РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П. ПАВЛОВА
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П. ПАВЛОВА На правах рукописи РЫБАКОВА ГАЛИНА ИВАНОВНА СТРУКТУРНАЯ КИНЕТИКА НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКА LYMNAEA STAGNALIS В ДИССОЦИИРОВАННОЙ КУЛЬТУРЕ ТКАНИ 03.00.13 – физиология 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2008 2 Работа выполнена в лаборатории функциональной морфологии и физиологии нейрона Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Научный руководитель: Сотников Олег Семенович, д.б.н., засл. деятель науки РФ, профессор Официальные оппоненты: Отеллин Владимир Александрович, д.м.н., чл.-корр. РАМН, зав. лабораторией онтогенеза нервной системы Института физиологии им. И.П. Павлова РАН Даринский Юрий Анатольевич, д.б.н., зав. кафедрой анатомии и физиологии СПб государственного педагогического университета. Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный Университет Защита диссертации состоится « » 2008 г. в ч 00 мин на заседании Диссертационного Совета (Д 002.020.01) по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, г. СанктПетербург, наб. Макарова, 6). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Автореферат разослан « ____» ____________ 2008 г. Учёный секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук Н.Э. Ордян 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Сближение и воссоединение физиологических и морфологических исследований всегда являлось актуальной проблемой нейробиологии. Наиболее современным и распространенным методом клеточной морфо-физиологии является культура диссоциированных нейронов (Spenser et al., 1998; Chuckowree, Vickers, 2003; Tanaka et al., 2006; Jeon et al., 2007). Этот метод позволяет совместить микроэлектродные электрофизиологические и микроскопические исследования. Оказалось, что в культуре нейронов с помощью микроскопии можно выявить и ряд новых неэлектрических функций нейронов (Сотников, 2001). Только с помощью прижизненных исследований нейронов можно уточнить или опровергнуть представления о многих процессах, сформулированных на основании фиксированных «мертвых» препаратов нейрогистологами в прошлом. Актуальность проблемы исследования поведения живых нейронов состоит также в том, что это единственный способ дополнить существующее представление о структуре нейрона данными о его структурной кинетике: регенерационной возможности конусов роста (Baker et al., 2003; Gordon-Weeks; 2004), ретрактильных потенциях нейритов, эффектах многочисленных факторов роста и различных фармакологических веществ (Калюнов, 1986; Yar et al.,1993; Spenser et al., 1995; Ahmed et al., 1997; Spenser et al., 1998). Необычность состояния культуральных исследований в настоящее время состоит в том, что при больших потенциальных возможностях метода культивирования нейронов, при глубоких современных цитохимических знаниях о создаваемых системах нейронов, в неврологии отсутствует сколько-нибудь полное представление о структурной кинетике поведения живых нейронов в диссоциированных культурах. Несмотря на многочисленные и глубокие исследования электрофизиологических молекулярной особенностей связей биологии между в культуре нейронами, ткани, биохимических процессов, протекающих в нейрональных моделях (Magoski, Bulloch, 1998; Kabir et al., 2001; Widmer et al., 2005; Vana, Weiss, 2006), остаются малоизученными структурные процессы, происходящие с нейронами, механизмы морфогенетических процессов. Оказывается мало исследованной кинетика морфологических изменений самих нейронов, поведение нейронов после их травмы, адаптационный период травмированных нейронов, начало регенераторных процессов, механизмы регенерации, различные формы сократительной активности отростков, механизмы формирования нервных отростков и полярности тела клетки, закономерности формирования ганглиев, локальных и сложных сплетений, механизмы их распада, а также возможности формирования межнейрональных 4 связей, включая синцитиальную связь. Несомненно, знание структурных деталей поведения живых нейронов в различных неадекватных условиях имеет прямое отношение к раскрытию патологических механизмов (Luo, O’Leary, 2005). Этим весьма актуальным вопросам и будет посвящена настоящая диссертация. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось последовательное изучение поведения нервных клеток непосредственно после их выделения из мозга и при культивировании in vitro. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить поведение травмированных нейронов после диссоциации ганглия. 2. Исследовать сократительную активность нейритов в культуре ткани. 3. Проанализировать экструзионные и морфогенетические процессы в культуре. 4. Изучить формирование синцитиальной связи между нейритами в культуре ткани. Научная новизна. Проведенные экспериментальные наблюдения за поведением нейронов в культуре ткани свидетельствуют о наличии у нейрона важной неэлектрической функции - сократительной активности. Обнаружено, что ретракция является составной частью регенераторного процесса, а терминальные структуры – конусы роста и колбы ретракции могут служить индикаторами соответствующих процессов не только на живых, но и на фиксированных препаратах. Исследование изолированных нервных волокон демонстрирует автономность этого процесса, его относительную независимость от сомы нейрона. Нам впервые удалось выделить необычную, неизвестную для нейронов форму ретрактильной активности. Помимо обычного линейного сокращения описан новый вид ретракции - изометрическое сокращение, которое характеризуется резким уменьшением объема волокна при сохранении его длины и напоминает ретроградный ток нейроплазмы. Описаны процессы аутотомии сокращающихся нервных отростков и аутоампутации терминалей, механизм которой напоминает апокриновую секрецию нейросекреторных клеток. Высказано предположение о том, что ампутация дегенерирующих терминалей представляет собой микроинъекции нейронального трофического материала в окружающие ткани. С помощью цейтраферной видеосъемки удалось продемонстрировать механизм формирования ганглия, его строгой цитоархитектоники путем сокращения отростков контактирующих нейронов и сближения их тел, при котором их контакты и ретрагирующие отростки закономерно оказываются в центре узла, а тела нейронов снаружи. Впервые удалось показать с помощью культуры ткани, что регенерация нейрона всегда начинается с формирования ламеллы у края его сомы, а не с непосредственного образования нейритов. Ламелла либо сразу превращается в цилиндрический отросток с 5 конусом роста, либо сохраняется и растет длительное время. Представлено подробное описание строения и динамики ламеллярных структур, идентичность с конусами роста и их взаимные переходы. Продемонстрировано, что миграция нейрона осуществляется с помощью перемещения ядра с околоядерной цитоплазмой внутри собственного отростка, при этом обнаруживается новый способ формирования отростка, называемого нами шлейфным. Впервые была обнаружена способность к слиянию ветвей нейритов между собой. Разработаны 2 критерия, позволяющие на живых нейронах в культуре ткани доказать наличие синцитиальной цитоплазматической связи между отростками разных нейронов. Сформулирована гипотеза о возможности образования межнейрональной синцитиальной связи у нейронов, лишенных глии, и в естественных условиях in vivo. Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы состояла в том, чтобы дополнить известные статические представления о строении нейрона материалом о структурной кинетике живых нейронов, их отростков и окончаний, продемонстрировать, что кроме электрогенеза у нейрона существуют другие неэлектрические функции, показать, что с помощью регенерации, ретракции отростков, их аутотомии и миграции сомы нейрона нервные клетки способны к самосборке сложных нейрональных систем. Практическое значение работы состоит в том, что полученные данные могут представить собой принципиально новое дополнение к курсу нейрофизиологии и нейрогистологии нейрона. Полученные данные о сократительной активности нейритов могут учитываться в практической нейрохирургии при травме нервов и проводящих путей, когда, по нашему мнению, целесообразно не только ускорение регенерации с помощью стимуляторов роста, но и предотвращение или ингибирование посттравматической ретракции нейритов. Предложенные нами индикаторы процессов регенерации и ретракции нейритов могут быть использованы для исследования этих процессов в патологических и экспериментальных условиях на статичных гистологических препаратах. Апробация материалов диссертации. Результаты работы были представлены на научнопрактической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины – 2002» (Санкт-Петербург, 2002); на V Российской медикобиологической научная конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2002); на IVи V Международных Конференциях «Колосовские чтения» (Санкт-Петербург, 2002, 2006); на научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии, гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004); на Международной научной 6 конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на севере» (Сургут, 2004); на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005); на IV Всероссийской конференции, посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2005); на конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2005); на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); на Первом международном междисциплинарном конгрессе “Достижения нейронауки для современной медицины и психологии” (Судак, 2005); на Международной конференции "Biology Motility", (Пущино, 2006); на XX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007). Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 5 статей в журналах из списка ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав с изложением экспериментальных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 237 страниц. Из них – 97 рисунков, 3 графика и 1 таблица. Список литературы включает 334 источника: 82 отечественных и 252 зарубежных. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа проводилась на нейронах пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis. Окологлоточное нервное кольцо после отсечения нервов переносили в физиологический раствор для моллюсков при комнатной температуре с добавлением 50мкг/мл гентамицина сульфата. После этого нервное кольцо разрезали на ганглии, которые переносили в 0,3% раствор проназы (Serva), приготовленный на физиологическом растворе, при температуре 200С на 50 мин. Для проведения острых опытов, в которых изучали ретракцию нервных отростков, висцеральный или большой париетальный ганглий помещали на стандартное покровное стекло в каплю 20%-ной среды Игла. Под микроскопом МБС-1 тонкими препаровальными иглами снимали ганглионарные оболочки. Механическим путем диссоциировали его на мелкие части. В результате выделялось много одиночных нейронов с отростками, длина которых достигала 240 мкм. Затем вокруг капли с нейронами делали валик из смеси вазелина и парафина. Полученная камера сверху накрывалась вторым покровным стеклом. Сразу после приготовления препарата производилась цейтраферная видеосъемка – 1 кадр каждые 2 минуты. Для проведения длительного культивирования выделенные ганглии пипетировали в растворе Рингера с помощью Г-образных стеклянных микропипеток с диаметром отверстия кончика 0,8 и 0,6 мм. В результате удавалось получить значительное 7 количество изолированных, лишенных глии нейронов. Для культивирования использовалась 20% бессывороточная питательная среда с определенным химическим составом RРМI-1640 или Игла МЕМ (Sigma) без глютамина и бикарбоната, которую стерилизовали непосредственно перед посадкой. В среду также добавляли гентамицина сульфат в концентрации 50 мкг/мл, L-глютамин в концентрации 0,3 г/л. С помощью бикарбоната натрия устанавливали pH среды 7,8 рH-метр-милливольтметром типа рH-150 (“Измеритель”, Гомель). Для культивирования нейронов использовали модифицированный сосуд Кареля и стеклянные кольца высотой 0,8 см и диаметром 0,8 см (подробнее методику см. Костенко и др., 1998) Посадка нейронов проводилась в специальном стерильном помещении. Культура исследовалась в течение 5-6 дней. Наблюдение за нейронами осуществлялось на автоматизированной микровидеоустановке, созданной фазовоконтрастного микроскопа (ЛОМО). МБИ-13 на базе инвертированного Производилась цейтраферная видеосъемка – 1 кадр каждые 10 минут. Изображение регистрировалось с помощью видеокамеры Panasonic NV DS50 в режиме «M-card», а затем переносилось на компьютер, где проводился анализ поведения нейронов. Характер изменений исследовался на сериях видеоизображений. Для иллюстрации процесса выбирались кадры с наиболее выраженными изменениями и группировались в блоки. Рисунки в диссертации представлены в виде серийных кадров видеосъемки. Измерения проводились в программном пакете TRIM. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование поведения нейронов в диссоциированных культурах предполагает их выделение, при котором нейрон испытывает механическую травму. Исследование поведения таких травмированных нейронов после диссоциации ганглия выявило активную сократительную реакцию нервных отростков, завершающуюся их полным втягиванием в тело клетки у большинства нейронов (рис. 1). На концах сокращающихся отростков формируется булавовидное образование (колба ретракции). Активнее и быстрее сокращаются более тонкие вторичные отростки. Сокращение может протекать с разной скоростью и осуществляется в несколько этапов: с замедлениями, остановками и небольшими удлинениями (рис 2). Скорость ретракции варьирует в широких пределах от 0.4 мкм/мин до 10 мкм/мин, что соизмеримо со скоростью регенерации. Начальная скорость ретракции, как правило, больше конечной в 2-3 раза. Было показано, что регенерация возможна и при остановке сокращения травмированного отростка. На конце нейрита после остановки ретракции формируется пластинчатый конус роста. 8 Рис. 1 Сокращение травмированного нервного отростка и его ветви. а-е – стадии процесса сокращения. Время – от начала наблюдения. мкм 1 250 2 3 200 4 5 150 6 100 7 8 50 0 0 20 40 60 80 100 Время, мин Рис 2. Характер изменения длины отростков во времени при их ретракции После полной ретракции инициального отростка клеток, ставших шаровидными, отмечается период абортивных попыток формирования новых отростков. Это проявляется последовательным образованием экструзионных ламеллярных овальных выпячиваний нейроплазмы клетки. Причем выпячивания волнообразно перемещаются по окружности нейрона и несколько смещают тело клетки в свою сторону. В результате возникает вращательное движение тела нейрона. 9 Следующий этап в развитии культуры диссоциированных нейронов – регенерация нервных отростков. Регенерация нейрона всегда начинается с формирования ламеллы у края его сомы. Ламелла либо сразу превращается в цилиндрический отросток с конусом роста, либо сохраняется и растет длительное время, сохраняясь у дифференцированных нейронов. На классических препаратах Н.Г Колосова (1954), Б.А. Долго-Сабурова (1985), А. Abrakham (1981), А.А. Милохина (1967) ламеллярные структуры нервных волокон широко представлены у взрослых животных, особенно в области сенсорных окончаний вегетативной нервной системы. Поэтому можно с уверенностью говорить о том, что описанные нами ламеллы не является исключительно культуральным феноменом. Конус роста представляет собой расширяющуюся к периферии небольшую ламеллу приблизительно треугольной формы с большим количеством тончайших, едва заметных филоподий. Имеется масса переходных форм между обычными небольшими ламеллами конуса роста и крупными ламеллами, снабженными множественными филоподиями. Удается показать, что конусы роста и колбы ретракции на фиксированных препаратах могут служить индикаторами роста и ретракции, наблюдаемых у живых нейронов. В культуре одиночных нейронов при отсутствии соседних клеток и возможности контакта с ними постоянно формируются рекуррентные отростки, образующие аутапсы. В результате возникают структуры, напоминающие ячейки, аркады, кольца. Нами продемонстрирован механизм их формирования. Регенерация представляет собой двухэтапный процесс, при котором экструзионная составляющая чередуется с процессом ретракции. Причем при росте одних отростков одного нейрона наблюдается ретракция других его отростков. Явление ретракции отмечается и после установления межнейронных контактов. Нам впервые удалось выделить две формы ретрактильной активности нейронов. Первая – обычная, линейная форма сокращения, сопровождающаяся уменьшением длины отростка. Вторая форма, которую мы назвали изометрической, не приводит к изменению длины отростка, а сопровождается транслокацией массы нейроплазмы в сторону тела нейрона. Повидимому, изометрическое сокращение чаще наблюдается при формировании двух точек фиксации (значительной адгезии), расположенных на конце волокна и на теле клетки. Такая форма сокращения известна для мышечных волокон (Golovko, Tyurina, 2006). В классической гистологии этому состоянию, по-видимому, соответствует так называемые “мумифицированные”, “атрофированные” волокнам, которые часто встречаются нейрогистологам при исследовании травм или заболеваний нервной системы (Амвросьев, 1967, 1972). Эффект «дендритной атрофии» отмечен при диабете, хроническом стрессе и хроническом воздействии кортикостерона (Magarinos, McEwen, 2000). 10 Исследование в культуре ткани показывает значительную распространенность изометрической формы сокращения. Примечательно, что эту форму сокращения удалось описать на живых волокнах в культуре ткани. По-видимому, эта форма сокращения оказалась скрытой для обычных нейрогистологических исследований, так как не проявляет себя изменением длины отростка. Изометрическое сокращение ламеллярных отростков может приводить к формированию тубулярных отростков. По-видимому, процесс ретракции нейритов является автономным, так как он сохраняется у изолированных от тела нейрона волокон. Фрагменты нервных волокон, изолированные от тела нейрона, тем не менее, не теряют способности сокращаться. Следовательно, эта способность отростка не зависит от сомы и связана с локальной активностью сократительных белков нейроплазмы. Такие фрагменты нервных волокон сокращаются с обоих концов. Это проявляется образованием колб ретракции на этих концах. Фактически на прижизненных препаратах удается воспроизвести феномен П.З. Гудзя (1963), который на фиксированных препаратах обнаружил на концах изолированных фрагментов нервных волокон, как он полагал, “колбы роста”. На самом же деле эти колбовидные структуры свидетельствуют о сокращении нервного отростка. Сокращающиеся изолированные волокна претерпевают варикозную деформацию. Так как при нарушении целостности волокна всегда отмечается его ретракция, нами высказано предположение о том, что ретракция нейритов является существенным фактором в механизме формирования диастаза перерезанных нервов. Поэтому нами предприняты эксперименты по ингибированию сокращения нервных отростков. Оказалось, что ретракция волокон отсутствует или тормозится в бескальциевой среде и в среде, содержащей ионы кобальта. В присутствии блокаторов кальциевых каналов нимодипина и нитрендипина также наблюдалось частичное ингибирование ретракции. Эти данные соответствуют результатам предшествующих исследований (Dispersyn et al., 1999). Возможность ингибирования ретракции продемонстрирована также при действии никардипина (Nachman-Clewner et al., 1999), флунаризина, γ-конотоксина (Pugh, Berg, 1994), форсколина, вортманина (Leemhuis, 2004), при повышении в среде концентрации Mg2+ (Grumbacher-Reinert, Nicholls, 1992; Neely, 1999). Интенсивная ретракция при наличии адгезионных контактов может завершаться аутотомией отростков. Наиболее часто отмечается аутоампутация терминалей отростков. Она может происходить при обычной ретракции без истончения отростка. Механизм аутоампутации напоминает апокриновую секрецию. Так как дегенерирующие цитосомы сенсорных терминалей, заполненные распадающимися лизосомами, содержат значительное количество активированных протеолитических и других гидролитических 11 ферментов, которые являются нейротрофинами, можно думать, что нами описан механизм выделения трофических веществ, обеспечивающих нейротрофическое влияние на окружающие ткани. Последнее время появилось значительное число работ, демонстрирующих выделение биологически активных пептидов: субстанции Р и кальцитонин-ген-родственного пептида сенсорными окончаниями и их трофический эффект на окружающие ткани (Holzer, 2001; Herbert, Holzer, 2002). Описан феномен перемещения сомы нейрона (ядра с окружающей нейроплазмой) внутри собственного отростка. Показано, что механизм миграции нейронов включает несколько факторов. Во-первых, при этом необходима адгезия окончания растущего нейрита, во-вторых, подтягивание сомы нейрона в направлении адгезированного конуса роста. Этот процесс, как показано нами в культуре ткани, протекает путем транслокации сомы нейрона внутри собственного отростка. При этом удается продемонстрировать новый способ формирования отростков, который осуществляется не путем экструзии и роста, а путем ретракции и смещения сомы нейрона в направлении уже существующих отростков. В результате в зоне бывшей локализации тела остается вытянутый, ровный, неветвящийся отросток, который мы назвали шлейфным. Вполне вероятно, что таким образом формируются все инициальные отростки униполярных нейронов, которые также являются ровными, неветвящимися, от которых отходят аксон и дендрит. При перемещении тела нейрона в дендритные отростки, ветви дендритов становятся отростками тела нейрона. Одноотростчатый нейрон превращается в мультиполяр. После установления контактов между отростками одиночных нервных клеток, ретракция этих отростков приводит к сближению тел клеток. При этом контакты и сами сократившиеся отростки оказываются внутри агрегата, как и положено нейропилю, а сомы нейронов остаются на периферии формирующегося ганглия. Эта цитоархитектоника полностью соответствует организации ганглиев многоклеточных животных. Удалось выявить, что сократительная функция нейритов обеспечивает также сближение одиночных ганглиев, образуя синганглии. Натяжение нервных волокон в сформированном сплетении приводит к их сближению и, в конечном итоге, к образованию нервных пучков. Таким образом, ретрактильный механизм формирования ганглиев и пучков приводит к появлению из диффузного сплетения плексусно-ганглионарной системы нейронов, которая, как было показано ранее (Сотников и др., 1994), напоминает формирование плексусно-ганглионарных нервных систем беспозвоночных. При выращивании сплетений мы наблюдали, что вначале формируются локальные сплетения, объединяющие группы сближающихся нейронов. (Выделено три способа формирования локального сплетения.) В дальнейшем нервные волокна этих сплетений 12 растут к соседним локальным сплетениям, формируя сложные культуральные сплетения (рис 3). Примечательно, что распад сплетений в стареющих культурах происходит в обратном порядке: выделение локальных сплетений из сложных, нарушение межклеточных связей внутри локальных сплетений, ретракция и дегенерация оставшихся волокон и в последнюю очередь гибель тел нейронов. Рис. 3 Панорама плексусно-ганглионарной системы нейронов. 1 – микроганглии; 2 - нервные пучки; 3 – интернейрональные волокна; 4 – асинаптические нервные волокна; 5 – ампутированные цитосомы; А-В – тела нейронов. Время – от начала культивирования. 13 Возможно, это наблюдение имеет практический интерес, так как не исключено, что подобный механизм существует и при реальной патологии. При исследовании стареющих сплетений обращает внимание появление варикозностей на нервных отростках, преобладание колб ретракции над конусами роста, увеличение числа истонченных отростков в результате изометрического сокращения и ампутированных колб ретракции (цитопластов). Вначале варикозности появляются на тонких частях волокна. С помощью фазового контраста на живых объектах видно, что варикозности состоят из двух компонентов: из жидкой наружной нейроплазмы, стремящейся сформировать каплю, и тонкой плотной структуры (филаментозно-тубулярного аксиального цитоплазматического тяжа). Нами впервые обнаружена в культуре ткани способность к слиянию ветвей нейрита между собой. Контактирующие нервные волокна разных нейронов также способны образовывать синцитиальные цитоплазматические анастомозы. Разработаны 2 критерия, позволяющие на живых нейронах в культуре ткани доказать наличие таковой связи. Нами обнаружено, что если тело одного из двух контактирующих своими отростками нейронов гибнет, а ее отростки остаются жизнеспособными, это означает, исходя из закона валлеровской дегенерации, что они имеют синцитиальную цитоплазматическую связь с другим трофическим центром (рис. 4). Рис. 4 Схема динамики формирования синцитиальной связи между отростками разных нейронов в культуре ткани. а-г– стадии образования синцития; А,Б,В – нейроны, формирующие синцитий; а – соединенные филоподии (стрелка) клеток А и Б перед слиянием их ламеллярных отростков; б – контакт и возможное слияние отростка (1) клетки А и ламеллы (2) клетки Б; в – гибель тела нейрона Б и сохранение жизнеспособности его отростков (2). 14 В качестве второго критерия мы использовали эффект перемещения цитоплазматических варикозностей через область контакта отростков двух нейронов. Варикозности, предсуществующие на одном из отростков, преодолевали место контакта с другим нейроном и перемещались вдоль отростка чужого нейрона вплоть до его тела. Ранее в литературе приводились факты слияния филоподий нейрональных конусов роста между собой и с пластинчатой частью конуса роста в культуре ткани (Luduena, Wessels, 1973). Доказательства слияния филоподий были подтверждены авторами также с помощью электронного микроскопа (Spooner et al., 1974). Как известно, слияние мембран и образование синцития – это универсальный и сейчас уже хорошо исследованный клеточный процесс. Он характерен для многих нормально функционирующих ненервных клеток и при их патологии (Ненашев, 1984; Bennett, Gibson, 1995), при оплодотворении и в эмбриогенезе, при образовании мышечных волокон (Самосудова и др., 1988; Орлов и др., 1989; Риттер и др., 1990), искусственном получении гибридных клеток (Рингерц, Сэвидж, 1979; Zimmermann, Stopper, 1987). Нами представлены факты наличия такой связи в культуре ткани. При обсуждении вопроса о возможности синцитиальной связи между нейронами обращает на себя внимание, что формирование такой связи между всеми другими клетками и возможность их слияния не вызывает дискуссии (Ephrussi, 1976; Зеленин и др., 1982). Более того, недавно убедительно продемонстрирована возможность слияния нейронов и глиоцитов (Ackman et al., 2006; Самосудова и др., 2007), нейронов Пуркинье и стволовых клеток костного мозга (Alvarez-Dolado et al., 2003; Bae, 2005; Terashima et al., 2005). Хотя в нормальной культуре диссоциированных нейронов формирование синцитиальной связи, по-видимому, описывается впервые, упоминание о такой возможности при патологических условиях в современной литературе имеется (Боголепов и др., 1986; Самосудова и др., 1994; Семченко и др., 19). Таким образом, исследование поведения живых изолированных нейронов в культуре ткани позволяет обнаружить новые факты, которые свидетельствуют о том, что у нервных клеток помимо функции электрогенеза существует ряд неэлектрических функций, и выявить ряд морфогенетических процессов. В результате представления о структуре нейронов и нервных систем в статике могут быть дополнены представлениями о структурной кинетике нейронов. ВЫВОДЫ 1. Прижизненные кинетические исследования поведения нейронов в культуре ткани с помощью автоматической цейтраферной видеосъёмки выявили, что регенерация нервных 15 отростков начинается не с непосредственного образования нейритов, а с появления ламелл, на базе которых формируются истинные нейриты. Рост нейритов обязательно чередуется с их сокращением, что представляет собой структурный рециклинг терминалей. Конусы роста и колбы ретракции являются закономерными индикаторами процессов регенерации и сокращения соответственно. 2. Исследования травмированных и длительно культивируемых нейронов впервые позволили выделить две формы сокращения нервных отростков: линейное сокращение со скоростью от 0.4 мкм/мин до 10 мкм/мин, сопровождающееся уменьшением длины отростка, и изометрическое сокращение, которое характеризуется целлюлопетальным перемещением нейроплазмы и уменьшением объема волокна без изменения его длины. При ретракции отростка возможна транслокация ядра нейрона внутри этого отростка с образованием остаточного шлейфного отростка. Механизм линейной ретракции нейритов обладает автономностью, поэтому изолированные нервные отростки способны сокращаться и в отсутствие тела нейрона. 3. У сокращающихся нервных отростков впервые описано явление аутотомии и аутоампутации терминалей. Механизм реализации аутоампутации подобен апокриновой секреции. 4. С помощью культуры ткани удалось разработать модель формирования межнейронной синцитиальной связи, для определения которой предложены два критерия: отсутствие валлеровской дегенерации у ветвей погибшего нейрона, которые ранее установили связь с ветвями другого нейрона и процесс перемещения цитоплазматических варикозностей между отростками двух контактирующих клеток. Впервые обнаружена также способность к слиянию различных ветвей нейрита между собой. 5. Впервые продемонстрирован механизм формирования цитоархитектоники ганглиев, характерный для ганглиев беспозвоночных in vivo. Он заключается в ретракции контактирующих нервных отростков, сближении и агрегации тел нейронов. При этом межнейрональные контакты и сократившиеся отростки оказываются внутри агрегата, образуя нейропиль, а сомы нейронов остаются на периферии формирующегося ганглия. 6. Прослежена закономерная кинетика формирования и распада сложной плексусноганглионарного системы нейронов. Вначале одиночные смежные нейроны устанавливают первичные контакты и образуют локальные сплетения. Затем путем роста отростков и установления контактов между локальными сплетениями формируется общая сложная плексусно-ганглионарная система. Распад сложных сплетений происходит в обратном порядке. 16 СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Рыбакова Г.И. Модель культуры изолированных нейронов для анализа нейротропных веществ и нейропатологических конференции молодых процессов.// ученых Тез. «Актуальные докл. научно-практической вопросы клинической и экспериментальной медицины – 2002». СПб, МАПО, 2002.- С.207. 2. Рыбакова Г.И. Идентификация нормальных и патологически измененных нейронов в культуре ткани.// Тез. докл. IV международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения – 2002». СПб, 2002.- С.247. 3. Сотников О.С.,Рыбакова Г.И., Чепур С.В. Кинетика структуры нервных отростков in vitro в предрегенерационный период.// Тез. докл. научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии, гистогенез и регенерация тканей». СПб, ВМА. 2004.- С.54. 4. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Рашевская Ю.В.Сократительная активность нервных отростков в культуре ткани и in situ. // Тез. докл. Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на севере». Сургут, 2004.- С.128-131. 5. Рыбакова Г.И., Рашевская Ю.В., Арчакова Л.И. Новый механизм формирования отростков травмированных нервных клеток.// Тез. докл. Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». СПб, 2005.- С. 101. 6. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Арчакова Л.И. Попытка моделирования метасимпатической нервной системы в культуре ткани.// Тез. докл. IV Всероссийской конференции, посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П.Павлова РАН «Механизмы функционирования висцеральных систем». СПб, 2005.- С. 233-234. 7. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Рашевская Ю.В. Функция асинаптических дендритов (тканевых рецепторов). // Тез. докл. 4-ой Всероссийской конференции «Бабухинские чтения в Орле», ЗАО ФНПП «Ретиноиды», Альманах 2005, В.21.- С.102-104. 8. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Рашевская Ю.В.Термодинамические закономерности динамики структуры живых нейронов в культуре ткани.// Тез. докл. V Сибирского физиологического съезда. Томск: СибГМУ, 2005.- С. 32. 9. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Рашевская Ю.В., Арчакова Л.А. Двигательная активность поврежденных нервных отростков.// Тез. докл. Первого международного 17 междисциплинарного конгресса “Достижения нейронауки для современной медицины и психологии”. Судак, 2005.- С. 149-151. 10. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Арчакова Л.А, Лукашин В.Г. Аутотомия и аутоампутация нервных отростков в культуре ткани и in vivo. //ДАН.- 2006.- T.409, № 6.- C. 841-843. (Autotomy and Self-amputation of Nerve Processes in Tissue Culture and in Vivo.// Doklady Biol. Sci.- 2006.- V. 409.- P.293-295). 11. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Арчакова Л.А, Лукашин В.Г. Индикаторы роста и ретракции нейритов в культуре ткани и на гистологических препаратах.// Бюлл. экспер. биол. и мед.- 2006.- T. 142, №8.- C. 227-232. 12. Сотников О.С., Малашко В.В., Рыбакова Г.И. Феномен слияния нервных волокон.// ДАН.- 2006.- T. 410, №1.- C. 130-133. 13. Рыбакова Г.И., Сотников О.С. Синцитиальная связь нейритов в культуре ткани. // Тез. докл. V Международной конференции «Колосовские чтения-2006». СПб, Морфология.- 2006.- Т.129, В.2.- С.83 14. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Малашко В.В., Соловьева И.А. Контактная и синцитиальная связи нейронов.// Тез. докл V Международнрй конференции «Колосовские чтения-2006». СПб, Морфология.- 2006.- Т.129, В.2.- С.91. 15. Sotnikov O.S., Rybakova G.I. Neurites interflow in tissue culture.// International conference "Biology Motility". Pushino, 2006, Р. 64-65. 16. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Малашко В.В. Цитоплазматический синцитий в нервной системе.// Тез. докл. XX съезда физиологического общества им. И.П.Павлова, РАН. М., 2007, С. 429. 17. Сотников О.С., Малашко В.В., Рыбакова Г.И. Синцитиальная связь нейронов в культуре ткани в раннем онтогенезе.// Морфология.- 2007.- T. 131, № 2.- C. 7-15. 18. Сотников О.С., Рыбакова Г.И., Соловьева И.А. Проблема слияния отростков нейронов.// Морфология.- 2007.- T. 132, № 5.- C. 18-22.
