Лабораторный практикум по общей микробиологии
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ ПО ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ ДЛЯ СПЕЦИАЛЬНОСТЕЙ:040100 – ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЛО 040400 – СТОМАТОЛОГИЯ Нальчик 2005 УДК 576.8 (075) ББК 28.4 я73 Г12 Рецензент: Доцент кафедры микробиологии Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии Якушенко О.С. Составители: Габрилович И.М., Блиева Л.З., Хараева З.Ф. Методические указания к лабораторным занятиям по общей микробиологии. Методические разработки. – Нальчик:Каб.-Балк.университет, 2006 -155с. В методических разработках содержится описание лабораторных занятий по разделам общей микробиологии. К каждой теме дается краткая характеристика темы занятия, практикуму список заданий по лабораторному и контрольные вопросы. Издание предназначено для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по микробиологии и контроля усвоения материала. Рекомендовано РИСом университета УДК 576.8 (075) ББК 28.4 я73 Кабардино-Балкарский государственный университет, 2005 РАЗДЕЛ I. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ТЕМА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ Лабораторные занятия по микробиологии, вирусологии и иммунологии начинаются с ознакомления студентов с организацией микробиологической лаборатории, её оборудованием, основными методами исследования. В микробиологических лабораториях выполняется бактериологические, вирусологические и серологические анализы материалов, полученных от больных (с бактерионосители исследования целью и воды, диагностики проводятся воздуха, заболеваний), санитарно почвы, – обследуются микробиологические пищевых продуктов. Микробиологические лаборатории создаются при лечебных, учебных и научных учреждениях, санитарно – эпидемиологических станциях (СЭС). Работа с болезнетворными микробами требует обязательного соблюдения ряда правил личной профилактики. Правила работы в микробиологических лабораториях 1. Работа в лаборатории должна проводиться в сменной обуви, в медицинских халатах и шапочках. В необходимых случаях на лицо надевается маска. При работе с особо опасными микроорганизмами необходимо руководствоваться специальными инструкциями. 2. В лаборатории не разрешается курить и принимать пищу, а также делать лишние передвижения. 3. Рабочее место должно быть в образцовом порядке, личные вещи следует хранить в специально отведенных местах. Из личных вещей студента на рабочем столе допускается иметь только рабочую тетрадь, в которой делаются записи и зарисовки. 4. При случайном попадании заразного материала на стол или на пол это место тщательно обрабатывается дезинфицирующим раствором. 5. После окончания работы нужно тщательно вымыть руки и при необходимости обработать их дезинфицирующим раствором. 6. Хранение и уничтожение микроорганизмов проводится согласно специальным инструкциям. Методы микробиологических исследований Все микробиологические исследования могут быть сведены к 5 основным методам: – микроскопический метод состоит в изучении исследуемого материала с помощью различных микроскопов; – бактериологический (микологический, вирусологический) метод заключается выделении в искусственном чистых культур культивировании с последующей микроорганизмов их и идентификацией (определением вида); – серологический метод основан на определении специфических антител к антигенам в крови и других биологических жидкостях пораженного организма с помощью различных реакций иммунитета; – биологический; или экспериментальный, метод заключается в заражении животных исследуемым материалом с целью воспроизведения инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя; – аллергический метод заключается в постановке кожных аллергических проб с соответствующими аллергенами с целью обнаружения повышенной чувствительности возбудителям инфекционных макроорганизма заболеваний к или определенным продуктам их жизнедеятельности. Микроскопический метод исследования Изучение морфологии микроорганизмов ввиду их малой величины возможно только с помощью микроскопа. Для микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии. Современные световые микроскопы характеризуются предельной разрешающей способностью 0,2 мкм, под которой понимают наименьшее расстояние между двумя точками, различимое с помощью микроскопа. Разрешающая способность микроскопа (d) описывается формулой: d =/NA, где – длина волны проходящего света, NА – численная (нумерическая) апертура объектива, равная nsin (n – показатель преломления среды между объектом и объективом, а – половина отверстного угла, образуемого двумя крайними лучами, попадающими в объектив). Для иммерсионных объективов NA=1,25, для объективов сильного увеличения – 0,65, для объективов слабого увеличения – 0,2. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В повседневной практике обычно используют увеличение порядка 630 – 900. Основными разновидностями метода световой микроскопии являются: Микроскопия в темном поле. Ее применяют для изучения неокрашенных микробов, их подвижности. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной центральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лучей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи. В связи с этим поле зрения остается неосвещенным, в то время как объекты, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне. Люминесцентная микроскопия. Люминесценция – это свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией (коротковолновая и ультрафиолетовая части спектра). Микробы обладают слабой собственной первичной люминесценцией, и поэтому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами; люминесцирующих красителей – флюорохромами, ультрафиолетовых и которые коротковолновых светятся синих под лучей. влиянием Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, т. е. связываются с отдельными клеточными структурами (ядро, цитоплазма, включения). Для люминесцентной микроскопии необходим источник ультрафиолетового света и набор светофильтров. Фазово–контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашенных микробов затруднено в связи с их малой контрастностью. В видимом свете они прозрачны. Однако при прохождении света через микробную клетку происходит изменение фазы световых лучей, что обусловлено различиями толщины и показателей преломления отдельных структур. Эти изменения могут быть обнаружены при использовании специальных фазово–контрастных микроорганизмы и отдельные устройств, части в микробной результате клетки чего становятся контрастными и видимыми человеческим глазом. В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов, излучаемых специальным источником (электронная пушка). На пути потока электронов помещены электромагнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирующими, т. е. действует подобно линзам для световых лучей. Исследуемый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают в безвоздушной среде на пути потока электронов после их прохождения через конденсорную линзу. Затем пучок электронов проходит через объективную и проекционные линзы. Изображение флюоресцирующем микроскопируемого экране. Возникновение объекта наблюдают изображения на на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обладают неодинаковой проницаемостью для электронов. Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты величиной 10 – 10000 нм. Ее широко применяют для исследования тончайших структур бактериальной клетки и функциональных особенностей ее компонентов, для изучения морфологии и биологических свойств вирусов и фагов. В сканирующем-зондовом микроскопе используют используют комбинации инвертированного оптического и зондового микроскопов. Минимальный шаг сканирования составляет 0,01нм. Сканирующая-зондовая микроскопия применяется для определения плотности и размеров бактерий и вирусов, определения параметров состояния мембран (эластичности, проводимости), исследования структуры ДНК, особенностей биомакромолекул и антигенов поверхности клеток. ЗАДАНИЕ 1. Ознакомиться с основным оборудованием микробиологической лаборатории, с лабораторной посудой, оборудованием рабочего места. Микробиологическая лаборатория должна иметь лабораторные столы, покрытые материалами (линолеум, пластик), которые хорошо моются и могут подвергаться обработке дезинфицирующими растворами; винтовые табуреты, удобные как для микроскопирования, так и для другой работы; шкафы для посуды, питательных сред, реактивов. Необходимым оборудованием микробиологической лаборатории являются: термостат, компрессор, автоклав, холодильники, аналитические. центрифуги, Лаборатория инструментарием: пробирки сушильный оснащается шкаф, весы микроанаэростат, лабораторные необходимой бактериологические, и посудой и серологические и центрифужные, чашки Петри, пипетки градуированные и пастеровские, стекла предметные стерилизаторы для и покровные, наборы инструментов, инструментов, водяные бани, шприцы, аппаратура для фильтрования и др. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими сыворотками и другими и лабораторными материалами. Лабораторный иммерсионным стол маслом, оборудуется газовыми биологическим горелками (или микроскопом, спиртовками), бактериологической петлей, дезинфицирующим раствором, штативом для пробирок. Для окраски препаратов на столе должны находиться набор красителей, спирт, фильтровальная бумага, эмалированный кювет, емкость с водой, предметные стекла, пинцет для извлечения стекол, банка для отработанных стекол. 2. Освоить особенности работы с иммерсионной системой микроскопа при исследовании готовых препаратов. При иммерсионной микроскопии окрашенных препаратов необходимо создавать хорошее освещение, для чего надо максимально поднять конденсор, открыть диафрагму конденсора, поставить малый сухой объектив на расстоянии 5 – 7 см от предметного столика и с помощью плоского зеркала установить равномерное освещение поля зрения. При работе с иммерсионной необходимо соблюдать системой следующие во избежание порчи правила: после объектива нанесения на поверхность препарата небольшой капли иммерсионного масла под контролем глаза сбоку погрузить в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива, а затем, глядя в окуляр, при помощи сначала макрометрического, а затем микрометрического винта установить препарат в фокусе микроскопа. Микроскопирование необходимо проводить, не снимая руки с микрометрического винта, что дает возможность, изменяя фокусное расстояние, рассмотреть всю поверхность поля зрения. После работы иммерсионная система и столик микроскопа должны быть очищены от масла. 3. Микроскопировать нативные препараты бактерий. При микроскопировании живых микроорганизмов можно, наряду с формой бактерий, наблюдать за их подвижностью, а также определить количество клеток в исследуемом объеме. Живые микроорганизмы исследуют в препаратах "висячая" и "раздавленная" капля. Приготовление препарата "висячая капля" На середину покровного стекла нанести каплю исследуемой жидкой культуры. Каплей вниз опустить покровное стекло на предметное стекло с углублением (лункой), края которого смазаны вазелином. Капля должна свободно свисать и не касаться дна краев углубления. Создается герметически закрытая камера, в которой бактерии можно наблюдать длительное время (4-6 часов). При малом увеличении найти край капли, после чего переместить ее в центр поля зрения и микроскопировать с объективом сильного увеличения и с иммерсионным объективом. Приготовление препарата "раздавленная капля" На середину предметного стекла нанести каплю жидкой бактериальной культуры. Осторожно накрыть её покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха, после чего микроскопировать с малым сухим, а затем с большим сухим и иммерсионным объективами. Прижизненная окраска бактерий Для такой окраски применяются сильно разбавленные растворы красителей, которые не оказывают токсического действия на бактерии. На предметное стекло нанести каплю 0,001% раствора метиленового синего, в которую внести взвесь бактерий, после чего приготовить препарат "раздавленная капля" и микроскопировать его. Контрольные вопросы 1. Что является предметом изучения микробиологии? 2. Какие разделы включает микробиология? 3. Основные этапы развития микробиологии. 4. Каковы принципы таксономии микроорганизмов? 5. В чем состоит нумерическая таксономия микроорганизмов? 6. Как строится номенклатура микроорганизмов? 7. Каково назначение микробиологической лаборатории? 8. В чем состоят основные правила работы в микробиологической лаборатории? 9. Каковы методы микробиологических исследований? 10.Из каких частей состоит биологический микроскоп? 11.Как определить увеличение микроскопа? 12.Что собой представляет разрешающая способность микроскопа? От чего она зависит? 13.Какие существуют методы микроскопирования? 14.Каковы правила работы с сухими объективами? 15.В чем состоит принцип иммерсионной микроскопии? 16.Каковы правила иммерсионной микроскопии? 17.В чем состоит фазово – контрастная микроскопия? Ее применение. 18.С какой целью применяется темнопольная микроскопия? 19.Каков принцип люминесцентной микроскопии? 20.В чем состоит электронная микроскопия? Каковы ее возможности? 21.В чем состоит принцип сканирущей-зондовой микрскопии? 22.Какими методами исследуются нативные препараты бактерий? 23.В чем состоит приготовление препарата "висячая капля"? 24.Как готовится препарат "раздавленная капля"? 25.В чем состоит прижизненная окраска бактерий? ТЕМА 2. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ: МОРФОЛОГИЯ И СТРУКТУРА БАКТЕРИЙ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ, ПРОСТЫЕ И СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ Всем бактериям присущи определенная форма и размеры, которые выражаются в микрометрах. Они варьируют в широких пределах – от 0,1 – 0,15 мкм (Mycoplasma) до 10 – 15 мкм (Clostridium) в длине и от 0,1 мкм до 1,5 – 2,5 мкм в диаметре. Бόльшая часть бактерий имеет размеры от 0,5 – 0,8 мкм до 2 – 3 мкм. Различают следующие основные формы бактерий: шаровидные (сферические), или кокковидные, палочковидные (цилиндрические), извитые (спиралевидные), нитевидные. Существуют бактерии, имеющие треугольную форму. Обнаружены так называемые квадратные бактерии, которые образуют скопления из 8 или 16 клеток в виде пласта. Организация бактериальной клетки такова, что она позволяет ей координировать все процессы жизнедеятельности, за определенный срок удваивать свою биомассу и размножаться путём бинарного деления. В составе бактериальной клетки можно выделить различные структуры: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, мезосому, периплазматическое пространство, цитоплазматические включения, рибосомы, капсулу, микрокапсулу, жгутик, плазмиды, пили, фимбрии, перемычки в периплазматическом пространстве. Клеточная стенка – структурный компонент, присущий только бактериям: сохраняет постоянную форму клетки; защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды; участвует в регуляции роста и деления клеток; обеспечивает коммуникацию с внешней средой через каналы и поры; несёт на себе специфические рецепторы для бактериофагов; определяет антигенную характеристику бактерий; содержащийся в её составе пептидогликан наделяет клетку важными иммунобиологическими свойствами; Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L – трансформации. Структура и химический состав клеточной стенки у разных бактерий не одинаков. По окраске мазков по методу Грама все бактерии дифференцируют на грамположительные и грамотрицательные, которые характеризуются отличительными особенностями (табл. 1). Таблица 1 Особенности клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий Признак и компоненты 1. Структура 2. Толщина 3. Ригидный и пластичный 4. Пептидогликан 5. Тейховые кислоты 6. Наружная мембрана 7. Белки 8. Чувствительность к пенициллинам и лизоциму Представители Грамположительные Грамотрицательные однородная 20 – 60нм связаны ковалентно слоистая 14 – 18 нм связаны лабильно до 90% сухой массы, предст. 5 – 6 слоями, часто не содержит диаминопимелиновую кислоту до 50% сухой массы у некоторых имеются токсические гликолипиды; липополисахариды отсутствуют белки, определяющие антигенную специфичность высоко чувствительна до 5 – 10% сухой массы предст. 1 – 2 слоями, содержит диаминопимелиновую кислоту отсутствуют представлена липопротеинами, фосфолипидами, липополисахаридами бациллы, клостридии, коринебактерии, стафилококки, стрептококки, пептококки энтеробактерии, вибрионы, нейссерии, вейлонеллы, бактероиды, спириллы, псевдомонады белки – порины менее чувствительна Цитоплазматическая мембрана является полифункциональной структурой. Выполняет следующие функции: воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды; является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление; совместно с клеточной стенкой участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерий; участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид; в цитоплазматической мембране содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов; участвует в процессах транспорта питательных веществ в клетку и продуктов жизнедеятельности из клетки в окружающую среду; участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и образовании мезосом; с цитоплазматической мембраной связаны жгутики и аппарат регуляции их движения. Цитоплазма бактерий представляет собой сложную коллоидную систему. Она неподвижна. В цитоплазме располагаются ядерный аппарат – нуклеоид, плазмиды, рибосомы, мезосомы, различные включения. Нуклеоид состоит из одной замкнутой спиральной нити ДНК. Длина нити – около 1 мм. Это одиночная бактериальная хромосома. В нуклеоиде также находятся РНК – полимераза, основные белки (но не гистоны). Бактериальная хромосома имеет вид бус. Один конец её часто связан с мезосомой. Плазмиды – внехромосомные генетические структуры бактерий. Представляют собой замкнутую молекулу двухнитчатой ДНК, связанную с белком. Локализуются в цитоплазме клетки или в состоянии интеграции с хромосомой. Приобретение или утрата плазмид приводит к приобретению или утрате одного или нескольких признаков, хотя существуют «немые» плазмиды. Наиболее известны F – плазмида, R – фактор, Col – плазмида. Мезосомы – мембранные структуры бактерий, выполняющие функцию генерации энергии, аналоги митохондрий эукариот. Способны ассоциироваться с рибосомами. Представляют собой инвагинации цитоплазматической мембраны, на которой локализованы ферменты дыхания. Рибосомы – внутриклеточные органоиды, осуществляющие синтез белка. Состоят из белка и трех типов РНК, построены из 2 субъединиц. Бактериальные рибосомы не связаны с мембранным аппаратом, имеют константу седиментации 70S. Для изучения морфологии бактерий из них готовят нативные (прижизненные) препараты и фиксированные мазки. Фиксированные окрашенные препараты позволяют разграничить бактерии, выявлять детали строения микробной клетки, они удобны в практической работе, особенно при изучении патогенных микроорганизмов. Подготовка фиксированных препаратов включает приготовление мазка, высушивание его, фиксацию и окрашивание мазка. Для приготовления мазка на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал с плотной питательной среды и распределяют так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1 – 1,5 см. При приготовлении мазков из жидких культур исследуемый материал непосредственно наносится на предметное стекло. Высушивание мазка проводится на воздухе или в струе тёплого воздуха. Фиксация мазка производится с целью прикрепления микроорганизмов к стеклу и обеззараживания препарата. Кроме того, фиксированные бактерии лучше воспринимают красители. Для фиксации мазков высушенный препарат проводят 3 – 4 раза через пламя горелки, причём в пламени препарат следует выдерживать не более 2 секунд. Если фиксация проведена правильно, стекло при прикосновении к тыльной поверхности руки тотчас после окончания процесса фиксации слегка обжигает кожу. В некоторых случаях мазки можно фиксировать путем погружения в этиловый спирт на 15 – 20 минут, в смесь равных объёмов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова) на 15 – 20 минут, в ацетон на 5 минут. Окрашивание мазков осуществляется растворами анилиновых красителей. В основе окраски лежат сложные химические и физико – химические процессы взаимодействия компонентов микробной клетки с анилиновыми красителями. Красящая способность последних зависит от наличия у них карбоксильных, серосодержащих, аминогрупп, от заряда микробной клетки. Для окраски микроорганизмов используют, главным образом, основные красители - метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый, фуксин, гематоксилин, везувин и др.. Для выявления различных структурных элементов бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители (нейтральный красный, кислый фуксин, Конго, пикриновая кислота и др.). Отношение микроорганизмов к красителям определяет их тинкториальные свойства. Различают простые и сложные методы окраски. Первые состоят в окрашивании мазков одним красителем и дают возможность ознакомиться с общей морфологией микробов. Сложные, или дифференцированные, способы окраски производятся различными красителями и применяются для детального изучения структуры клетки, а также для характеристики и дифференциации данного микроба от других. ЗАДАНИЕ 1. Приготовить мазки из жидкой культуры бактерий и с плотной питательной среды. 2. Окрасить мазок простым способом, для чего на фиксированный препарат нанести водный раствор фуксина (фуксин Пфейффера) на 1 – 2 мин или раствор метиленового синего на 3 – 5 мин, затем краску слить, препарат ополоснуть водой и просушить с помощью фильтровальной бумаги. Микроскопировать с иммерсионной системой и зарисовать. 3. Окрасить мазок дифференцированным методом. Техника окраски по Граму а) на фиксированный препарат поместить полоску фильтровальной бумаги и на неё нанести раствор карболового генцианвиолета на 1 – 2 минуты; б) краситель слить, снять фильтровальную бумагу и обработать препарат в течение 1 – 2 минут раствором Люголя до почернения препарата; в) слить раствор Люголя и на препарат нанести несколько капель этилового спирта на 30 – 60 сек; г) промыть водой и докрасить препарат водным фуксином в течение 1 – 2 минут; д) слить краску, промыть водой, высушить и микроскопировать препарат с иммерсионной системой. При данном методе одни бактерии окрашиваются в тёмно – фиолетовый цвет (грамположительные), другие – в красный или розовый (грамотрицательные). Сущность метода состоит в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксируют комплекс генцианвиолет – раствор Люголя, не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов комплекс легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем. Зарисовать грамположительные и грамотрицательные бактерии. 4. Изучить в готовых микроорганизмов: препаратах шаровидные, различные палочковидные, формы извитые, нитевидные. Контрольные вопросы 1. Каковы морфологические и структурные особенности строения бактериальной клетки? 2. Какова структура, химический состав и функции клеточной стенки бактерий? 3. Какими отличительными особенностями характеризуются клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий? 4. Какую роль играет цитоплазматическая мембрана? 5. Каковы особенности организации ядерного аппарата бактерий? 6. Чем характеризуются плазмиды? 7. Что собой представляют цитоплазма, мезосомы и рибосомы бактерий? 8. Как и для чего производится фиксация мазков? 9. В чём состоит механизм окраски бактерий и от чего он зависит? 10.С какими целями применяются простые и сложные методы окраски? 11.В чём заключается принцип окраски по Граму? 12.Каковы преимущества исследования бактерий в живом состоянии и в фиксированных окрашенных препаратах? ТЕМА 3. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ: МОРФОЛОГИЯ И СТРУКТУРА БАКТЕРИЙ. СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой. Микрокапсула выявляется при электронной микроскопии в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула представляет собой слизистый слой, который обычно сохраняет связь с клеточной стенкой. Капсула служит внешним покровом бактерий, толщина её более 0,2 мкм, она чётко обнаруживается под микроскопом после негативного окрашивания. Например, по методу Бурри – Гинса. Капсулы, в связи с их гелеобразной консистенцией, плохо удерживают красители, поэтому для их обнаружения наиболее приемлем метод негативного контрастирования. По химическому составу различают капсулы, состоящие из полисахаридов, содержащих азот (аминосахара); капсулы полипептидной природы. Некоторые виды патогенных бактерий (S. pneumoniae, B. anthracis, C. perfringens и др.) образуют капсулы лишь в организме человека или животного, другие – как в организме, так и на искусственных питательных (иногда специальных) средах (S. aureus, S. Pyogenes, K. pneumoniae, K. rhinoscleromaris и др.). У патогенных бактерий капсула может окружать одну, две или целую цепочку клеток. Капсулы образуют мощную оболочку бактерий, предохраняют их от высыхания, несут для них запасные питательные вещества. Капсульные антигены патогенных бактерий определяют их антигенную специфичность и иммуногенные свойства. Нередко слизистые экзополимеры выделяются бактериальной клеткой в значительно большем количестве, частично отделяются от неё и образуют рыхлый слизистый слой. В цитоплазме бактерий могут содержаться включения – компактные скопления химических веществ в форме видимых в световой микроскоп гранул. Представляют собой запасные питательные вещества или продукты обмена (волютин, гликоген, крахмал, жиры, сера, железо и др.). Присутствуют непостоянно. Имеют значение в идентификации. Выявляются специальными методами окраски анилиновыми красителями. Бактерии имеют органоиды движения – жгутики. Это тонкие длинные нитевидные белковые образовании диаметром 12 – 30 нм и длиной от 6 – 9 до 80 мкм. Белок, из которого построены жгутики, называется флагеллин. Он обладает сократительной способностью. Жгутик состоит из однотипных спиралевидных или продольно уложенных вокруг полой сердцевины белковых субъединиц, образующих цилиндрическую структуру, которая особым образом прикреплена к бактериальной клетке. По характеру расположения жгутиков и их количеству подвижные бактерии условно делят на 4 группы: 1) монотрихи – один полярно расположенный жгутик (V. cholerae); 2) лофотрихи – пучок жгутиков на одном конце (Pseudomonas methanica); 3) амфитрихи – по одному жгутику или пучки жгутиков на обоих концах клетки (Spirillum volutans); 4) перитрихи – множество жгутиков, расположенных вокруг клетки (E. coli, Salmonella typhi). Жгутики выявляются прямым путем с помощью специальной окраски (с использованием протравы, которая вызывает набухание жгутиков) или косвенно по движению в капле суспензии, регистрируемому в темнопольном, фазово – контрастном и световом микроскопах, по диффузному помутнению полужидких сред или серологически. На поверхности некоторых бактерий располагаются нежные реснички. Это небольшие трубочки, по внешнему виду напоминающие жгутики, но в отличие от них тоньше, короче, имеют канал. Встречаются у грамотрицательных бактерий. Различают: половые секс – пили и общие – фимбрии. Секс – пили – нитевидные структуры белковой природы (длина 0,5 – 10 мкм), которые образуются под контролем F – фактора (F – пили) или Col – фактора (i – пили). Возникают на поверхности бактерий в процессе конъюнкции и выполняют функцию органеллы, через которую ДНК переходит от донора к реципиенту. Количество плазмид (1 – 2 на клетку). Они отличаются антигенной специфичностью, наличием терминальных вздутий, способностью у адсорбции фагов, причём на i – пили – i – подобные фаги. Фимбрии – трубчатые образования, исходящие из цитоплазмы. Их синтез контролируется бактериальной хромосомой. Общий диаметр фимбрий равен 3 – 25 нм, внутренний диаметр канала – около 2 нм. Одна бактерия может содержать сотни фимбрий, расположенных или на боковых поверхностях бактерии, например, у кишечной палочки, или на полюсах, например, у псевдомонад. Фимбрии принимают участие в слипании бактерий в агломераты, в их прилипании к различным поверхностям, в питании, поддержании осмотического давления. Выявляют агглютинацией эритроцитов и иммунными реакциями. Могут быть обнаружены лишь при электронной микроскопии. Некоторые бактерии при неблагоприятных для существования условиях образуют характерно для защитные бактерий Sporolactobacillus, формы родов – споры. Bacillus, Clostridium, и Desulfatomaculum Спорообразование Sporosarcina, актиномицетов рода Thermoactinomyces. Спора, образующая внутри цитоплазмы бактериальной клетки, может иметь округлую или овальную форму. Она может располагаться в центре (центральное расположение у С.perfringens), на конце (терминальное расположение у C. tetani) или ближе к одному из концов (субтерминальное расположение у C. botulinum). Спора отличается от вегетативной формы репрессией генома, почти полным отсутствием обмена веществ, малым количеством свободной воды в цитоплазме, повышением в ней концентрации ионов кальция и появлением дипиколиновой кислоты, с которыми связывают термоустойчивость споры. образованием дополнительных оболочек, препятствующих осуществлению ЗАДАНИЕ 1. Приготовить препарат по методу Бурри – Гинса и микроскопировать его. Выявление капсул по методу Бурри – Гинса а) на край предметного стекла нанести каплю туши, а рядом каплю исследуемой культуры. Капли быстро перемешать и с помощью шлифованного стекла приготовить тонкий мазок; б) после высушивания мазок фиксировать над пламенем и окрасить фуксином в течение 1 – 2 минут; в) осторожно промыть водой и высушить. Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашивается и имеет вид светлой зоны вокруг бактерий на тёмном фоне. 2. Окраска включений волютина по методу Нейссера Приготовить мазок и окрасить по методу Нейссера для выявления зёрен волютина, микроскопировать. а) фиксированный мазок окрасить в течение 2 – 3 минут уксуснокислой синькой Нейссера; б) препарат 10 – 30 секунд обрабатывать раствором Люголя; в) не промывая водой, мазок докрасить в течение 30 – 60 секунд везувином. Зёрна волютина окрашиваются в синий цвет, тела клеток – в жёлтый. 3. Микроскопировать препарат, приготовленный по методу Леффлера. Окраска жгутиков по методу Леффлера а) приготовить мазок из 18 – 24 – часовой культуры, для чего взвесь бактерий внести в каплю стерильной водопроводной воды, нанесенной на предметное стекло и высушить; б) мазок обработать в течение 15 – 20 минут протравой, содержащей 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 25 % водного раствора танина и 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа; в) мазок тщательно промыть водой, высушить на воздухе и докрасить фуксином Циля в течение 3 – 4 минут при легком подогревании; г) препарат промыть водой и высушить. 4. Приготовить мазок из спороносной культуры способом Ожешки, окрасить по Цилю – Нильсену и микроскопировать. Выявление спор способом Ожешки а) приготовить мазок на краю предметного стекла; б) нефиксированный мазок подвергнуть протравливанию кислотой при повышенной температуре, для чего на мазок налить 1 % раствор соляной кислоты и подогреть над пламенем горелки в течение 2 – 3 минут; в) кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. При такой обработке оболочка споры размягчается и становится доступной для красителя. Далее мазок окрасить по методу Циля – Нильсена: а) на мазок поместить кусочек фильтровальной бумаги, на него налить карболовый фуксин Циля и подогреть стекло над пламенем горелки до появления паров; б) охладить, снять бумагу, промыть водой и обесцветить 5 % серной кислотой в течение 30 секунд; в) препарат тщательно промыть водой и докрасить раствором метиленового синего в течение 3 – 5 минут; г) препарат промыть водой и высушить. Карболовая кислота разрыхляет оболочку споры и тем самым повышает её тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия бактериальных спор с красителями. Споры окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные тела бактерий обесцвечиваются метиленовым синим. Контрольные вопросы 1. Какова роль капсулы в жизнедеятельности бактериальной клетки? 2. Каков химический состав капсул и микрокапсул? 3. Какими методами выявляется капсула бактерий? 4. Каковы основные функции включений? 5. Как обнаружить наличие зёрен волютина у бактерий? 6. Какова структура, химический состав и функции жгутиков бактериальной клетки? 7. Каков принцип выявления жгутиков? 8. Каковы особенности строения пилей, фимбрий? 9. Какую роль играют споры бактерий? 10.Каковы особенности структуры и химического состава бактериальных спор? 11.В чём состоит процесс спорообразования у бактерий? 12.Какими методами выявляются споры бактерий? ТЕМА 4. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ: МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОЧНЫХ ФОРМ МИКРООРГАНИЗМОВ Среди основных форм микроорганизмов выделяют следующие группы: бактерии, грибы, вирусы, простейшие. Особой группой являются микоплазмы. Грибы следующими – растительные основными микроорганизмы, признаками: в характеризующиеся протоплазме располагаются несколько ядер с двойной мембраной, ядрышком и хромосомами, а также рибосомы, митохондрии, лизосомы, вакуоли, включения гликогена, волютина, развитая эндоплазматическая сеть. Клеточная стенка толстая, прочная, содержит хитин, хитинозан, целлюлозу. С возрастом клеточная стенка утолщается, иногда в ней откладываются высокомолекулярные липиды, минеральные соли, пигменты. Тело мицеллярных грибов представляет собой систему из ветвящихся, разделенных или неразделенных перегородками нитей – гиф, которые образуют мицелий. У дрожжевых и дрожжеподобных грибов форма тела палочковидная, овальная или шаровидная. Размеры мицелярных грибов 1 – 10 х 100 мкм, дрожжей 1,5 – 6 х 1,5 – 8 мкм. Способы размножения многообразны: 1 – вегетативный способ, при котором мицелий распадается на фрагменты с образованием артро – или хламидоспор; 2 – бесполое размножение состоит в образовании эндо – или экзоспор на специальных изолированных гифах – спорангиях; 3 – половые способы проявляются в слиянии двух гаплоидных ядер или фрагментов мицелия с последующим редуцированным делением гаметы (мейоз). Различают низшие (хитридиомицеты, гифохитридиомицеты, (аскомицеты, изучения оомицеты, базидиомицеты, морфологии зигомицеты) дейтеромицеты) грибов применяется и высшие грибы. Для микроскопия нативных препаратов, приготовленных по типу препарата «раздавленная капля». Простейшие – одноклеточные животные организмы, имеющие формы шара, овоида, боба, рыбы. Размеры колеблются от 1 – 2 до сотни и более мкм. Простейшие имеют одно, реже два и более ядер, в ядре выявляется до 6 хромосом. Кариоплазма хорошо выражена. В центре располагается ядрышко. Цитоплазма нередко разделяется на эктоплазму, имеющую гелеобразную консистенцию, и жидкую эндоплазму. В эндоплазме присутствуют митохондрии, эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, рибосомы, иногда вакуоли, включения гликогена. Оболочка типа пелликулы или кутикулы. Некоторые виды могут превращаться в форму покоя – цисту. Для изучения простейших прибегают к исследованию нативных препаратов, а также окрашенных по Романовскому – Гимза после фиксации смесью Никифорова, этиловым или метиловым спиртом. Для выявления простейших в крови готовят препараты «толстая петля», которые окрашивают по Романовскому – Гимза. Микоплазмы – уникальная группа мелких грамотрицательных бактерий, отличающихся полным отсутствием клеточной стенки. Это полиморфные сферические, эллипсоидные (размерами 0,2 – 1,5 мкм) и нитевидные ветвящиеся клетки (длиной до 150 мкм). Благодаря малым размерам микоплазмы могут фильтроваться через бактериальные фильтры. Не образуют спор, обычно неподвижны. Название подчёркивает их пластичность и то, что они имеют гомогенную консистенцию. В отдельные группы выделены микроорганизмы переходных форм: Актиномицеты (actis – луч, myces – гриб) – бактерии, по внешнему виду сходные с мицеллярными грибами. Мицелий большинства актиномицетов имеет форму тонких (0,2 – 2 мкм) ветвящихся, разделенных или неразделенных перегородками нитей – гиф. Кроме мицеллярной, встречаются палочковидная и кокковидная формы. От грибов отличаются строением ядра (нуклеоид), клеточной стенки (содержат пептидогликаны и не содержат хитин и целлюлозу), чувствительностью к антибактериальным препаратам. Бывают подвижные и неподвижные виды. Капсул не образуют. Грамположительные и грамотрицательные. Размножаются с помощью спор, которые формируются в результате сегментации и фрагментации гиф. Описан половой способ размножения. Для изучения актиномицетов готовят окрашенные препараты или препарат «раздавленная капля». Спирохеты (spira – виток, chaite – волосы) – тонкие спирально извитые подвижные микроорганизмы, которые обладают признаками бактерий (отсутствие дифференцированного ядра, способ размножения) и простейших (осевая нить, активно сокращающееся тело). Размеры клеток 0,05 – 3 х 5 – 500 мкм. Нить растянута на всю длину клетки, выполняет локомоторную и опорную функции, содержит пучок в 2 – 150 фибрилл белка флагеллина и аминосахара. В неблагоприятных условиях спирохеты могут переходить в цисту, представляющую собой укороченную и свёрнутую в спираль, окруженную толстой слизистой оболочкой спирохету. Грамотрицательные, но в процессе окраски по этому методу тело спирохет часто разрушается. Для их выявления исследуют нативные препараты при помощи темнопольной или фазово–контрастной микроскопии, а также препараты, окрашенные Романовскому – Гимза или методом серебрения по Морозову. Группа облигатными хламидий. бактерий, которые аналогично вирусам являются внутриклеточными паразитами, включает риккетсий и Риккетсии – мелкие (0,3 – 0,6 х 0,4 – 2 мкм) полиморфные грамотрицательные бактерии, названные в честь американского микробиолога Г. Риккетса. жизненный цикл риккетсий зависит от жизнедеятельности клетки – хозяина и складывается из 2 стадий – вегетативной и покоящейся. В вегетативной стадии они имеют палочковидную форму, активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной подвижностью. В покоящейся стадии имеют сферическую форму и не размножаются. Риккетсии – типичные прокариоты. Для их выявления применяется окраска препарата по Романовскому – Гимза. Хламидии – мелкие аспорогенные бескапсульные грамотрицательные неподвижные бактерии. Вне клеток хозяина хламидии существ уют в виде элементарных телец сферической формы размерами 0,3 мкм. В клетке хозяина они превращаются в ретикулярные тельца (диаметром 1 мкм), которые начинают делиться. Особи конечного деления превращаются в элементарные тельца, располагающиеся в цитоплазме в виде микроколоний, окруженных общей мембраной (хламидой). По Романовскому – Гимза элементарные тельца окрашиваются в красный цвет, ретикулярные – в голубой. ЗАДАНИЕ 1. Приготовить препараты «раздавленная капля» из грибов и актиномицетов, для чего в каплю воды на предметном стекле внести кусочек мицелий или тела гриба, тщательно расщепить его и накрыть покровным стеклом. Микроскопировать с сухой системой. Обратить внимание на строение мицелия, органов плодоношения. 2. Приготовить фиксированные препараты дрожжевых грибов, окрасить фуксином или метиленовым синим, микроскопировать. Обратить внимание на форму клеток, наличие признаков почкования. 3. Изучить морфологию простейших в готовых окрашенных препаратах. Приготовить препарат «толстой капли» из крови. Приготовление препарата «толстая капля» На предметное стекло нанести две капли крови, которые равномерно распределить в виде пятна с 10 – копеечную монету. Нефиксированный препарат окрасить по Романовскому – Гимза. Окраска по Романовскому – Гимза Краска Романовского – Гимза состоит из азура, эозина и метиленового синего. Цитоплазма окрашивается в голубой цвет, ядро – в красно – фиолетовый. Перед окраской 20 капель краски добавить к 10 мл дистиллированной воды и налить её на препарат на 30 – 40 минут, после чего краску слить, препарат промыть водой, высушить и микроскопировать. 4. Ознакомиться с морфологией спирохет в окрашенных по Романовскому – Гимза препаратах и в нативных препаратах при темнопольной микроскопии. Техника темнопольной микроскопии С помощью осветителя и его диафрагмы равномерно освещают зеркало микроскопа и вращением его добиваются появления на верхней линзе конденсора освещенного кольца. На поверхность конденсора наносят каплю дистиллированной воды, препарат «раздавленная капля» кладут на столик микроскопа и конденсор поднимают до соприкосновения с предметным стеклом. Устанавливают большой сухой объектив, находят объект, с помощью зеркала достигают максимальной освещенности поля зрения, после чего добиваются резкости изображения. На тёмном фоне видны спирохеты в виде тонких, блестящих, спиралевидно закрученных нитей. 5. Изучить морфологию риккетсий, хламидий, микоплазм в готовых препаратах. Контрольные вопросы 1. Каковы основные различия в ультраструктуре клеток прокариотических и эукариотических микроорганизмов? 2. Чем характеризуются микоплазмы? 3. Как устроены клетки микроскопических грибов? 4. Какими способами размножаются грибы? 5. Чем отличаются низшие грибы от высших? 6. Каковы морфологические особенности простейших? 7. Какие микроорганизмы относят к переходным формам и чем они характеризуются? 8. Каковы особенности строения актиномицетов? 9. Какое строение имеют спирохеты? 10.Каковы отличительные особенности риккетсий и хламидий? 11.Какими методами изучаются грибы и актиномицеты? 12.Какие методы исследования применяют для выявления спирохет и простейших? РАЗДЕЛ II. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ТЕМА 1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ: ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ Культивирование микроорганизмов широко используется в лабораторных условиях для их выделения, накопления и сохранения. Для культивирования бактерий пользуются естественными и искусственными питательными средами различного состава. Питательные среды должны отвечать следующим требованиям: содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества, соли и ростовые факторы; иметь оптимальную рН, вязкость достаточную влажность; должны быть стерильными и по возможности прозрачными. По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории: основные – предназначены для выращивания многих видов бактерий (мясо – пептонный бульон, мясо – пептонный агар); элективные – способствующие развитию отдельных видов микробов (кровяные, сывороточные, яичные); селективные – подавляющие рост одних микроорганизмов и не влияющие на рост других (среды Мюллера, селенитовая, Рапопорт); дифференциально – диагностические – позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гиса). По консистенции питательные среды могут быть жидкими, плотными и полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких – либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда естественных продуктов (молока, крови). Для получения плотных сред к ним добавляют агар – агар, который представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорослей. Агар – агар плавится при 1000С, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 450С. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1,5 – 3,0 %. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0,3 – 0,7 %). Стерилизация – обеззараживание, полное уничтожение микроорганизмов в питательных средах, посуде и прочих различных материалах. Производится с помощью физических, химических и механических методов. К физическим относятся: а) прокаливание, или фламбирование, над пламенем горелки; б) кипячение; в) стерилизация сухим жаром; г) стерилизация паром под давлением – автоклавирование; д) стерилизация текучим паром; е) дробная стерилизация; ж) тиндализация; з) пастеризация; и) стерилизация УФ – лучами;к) стерилизация ионизирующим излучением (рентгеновские или гамма – лучи). Химическая стерилизация проводится с помощью веществ, обладающих антимикробным действием. В качестве стерилизантов в настоящее время используют растворы карболовой кислоты или фенола (3 – 5 %), сулемы (0,1 – 0,2%), хлорамина (1 – 5 %), этиловый спирт, щелочи и кислоты различной концентрации. Для обработки сред, компоненты которых легко разлагаются при нагревании, применяют механическую стерилизацию фильтрованием через мелкопористые фильтры (свечи Шамберлана, Беркефельда, фильтр Зейтца). Демонстрация 1. Питательные среды: основные, элективные, селективные, дифференциально – диагностические. 2. Бактериальные фильтры. ЗАДАНИЕ 1. Ознакомиться с устройством и работой автоклава и сушильного шкафа. 2. Приготовить питательный мясо – пептонный бульон, для чего в колбу со 100 мл дистиллированной воды поместить навеску пасты, содержащей концентрированный рыбный гидролизат, размешать, кипятить в течение 2 – 3 минут, определить рН (7,2 – 7,5), профильтровать, разлить в пробирки и простерилизовать в автоклаве. 3. Приготовить питательную среду из сухого агара, для чего всыпать в колбу со 100 мл дистиллированной воды навеску сухого порошка, размешать, кипятить на слабом огне 1 – 2 минуты, профильтровать, разлить по пробиркам. После автоклавирования пробирки оставить на столе в наклонном положении для застывания агара в виде скошенной поверхности (скошенный агар). Контрольные вопросы 1. Какую роль выполняют вода, минеральные соли, углеводы и липиды в микробной клетке? 2. Как классифицируют микроорганизмы по типам питания? 3. Каковы особенности автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов? 4. В чём состоит строительный и энергетический обмен у микробов? 5. Какие продукты образуются в результате строительного и энергетического обмена микроорганизмов? 6. Какие требования предъявляются к питательным средам? Что такое ростовые факторы? 7. Как классифицируются питательные среды? Привести примеры основных категорий питательных сред. 8. Что такое стерилизация и дезинфекция? 9. Какие существуют методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды? ТЕМА 2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ: ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР Основными задачами бактериологического метода являются: 1) получение чистой культуры какого – либо вида из микробной ассоциации (из внешней среды или из организма человека) и предупреждение контаминации посторонней микрофлорой исследуемого материала; 2) идентификация микробов выделенной чистой культуры; 3) определение дополнительных средств, например, чувствительности к антибиотикам, вирулентности. В основе бактериологического исследования лежит получение чистых культур, т. е. совокупности микробов одного вида, полученных из одного образца материала и содержащихся в определенном объеме среды. Выделение чистых культур бактерий состоит из 3 – х этапов: 1) посев исследуемого материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний; 2) исследование колоний; 3) пересев с выбранных колоний на скошенный в пробирке МПА или специальную среду. Существуют различные техники первичного исследуемого материала на питательные среды для получения изолированных колоний: Техника посева на чашки Петри бактериологической петлей Петлю исследуемого материала наносят на агар около края чашки и растирают на небольшом участке, затем, не отрывая петли, засевают материал на всю поверхность среды параллельными штрихами с интервалом 4 – 5 мм (рис. 1а). Посев можно производить и следующим способом: делается 4 – 5 параллельных штрихов в направлении А, затем петля прожигается в пламени горелки и ею проводятся штрихи в направлении Б поперек первоначально нанесенных полос. Петля снова прожигается, и делаются штрихи в направлении В, а затем и в направлении Г (рис. 1б). Ещё один вариант посева петлей заключается в том, что чашку со средой делят на 4 – 5 радиальных секторов и одной и той же петлей поочередно делают посевы на всех секторах (рис. 1в). А Б Г В а б в Рис. 1. Варианты посева петлей Техника посева шпателем (метод Дригальского) Берут 3 чашки Петри с плотной питательной средой. На середину первой петлей или пастеровской пипеткой вносят каплю исследуемого материала и круговыми движениями шпателя производят сплошной посев. Этим же шпателем, не стерилизуя его, распределяют материал по второй и третьей чашкам. Техника посева тампоном Первоначально тампоном, поворачивая его разными сторонами, проводят на чашке со средой диагональную дорожку шириной 1 – 2 см, затем штрихами петли через дорожку засевают среду по обе её стороны. Во втором варианте один из радиальных секторов чашки засевают тампоном, а затем поочередно остальные секторы – петлей с заходом каждый раз на уже обработанную тампоном поверхность. Техника посева в толщу плотной среды (метод Коха) Готовят 10 – кратные разведения материала в стерильном изотоническом растворе хлористого натрия и вносят по 1 мл каждого разведения в пробирки с 9 мл расплавленного и остуженного до 45 – 500С агара. После тщательного перемешивания содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри. Метод применим при количественных исследованиях. Техника посева проб исследуемого объекта (отпечатки) Свежий срез объекта (например, кусочков органов, пищевых продуктов плотной консистенции) берут пинцетом и прикасаются к поверхности агара в соответствующем участке чашки Петри. Получив изолированные колонии, из колоний с различной характеристикой или содержащих различные по форме и окраске бактерии делают пересев бактерий. Выделяют следующие техники пересева: Техника посева проб в пробирки со скошенной средой Обычно на скошенные среды переносят культуру с колоний на чашках. Для этого необходимо приподнять крышку чашки Петри и стерильной петлёй прикоснуться к колонии. После этого в левую руку берут пробирку со скошенным агаром (между большим и указательными пальцами) так, чтобы поверхность скошенного агара была перед глазами. Пробирку открывают над пламенем горелки, обжигают её край, а затем петлю вводят в пробирку до дна, где имеется небольшое количество конденсационной воды. Плоской поверхностью петли прикасаются к поверхности агара и делают посев штрихообразными движениями, постепенно продвигаясь снизу вверх. Обжигают в пламени край пробирки и пробку, закрывают пробирку над пламенем. Техника посева в жидкую среду Простерилизованной бактериологической петлей отбирают материал, наносят его на стенку пробирки у верхнего уровня среды и, слегка встряхивая пробирку, смывают его средой. Край пробирки и пробку обжигают, быстро закрывают. Техника посева бляшкой При определении некоторых свойств исследуемых культур бактерий на плотных средах производят плотный посев на ограниченном участке среды в виде прямоугольника, овала, круга размерами 0,5 – 0,8 х 1 – 1,5 см. Между бляшками следует выдерживать расстояние в несколько см. Техника посева в конденсационную воду Выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей и вносят в конденсационную воду. У выражено подвижных культур рост бактерий с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность скошенной среды. С верхней части роста бактерий производят пересев в конденсационную воду второй пробирки и т. д. Методика позволяет получить чистую культуру подвижных бактерий (например, протея, возбудителя столбняка). Техника посева в верхнюю часть скошенной среды Материал наносят в виде бляшки на верхнюю часть свежескошенной среды. Пробирки помещают в термостат в вертикальном положении и наблюдают за сползанием культуры вниз по поверхности скошенной части, которое характерно для слизистых штаммов. Техника посева уколом в столбик плотной или полужидкой среды Используют высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, полускошенные плотные среды. Во всех случаях бактериальной петлей или иглой с посевным материалом делают прокол среды с поверхности до дна. Пробирку рекомендуют держать дном вверх, чтобы не наступила контаминация среды воздушной микрофлорой. После инкубации изучают изолированные колонии. Колонии обладают набором определенных признаков: а) размеры – большие (диаметр более 4 – 5 мм), средние (диаметр 2 – 4 мм), мелкие (диаметр менее 1 – 2 мм) и микроскопические (диаметр менее 1 мм); б) цвет – белый, жёлтый, сине – зелёный, бурый, чёрный, цвет среды и др.; в) форму – круглая, лаптеобразная, розеткообразная и др.; г) края – ровные, волнистые, зазубренные, отростчатые и др.; д) поверхность – гладкая, шероховатая, блестящая, матовая, плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная и др.; е) консистенция – сухая, пастообразная, слизистая, однородная, зернистая; ж) прозрачность – прозрачная, мутная. Для определения морфологии клетки и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму. Оставшуюся часть колонии отсевают на скошенный питательный агар. Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых сводится к удалению кислорода из среды. Условия анаэробиоза создают различными способами: 1. Физические: а) удаление воздуха при помощи насоса из герметически закрывающегося прибора – анаэростата; б) удаление воздуха из среды при помощи кипячения с последующим быстрым охлаждением и заливкой среды стерильным вазелиновым маслом; в) внесение в жидкую питательную среду кусочков печени, мяса, почки, которые поглощают кислород; г) посев в высокий столбик агара, который затем заливается слоем вазелинового масла для предотвращения доступа воздуха; д) использование трубок Вейон – Виньяля: в стеклянную трубку длиной около 30 см и диаметром 3 – 4 мм насасывают расплавленный агар, засеянный микробами, трубку запаивают с обоих концов, для выделения колоний у нужного места трубку надламывают и производят отсев бактерий. 2. Химические: а) добавление в питательную среду веществ, редуцирующих кислород (например, глюкозу, глутатион, пировиноградную кислоту и др.); б) добавление в атмосферу роста химических веществ, поглощающих кислород (например, щелочного пирогаллола). 3. Биологический (метод Фортнера): совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов на кровяном агаре с глюкозой в запаранифинированной чашке Петри. ЗАДАНИЕ 1. Рассеять смешанную культуру на питательные среды для получения изолированных колоний, используя при этом различные техники посева. 2. Изучить колонии на чашках: определить размеры колоний, форму, поверхность, характер края, прозрачность колонии, наличие пигмента, консистенцию. Из части колонии приготовить мазок, окрасить по Граму, микроскопировать. Зарисовать и записать морфологию бактерий. 3. Отсеять оставшуюся часть колонии на скошенный питательный агар. 4. Ознакомиться с методами создания анаэробиоза. Контрольные вопросы 1. Что представляет собой процесс дыхания у микробов? 2. На какие типы разделяют микроорганизмы по способу дыхания? 3. Каковы характерные черты аэробного типа дыхания? 4. В чём особенности анаэробного типа дыхания? Что такое брожение? 5. Какие существуют методы создания анаэробиоза? 6. Как происходит размножение бактерий? 7. Что такое «число бактерий» и «микробная масса»? 8. перечислить фазы развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде? 9. Что такое время генерации бактерий и как оно определяется? 10.В чём заключается способ непрерывного культивирования бактерий? 11.Что такое «синхронная культура» и как её получают? 12.Что собой представляет чистая культура бактерий? 13.Какие этапы включает выделение чистых культур бактерий? 14.Какие существуют техники первичного посева исследуемого материала? 15.Какие существуют техники пересева бактерий? 16.Какие признаки колоний имеют дифференциальное значение? 17.Какую роль играют пигменты бактерий? 18.Почему пигмент у одних бактерий окрашивает только колонии, а у других – колонии и питательную среду? ТЕМА 3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД: ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ Идентификация микробов представляет собой определение систематического положения выделенной из какого – либо источника культуры до уровня вида, для чего используют комплекс признаков: морфологических, химических, культуральных, биохимических, серологических, экологических. Для установления вида, рода и особенно варианта бактерий применяют определение биохимических признаков, так как каждый вид характеризуется определенным набором ферментов. Для дифференциации бактерий выявляют у них протеолитические, сахаролитические, антиоксидантные, гемолитические ферменты, а также способность бактерий к редукции некоторых веществ (красители, нитраты и др.). Протеолитическая способностью разжижать активность желатину, бактерий свернутую определяется сыворотку их крови, образовывать при расщеплении белков индол, сероводород, аммиак. Сахаролитические свойства бактерий выявляются в способности ферментировать углеводы с образованием различных кислых продуктов и газообразных веществ. Для этого используют короткий и длинный «пёстрый» ряд. Первый включает в себя среды Гиса с моно – дисахаридами (глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой) и с шестиатомным спиртом – маннитом. В длинный «пёстрый» ряд вводят дополнительно среды с моносахаридами, полисахаридами и спиртами. В качестве индикатора во все среды добавляют реактив Андраде (щелочной раствор кислого фуксина). Чистую культуру исследуемых бактерий засевают на среды «пёстрого» ряда. Если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Антиоксидантная активность бактерий заключается в способности разлагать активные формы кислорода, секретируемые активированными макрофагами. Основную роль играют: фермент каталаза – разлагающая перекись водорода и супероксиддисмутаза – разрушающая супероксиданион радикал. Гемолитическая активность бактерий проявляется в способности расщеплять гемоглобин. В зависимости от полноты разложения гемоглобина выделяют три вида гемолитической активности - α,β,γ. Выявляют наличие этих ферментов при посеве на кровяной агар. ЗАДАНИЕ 1. Просмотреть посевы на скошенном агаре, приготовить мазки, окрасить по Граму, микроскопировать. 2. Засеять чистую культуру в пробирку с мясо – пептонным бульоном для определения протеолитических свойств бактерий. Под пробку для выявления индола, сероводорода, аммиака. Обнаружение индола производится при помощи фильтровальной бумаги, пропитанной раствором щавелевой кислоты, высушенной и разрезанной на узкие полоски. В случае образования индола бумажка окрашивается в розовый цвет. При наличии сероводорода бумага, пропитанная раствором уксуснокислого свинца, чернеет. С целью выявления аммиака применяют лакмусовую бумажку, которая в положительном случае синеет. 3. Засеять исследуемую культуру на среды «пёстрого» ряда: с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом. Посев следует произвести уколом в столбик полужидкого агара, содержащего углевод и индикатор, затем инкубировать при 370С в течение 18 – 24 часов. 4. Засеять исследуемую культуру в питательную среду Кларка для определения интенсивности ферментации глюкозы: реакция Фогес – Проскауэра и с метилрот. Среда Кларка содержит: 5 г пептона, 5 г глюкозы, 5 г калия фосфата двуосновного и до 1000 мл дистиллированного воды. 5. Определить наличие у бактерий каталазы, для чего на предметное стекло нанести каплю 3 % раствора Н2О2 и внести в неё петлю бактериальной культуры. Каталаза разлагает Н2О2 на воду и кислород. Выделение пузырьков кислорода свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы. Контрольные вопросы 1. Какими методами осуществляется идентификация бактерий? 2. Какие свойства бактерий характеризуют их биохимическую активность? 3. Как производится определение протеолитических свойств? 4. Каким путём определяют наличие у бактерий сахаролитических свойств? 5. Как выявляют у бактерий наличие фермента каталазы? 6. Каков принцип определения у бактерий редуцирующих свойств? ТЕМА 4. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД: ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ (ОКОНЧАНИЕ). ДЕЙСТВИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ. АНТИБИОТИКИ Микроорганизмы, находящиеся во внешней среде, подвергаются воздействию разнообразных физических, химические и биологических факторов. Каждый вид имеет свои, наследственные закрепленные зоны влияния отдельных факторов. Среди физических – особое значение в жизни микробов имеет температура. В зависимости от температурных параметров выделяют три группы микроорганизмов – термофилы, психрофилы и мезофиллы. Для термофилов зона оптимального роста равна 50 – 600С, верхняя зона задержки роста – 750С, нижняя – 450С. Психрофилы имеют зону оптимального роста в пределах 10 – 150С, максимальную зону задержки роста 25 – 300С, минимальную 0 – 50С. Некоторые виды холодолюбивых бактерий, размножаясь в пищевых продуктах при температуре бытового холодильника, вызывают заболевания у человека. Патогенные бактерии и большинство микробов – сапрофитов являются мезофиллами. Оптимальная температура их роста колеблется в пределах 30 – 370С, максимальная 43 – 450С, минимальная 15 – 200С. Губительное действие на микроорганизмы оказывают высушивание, , ионизирующая радиация, УФ – лучи, ультразвук, и также химические вещества, обладающие противомикробным действием (галогены, окислители, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов и т. д.). Микробные ассоциации зависят от факторов внешней среды, но и от сложных взаимоотношений микроорганизмов, которые могут носить характер симбиоза или антагонизма. Антагонистические свойства микробов могут быть обусловлены разными механизмами. Один из них – образование антибиотических веществ. Среди микроорганизмов продуцентами антибиотиков являются актиномицеты, грибы и бактерии. Антибиотики – химиотерапевтические вещества биологического, полусинтетического или синтетического происхождения, которые в малых концентрациях вызывают торможение размножения или гибель чувствительных к ним микробов и опухолевых клеток во внутренней среде животного организма. По направленности действия все антибиотики делят на следующие группы: противобактериальные, противовирусные, противогрибковые, противопротозойные, противоопухолевые. Они могут обладать узким (например, бензилпенициллин), умеренным (например, ампициллин) или широким (например, аминогликозиды, тетрациклины) спектром действия. По химическому составу антибиотики подразделяют на несколько групп: 1. Бета – лактамные антибиотики, включающие природные пенициллины, пенициллинов, несколько несколько поколений поколений полусинтетических цефалоспоринов, нетрадиционные бета – лактамы. 2. Стрептомицины и стрептомициноподобные антибиотики. 3. Макролиды – эритромицин, олеандомицин, карбомицин. 4. Аминогликозиды – гентамицин, неомицин, канамицин. 5. Тетрациклин и его полусинтетические производные. 6. Гликопептиды – ристомицин, линкомицин, ванкомицин. 7. Левомицетин – синтетическое вещество, идентичное природному антибиотику, хлорамфениколу. 8. Производные параамино – салициловой кислоты (препараты ПАСК -противотуберкулёзные антибиотики), изокотиновой кислоты, а также рифампицины и др. 9. Фосфомицины – антибиотики из группы фосфоновой кислоты. 10.Фторхинолоны – неприродные соединения (ципрофлоксацин, ципробан и др.). 11.Полиеновые антибиотики – нистатин, леворин, амфотерицин В. По механизму антимикробного действия антибиотики отличаются друг от друга. Мишенью для их ингибирующего действия служит одна или несколько биохимических реакций, необходимых для синтеза и функционирования определенных структур микробной клетки (табл. 2). Таблица 2 Механизмы ингибирующего действия некоторых групп антибиотиков на микробную клетку Антибиотики Пенициллины, цефалоспорины, циклосерин, фосфомицин, ристомицин Полиеновые антибиотики, полимиксины Аминогликозиды, тетрациклины, левомицетин, макролиды Рифампицины, актиномицеты, оливомицин, антрациклины Эритромицин Мишени действия антибиотиков Ингибирование синтеза клеточной стенки Фторхинолоны Ингибирование ДНК – гиразы или специфических участков ДНК, созданных ДНК – гиразой Нарушение функций цитоплазматической мембраны Ингибирование синтеза белков на рибосомах Ингибирование ДНК – зависимой РНК – полимеразы Блокирует реакцию транслокации ЗАДАНИЕ 1. Просмотреть посевы на средах «пёстрого ряда» и в мясо – пептоном бульоне. Зарегистрировать результаты. Образование индола, сероводорода, аммиака обозначается «+», отсутствие – « – ». Ферментация углевода с образованием кислоты (изменение окраски среды) отмечается «К», с образованием кислоты и газа (наличие пузырьков в столбике среды) – «КГ», отсутствие ферментации углеводов – « – ». 2. Поставить реакции Фогес – Проскауэра и с метилрот, для чего посев на среде Кларка разделить на две части. К первой добавить 2 – 3 капли 0,04 % раствора метилрот: в случае положительной реакции появляется красное окрашивание, при отрицательной – жёлтое. Констант второй части среды добавить равный объем 10 % раствора КОН и поставить в термостат при температуре постепенно в случае Проскауэра 370С: окраска положительной реакции наблюдается розовое появляется Фогес окрашивание, – в отрицательных случаях окраска не меняется. 3. Заполнить протокол исследования чистой культуры бактерий (табл. 3). 4. Испытать действие света на бактерии (опыт Бухнера). На поверхность агара в чашке Петри налить 1 мл бульонной культуры, равномерно распределить по поверхности, остаток удалить пипеткой. Кружочки стерильной бумаги поместить на поверхность агара и осветить открытую чашку прямыми солнечными лучами в течение 1 – 2 часов, после чего чашку закрыть крышкой и поставить в термостат. Таблица 3 Протокол исследования чистой культуры бактерий Свойство Морфология бактерий Окраска по Граму Подвижность Характеристика колоний: размеры форма поверхность край колонии прозрачность консистенция характер пигмента Образование индила сероводорода аммиака Ферментация глюкозы лактозы маннита сахарозы Наличие каталазы Реакция с метилрот Фогес – Проскауэра 5. Произвести определение Результат чувствительности бактерий к антибиотикам двумя методами. Метод дисков На поверхность агара в чашке Петри вылить 1 мл взвеси бактерий и распределить её по поверхности, остаток культуры убрать пипеткой. После высыхания поверхности чашки на её сектора нанести пинцетом диски с антибиотиками. Выдержать чашки в течение 30 минут, после чего поместить в термостат. Метод разведений Взять два ряда пробирок: 1 – 7 пробирок по 1 мл физиологического раствора; 2 – 8 пробирок по 2 мл бульона. В первую пробирку первого ряда внести 1 мл пенициллина, содержащий 160 единиц. Содержимое пробирки перемешать и 1 мл перенести во вторую пробирку, из второй пробирки 1 мл перенести в третью и т. д. Таким образом, в пробирках будет 80, 40, 20, 10, 5 единиц и т. д. пенициллина в 1 мл. В каждую пробирку второго ряда (кроме восьмой) внести по 0,2 мл разведения пенициллина из соответствующей пробирки первого ряда. Получаем разведения пенициллина – 8, 4, 2, 1 и т. д. в 1 мл бульона. В каждую пробирку засеять одну петлю суточной бульонной культуры испытуемого микроба. Результат учитывается через сутки пребывания пробирок в термостате. Отметить наименьшую концентрацию антибиотика (наибольшее его разведение), при которой отсутствует рост микроба (бактерицидная концентрация), а также ту концентрацию при которой лишь наблюдается задержка роста культуры (бактериостатическая концентрация) по сравнению с контрольной восьмой пробиркой. Контрольные вопросы 1. Какое действие оказывают физические и химические факторы на микроорганизмы? 2. Как подразделяются микробы по отношению к температуре? 3. Как проявляются антагонистические свойства микроорганизмов? 4. По каким признакам классифицируют антибиотики? 5. Каков механизм действия антибиотиков? 6. Какими методами определяется чувствительность бактерий к антибиотикам? 7. Какова методика тестирования ФП реакции и с метилрот? 8. В чём состоит сущность опыта Бухнера? ТЕМА 5. ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ МИКРОБОВ ВО ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ И ИХ ОБНАРУЖЕНИЕ. МИКРОФЛОРА ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА Микроорганизмы способны использовать любые. Даже минимальные возможности для своего существования. Активная жизнедеятельность микробов, их гигантская роль в круговороте веществ в природе имеют исключительное значение для поддержания динамического равновесия всей биосферы. Естественной средой обитания микроорганизмов служат в первую очередь почва, вода и воздух. Они заселяют также кожные покровы и слизистые оболочки человека и животных. Наиболее благоприятные условия для своего существования микробы находят в почве. Кроме многочисленных видов бактерий и актиномицетов, в почве обитают грибы, простейшие, фаги. Патогенные микроорганизмы попадают в почву с испражнениями, мочой, гноем, мокротой, слюной другими выделениями, с трупами людей и животных, погибших от инфекционных заболеваний. Сроки выживания в почве возбудителей кишечных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, холеры), чумы, бруцеллёза, туляремии, туберкулёза широко варьируют и составляют от нескольких часов до нескольких месяцев. Значительно дольше в почве сохраняются спорообразующие патогенные бактерии – аэробные (споры B. anthracis, возбудителя сибирской язвы, сохраняются в почве свыше 15 лет) и анаэробные – возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма (их споры также сохраняются в почве многие годы, а при благоприятных условиях прорастают и бактерии размножаются, поддерживая тем самым своё существование в почве). Для санитарно – бактериологической оценки почвы определяют её коли – титр – наименьшее весовое количество, в котором обнаруживаются кишечные палочки и перфрингенс – титр – наименьшее весовое количество, в котором обнаруживаются клостридии перфрингенс. В воде содержатся флюоресцирующие, пигментные, серо – и железобактерии, грибы, спириллы, вибрионы. Возбудители многих инфекционных заболеваний (брюшного тифа, дизентерии, сальмонеллёзов, холеры, вирусных гепатитов, полиомиелит и т. п.) выделяются вместе с испражнениями от больных и носителей и вместе со сточными водами поступают в воду открытых водоёмов. Для общей количественной оценки микрофлоры воды определяют микробное число – количество мезофильных бактерий в 1 мл воды. Для санитарно – бактериологической оценки воды определяют её коли – титр – наименьший объем воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП и коли – индекс – количество БГКП в 1 л воды. Количество микробов в воздухе варьирует в больших диапазонах – от нескольких бактерий до десятков тысяч их в 1 м3. При санитарно – бактериологической оценке воздуха закрытых помещений особое внимание обращают на содержание в 1 м3 воздуха – и – гемолитических стрептококков, золотистого стафилококка, которые являются показателями загрязнения воздуха верхних дыхательных путей человека. ЗАДАНИЕ 1. Учесть результаты опыта Бухнера: отметить более обильный рост бактерий в местах, которые были закрыты бумагой. 2. Учесть результаты испытания чувствительности бактерий к антибиотикам методом, что дисков. С помощью линейки отмечается величина зоны задержки роста бактерий вокруг дисков и определяется степень чувствительности бактерий к каждому антибиотику. При диаметре этой зоны свыше 25 мм бактерий считаются высоко чувствительными, при зоне диаметром 15 – 25 мм – чувствительными, а при отсутствии зоны задержки роста – устойчивыми. 3. Произвести посев воздуха седиментационным методом (Коха), для чего чашку с питательным агаром поставить на горизонтальную поверхность, открыть её на 5 минут, после чего поместить в термостат. При учёте результатов подсчитывается число выросших колоний на чашке и рассчитывается микробное число воздуха, для чего используется таблица Омелянского (табл. 2). Таблица 2 Расчёт числа микробов в1 м3 воздуха Диаметр чашки, Площадь чашки, Множитель для расчёта числа см см2 микробов в 1 м3 воздуха 8 50 100 9 63 80 10 78 60 11 95 50 12 113 45 Пример: на чашке диаметром 10 см выросло 40 колоний, количество микробов в 1 м3 воздуха составляет: 40. 60=2400. 4. Ознакомиться с принципом исследования воздуха аспирационным методом, что с использованием аппарата Кротова, позволяющим определить содержание микроорганизмов в известном объёме воздуха. Основными элементами аппарата Кротова являются побудитель аспирации (электромотор с центробежным вентилятором), прибор для определения объёма протянутого воздуха (микроманометр) и вращающийся диск, на который помещают открытую чашку Петри с плотной питательной средой. Корпус прибора герметически закрывается крышкой, центральная часть которой представляет собой прозрачный диск с клиновидной щелью (шириной 0,1 мм у центра). При вращении вентилятора воздух засасывается через щель, ударяется о поверхность питательной среды и оставляет на ней значительную часть микроорганизмов. скоростью до Одновременное 60 об/мин вращение гарантирует чашки со равномерное распределение микроорганизмов по всей поверхности среды. Аппарат позволяет пропускать от 25 до 50 л воздуха в минуту. 5. Произвести посев пробы почвы для определения перфрингенс – титра. Для этого приготовить разведения суспензии почвы: навеску 1 г почвы залить 10 мл стерильной воды (разведение 10 – 1 ), перемешать, 1 мл разведения перенести в 9 мл воды (разведение 10 – 2) и т. д. Пробирки со средой Вильсон – Блера (висмут – сульфитный агар) прогреть на водяной бане до расплавления среды, внести в пробирки по 1 мл суспензии из разных разведений, перемешать и оставить застывать в виде высокого столбика. Инкубировать в термостате. При регистрации результатов отмечается, в каком разведении появились чёрные колонии в глубине агарового столбика. Контрольные вопросы 1. Каковы экологические среды микроорганизмов и типы экологических связей в микробиоценозах? 2. Какую роль играют свободноживущие микроорганизмы в формировании и развитии биосферы? 3. Чем характеризуется нормальная микрофлора почвы, водоёмов и воздуха? 4. Какие микробы играют санитарно – показательную роль для почвы, воды и воздуха? 5. Каково значение нормальной микрофлоры тела человека? Назовите представителей отдельных биотопов организма. 6. Что такое дисбактериоз и каковы причины его возникновения? РАЗДЕЛ III. ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ ТЕМА 1. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ Вирусы характеризуются малыми размерами тела, отсутствием самостоятельных белоксинтезирующих и энергию генерирующих систем, выраженным цитотропизмом и облигатным внутриклеточным паразитизмом. Культивирование вирусов проводят в культурах клеток, органных культурах, развивающихся куриных эмбрионах, восприимчивых лабораторных животных. Широкое распространение получил предложенный в 1952 г Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вирусосодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при 370С. Через 48 – 96 ч выявляются пятна – бляшки. Они имеют диаметр 1 – 3 м и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия (ЦПД) вируса. ЦПД вирусов может проявляться в виде следующих изменений: 1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Коксаки). 2. Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энцефалита). 3. Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы). 4. Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса). 5. Симпластообразование (респираторно – синцитиальные вирус, вирус кори). О росте вирусов в клетках можно судить и с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в жёлтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый. Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютининацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютининации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей). Для культивирования и изучения вирусов используют органные культуры – небольшие фрагменты органов животных, культивируемые на поверхности плотной микробиологической или жидкой практике для питательной выделения, среды. культивирования В и идентификации вирусов используют куриные эмбрионы. Вирусы могут быть выделены их исследуемого материала путём заражения восприимчивых лабораторных животных (например, морских свинок, белых мышей, крыс белых, хомяков сирийских и т. п.). ЗАДАНИЕ 1. Учесть результаты посева воздуха седиментационным методом (Коха). 2. Учесть результаты посева пробы почвы для определения перфрингенс – титра. 3. Произвести заражение куриных эмбрионов. Техника заражения куриных эмбрионов Отобрать свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводить в гнёздах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 – 37,50С, относительной влажности 63 – 65 %. Для заражения отобрать 4 – 13 – дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обработать спиртом, обжечь над пламенем и в области введения смазать 2 % йодной настойкой. Средств ввести в аллантоисную и амниотическую полости. Проколоть ножницами небольшое отверстие в скорлупе над воздушной полостью и ввести с помощью иглы шприца исследуемый материал в количестве 0,1 – 0,2 мл на глубину 1 – 2 см. Отверстие залить парафином. При заражении в полость амниона иглу шприца или пастеровскую пипетку направить к зародышу под контролем овоскопа и ввести исследуемый материал (закрытый способ заражения). При выполнении открытого способа заражения в скорлупе над воздушной полостью вырезать отверстие размерами 0,5 – 0,7 х 0,5 см, удалить скорлупную оболочку, вскрыть хорионаллантоисную оболочку, захватить пинцетом амниотические оболочки и ввести в полость исследуемый материал. Отверстие в скорлупе закрыть покровным стеклом, смоченным в расплавленном парафине. Зараженные КЭ поместить в термостат. 4. В готовых препаратах изучить характер внутриклеточных включений, образуемых вирусами. Контрольные вопросы 1. Каковы особенности химического состава и структурной организации вирионов? 2. Какие признаки лежат в основе систематики вирусов? 3. Каковы особенности вирусных нуклеиновых кислот и белков? 4. Каковы формы взаимодействия вируса с клеткой хозяина? 5. Какими методами производится культивирование вирусов? 6. Что собой представляют перевариваемые тканевые культуры? 7. Что такое цитопатическое действие вируса и как оно может проявляться? 8. Какими методами производится заражение куриного эмбриона? 9. Что собой представляют образуемые вирусами? внутриклеточные включения, ТЕМА 2. МЕТОДЫ РАБОТЫ С БАКТЕРИОФАГАМИ Бактериофаги являются вирусами, паразитирующими в бактериальной клетке. На основании формы и строения различают пять морфологических типов бактериофагов: с длинным отростком, футляр которого сокращается; с длинным несокращающимся отростком; с коротким отростком; с аналогом отростка и нитевидные фаги. Первые три морфологические типа содержат двунитчатую ДНК, четвёртый – однонитчатую ДНК или РНК, пятый тип – однонитчатую РНК. Головка бактериофага образована белковыми капсомерами и имеет, как правило, полигональную форму. В её полости располагаются плотно скрученная ДНК или РНК, а также несколько аминов. Отросток, соединяющийся с головкой, шейкой, предназначен для прикрепления к рецепторам бактериальной клетки и её инфицирования. Бактериофаги в зависимости от типа вызываемой у бактерии инфекции делят на вирулентные и умеренные. Вирулентные дают литическую продуктивную инфекцию, в результате чего образуется новая генерация фагов. Умеренные вызывают, как правило, абортивную лизогенную инфекцию, которая состоит в интеграции геномов бактерии и лизогенного фага. Бактериофаги широко распространены в природе и встречаются всюду, где имеются бактерии. Поэтому их можно выделить из различных объектов внешней среды (водоёмы, сточные воды), из организма человека и животных. Бактериофаги находят широкое применение в различных научных исследованиях. В практической работе они используются в целях идентификации ряда возбудителей (фагочувствительность), диагностика (фагодиагностика), для выявления связей между источниками инфекции (фаготипирование), для лечения (фаготерапия) и предупреждения (фагопрофилактика) некоторых заболеваний. ЗАДАНИЕ 1. Выявить результаты заражения куриных эмбрионов. Обработать скорлупу над воздушной полостью спиртом, йодом, снова спиртом и обжечь над пламенем. Ножницами удалить часть скорлупы над воздушной полостью. Снять пинцетом подскорлупную оболочку и пастеровской пипеткой или шприцем отсосать аллантоисную жидкость в стерильную пробирку. 2. Поставить реакцию гемагглютинации для выявления вируса. Активная реакция гемагглютинации Для качественного обнаружения вируса к капле вируссодержащей суспензии на предметном стекле добавить каплю 1 % суспензии отмытых куриных эритроцитов. В положительной реакции вирусы адсорбируются на эритроцитах, что через несколько минут проявится образованием агглютинатов. В контроле каплю суспензии эритроцитов смешать с каплей физраствора. 3. Произвести титрование бактериофага двухслойным методом Грациа. Приготовить 10 – кратные разведения бактериофага, для чего в пробирку с 4,5 мл стерильного физиологического раствора внести 0,5 мл суспензии фага (разведение 10 – 1 ), новой пипеткой 0,5 смеси перенести во 2 – ю пробирку с 4,5 мл физиологического раствора (разведение 10 пробирку (разведение 10 – 3 – 2 ), затем в 3 – ю ) и т. д. Расплавить 0,7 % – ый питательный агар, разлить в пробирки по 2,5 мл, охладить до 45 – 500С, внести в пробирки 0,2 – 0,3 л бульонной культуры чувствительных бактерий и 1 мл фага из соответствующего разведения, перемешать, быстро вылить в чашку с агаром и распределить равномерно по её поверхности путём покачивания. После застывания агара чашки инкубировать в термостате при температуре 370С. 4. Провести типирование бактерий с помощью бактериофагов. На агаровую поверхность в чашке Петри вылить 1 мл бактериальной суспензии, покачиванием чашки равномерно распределить бактерии, остаток культуры удалить пипеткой. На сектора чашки нанести петлей типовые фаги. После подсыхания капель чашки поместить в термостат. 5. Поставить опыт Ньюкомба. На 4 чашки с питательным агаром было засеяно по 0,1 мл бактериальной суспензии. Чашки инкубировались 4 часа до появления первых признаков видимого роста. На 2 чашках произвести перераспределение бактерий путём растирания стеклянным шпателем поверхности среды, после чего на все чашки налить по 1 мл вирулентного бактериофага и покачиванием чашки распределить его равномерно по всей поверхности чашки. Посевы поставить в термостат при температуре 370С. Контрольные вопросы 1. Каковы основные особенности бактериофагов? 2. Какие существуют морфологические типы бактериофагов? 3. Какими особенностями характеризуются фаговые нуклеиновые кислоты и белки? 4. Каковы особенности взаимодействия бактериофагов с клеткой хозяина? 5. В чём различия между вирулентными и умеренными фагами? Что такое лизогения? 6. Из каких объектов производится выделение бактериофагов? 7. Какое практическое применение находят бактериофаги? 8. Что собой представляет титр фага и как он определяется? 9. Каков принцип метода фаготипирования? С какой целью его производят? 10.В чём сущность опыта Ньюкомба? 11.Как выявляют результаты заражения куриных эмбрионов? ТЕМА 3. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ У большинства микроорганизмов в большей степени, чем у высших организмов, выражена изменчивость, что связано с коротким периодом генерации, большей частотой мутаций, генетическим обменом, выходящим за пределы вида. изменчивость. Различают Фенотипической фенотипическую изменчивости и генотипическую (модификации) свойственны высокая частая реверсия в исходную форму, адаптивный к среде характер сдвигов, отсутствие изменений в генетическом коде. По наследству не передаётся. Проявляется в виде полиморфизма клеток, временной потери жгутиков, диссоциации на S – и R – формы колоний, образования нестабильных L – форм бактерий и т. д. Изменчивость генотипическая наступает в результате мутаций и рекомбинаций. Ей присущи низкая частота, редкость реверсий, случайный (не адаптивный) характер сдвигов, она сопровождается изменением генетического кода и передачей приобретенных признаков потомству. В результате мутаций могут изменяться различные признаки микроорганизмов (морфологические, биохимические, антигенные и др.). Рекомбинациями называют процессы обмена генетическим материалом между двумя микробными клетками, которые могут происходить в результате трансформации (проникновения фрагментов ДНК донора в клетку реципиента без непосредственного контакта между бактериальными клетками), трансдукции (переноса фрагментов ДНК донора в клетку реципиента с помощью бактериофага), конъюгации (переноса части хромосомы донора в клетку реципиента при непосредственном контакте между двумя бактериальными клетками). ЗАДАНИЕ 1. Учесть результаты титрования бактериофага, рассчитать титр фаговой суспензии, для чего подсчитать число образовавшихся негативных колоний на чашке и умножить полученное число на показатель разведения фага. 2. Учесть результаты опыта фаготипирования 3. Учесть результаты опыта Ньюкомба: подсчитать число колоний на контрольных и перераспределенных чашках. Сделать вывод. 4. Изучить фенотипическую изменчивость бактерий – влияние фенола на подвижность бактерий. Бактериальную культуру вырастить в МПБ и в бульоне с 1 % фенола. Исследовать её подвижность методом «раздавленной капли». Неподвижную культуру из пробирки с фенолом отсеять в пробирку со свежим питательным бульоном, испытать на подвижность методом «раздавленной капли». Сделать вывод. 5. Ознакомиться с диссоциацией бактерий S – и R – формы. 6. Поставить опыт трансформации: поместить в пробирку 1 мл раствора ДНК – культуры донора, смесь инкубировать в течение 30 минут при температуре 370С, после чего произвести высев петлёй на селективную питательную среду, содержащую 100 ед/мл стрептомицина. Одновременно произвести контрольные высевы культуры – реципиента и раствора ДНК. При учёте результатов обратить внимание на наличие роста в высеве из трансформационной смеси при отсутствии роста в контрольных высевах. 7. Поставить опыт трансдукции: в пробирку поместить 1 мл 4 – часовой культуры – реципиента – E. coli lac – , добавить 1 мл суспензии трансдуцирующего фага, содержащего форм 1 мл 10 6 – 107 частиц, смесь инкубировать в течение 60 минут при температуре 370С, после чего 0,1 мл смеси нанести на среду Эндо и распределить стеклянным шпателем по поверхности чашки. Контролем служит посев 0,1 мл культуры – реципиента на ту же среду. Чашки инкубировать в термостате. При учёте результатов следует определить число выросших колоний, способных расщеплять лактозу (окрашенных в красный цвет). Контрольные вопросы 1. Какое значение имеет изучение генетики микроорганизмов? 2. Какова организация генетического материала у бактерий? Что такое генотип, фенотип и генофонд популяций бактерий? 3. Что представляют собой внехромосомные факторы наследственности микроорганизмов? 4. Чем характеризуются фенотипические изменения (модификации) бактерий? 5. В чем состоят генотипические изменения у микроорганизмов? 6. Что собой представляют мутации, каков их молекулярный механизм? 7. Какие типы мутаций встречаются у бактерий? 8. Что такое мутагены и каков механизм их действия? 9. Какие формы генетических рекомбинаций присущи бактериям? РАЗДЕЛ IV. ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ ТЕМА 1. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ Инфекция – совокупность патологических, адаптационно – приспособительных и репаративных реакций организма, возникающих в результате его конкретного взаимодействия с патогенными и при определенных условиях условно – патогенными вирусами, бактериями и грибами. Аналогичные процессы, вызванные простейшими, называют инвазиями. Формы инфекции, в зависимости от свойств главных факторов инфекционного процесса (т. е. возбудителя и макроорганизма), принято разделять на две основные группы: 1) манифестная инфекция, которая протекает при наличии характерного симптомокомплекса, включает: типичную для данного возбудителя форму инфекции, когда возбудитель размножается, проникает вызывая в организм, типичные активно для данной в нём болезни клинические проявление; атипичную форму, когда возбудитель проникает в организм, активно в нём размножается, организм отвечает соответствующими иммуно – биологическими реакциями, которые приводят к формированию активного иммунитета, но клинические симптомы болезни носят невыраженный, стёртый или атипичный характер; персистентную (хроническую) форму, когда возбудитель проникает в организм, размножается в нём, вызывает активную форму болезни, но под влиянием иммунных систем организма и химиопрепаратов подвергается L – трансформации. L – формы бактерий могут длительное время персистировать в организме. Возвращаясь в свою исходную форму, возбудитель вызывает рецидив болезни (например, туберкулёз); медленные организм инфекции, и может когда долгое возбудитель время проникает сохраняться в в нём внутриклеточно в латентном состоянии. При благоприятных для возбудителя условиях он начинает размножаться, заболевание протекает всё тяжелее и тяжелее и, как правило, заканчивается смертью больного (например, СПИД); 2) бессимптомная инфекция, которая протекает без выраженных симптомов, включает: абортивную форму инфекции, когда возбудитель проникает в организм, но не размножается в нём. Инфекционный процесс обрывается, и возбудитель рано или поздно погибает или удаляется из организма; латентную форму, когда возбудитель проникает в организм, размножается в нём, соответствующими макроорганизм отвечает иммунобиологическими на него реакциями, ведущими к формированию приобретенного иммунитета и удалению возбудителя из организма. Однако никаких внешних клинических проявлений этой инфекции нет, она протекает скрыто (например, полиомиелит, бруцеллёз, некоторые вирусные гепатиты); дремлющую инфекцию, когда бессимптомное пребывание возбудителя в организме может сохраняться долгое время после латентной инфекции или после перенесенного заболевания. Патогенные микробы находятся некоторое время как бы в «дремлющем» состоянии. Под влиянием условий, понижающих сопротивляемость организма, микроорганизмы активизируются и вызывают заболевание или его рецидив (например, заглохший воспалительный процесс в кариозном зубе); бактерионосительство, когда после либо латентной инфекции, либо перенесенного заболевания организм в состоянии полностью освободиться от возбудителя. Бактерионосители, являясь источником заражения, играют большую роль в эпидемиологии многих заболеваний (например, брюшного тифа, дифтерии). Биологический состоит в (экспериментальный) искусственном воспроизведении метод исследования клинической картины инфекционных болезней на лабораторных животных. В практической микробиологии его используют для диагностики инфекционных болезней, выделения и идентификации чистой культуры возбудителя, индикации и идентификации экзотоксинов. Кроме того, его широко применяют в экспериментальной микробиологии и иммунологии, а также для контроля иммунопрепаратов. Биологический метод исследования используют в тех случаях, если другие методы неэффективны и если имеются необходимые условия для содержания лабораторных животных. Метод включает заражение животного, наблюдение за ним, вскрытие погибшего или забитого животного. Материал для заражения должен быть забран в асептических условиях, в стерильную посуду, гомогенизирован, использован возможно быстрее. Способ заражения зависит от типа материала, вида животного, предполагаемого повреждающего агента. Материал может быть введён накожно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, через нос, рот и прямую кишку, в сердце, желудок, мозг, в вагину, яичко, конъюнктиву, в суставные полости. Перед заражением с операционного поля необходимо удалить шерсть и обработать его 70 % этанолом с последующим смазыванием настойкой йода. При наблюдении за зараженными животными отмечается вялость, отсутствие аппетита, понос, различные двигательные нарушения. В этот период животные должны быть обеспечены полноценным питанием, доброкачественной питьевой водой, предохранены от простуды, перезаражения. В случае гибели животного или его умерщвления проводят микробиологическое исследование трупа. Вскрытие производят в асептических условиях: мелких животных – в кюветах на парафиновой пластинке, крупных – на специальных операционных столиках. Целью бактериологического исследования трупа является обнаружение микроба, содержавшегося во введенном материале, определение места его локализации в организме и выделение чистой культуры возбудителя. ЗАДАНИЕ 1. Заразить белых мышей исследуемым материалом подкожно и внутрибрюшинно, проведя предварительное обезболивание. Для чего животное поместить до засыпания в закрытый стеклянный сосуд, в котором находится вата, смоченная эфиром или хлороформом. Подкожный способ заражения При подкожном введении исследуемого материала фиксировать животное, протереть место инъекции кусочком ваты, смоченной в спирте, захватить в складку кожу на спине у корня хвоста, ввести в неё иглу примерно до половины, медленно ввести 0,5 мл материала, отпустить складку. Затем иглу быстро извлечь, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом. Внутрибрюшинный способ заражения Животное фиксировать головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. После обработки спиртом места инъекции в левой нижней трети живота проколоть кожу, держа иглу под острым углом, затем перевести шприц в положение, перпендикулярное брюшной стенке, толчкообразным движением проколоть брюшину и ввести содержимое шприца. Извлечь иглу, прикрыв место инъекции ватой, смоченной в спирте. 2. Произвести вскрытие погибших белых мышей. Вскрытие и исследование трупа животного делят на 3 этапа: а) вскрытие и исследование наружных покровов Закрепить труп животного животом кверху, положив его на кусочек марли, смоченной дезинфицирующим раствором. Обработать шерсть и кожу ватным тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. Стерильными инструментами сделать разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы вдоль конечностей. Отсепарировать кожу, отметить состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов. При обнаружении измененных узлов произвести из них посевы на питательные среды и сделать мазки – отпечатки на предметных стёклах. б) вскрытие и исследование грудной полости Вскрыть грудную полость, для чего сделать разрез в диафрагме, ввести в него браншу ножниц, перерезать рёбра с обеих сторон от грудины, откинуть вырезанный лоскут кверху, осмотреть органы грудной полости. При наличии экссудата сделать из него посевы и мазки. Для взятия крови из сердца прижечь пинцетом участок его, проколоть этот участок стерильной пастеровской пипеткой, набрать несколько капель крови, произвести посев и приготовить мазок. Сделать посев из ткани лёгкого и мазки – отпечатки из него. в) вскрытие и исследование брюшной полости Вскрыть брюшную полость, осмотреть её органы, обратить внимание на наличие экссудата, величину и цвет печени, селезёнки, мезентериальных лимфатических узлов. Произвести посевы из печени, селезёнки, почек, лимфоузлов и приготовить мазки – отпечатки этих органов. Для этого вырезать из ткани органа небольшие кусочки, взять пинцетом и прикоснуться к поверхности агара в соответствующем участке чашки Петри (рис. 2), а затем к предметному стеклу. По окончании вскрытия завернуть труп в подложенную под него марлю. Кровь Лёгкие Печень Селезёнка Почки Пах. уз. Мезен. уз. Рис. 2. Схема посева из органов белой мыши 3. Зафиксировать приготовленные мазки – отпечатки над пламенем, окрасить водным фуксином или метиленовым синим, а также по Граму, микроскопировать. 4. Зарегистрировать результаты определения ферментов агрессии (коагулазы, фибринолизина), гемолитической способности бактерий. Определение клеточной коагулазы В капле густой суспензии исследуемой культуры на предметном стекле размешать каплю цельной цитратной плазмы кролика или человека. В положительных случаях через несколько секунд образуется сгусток. Одновременно поставить заведомо положительный и заведомо отрицательный контроль. Пробирочная реакция установления свободной коагулазы В 1 мл цитратной плазмы кролика или человека, цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором, размешать по петле 18 – 24 – часовой агаровой культуры. Смесь вместе с заведомо положительным и заведомо отрицательным контролями инкубировать при 37 0С и контролировать на появление сгустка через 2 – 4 – 18 ч. дальнейшая инкубация свёрнутой плазмы может привести к расплавлению сгустка, что свидетельствует культуры. о фибринолитической активности исследуемой Определение гемолитической активности Приготовить кровяной агар, для чего к расплавленному и охлажденному до 450С 2 % МПА добавить 5 – 10 % подогретой стерильной крови барана, кролика или человека, смешать и разлить по чашкам Петри, выдержать сутки в термостате на возможно бактериальную контанацию. Исследуемую культуру засеять штрихом или бляшкой. Гемолиз проявляется в виде зон просветления вокруг колоний или бляшек роста. Контрольные вопросы 1. Чем характеризуется инфекция и её разнообразные формы? 2. Какие периоды болезни выделяют при манифестной инфекции? 3. Дайте характеристику признакам микроорганизма, определяющим развитие инфекции. 4. Какими факторами определяется вирулентность микробов? 5. Что представляют собой ферменты агрессии? 6. Каков химический состав и механизм действия бактериальных токсинов? 7. В чём состоят различия между бактериальными экзо – и эндотоксинами? 8. Чем определяются инфекционные свойства вирусов и каковы особенности вирусных инфекций? 9. Каковы пути распространения микробов в организме? 10.В чём различие между бактериемией и септицемией? 11.В чём состоит биологический (экспериментальный) метод исследования? 12.Каковы методы экспериментального заражения животных? 13.Каков порядок вскрытия лабораторных животных? 14.Какими методами определяют наличие ферментов агрессии и гемолитической способности бактерий? ТЕМА 2. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ. ФАГОЦИТОЗ. Под иммунитетом понимают совокупность процессов и механизмов, обеспечивающих организму постоянство внутренней среды от всех генетически чужеродных элементов экзогенной и эндогенной природы. Неспецифические факторы резистентности являются проявлениями врожденного иммунитета. Выделяют: механические барьеры (кожа, слизистые), гуморальные факторы (иммуноцитокины, лизоцим, бетализины, система пропердиновых белков, белки острой фазы) и клеточные факторы (фагоциты, естественные киллеры). В отличие от иммунитета для неспецифической резистентности характерно: 1) Отсутствие специфического ответа на определенные антитела; 2) Наличие как индуцибельных, так и неиндуцибельных факторов защиты; 3) Отсутствие способности сохранять память от первичного контакта с антигеном. Основными клеточными клетками-эффекторами при уничтожении микробов являются фагоциты (нейтрофилы, макрофаги). Однако функции фагоцитов не ограничиваются только киллигом чужеродной частицы. Фагоцит выпоняет 3 основных группы функций: 1) Защитная (собственно фагоцитоз) 2) Представляющая - макрофаг представляет АГ лимфоцитам в системе клеточной кооперации 3) Секреторная – продуцирует более 60 активных медиаторов, среди которых ИЛ-1,8; активные формы кислорода, продукты метаболизма арахидоновой кислоты и др. С развитием недостаточной активности какого-либо из факторов неспецифической резистентности развивается иммунодефицитное состояние, в связи, с чем необходимо иметь представление о путях оценки функциональной активности каждого из выше перечисленных компонентов. фагоцитоз % фагоцитирующих клеток Фагоцитарное число поглощение 1.Определение продукции АФК 2.НСТ-тест 3.Тест на внутриклеточный киллинг по Nielsen A. 4. Активность лизоцима, лактоферрина. катионных белков киллинг Схема 1. Основные методы оценки различных этапов фагоцитоза. ЗАДАНИЕ 1. Учесть результаты посевов вскрытых животных. Подсчитать общую обсемененность в разных секторах, заполнить в тетради таблицу обсемененности разных органов и тканей экспериментального животного. 2. Описать колонию (по выбору преподавателя) по стандартной схеме (см. тему ‘Бактериологический метод исследования’). 3. Приготовить мазки Микоскопировать, и окрасить охарактеризовать их по Граму. морфологическую картину. 4. Изучить в готовых препаратах картину незавершенного фагоцитоза. 5. Разобрать схему постановки опыта фагоцитоза. 6. Разобрать схему постановки опсоно-фагоцитарной реакции. Контрольные вопросы: 1. Перечислите основные группы факторов неспецифической резистентности. 2. Охарактеризуйте анатомические барьеры неспецифической резистентности. 3. Каковы основные отличия неспецифической резистентности от иммунитета. 4. Охарактеризуйте гуморальные факторы неспецифической резистентности (лизоцим, иммуноцитокины, комплемент,бетализины, пропердиновая система, белки острой фазы) 5. Система комплемента: строение, функции, типы активации? 6. Какие клеточные факторы неспецифической резистентности вы знаете? 7. Охарактеризуйте стадии фагоцитоза. 8. Каковы формы фагоцитоза. 9. Каковы механизмы фагоцитоза. 10.Охарактеризуйте основные формы свободных радикалов. 11.Что такое фагоцитарный индекс и фагоцитарное число. Методы оценки. 12.Какими методами можно дополнительно оценить активность фагоцита? 13. Метод оценки внутриклеточного киллинга: клиническое значение, постановка. 14.Сущность опсонизации. Фагоцитарно-опсонический индекс. 15.НСТ-тест:постановка, клиническое значение. 16.Значение антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой активностей бактерий. ТЕМА 3. РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА (1 ЗАНЯТИЕ) Одной из форм иммунологической реактивности является способность организма к выработке антител в ответ на антиген. Антигеном является вещество определенной химической структуры, несущее чужеродную генетическую информацию. Антигены бывают полноценные, то есть способные вызывать синтез антител и связываться с ними, и неполноценные или гаптены. Гаптены способны только связываться с антителом, но не вызывать его синтез в организме. Бактерии и вирусы представлены сложной системой антигенов (таблицы 4,5), некоторые их них обладают токсическими и иммуносупрессивными свойствами. Таблица 4 Антигены бактерий Связанные со структурой клетки Продуцируемые клеткой О-аг – соматический (пептидогликан) Фибринолизин Н-аг – жгутиковый (флавопротеин) Лецитиназа К-аг – капсульный (А-аг, Vi-аг, L-аг) Гиалуронидаза Антигены мембранных структур Экзотоксины (липопротеиды) Таблица 5 Антигены вирусов Связанные с вирионом Связанные с зараженной клеткой Антигены белков слияния Антигены, экспрессированные на поверхности клетки Антиген капсида Антигены, встроенные в мембрану клетки Антиген суперкапсида - Антиген нуклеопротеида - Иммунологические методы исследования — диагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для лабораторной диагностики инфекционных болезней, определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аллергии и аутоиммунных болезней, беременности, гормональных нарушений, а также в научно-исследовательской работе. Они включают серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro. В зависимости от механизма серологические реакции можно подразделить на реакции, основанные на феномене агглютинации; реакции, основанные на феномене преципитации; реакции лизиса и реакция нейтрализации. Реакции, основанные на феномене агглютинации. Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек — носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену. Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t°37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Выделяют мелкозернистую и крупнохлопчатую реакции агглютинации. При связывании через Н-антиген бактерий образуются осадок из крупных конъюгатов аг-ат, в виде хлопьев. При контакте с О-аг появляется мелкозернистый осадок. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, кишечных инфекций, сыпного тифа. Реакция пассивной, или непрямой, гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами. называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов. Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.). Реакции, основанные на феномене преципитации. Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод радиальной двойной иммунодиффузии иммунодиффузии, по Оухтерлони, иммуноэлетрофорез), которые метод носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы— полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген— антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител. ЗАДАНИЕ 1.Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле. Для этого на предметное стекло пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки и рядом каплю физиологического раствора. В каждую пробу с помощью бактериологической бактериальной культуры и петли вносят эмульгируют. небольшое Через 2-4 количество минуты в положительном случае в пробе с сывороткой появляются хлопья, кроме того капля становится прозрачной. В контрольной пробе капля остается равномерно мутной. 2.Поставить развернутую реакцию агглютинации. Для постановки реакции взять 6 пробирок. Первые 4 пробирки являются опытными, 5 и 6 – контрольными. Во все пробирки кроме 1 вносят 0,5мл физ.раствора. В первых 4 пробирках провести титрование исследуемой сыворотки (1:50; 1:100; 1:200; 1:400). Во все пробирки, кроме 5-й внести 0,5мл антигена. Пробирки встряхнуть и поставить в термостат (370С) на 2 часа, затем оставить пробы в комнатной температуре на 18часов. Учет результатов проводят по следующей схеме: ++++ полная агглютинация, хорошо выраженный хлопьевидный осадок, надосадочная жидкость прозрачная +++ неполная агглютинация, выраженный осадок, надосадочная жидкость слегка мутная ++ частичная агглютинация, есть небольшой осадок, жидкость мутная + частичная агглютинация, осадок слабо выражен, жидкость мутная - агглютинации нет, осадка нет, жидкость мутная. 3.Ознакомиться с постановкой реакции преципитации при диагностике токсигенного штамма C.diphtheriae. 4. Разобрать схемы прямой и непрямой реакций Кумбса . Контрольные вопросы 1. Иммунитет, его виды 2. Центральные и периферические органы иммунитета. Функции, строение. 3. Основные клетки, задействованные в иммунных реакциях. 4. Классификация антигенов, свойства антигенов, свойства гаптенов. 5. Антигенное строение бактериальной клетки, вируса. 6. Гуморальный иммунитет: особенности, основные клетки, задействованные в гуморальном иммунитете. 7. В-лимфоциты, строение клетки, фазы созревания и клетки, фазы созревания и дифференцировки. 8. Т-лимфоциты: строение дифференцировки. 9. Трехклеточная кооперация в иммунном ответе. 10.Классификация иммуноглобулинов. 11.Строение иммуноглобулина. 12.Неполные антитела, строение, значение. 13.Реакции иммунитета, классификация. 14.Реакция агглютинации, варианты постановки, диагностическое значение. 15.Реакция Кумбса, схема постановки, диагностическое значение. 16.Реакция преципитации, варианты постановки, диагностическое значение. ТЕМА 4. РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА (2 ЗАНЯТИЕ) Реакции лизиса, как правило, проходят с участием 3-х основных компонентов: антиген, антитело, комплемент. Реакции с участием комплемента основаны на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам и лизировать при этом антиген. Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген — антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении сенсибилизированных антителами эритроцитов гемолиза серодиагностики не сифилиса наблюдается. (реакция Реакцию Вассермана), применяют вирусных для и бактериальных инфекций. Реакции бактериолиза основаны на способности комплемента лизировать бактериальную клетку после прикрепления к ее поверхности молекулы антитела. Реакцию используют как при диагностике бактериальных культур, так и определении типа сывороток. Для учета результатов применяют прямые посевы на питательные среды и через 24 часа регистрируют рост с количественным определением степени обсемененности материала. Реакции иммоболизации по механизму сходны с реакциями бактериолиза, но учет результатов производится путем изучение подвижности объекта. Исключением из стандартных реакций иммунного лизиса является реакция агглютинации-лизиса. В качестве антигена в этой реакции участвуют лептоспиры, которые лизируются без участия системы комплемента уже после прикрепления к их поверхности молекул антител. Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эту реакцию используют для обнаружения антистрептолизинов, антистрептокиназы и антистафилолизинов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биологическому эффекту, так, например, титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры патогенность вирусов нейтрализуется, при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции. Помимо вышеописанных методов современные иммунологические лаборатории для определения наличия антител или антигенов используют следующие модификации диагностических систем: A. Иммуноферментные, методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной разновидностью фосфатазой. Наиболее иммуноферментного популярной метода является иммуносорбция. На твердом носителе сорбируют антиген. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. В лунки с сорбированным антигеном вносят исследуемую сыворотку крови, затем меченную ферментом антисыворотку и субстрат. Положительные результаты учитывают по изменению цвета жидкой среды. Для обнаружения антигенов на носитель сорбируют антитела, затем вносят в лунки исследуемый материал и проявляют реакцию меченной Повышению ферментом чувствительности антимикробной сывороткой. иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов способствует введение в систему реакции авидина и биотина. B. Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлись меченный радионуклидом гормон (антиген) и антисыворотка к нему. C. Иммуногистологические методы предназначены для определения антигенов на поверхности или внутри клетки, например для обнаружения маркеров лимфоцитов и иммунокомплексов при гломерулонефритах и других заболеваниях почек. В этой реакции для выявления антигенов пользуются или иммунофлюоресценцией, или иммуноферментными Количество конъюгатами специфических антигенов с пероксидазой. определяют по интенсивности окрашивания. Иногда используют автоматическую регистрацию с помощью спектрофотометра. D. Иммуноблоттинг применяют для выявления антител к отдельным антигенам или «узнавания» антигенов по известным сывороткам. Метод состоит из 3 этапов: разделения биологических макромолекул (например, вируса) на отдельные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле; переноса разделенных белков из геля на твердую подложку (блот); выявления на подложке искомых белков с помощью прямой или непрямой иммуноферментной реакции. Как иммуноблоттинг используют диагностический при метод ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки вируса. ЗАДАНИЕ 1. Зарегистрировать результаты постановки развернутой реакции агглютинации. Разобрать возможные варианты в диагностике заболеваний, где наиболее важно определение титра антител. 2. Произвести реакцию связывания комплемента (согласно таблице 6). Таблица 6 ингредиенты Пробирки 1 2 3 4 5 Сыворотка* 0,25 - 0,25 - - Антиген 0,25 0,25 - - - Комплемент 0,25 0,25 0,25 0,25 - Физиологический раствор - 0,25 0,25 0,5 0,75 Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 * - сыворотка, предварительно инактивируется при 56 0С в течение 30 минут для разрушения нативного комплемента. 3. Разобрать принцип определения состояния иммунного статуса. Контрольные вопросы 1. Т-лимфоциты, строение клетки, фазы дифференцировки, функции. 2. Цитотоксические клетки, классификация, механизмы лизиса. 3. К-клетки, механизм лизиса. 4. NK-клетки, механизм лизиса. 5. Иммунный статус, основные компоненты, диагностическое значение исследования иммунного статуса. 6. Показатели функционирования гуморального иммунитета. 7. Показатели функционирования клеточного иммунитета. 8. Показатели функционирования факторов неспецифической резистентности организма. 9. Классификация иммунодефицитов. 10.Аутоиммунные заболевания: классификация. 11.Реакции лизиса, варианты постановки, механизм. 12.Реакция связывания комплемента: механизм, значение, методика постановки. 13.Реакция иммобилизации, варианты учета результатов. 14.Реакции нейтрализации. 15.Современные модификации диагностических методов. ТЕМА 5. АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ПРИНЦИПЫ ИММУНОТЕРАПИИ И ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ Аллергия (гиперчувствительность) – специфически измененная реакция организма на антиген (аллерген), сопровождающаяся повреждением собственных тканей. Выделяют 4 типа аллергических реакций по Gell и Coombs: реагиновый тип, цитотоксический, повреждение иммунными комплексами и аллергическая реакция замедленного типа. Особенностями методов диагностики при аллергиях является широкое применение кожных проб и лабораторных методов (таблица 7). Таблица 7 Методы специфической диагностики аллергии Кожные тесты Провокационные Клеточные тесты Определение тесты Ig E Прик-тест Скарификационный Интраназальный Конъюктивальный Дегрануляция Иммунофермент- базофилов ный ППН по Фрадкину Радиоаллерго- тест Тест сорбентный Праустниц- интратрахеальный Кюнстера Внутрикожный тест Определение рц к IgE на базофилах - Реакция бласттрансформации - Для иммунопрофилактики могут быть использованы препараты, усиливающие иммунитет и, следовательно, защиту от любого чужеродного агента (неспецифическая профилактика). Вакцины и сыворотки необходимы для создания иммунитета против конкретного возбудителя. Для активной специфической иммунопрофилактики используют вакцины. Выделяют следующие типы вакцин: убитые, живые аттенуированные, химические (субъединичные), рекомбинантные, искусственные (синтетические пептидные). Кроме того, выделяют лечебные вакцины (герпетическая, гонококковая, стафилококковая, протейная и др.) и профилактические (плановые, эндемические, профессиональные, эпидемические). Сыворотки используют в целях пассивной иммунизации, выделяют моно- и микстсыворотки. Схема 2 . Виды иммунотерапии ИММУНОТЕРАПИЯ специфическая сыворотки Формирование иммунитета неспецифическая иммунозаместительная иммунотропные препараты иммунодепрессанты иммуностимуляторы иммуномодуляторы восстановление нормального иммунитета Методы иммунотерапии зависят от состояния иммунного статуса пациента и могут быть различны (схема невосприимчивости к определенному 2). При формировании микроорганизму используют сыворотки (антитоксические, антимикробные). В случае использования неспецифических иммуномодуляторов - в целом нормализуются защитные силы организма. ЗАДАНИЕ 1. Ознакомиться с техникой постановки кожных аллергических проб и системой оценки результатов. 2. Разобрать методы получения вакцин. 3. Ознакомиться с готовыми препаратами живых, убитых, химических вакцин, антитоксических и антимикробных сывороток, гамма- глобулинов. Контрольные вопросы 1. Трансплантационный иммунитет: система гистосовместимости, тканевые антигены. 2. Трансплантационный иммунитет: реакция трансплантант против хозяина. 3. Трансплантационный иммунитет: механизм трансплантанта. 4. Аллергия: классификация аллергенов. 5. Аллергия: механизм аллергической реакции 1 типа. 6. Аллергия: механизм аллергической реакции 2 типа. 7. Аллергия: механизм аллергической реакции 3типа. 8. Аллергия: механизм аллергической реакции 4 типа. 9. Кожные аллергические пробы. 10. Методы активной иммунопрофилактики. 11. Методы пассивной иммунопрофилактики. отторжения 12. Типы вакцин. 13. Общие требования к качеству вакцин. 14. Анатоксины: состав, назначение. 15. Методы получения вакцин. 16. Адъюванты: классификация, механизм действия. 17. Основные принципы иммунотерапии. 18. Неспецифическая иммунодепрессанты. иммунотерапия: иммуностимуляторы и Рекомендуемая для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям литература: 1. Адо А.Д. Общая аллергология.-М.1997. 2. Борисов Л.В., Смирнова А.М., Фрейдлин М.С. Медицинская микробиология.-М.1994. 3. Воробьев А.А. Микробиология.-М.2001. 4. Галактионов В.Г. Графические модели в иммунологии .-М.1986. 5. Клиническая иммунология (под редакцией Караулова А.В.) –М.2001. 6. Клиническая иммунология и аллергология (под редакцией Йегера Л.) – М.1990. ( в 3 томах) 7. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробилогия.-СанктПетербург.-1998. 8. Красильников А.П. Микробиологический справочник.-Минск.-1999. 9. Медицинская микробиология (под редакцией В.И. Покровского) – М.2001. 10.Медицинская вирусология (под редакцией Королюка А.М.)- СанктПетербург.-2003. 11.Пыцкий В.И., Андрианова Н.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания –М.1991. 12.Ройт А.Иммунология.-М.2000. 13.Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология – М.2000.
