/отмывания (например, с использованием наборов “ДНК-сорб”, ЦНИИ эпидемиологии) или фенол-хлороформной экстракции. Концентрации ДНК в пробе при необходимости можно определить спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Число микроорганизмов, эквивалентных данной концентрации ДНК, рассчитывается исходя из приблизительного соотношения: 1 бактериальная клетка содержит 4 фемтограмма ДНК. Образцы СМЖ можно использовать в реакции амплификации непосредственно; перед исследованием проба (100 мкл СМЖ, покрытые сверху 100 мкл минерального масла) инкубируется в термостате для микропробирок 20 минут при 990С для разрушения бактерий, после чего центрифугируется при 10000 g в течение 1 минуты при комнатной температуре и супернатант отбирается для постановки ПЦР. Концентрацию и чистоту ДНК в подобной пробе можно повысить, добавив этап выделения путем сорбции. При этом, чтобы убедиться, что в каждом образце СМЖ выделение ДНК прошло успешно, в образец СМЖ пред выделением ДНК добавляется внутренний контроль - препарат ДНК, например, вируса гепатита В (HBV), а также приготовляется дополнительная пробирка без СМЖ, но с HBV, которая представляет собой отрицательный контроль выделения. В дальнейшем для каждого образца СМЖ ставится реакция на выявление ДНК HBV, которая должна дать положительные результаты. Праймеры и процедуры амплификации Специфическое оборудование и расходные материалы, необходимые на этом этапе: 1) многоканальный амплификатор (“Терцик” фирмы “ДНК-технология”, "GeneAmp PCR System 2400", Perkin Elmer, и т.п.); 2) одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл ("Хеликон"). Для выбора праймеров с целью определения принадлежности возбудителя к родам Neisseria, Streptococcus и Haemophilus был использован ген бактериальной 16S рибосомальной РНК. Один из праймеров (LU3) был общим, а 3 остальных (NSN, STN, HIN) – специфичные для нейссерий, стрептококков и гемофилов соответственно (Таблица 1). Изучение нуклеотидных последовательностей геномов Neisseria (в том числе N. meningitidis серогрупп А, В, С), Streptococci и Haemophilus, а также генома других бактерий, хранящихся в базе данных GenBank показало родоспецифичность данных праймеров. Хотя праймеры могут взаимодействовать с геномом бактерий, иных чем N.meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, например, с геномом бактерий видов N.gonorrhoeae, N.flavescens, S.mitis, S.suis, H.parainfluenzae, H.haemolyticus и др., по данным ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ такие бактерии не выделялись из СМЖ больных ГБМ в Москве в течение последних 8 лет. Поэтому положительная реакция с праймерами к Neisseria может служить практически однозначным указанием на присутствие ДНК N.meningitidis в СМЖ, реакция с праймерами к Haemophilus - указанием на присутствие ДНК H.influenzae, и так далее. Таблица 1. Олигонуклеотиды для определения принадлежности бактерий к родам Neisseria, Streptococcus и Haemophilus на основе гена 16S РНК. Род бактерий, с геномом которого взаимодействует праймер Сокращенное название праймера Последовательность оснований в праймере (5’-3') Neisseria, Streptococcus, Haemophilus и многие другие эубактерии LU3 AACT(C/A)CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA Neisseria NSN AAGCAATCAGGTTGCCCAACAGCTAA Haemophilus HIN ACAAGCTCATCTCTGAGCTCTTCTTAGG Streptococcus STN CTGAGACTGGCTATAAGAGATTAGCTTGC Специфические "серогрупповые" праймеры (Таблица 2) распознают следующие гены менингококков: для серогруппы А - уникальный ген, кодирующий УДФ-N-ацетил-d-глюкозамин-2-эпимеразу (mynA), для серогрупп В и С - гены, кодирующие полисиалилтрансферазу-D (siaD). Эти гены участвуют в синтезе полисахаридов капсулы менингококков. С помощью специализированных программ FASTA и BLASTA не было обнаружено гомологии выбранных праймеров с нуклеотидными последовательностями других бактерий и эукариотических организмов. Праймеры выбраны таким образом, чтобы обеспечить не менее 4-5 несовпадений с негомологичными нуклеотидными последовательностями генов siaD, то есть способны дискримировать менингококки серогруппы B от менингококков серогруппы C (а также W135, Y, и других). Праймеры теоретически способны определить серогруппу менингококка более, чем в 90% случаев заболевания, поскольку менингококки групп А, В и С суммарно ответственны более чем за 90% случаев МИ в России [Koroleva 1998]. Результат ПЦР с серогрупповыми праймерами является дополнительной проверкой и подтверждением верности результатов, полученных с родоспецифическими праймерами. Таблица 2. Олигонуклеотиды для определения серогрупповой принадлежности N. meningitidis на основе генов, участвующих в синтезе капсулы. Определяемая серогруппа Сокращенное название праймера Последовательность оснований в праймере (5’-3') А GA1 GCCAGAGGAAGCAAATAGGCGTT A GA2 GAGCGGAATCACAAAAGAGAATGTTG B GB1 TGGTGGAAAACACTGAAATGATCCA B GB2 TCGATTACTCTCCGCGTGTACCTTG C GC1 CCTGAATATGGTAACAATTAATCCCCGT C GC2 CTTGTTGGGCTGTATGGTGTATCGAATC Условия амплификации для определения родовой принадлежности возбудителя Амплификацию ДНК проводится в 25 мкл раствора, содержащего 15 пМ общеродового LU3 праймера, 15 пМ праймера, специфичного для стрептококка и по 10 пМ праймеров для менингококка и гемофильной палочки. Для повышения эффективности амплификации используется техника “горячего старта”: смесь праймеров (2.5 мкл) и дезоксинуклеотидтрифосфатов (2.5 мкл раствора дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ производства “Sigma”, США, каждый в концентрации 2 мМ) изолируется от остальных компонентов реакционной смеси перегородкой из воска. В верхний компартмент добавляется 5 мкл 5-кратного раствора для проведения ПЦР (содержащего TRIS, рН 8.0, 0,335 М, “Sigma”; MgCl2, 15 мМ; бычий сывороточный альбумин 0,625 г/л, “Sigma”; 40% глицерина; 0.0625% ксиленцианола, “Serva”, ФРГ); 0,5 мкл термостабильной рекомбинантной Taq-полимеразы “ДиаТак” (производство ЦНИИЭ, г. Москва) в концентрации 5 ед/мкл; 4.5 мкл деионизованной воды; 10 мкл исследуемого образца (раствора ДНК, полученной из СМЖ или культуры бактерий). Амплификация нескольких образцов одновременно проводится на многоканальном амплификаторе. В дополнительные пробирки, предназначеные для контроля реакции, вместо исследуемой пробы добавляют отрицательный контроль “К-” – буфер для элюции ДНК из набора для выделения ДНК и положительный контроль “К+” - раствор ДНК N.meningitidis, S.pneumoniae, H.influenzae. При проведении диагностических исследований отрицательный контроль К-, также как и отрицательный контроль выделения В-, рекомендуется ставить через каждые 10 исследуемых образцов. Рекомендуемые оптимальные параметры ПЦР составляют: денатурация пробы при температуре 95 0 С в течение 2 мин, далее 40 циклов (950С – 20 сек, 670С– 20 сек, 720С– 40 сек) с последующим прогреванием реакционной смеси при 720С в течение 1 минуты. Условия амплификации для определения серогрупповой принадлежности менингококков Для определения серогрупповой принадлежности N. meninigitidis ПЦР проводится со смесью трех пар олигонуклеотидов в одной пробирке с целью экономии реактивов и времени проведения исследования. В 25 мкл реакционной смеси содержится по 10 пМ каждого из 6 праймеров. Остальные компоненты реакционной смеси такие же, как и при определении родовой принадлежности микроорганизмов. Оптимальная процедура ПЦР для серогруппирования состоит из: денатурации пробы при температуре 950 С в течение 2 мин; собственно циклов амплификации 950С – 10 сек, 600С– 10 сек, 720С– 10 сек; последующего прогревания реакционной смеси при 720С в течение 1 минуты. Число циклов зависит от анализируемого материала: при постановке ПЦР на ДНК штаммов проводится 40 циклов, на образцах СМЖ - 42 цикла амплификации. В качестве положительного контроля используют растворы ДНК N.meningitidis серогрупп А, В, и С. Анализ и учет результатов Продукты амплификации выявляются и дифференцируются методом электрофореза в 1.8% агарозном геле, содержащим бромистый этидий, с дальнейшей визуализацией геля при подсвечивании ультрафиолетовым излучением. Длина амплифицированного фрагмента гена 16S РНК Neisseria – 341 пар нуклеотидов, Haemophilus 516 п.н., Streptococcus– 792 п.н., длина специфических ампликонов N. meningitidis серогруппы А – 349 п.н., группы В – 539 п.н., С- 209 п.н. (Рис. 1). Фиксацию, хранение и анализ полученных изображений гелей удобно проводить с помощью специализированных систем обработки изображения (Gel-Doc, БиоРад; BioTest, ЦНИИ эпидемиологии); однако при небольшом объеме исследований возможна и непосредственная визуальная оценка и/или фотографирование результатов. Учет результатов. В дорожке (или дорожках) соответствующей положительному контрольному образцу (или образцам) должна быть яркая специфическая светящаяся полоса на уровне длин ампликонов, указанных выше. Длина ампликона определяется по дополнительной дорожке, содержащей маркеры длины. Положительными считаются образцы (клинические пробы), которые содержат специфическую светящуюся, большей или меньшей интенсивности, полосу на том же уровне (Рис.1). Отрицательными считаются образцы, в дорожках которых нет подобных полос. В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу, не должно быть высокомолекулярных полос (выше уровня 100 п.н.) Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях: Если в дорожке, соответствующей положительному контролю, отсутствует специфическая полоса. Причиной могла явиться ошибка в подготовке реактивов, постановке ПЦР или сбой программы амплификатора. Если в отрицательном контроле выявляется специфическая полоса, значит, произошла контаминация реактивов или проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР (без пробоподготовки) для выявления источника контаминации. Если недостоверный результат повторился хотя бы один раз, необходимо сменить реактивы. Метрологические понятия и терминология Диагностическая ценность нового теста, в данном случае ПЦР, определяется в сопоставлении с "классической" диагностикой, в данном случае бактериологической. Результаты сопоставления могут быть представлены в виде таблицы, подобной Таблице 3, исходя из которой вычисляется специфичность "нового" теста относительно "стандартного" теста, равная, в процентах, 100*ИО/(ИО+ЛП), и его чувствительность, равная 100*ИП/(ИП+ЛО). Очевидно, что специфичность тем больше (лучше), чем меньше число ложноположительных результатов; чувствительность тем больше (лучше), чем меньше число ложно-отрицательных результатов. Таблица 3. Данные, необходимые для вычисления чувствительности и специфичности нового теста. Результат "общепризнанного" диагностического теста Положительный Отрицательный Положительный Число истинно-положительных результатов нового теста (ИП) Число ложно-положительных результатов нового теста (ЛП) Отрицательный Число ложно-отрицательных результатов нового теста (ЛО) Число истинно-отрицательных результатов нового теста (ИО) Результат "нового" диагностического теста Специфичность и чувствительность теста не есть его абсолютные и неизменные характеристики. Они непосредственно зависят от материала, на котором испытывается "новый" тест. Кратко говоря, количество предположительно отрицательных и предположительно положительных образцов в материале, на котором испытывается тест, должно приблизительно соответствовать условиям, в которых тест будет применяться на практике [Платонов 2000б]. Не следует путать понятия чувствительности и предела или точности измерения теста. Если ПЦР позволяет обнаруживать до 10 копий генома бактерий в пробе - это именно точность измерения, а не чувствительность ПЦР-диагностики. Результаты испытаний предлагаемых методик Испытания в модельных экспериментах на бактериальные штаммах. В работе были использованы ДНК штаммов N.meningitidis серогрупп А, В, С (35, 47 и 10 штаммов соответственно), выделенных от больных менингококковой инфекцией в 1990-96 гг., а также 38 образцов ДНК иных микроорганизмов, способных вызвать воспалительные процессы на оболочках головного мозга (6 штаммов Haemophilus influenzae, по 1 штамму N.meningitidis серогрупп 29E, W135, X, Y, Z, N. cinereae, N. elongata, N. flavescens, N. gonorrhoeae, N. mucosa, N. sicca, N. subflava, Streptococcus pneumoniae, S. agalactiae, S. milleri, S. mitis, S. mutans, S. pyogenes, S. salivarius, S. sanguis, S. suis, S. viridans, H. parainfluenzae, H. haemolyticus, Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus), полученные из коллекций ЦНИИ эпидемиологии, ГИСК им. Л.А.Тарасевича (г.Москва) и Нидерландской референтной лаборатории гнойных бактериальных менингитов . При постановке ПЦР с помощью "родоспецифических" праймеров не было отмечено ни одной ложноположительной перекрестной реакции. При этом все штаммы N.meningitidis, H.influenzae, S.pneumoniae, были правильно классифицированы, как относящиеся к родам Neisseria, Streptococcus, Haemophilus, соответственно. Методика позволяла обнаруживать, как минимум, 10 копий бактериального генома на пробу. Напротив, ПЦР с ДНК штаммов, не относящиеся к родам Neisseria, Streptococcus, Haemophilus (то есть штаммами Escherchia, Klebsiella, Listeria, Pseudomonas, Proteus, Staphylococcus) дало отрицательные результаты, даже если подобная ДНК присутствовала в избытке, до 107 копий/мкл. Негативными были также результаты исследования избыточных количеств человеческой ДНК. Таким образом, в модельных экспериментах чувствительность и специфичность предлагаемых методик равнялась 100%. При постановке ПЦР с помощью серогрупповых праймеров на ДНК штаммов N. meningitidis серогрупп А, В, С во всех пробах точно выявлялось ДНК возбудителя соответствующей серогруппы, при этом не было отмечено ни одной ложно-положительной перекрестной реакции. Методика позволяла обнаруживать, как минимум, 10 копий генома соответствующих менингококков на пробу. ПЦР с ДНК 38 иных микроорганизмов (см. выше) дало отрицательные результаты, даже если подобная ДНК присутствовала в избытке, до 107 копий/мкл. Негативными были также результаты исследования избыточных количеств человеческой ДНК. Таким образом, в модельных экспериментах чувствительность и специфичность предлагаемых методик равнялась 100%. Испытания с использованием клинических образцов спинномозговой жидкости: определение родовой принадлежности возбудителей ГБМ. Было проведено ПЦР-тестирование 173 образцов СМЖ, взятых при поступлении больных с клиническим диагнозом менингококковый менингит (с или без проявлений менингококцемии) или диагнозом ГБМ неясной этиологии во 2ую Инфекционную клиническую больницу г.Москвы (Таблица 4). Бактериологически и/или методом ЛА менингококк был выявлен у 68 больных (39%), пневмококк - у 22 больных (13%), гемофильная палочка типа b - у 9 больных (5%), "прочие" бактерии (K.pneumoniae, E.coli, L.monocytogenous, S.aureus, E.cloacae и др.) - в сумме у 11 больных (6%); 63 случая (36%) не были этиологически расшифрованы с помощью "классических" методов. При этом культивирование само по себе позволяло диагностировать 30-50% эпизодов ГБМ, а метод ЛА 50-70% эпизодов ГБМ (см. подробнее Таблицу 4). Таблица 4. Результаты диагностики бактериологическим методом, методом латекс-агглютинации (ЛА) и с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Клинический диагноз при поступлении: в скобках число пациентов / образцов СМЖ, взятых при поступлении Диагноз бактериологический Диагноз методом ЛА Диагноз бактериологический и / или методом ЛА Диагноз методом ПЦР по образцу СМЖ Серогруппирование методом ПЦР по образцу СМЖ Возбудитель и его серогруппа Возбудитель и его серогруппа Возбудитель и его серогруппа Возбудитель Серогруппа возбудителя А (12) В (14) С (5) отр. (47) А (20) В (10) С (6) отр. (42) А (22) В (17) С (9) отр. (30) нейссерии (74) Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных менингококковая инфекция, менингит (35) А (3) В (3) С (2) Y(1) отр. (26) А (10) В (4) С (4) нейссерии (34) отр. (17) А (11) В (4) С (4) Y(1) отр. (15) Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных пневмококковый менингит (28) пневмококк (14) отр. (14) пневмококк (20) отр. (8) пневмококк (22) отр. (6) стрептококк (27) отр. (1) истинноотр. (28) ** Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных менингит, вызванный Hib (9) Hib (5) Hib(9) Hib(9) Haemophilus(9) истинноотр. (9) ** отр. (4) отр. (0) отр. (0) отр. (0) Гнойный бактериальный рост рост истинно- Менингококковая инфекция, менингит, менингококкцемия (78) отр. (4) отр. (1) А (29) В (28) С (13) отр. (8) А (19) В (3) С (8) истинноотр. (1)* отр. (4) истинно- менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных менингит, вызванный "прочими" бактериями (11) бактерий (11) отр. (0) отр. (11) отр. (11) ** отр. (11) бактерий (11) отр. (0) Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных не уточнен (12) отр. (12) отр. (12) отр. (12) отр. (12) отр. (12) Окончательный диагноз с учетом клинических и лабораторных данных - иные патологии, то есть не "гнойный бактериальный менингит" (78) отр. (78) отр. (78) отр. (78) истинноотр. (78) истинноотр. (78) * истинно-отрицательный результат ПЦР серогруппирования образца СМЖ, из которого был высеян штамм менингококков серогруппы. ** истинно-отрицательный результат ПЦР серогруппирования образца СМЖ, из которого был высеяны штаммы иных бактерий (не менингококков). Применение ПЦР с "родовыми" праймерами позволило выявить присутствие ДНК нейссерий у 108 больных (62%), ДНК стрептококков - у 27 больных (16%), ДНК бактерий рода Haemophilus - у 9 больных (5%). Только 29 образцов СМЖ (17%) были негативны в ПЦР, в том числе 11 образцов, из которых были выделены "прочие" бактерии, принадлежащими к родам, ДНК которых не взаимодействует с нашими праймерами. Использование данных, полученных тремя методами (культура, ЛА и ПЦР) оставило не диагностированными только 15 случаев ГБМ из 173. Приняв в качестве "золотого стандарта" результаты изоляции штаммов Neisseria, Streptococcus, Haemophilus из образцов СМЖ, можно оценить относительную чувствительность и специфичность наших ПЦР-методик. При ПЦРисследовании 70 образцов СМЖ, из которых были высеяны бактерии, ложно-отрицательный результат (отсутствие специфического ампликона после ПЦР) был получен в одном случае менингококкового менингита с менингококцемией, а ложно-положительные результаты ("обнаружение" ДНК не того рода бактерий, который был изолирован) не были отмечены. Таким образом, чувствительность ПЦР диагностики ГБМ по предложенной схеме составляет не менее 98%, а специфичность может достигать 100%. Существенно также, что ПЦРисследование 78 пациентов с иными патологиями (серозный менингит, ОРВИ, и др) не выявляло присутствия в СМЖ бактериальной ДНК. Аналогичные результаты были получены в более широком испытании "родоспецифических" праймеров, данные которого опубликованы [Платонов 1999г]. Определение серогруппы менингококка, вызвавшего ГБМ. Данные этого раздела исследований приведены в последнем столбце Таблицы 4. Серогруппу менингококков методом ПЦР удалось определить в 100 из 113 образцов СМЖ, взятых от больных с менингококковым менингитом (с или без проявлений менингококцемии). Во всех этих 100 пробах выявлялось также присутствие ДНК нейссерий. При этом в 68 образцах, где была известна серогруппа менингококка, при постановке ПЦР в 65 пробах получен истинно-положительный результат (совпадающий по серогруппе с данными бактериологии и /или ЛА); в 1 пробе – сомнительный результат (ПЦР-тесты выявляют присутствие ДНК менингококка серогруппы C, методом ЛА выявляется антиген менингококка серогруппы В, изолировать штамм не удалось); в 1 пробе – ложно-отрицательный результат (серогруппа не была определена). Также ПЦР на ДНК серогрупп А, В и С была негативна в образце, полученном от пациента с менингитом, вызванным серогруппой Y, что можно рассматривать как истинно-отрицательный результат. ПЦР на ДНК менингококков серогрупп А, В и С была негативна в 48 пробах СМЖ, полученных при ГБМ, вызванных пневмококками, Hib или "прочими" бактериями (истинно-отрицательный результат), а также 78 пробах от пациентов с иными патологиями (серозный менингит, ОРВИ). Таким образом, специфичность и чувствительность теста были не менее 98%, и, следовательно, результатам ПЦР-серогруппирования можно доверять даже при отсутствии иного лабораторного подтверждения. В частности, при исследовании 45 больных, у которых менингококковый менингит была диагностирован клинически при отрицательных данных ЛА и бактериологического посева, в 43 случаях диагноз был подтвержден выявлением нейссериальной ДНК в СМЖ, а в 34 случаях определена серогруппа менингококка. Поскольку в геноме менингококков содержится лишь одна копия mynA или siaD гена и несколько копий 16S РНК гена, не удивительна большая чувствительность "родоспецифической" диагностики по сравнению с "серогруппоспецифической". Ожидаемый эффект от внедрения метода Эффективность использования метода складывается из нескольких компонентов. Во-первых, ПЦР позволяет диагностировать в два с половиной раза больше случаев менингококкового менингита и в два раза больше случаев пневмококкового менингита по сравнению с культивированием. По сравнению с методом ЛА, ПЦР можно выявить в два раза больше случаев менингококкового менингита и в 1.4 раза больше случаев пневмококкового менингита. В случае менингита, вызываемого гемофильной палочкой типа b, эффективность ПЦР и ЛА приблизительно одинаковы, что вероятно объясняется большим накоплением бактериального антигена в СМЖ при данной патологии. Во-вторых, сроки ПЦР-диагностики составляют 3-4 часа, а микробиологической диагностики – более суток. В-третьих, себестоимость микробиологической диагностики, дополненной методом ЛА, - не менее 500 руб. на одного пациента, а себестоимость ПЦР-диагностики бактериальных инфекций в условиях ЦННИ эпидемиологии - менее 50 руб. Клинические подходы к терапии менингитов различной этиологии не совпадают, поэтому своевременная дифференциальная диагностика является важным элементом эффективного лечения. Кроме того, расширенное серогруппирование менингококков позволяет при определенной ситуации принять решение о выборочной или массовой вакцинации населения. В последние годы заболеваемость менингококковой инфекцией и ГБМ в России превышает 5 случаев на 100000 населения в год, а смертность – 0.5/100000/ год, что является серьезной проблемой здравоохранения. Конкретные оценки прямого клинического, эпидемиологического и экономического эффекта от внедрения генодиагностики бактериальных менингитов выходят за рамки данного пособия. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ Задачи Идентификация и классификация бактерий, вызывающих инфекционные заболевания, относятся к числу ключевых задач как прикладной, так и фундаментальной микробиологии и эпидемиологии [Spratt 1999, Tenover 1997]. Эпидемиолог должен быть готов ответить на два достаточно различных типа вопросов: 1) Являются ли штаммы изолированные в конкретном очаге заболевания идентичными, генетически родственными или не взаимосвязанными? Это задача краткосрочного и локального эпидемиологического расследования. Результатом такого расследования должно стать устранение возбудителя инфекции из окружающей среды, определенных продуктов и других источников инфекции, включая людей. 2) Как связаны штаммы, циркулирующие на данной территории, со штаммами, распространенными на других территориях или в другие годы? Это задача долгосрочного и глобального эпидемиологического анализа. Итогом анализа должно стать выяснение закономерностей распространения, циркуляции и эволюции патогенных штаммов и клонов и создание методов эпидемиологического надзора и прогноза, учитывающих эти закономерности [Черкасский 1993]. Классические серологические методы типирования Наибольшее распространение получили серологические методы классификации, основанные на выявлении антигенных детерминант молекул, представленных на бактериальной поверхности, - полисахаридов, белков, липополисахарида и т.д. [Swaminathan 1996, Koroleva 1998]. Как уже было сказано, менингококки подразделяются на серогруппы (по полисахариду), серотипы и серосубтипы (по белкам наружной мембраны), иммунотипы (по липополисахариду), пневмококки - на серотипы, гемофильная палочка - на серотипы (по полисахариду), из которых наиболее вирулентен серотип b. Принципиальное достоинство данного подхода связано с тем, что, как правило, поверхностные макромолекулы патогенных бактерий, в том числе возбудителей ГБМ, являются, с одной стороны, факторами вирулентности, обуславливающими возможность колонизации организма человека и генерализации инфекции, и, с другой стороны, - мишенью для специфических и неспецифических защитных систем человека [ Spratt 1999, Grifiss 19955, Платонов 1999a]. Поэтому определение серогрупп, серотипов, иммунотипов бактерий позволяет предсказать исход их взаимодействия с системами врожденного и приобретенного, в том числе вакцинального, иммунитета и является существенным элементом эпидемиологического надзора. Ограничения серологических методов. Взаимодействуя с системами иммунитета, поверхностные молекулы подвержены сильнейшему селекционному давлению. Механизмы, приводящие к фазовым вариациям, мутациям, рекомбинациям, горизонтальному переносу генов [Spratt 1999] обеспечивают широкую вариабельность поверхностных макромолекул и приводят к отсутствию четкой взаимосвязи иммунотипа штамма с его эволюционным происхождением и клональной принадлежностью: родственные штаммы могут иметь различные серотипы в то время как, штаммы, имеющие одинаковый серотип, не обязательно являются эволюционно близкими [Achtman 2001]. Существенным ограничением серологических методов типирования является необходимость выделения живой культуры бактерий, что далеко не всегда возможно. Кроме того, реагенты для серотипирования (специфические антитела) в России не выпускаются, а стоимость зарубежных реагентов велика. Поэтому серотипирование возбудителей ГБМ проводится в России редко и только в исследовательских целях [ Koroleva 1998]. Отечественные реагенты для серогруппирования менингококков выпускаются и серогруппирование должно проводиться [Приказ № 375]. Генотипирование по одному гену К этой группе относятся методы, основанные на амплификации определенного гена с помощью ПЦР и дальнейшей идентификации ампликона. Способы идентификации: гель-электрофорез (специфический ампликон должен иметь определенную длину и соответствующую электрофоретическую подвижность); рестрикционный анализ (ампликон подвергается действию ферментов-рестриктаз, нарезающих его на характерное число фрагментов определенной длины); ПЦР с иммуноферментным детектированием (аналог ИФА при котором ампликон связывается со специфическим зондом); и другие. Подобные методы активно внедряются в практику как недорогие и технически несложные методы экспрессанализа и диагностики [Swaminathan 1996, Платонов 1999в, Платонов 1999г]. Экспресс-методы способны обнаружить лишь ограниченное число вариаций гена, но ампликон можно характеризовать полностью путем его дальнейшего прямого секвенирования. Тем не менее, любые методики, работающие только с одним геном, априори упускают потенциально существенную информацию и, следовательно, недостаточно пригодны для классификации бактерий и филогенетических исследований. ПЦР-технологии для идентификации серогруппы менингококка, рассмотренные в предыдущем разделе, также фактически являются технологиями генотипирования по одному гену. Поскольку антигенные свойства белков наружной мембраны класса 1 и классов 2/3, характеризующие серотип и серосубтип менингококка, также определяются соответствующими генами, возможно серотипирование и серосубтипирование на основе ПЦРтехнологий. Генотипирование по всему геному К этой группе относятся гель-электрофорез в пульсирующем поле (ППГЭ), ПЦР-амплификация со случайными праймерами или праймерами, комплементарными повторяющимся последовательностям. При ППГЭ весь геном бактерии подвергается действию набора ферментов-рестриктаз, а затем фрагменты характеризуются путем электрофореза в меняющемся во времени и пространстве электрическом поле; в результате каждый фрагмент занимает в геле позицию, зависящую от его длины. Случайные праймеры или праймеры, комплементарные повторяющимся последовательностям, - это короткие праймеры, связывающиеся с большим количеством участков бактериального генома. В результате амплификации получается большое количество ампликонов, число и длина которых определяется числом и позицией потенциальных мест связывания праймеров в бактериальном геноме. Затем фрагменты характеризуются по подвижности в гель-электрофорезе. Формальной характеристикой штамма, исследованного методами ППГЭ или ПЦР со случайными праймерами, является электрофоретическая картина-паттерн, т.е. специфический набор полос на электрофореграмме препарата ДНК штамма. Паттерн практически уникален, то есть если при сравнении двух штаммов получаются одинаковые паттерны - это указывает на их идентичность [Swaminathan 1996, Achtman 2001, Bevanger 1998]. Различие в электрофоретических паттернах двух штаммов однозначно указывает на различие их геномов. В этом преимущество данных методов, когда нужно проследить эпидемическую цепочку и установить источник заражения. Ограничение данных методов в том, что различие в электрофоретических паттернах непосредственно не раскрывает природы, локализации и биологического смысла различия, требующего исследования иными методами. Так, например, "молчащая" мутация, не приводящая к замене аминокислоты и изменению свойств белка, вполне может привести к изменениям, выявляемым методами ППГЭ или ПЦР со случайными праймерами. Методы получения паттернов трудно стандартизовать, а степень их различия не всегда пропорциональна реальной степени различия штаммов. Эти методы не рекомендуется использовать для анализа долгосрочной эволюции возбудителей ГБМ или сравнения штаммов, циркулирующих на разных территориях [ Tenover 1997, Spratt 1999]. Мультилокусное секвенирование-типирование (МЛСТ) Основные принципы МЛСТ таковы. 1. Выбирается ограниченное количество (от 6 до 10) бактериальных генов, предпочтительно "нейтральных", не кодирующих известные факторы вирулентности или патогенности, но являющихся маркерами филогенетического родства. В исследуемой популяции каждый ген должен встречаться в достаточном числе аллелей (более десяти). Желательно, чтобы вариации в данных генах накапливались медленно, а обладание тем или иным аллелем маркерного гена само по себе не обуславливало явных эволюционных преимуществ штамма. Этому условию соответствуют гены цитоплазматических ферментов, отвечающих за внутриклеточный метаболизм. 2. Для каждого исследуемого штамма нуклеотидные последовательности выбранных генов (или их участков) определяются методом прямого секвенирования. Каждая уникальная последовательность определяет аллель локуса. Набор аллелей исследуемых локусов конкретного штамма определяет его сиквенс-тип (СТ). Эволюционные взаимосвязи различных СТ и генетическое расстояние между ними оценивается с помощью существующего специализированного программного обеспечения. 3. В Интернете поддерживаются общедоступные веб-сайты, содержащие базы данных об известных уникальных последовательностях и соответствующих им СТ. Автор, проведший МЛСТ-анализ конкретного штамма, может с помощью вышеупомянутой базы данных классифицировать обнаруженный СТ как известный или новый, а также внести свои результаты в общемировую базу. В общемировой базе хранятся в стандартизованной форме индивидуальные сведения о каждом штамме, включающие СТ и, если известно, данные о типировании другими методами (серологическими и пр.) и эпидемиологические данные (страна выделения, источник изолята например, СМЖ - и пр.). Таким образом, со временем проясняется взаимосвязь между МЛСТ и традиционными методами типирования. 4. В силу специфики методов получения и хранения информации о СТ, данные, получаемые различными лабораториями, абсолютно сопоставимы. В перспективе это позволит провести глобальный эпидемиологический анализ распространения штаммов в разное время, на различных территориях, среди пациентов с различными патологиями, и т.д. и т.п. К настоящему дню созданы МЛСТ-технологии для генотипирования основных возбудителей ГБМ - Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. Рассмотрим практическую реализацию данного подхода применительно к типированию менингококков. 1. В МЛСТ анализ включены 7 генов: adk (функция кодируемого белка - аденилаткиназа), gdh (глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа), aroE (шикимат дегидрогеназа), abcZ (предположительно - ABC переносчик), pdhC (субъединица пируват дегидрогеназы), pgm (фосфоглюкомутаза), fumC (фумарат гидратаза). 2. К настоящему времени изучена коллекция более, чем из 1200 штаммов менингококков. В коллекции были представлены штаммы: выделенные в различное время (с 1917 года по 2000 год) в разных странах всех континентов; различных серогрупп и серотипов; представляющие как "гипервирулентные", эпидемически значимые подгруппы менингококков, так и эндемичные штаммы. 3. Внутренние фрагменты названных генов размером приблизительно в 450 пар оснований амплифицированы с помощью специфической ПЦР и секвенированы; детали процедуры приведены в [Maiden 1998] и на веб-сайте http://mlst.zoo.ox.ac.uk. Выделено более 500 различных СТ. Дендрограмма генетического родства (на основе матрицы попарных различий аллельных профилей), построенная по методу UPGMA, объединяет эти СТ в несколько больших кластеров (Рис. 2). 4. На дендрограмме родства по МЛСТ в первую очередь четко отличаются менингококки серогруппы А от менингококков серогрупп В и С (Рис. 2). Это подтверждает современные представления о том, что для популяции менингококков группы А характерна клональная структура, в то время как среди менингококков групп В и С имеет место интенсивный процесс рекомбинаций и горизонтального переноса, в том числе и генов, ответственных за синтез капсулы В или С, что приводит к достаточно быстрому размыванию клональной структуры. 5. На дендрограмме родства по МЛСТ (Рис. 2) могут быть четко выделены так называемые гипервирулентные подгруппы (субгруппы I, III и IV менингококков серогруппы А, а также ET-5 и ET-37 комплексы, А4 кластер и "ветвь 3" менингококков серогрупп В и С [Платонов 2000a, Платонов 1999в]). Выделяется также ряд устойчивых субгрупп группы А, имеющих меньшее эпидемическое значение (субгруппы V, VI, X и др.) 6. Результаты генотипирования методом МЛСТ и методом ПЦР-амплификация со случайными праймерами в принципе совпадают, хотя последний метод более подвержен влиянию "шумов", вызванных несущественными мутациями. Также результаты генотипирования методом МЛСТ совпадают с результатами, полученными с помощью популярного ранее за рубежом, но чрезвычайно трудоемкого и доростоящего метода мультилокусного энзимоэлектрофореза, обсуждение которого выходит за рамки данного пособия [Tenover 1997]. Преимущества МЛСТ. Во-первых, МЛСТ имеет дело с однозначно идентифицированными изменениями нуклеотидных последовательностей. Во-вторых, МЛСТ можно проводить непосредственно амплифицируя соответствующие локусы из клинического материала (крови, спинномозговой жидкости, и т.п.) без выделения и хранения бактерий, что сокращает время и позволяет провести типирование в отсутствии жизнеспособного возбудителя, например, после антибиотикотерапии, или типирование так называемых "некультивируемых форм" бактерий. В-третьих, как методика определения СТ, так и форма их представления и анализа поддаются почти абсолютной стандартизации, позволяя сопоставлять и интегрировать данные независимо работающих лабораторий в единый, общедоступный с помощью сети Интернет массив. В результате мы имеем четкую характеристику клонов возбудителей ГБМ, циркулирующих на данной территории в данное время, и можем ее сопоставить с характеристикой клонов, выделенных ранее или на других территориях. Существующие ограничения метода в принципе преодолимы. Разделяя все множество патогенных менингококков (или пневмококков и т.д.) на несколько больших субгрупп и ограниченное число сиквенс-типов, метод МЛСТ не всегда может с достаточной точностью проследить пути эволюции и распространения сменяющих друг друга штаммов и клонов. Развитие метода МЛСТ должно пойти по линии включения в анализируемый набор также и генов, кодирующих "факторы вирулентности и патогенности", в том числе вариабельных генов, что придаст результатам большую осмысленность с точки зрения эпидемиологии и патогенеза заболеваний, вызываемых изучаемыми инфекционными агентами. В настоящий момент это сдерживается достаточно высокой стоимость прямого секвенирования (затраты на характеристику одного штамма можно оценить в 200-300 долларов). Но с развитием генетических технологий стоимость МЛСТ снижается и будет продолжать снижаться, что в непосредственном будущем поможет ввести этот метод в рутину специализированных лабораторий. Целевое типирование по нескольким генам Одним из ключевых элементов МЛСТ является то, что оно проводится во всех лабораториях мира по стандартной процедуре с одним и тем же набором генов. Однако, более детальный молекулярно-эпидемиологический анализ может потребовать изучение и других генов для более точной дискриминации различных генотипов. Эпидемические клоны менингококков серогруппы А было предложено дополнительно характеризовать по вариабельным генам, кодирующим белки tbpB (трансферрин-связывающий белок), iga (IgA-протеаза), opaB и opaD (так называемые "белки непрозрачности") и вставочному элементу IS1106. Аллели данных белков сначала были изучены путем прямого секвенирования, затем были подобраны рестриктазы, позволяющие дифференцировать аллели с помощью более быстрого и дешевого метода ПЦР с рестрикционным анализом [Achtman 2001]. Преимущества и ограничения метода: применяется для уточняющего, детального типирования, но не для базового генотипирования. Применение генотипирования для характеристики менингококков в Москве Применив МЛСТ-методологию и метод амплификации со случайными праймерами к анализу коллекции менингококков группы А, изолированных в 1969-97 годы в Москве от больных менингококковой инфекцией, нам удалось показать, что за этот период произошло по меньшей мере три смены клона, превалирующего на данной территории (см. Таблицу 5). В 1969-77 годах преобладали менингококки субгруппы III, МЛСТ-тип СТ-5. В 1983-85 годах преобладали менингококки субгруппы X и присутствовали менингококки субгруппы VI. Менингококки субгруппы III исчезли. В 1986-93 годах выявлялись только менингококки субгруппы VI. Для 1994-95 годов наиболее типичны штаммы субгруппы VI, однако встречаются и единичные изоляты субгрупп III и X. В 1996-97 годы вновь отмечается полное преобладание менингококков субгруппы III, однако имеющих CT-7 МЛСТ-тип [Achtman 2001].]. Подобные резкие смены превалирующих клонов не были характерны для менингококков серогрупп В и С, популяции которых была крайне гетерогенны в 1983-1997 годы во время спада вызванной ими заболеваемости [Кoroleva 1998]. Таблица 5. Годы изоляции определенных субгрупп N. meningitidis серогруппы А, Москва 1969-1997 гг. Число штаммов Субгруппа Сиквенс-тип III СТ-5 X VI CТ-74, 75, 76, 77 CT-2, 68, 69, 70, 71, 72, 73 III СТ-7 прочие всего Годы 1969-71 14 1973-77 3 1983-85 1 1 3 21 1986-93 6 27 24 24 1994-95 1 8 2 1996-97 1 1 19 23 40 21 Всего: 17 16 1 12 21 2 103 Существенно, что подобный эпидемиологический анализ не мог быть проведен с помощью серологических методов типирования, поскольку штаммы менингококков субгруппы III, сиквенс-типов 5 и 7, не отличаются по серотипу и серосубтипу (Таблица 6). Менингококки субгрупп X и VI также не дискриминируются по серотипу и серосубтипу. При этом менингококки субгруппы X до настоящего момента не были обнаружены где-либо, кроме Москвы и могли быть эндемичны для данного региона; менингкококки субгруппы VI были ответственны на эндемическую заболеваемость в Москве и Восточной Европе (ГДР) в конце восьмидесятых годов. Таблица 6. Серологическая характеристика N. meningitidis серогруппы А, Москва 1969-1997 гг. Субгруппа Число штаммов и % от общего числа штаммов данной субгруппы Серотип Серосубтип III 34/38 (89%) 21 P1.20,9 VI 6/39 (15%) 21 P1.10 VI 12/39 (31%) 4,21 P1.10 VI 17/39 (44%) 4,21 P1.5,10 X 17/24 (71%) 4,21 P1.10 X 6/24 (25%) 21 P1.10 Периоды преобладания в Москве менингококков субгруппы III совпадают с эпидемией (заболеваемость более 10 случаев на 100000 человек в год в 1969-73 гг.) и крупной вспышкой менингококковой инфекции, поразившей сотни человек (1996). Сравнительный анализ МЛСТ типов и последовательностей гипервариабельных генов iga, tbpB, opaB, opaD, вставочного элемента IS1106 у штаммов менингококков, выделенных в разных странах мира, указывает на то, что как в конце шестидесятых, так и в середине девяностых годов патогенные менингококки субгруппы III могли быть импортированы в Москву из Китая (Таблица 7). Изучение гипервариабельных генов позволяет дополнительно разбить штаммы, относящиеся к субгруппе III, на восемь различных генотипов [Achtman 2001]. Генотип 2, ответственный за эпидемию 1969-75 гг., наиболее близок к генотипу 1, выявленному ранее в Китае. Некоторые авторы (Костюкова и др.) связывают начало эпидемии с прибытием в центральную часть России вьетнамских рабочих, ехавших на поезде через Китай. Генотип 8, выявляемый во второй половине девяностых годов, мог произойти из "пандемического" генотипа 3 путем постепенной эволюции в Китае, где в 1982-1992 гг. выявлялись "промежуточные" штаммы N.meningitidis. Затем генотип 3 начал пандемическое распространение по всему миру. Таблица 7. Аллели генов, отличающие различные генотипы менингококков серогруппы А, эпидемической субгруппы III. Локус (ген) и его аллель Тип штамма Число штаммов tbpB iga pgm IS1106 opaB opaD 3 1 2 3 A10 92 131 Генотип 3, СТ-5, первая пандемия: Китай 1984, Западная Европа 1969-85, Бразилия 197376 43 1 2 3 A4 92 131 Генотип 8, СТ-7, третья пандемия: Китай 1993, Монголия 1994-95, Африка 1995-99, Великобритания 1997-2000 43 55 2 19 A7 92 131 Генотип 2, СТ-5, Москва, 19691973 14 38 2 3 A10 140 131 Генотип 8, СТ-7, Москва, 19941997 21 55 2 19 A7 92 131 Генотип 1, СТ-5, Китай 1966 Примечательно, что в 1991-99 годах наивысшая заболеваемость менингококковой инфекцией в России регистрировалась в дальневосточных районах, граничащих с Китаем. Быстрое и широкое распространение генотипа 3 указывает на его высокий эпидемический потенциал и должно вызвать настороженность органов эпиднадзора. Ожидаемый эффект от внедрения метода Последовательное и широкое применение генотипирования предоставляет принципиально новый инструмент в руки эпидемиолога и, в некоторых случаях, инфекциониста, поскольку морфологические, биохимические и серологические методы типирования дают недостаточно детализированные и трудно поддающиеся стандартизации результаты. В идеале применение генотипирования способно помочь как непосредственно проследить эпидемическую цепочку, так и решать общие задачи эпидемиологии и молекулярной эволюции патогенных микроорганизмов. Обсуждаемые в данном пособии подходы представляют собой только первые этапы создания нового научно-практического направления, которое несомненно получит дальнейшее развитие. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Обсуждаемые в данном пособии методики являются не заменой традиционных и апробированных микробиологических методик, но их существенным и необходимым дополнением. Широкое применение генодиагностики и генотипирования позволит повысить уровень диагностики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов и предоставит возможность более полного эпидемиологического слежения за распространенностью различных вариантов их возбудителей на территории России. 2. В современных условиях далеко не всякое лечебно-диагностическое учреждение России располагает возможностями для генодиагностики и, тем более, генотипирования бактериальных менингитов, хотя число подобных учреждений неуклонно расширяется. Однако, это не повод для недостаточного внимания к хорошо себя зарекомендовавшим и прогрессивным подходам. ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ готов оказать необходимую методическую помощь для создания специализированных ПЦР-лабораторий и внедрения методов ПЦРдиагностики широкого спектра бактериальных и вирусных инфекций, в том числе ГБМ, а также развивать обмен опытом с учреждениями, уже ведущими ПЦР-диагностику. Интенсивно разрабатываемые и экстенсивно распространяющиеся генетические методы нуждаются в стандартизации, сертификации и контроле качества, что невозможно без широкомасштабного сотрудничества специалистов различного профиля. ЛИТЕРАТУРА 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Медицинская микробиология / Под ред. В.И.Покровского, О.К.Поздеева. - М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. 1200 с. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. / Разработчики: Покровский В.В. Федоров Н.Л. Шипулин Г.А. и др. // ГКСЭН РФ, Москва 1995. Платонов А.Е. Резистентность человека к генерализованным бактериальным инфекциям (на примере менингококковой инфекции). // Вестник РАМН. – 1999. - № 5. C.40-45. Платонов А.Е., Белобородов В.Б., Вершинина И.В. Клинические особенности менингококковой инфекции у лиц с дефицитами терминальных компонентов комплемента. // Тер. архив. – 1999. - № 11. C.14-20. Платонов А.Е., Королева И.С. 10-я и 11-я международные конференции по патогенным нейссериям. // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 1999. - № 4. -C.60-64. Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Королева И.С., Шипулина О.Ю. Перспективы диагностики бактериальных менингитов. // Журн. микробиол. – 1999. - № 2. – С. 71-76. Платонов А.Е., Шипулин Г.А. Платонова О.В. Мультилокусное секвенирование - новый метод генотипирования бактерий и первые результаты его применения. // Генетика. – 2000. - Т.36, № 5. C.597-605. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: Издательство РАМН, 2000. С.1-51. Покровский В.И., Фаворова Л.А., Костюкова Н.Н. Менингококковая инфекция. - М.: Медицина, 1976. – 275 с. Практическое руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях. / Женева, ВОЗ, 1994. Приказ МЗ РФ № 375 от 23.12.1998. О мерах по усилению эпидемологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов // - Москва, 1998. С.1-57. Санитарные правила СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами" // Минздрав России, Москва, 1999. Санитарные правила СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов I-IV групп патогенности" // ГКСЭН России, Москва, 1996. Черкасский Б.Л. // Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Т.1 / Под. ред. В.И.Покровского. - М., 1993. Achtman M, van der Ende A, Zhu P, Koroleva IS, Kusecek B, Morelli G, Schuurman IGA, Brieske N, Zurth K, Kostyukova NN, Platonov AE. Clonal groupings associated with successive waves of serogroup A meningococcal disease from 1969 to 1997 in Moscow, Russia. // Emerging Infectious Diseases. – 2001. - Vol.7. Bevanger L., Bergh K., Gisnss G., et al. Identification of nasopharyngeal carriage of an outbreak strain of Neisseria meningitidis by pulsed-field gel electrophoresis versus phenotypic methods // J. Med. Microbiol. 1998. - Vol.47. - P.993-998. Griffiss JM. Mechanism of host immunity // Meningococcal disease / Ed. Cartwright K. - Chichester, 1995. P.35-70. Koroleva I.S., Platonov A.E., van der Ende A., et al. Characteristics of pathogenic Neisseria meningitidis in Moscow: Prevalence of "non-European" strains // Clin. Microbiol. Infection. - 1998. - Vol.4. - P.123-128. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1998. - Vol.95. P.3140-3145. Spratt B.G., Maiden M.C. Bacterial population genetics, evolution and epidemiology // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. - 1999. - Vol.354. - P.701-710. Swaminathan B., Matar G.M., Reeves M.V., et al. Molecular subtyping of Neisseria meningitidis serogroup B: comparison of five methods // J. Clin. Microbiol. - 1996. - Vol.34. - P.1468-1473. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V. How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections: a review for healthcare epidemiologists // Infect. Control. Hosp. Epidemiol. - 1997. - Vol.18. - P.426-439.
