1.1 Роль апоптоза в физиологических и патологических процессах
advertisement
УДК 616.988 ГРНТИ 76.03.31, 76.03.55, 76.29.50 Инв. № ПРИНЯТО: УТВЕРЖДЕНО: Приемочная комиссия Государственного заказчика Государственный заказчик Федеральное агентство по образованию От имени Приемочной комиссии От имени Государственного заказчика _____________________/Е.П. Попова/ ____________________/ Е.Я. Бутко/ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П1084 от 24 августа 2009 г. и Дополнения №1-П1084 от 23 октября 2009 г. Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова» Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.3.1 «Проведение научных исследований молодыми учеными-кандидатами наук» Проект: «Молекулярные основы регуляции программированной гибели клеток при хронических онкогенных вирусных заболеваниях» Руководитель организации: ______________________Б.С. Карамурзов м.п. Руководитель проекта: ________________________ А.А. Шевченко Согласовано: Управление научных исследований и инновационных программ От имени Заказчика _______________________/Кошкин В.И./ Нальчик 2009 г. Список исполнителей Научный руководитель, Шевченко А.А. с.н.с. УНИИД КБГУ, к.б.н. (Реферат, введение, 20.10.2009 главы 1-5, заключение) Исполнители Заведующая кафедрой Хараева З.Ф. микробиологии, вирусологии и (Главы 1-5, иммунологии КБГУ.д.м.н., 20.10.2009 приложение 2) профессор Профессор кафедры Иванова М.Р. инфекционных болезней КБГУ, (Главы 1-5) д.м.н., профессор 20.10.2009 Ассистент кафедры Мизиева С.М. терапевтической стоматологии (Главы 1-5) КБГУ 20.10.2009 Жемухова Р.Х. Аспирант КБГУ 20.10.2009 (Главы 1-5) Мусуков Б.М. Студент КБГУ 20.10.2009 (Главы 1-5) Хосаев Д.Ю. Студент КБГУ 20.10.2009 Начальник патентного отдела (Главы 1-5) Искакова Г.А. КБГУ 20.10.2009 Нормоконтролер, 20.10.2009 начальник ОСМО 2 (Приложение 1) Кольченко Е.А. Реферат Отчет 228 с., 1 ч., 8 рис., 24 табл., 280 источников, 2 прил. АПОПТОЗ, ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ, ГЕРПЕТИЧЕСКАЯ ИНФЕКЦИЯ, ПАПИЛЛОМАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ, ОНКОГЕННЫЙ РИСК Программируемая клеточная гибель или апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточной популяции в многоклеточном организме. Вирусы способны оказывать иммуносупрессивное действие, направленность которого может быть связана как с клеточным иммунитетом, так и с нарушением синтеза цитокинов и снижения апоптической активности зараженных клеток [Alonso С.L. 2004; Ambar B.B. 1999; Hardwick J.M. 2001; Hoetelmans R.W. 2000]. Особенно актуальной является проблема развития процесса вирогении в случае таких хронических вирусных инфекций как вирусные гепатиты В, С, герпетические инфекции, когда, несмотря не отсутствие активной репликации вируса, клетки макроорганизма «заражены» геномом вируса. Перспективной задачей современной иммунологии является поиск путей модуляции механизма работы клеток в направлении регуляции апоптоза. Целью исследования было изучение маркеров апоптоза в сыворотке крови и других биологических жидкостях при хронических вирусных инфекциях с высоким онкогенным риском. Для оценки активности апоптоза были исследованы ФНО-зависимые лиганды TRAIL, sFAS, ФНО-α у пациентов с хроническими гепатитами с парантеральным механизмом инфицирования, хроническими герпетическими инфекциями (ВПГ-1,2, ЦМВИ), папилломавирусной инфекцией разного онкогенного риска. Показатели изучались в сыворотке крови и отделяемом половых органов. Проведено сравнительное исследование активности показателей апоптоза при различных вирусных инфекциях и в различном биологическом материале. 3 Определены нозологические формы с наиболее выраженным снижением апоптоза, определены перспективные направления дальнейшего поиска причин нарушения противовирусной защиты, с целью использования в качестве прогностических, диагностических критериев и с целью выбора методов терапии. 4 Содержание Введение ....................................................................................................................... 7 Глава 1 Аналитический обзор .................................................................................... 9 1.1 Роль апоптоза в физиологических и патологических процессах ..................... 9 1.2 Морфологические изменения при апоптозе ..................................................... 11 1.3 Формирование в цитоплазме полостей и апоптотических телец................... 14 1.4 Механизмы апоптоза .......................................................................................... 16 1.4.1 Стимулы и сигнальная передача программы апоптоза ................................ 16 1.4.1.1 Рецепторы и лиганды клеточной гибели .................................................... 17 1.4.1.2 Митохондриальный путь апоптоза ............................................................. 21 1.4.1.3 Сфингомиелиновый сигнальный путь ........................................................ 24 1.4.1.4 Взаимодействие различных путей апоптоза .............................................. 26 1.4.1.5 Эффекторная фаза апоптоза и разрушение клеточных белков: каспазы 28 1.4.2 Протеинкиназы в механизме апоптоза .......................................................... 30 1.4.2.1 Митоген-активируемая протеинкиназа ...................................................... 30 1.4.2.2 Фосфатдилинозитол 3’-киназа (PI3-K) и Akt ............................................. 31 1.4.3 Белки – регуляторы апоптоза .......................................................................... 33 1.4.3.1 Представители семейства Bcl-2 ................................................................... 33 1.4.3.2 ВН3-белки ...................................................................................................... 36 1.4.3.3 Проапоптотические белки, высвобождаемые дестабилизированными митохондриями .......................................................................................................... 38 1.5 Генетический контроль апоптоза, генетическая регуляция апоптозной активности .................................................................................................................. 39 Глава 2 Выбор и обоснование оптимального варианта направления исследования .............................................................................................................. 42 2.1 Апоптоз при вирусных парентеральных гепатитах ......................................... 42 2.2 Апоптоз при герпетических и папилломавирусных инфекциях .................... 55 Глава 3 План проведения экспериментальных и теоретических исследований 66 5 Глава 4 Экспериментальные и теоретические исследования ............................... 68 4.1 Клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика обследованных групп больных хроническим вирусным гепатитом В, С ........... 68 4.1.2 Клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика обследованных групп больных герпетической инфекцией (вирус простого герпеса -1,2 типа и цитомегаловирусная инфекция) ............................................. 89 4.2 Лабораторные методы исследования ................................................................ 93 4.2.1 Метод определения sFAS ................................................................................ 93 4.2.2 Ход определения содержания TRAIL-связанного апоптоз ......................... 94 индуцирующего лиганда .......................................................................................... 94 4.2.3 Определение фактора некроза опухоли α(ФНОα) в сыворотке крови ....... 96 Глава 5 Результаты исследований .......................................................................... 98 5.1 Cывороточные показатели апоптоза при парентеральных гепатита ............. 98 5.2 Показатели апоптоза при герпетической и папилломавирусной инфекциях ................................................................................................................................... 103 5.2.1 Cывороточные показатели апоптоза при герпетической и папилломавирусной инфекциях ............................................................................ 103 5.2.2 Показатели апоптоза в отделямом половых органов при герпетической и папилломавирусной инфекциях ............................................................................ 110 Заключение .............................................................................................................. 115 Список использованных источников .................................................................... 122 Приложение 1 Отчет о патентных исследованиях .............................................. 149 Приложение 2 Клинические карты ....................................................................... 224 6 Введение Программируемая клеточная гибель или апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточной популяции в многоклеточном организме. Наиболее хорошо изучена последовательность событий, приводящих клетку к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства фактора некроза опухоли (ФНО) со специфическими рецепторами [Lorenz H.M. 2000; Reed J.C. 2002; Shigekazu N. 1997; Vaux D.L. 1997; Wang X. 2001]. Ярким представителем этой группы белков является система Fas/Fas-L. Fas-L является цитокином из ФНО-семейства, экспрессируется на поверхности различных клеток, в том числе на активированных Т-лимфоцитах и натуральных киллерах [Al Maini M.H. 2000; Aral H. 1997; Bamberger A.M. 1997; Holler N. 2003; Kang S. M. 1999; Kawaguchi Y. 1999]. Возможным механизмом «Fas-рецепторной недостаточности» при вирусных хронических инфекциях является увеличение содержания растворимого Fas26 рецептора (sFas), продукта альтернативного сплайсинга mРНК FasR и протеолитического отщепления трансмембранного FasR. ФНОα - один из основных цитокинов, способных оказывать прямое повреждающее действие на клетки-мишени и лизировать клетки, инфицированные вирусом, является необходимым и в то же время достаточным индуктором местных и системных воспалительных реакций [Кетлинский С.А. 1997; Козлов В.А. 2002; Новиков В.В. 2005]. ФНО также является индуктором апоптоза и воспринимается рецепторами, по структуре напоминающими Fas. Цитоплазматический фрагмент Fas и ФНО-рецепторов содержит домен «смерти», транслирующий апоптозный сигнал на внутриклеточный аппарат апоптоза [Аббасова С.Г. 1997; Барышников. А.Ю. 2002; Дмитриева Е.В. 2003; Akshay K.V. 1997; Bellgrau D. 1995; Banner D.W.1993; Galle P.R. 1995]. В тоже время вирусные белки способны оказывать иммуносупрессивное действие, направленность которого может быть связана как с клеточным иммунитетом, так и с нарушением синтеза цитокинов 7 и снижения апоптической активности зараженных клеток [Alonso С.L. 2004; Ambar B.B. 1999; Hardwick J.M. 2001; Hoetelmans R.W. 2000]. В вирусном генетическом материале закодированы вещества, которые и по строению, и по функции очень похожи на клеточные антиапоптозные белки-регуляторы (Bcl-2) [ Gross A. 1999; Guo В. 2001; Hsu Y.-T. 1997; Huang D.C. 1997; Ilyas M. 1998; Johnson A. L. 1999; Liang Y. 2002]. Особенно актуальной является проблема развития процесса вирогении в случае таких хронических вирусных инфекций как вирусные гепатиты В, С, герпетические инфекции, когда, несмотря не отсутствие активной репликации вируса, клетки макроорганизма «заражены» геномом вируса. Перспективной задачей современной иммунологии является поиск путей модуляции механизма работы клеток в направлении регуляции апоптоза. Целью исследования было изучение маркеров апоптоза в сыворотке крови и других биологических жидкостях при хронических вирусных инфекциях с высоким онкогенным риском. 8 Глава 1 Аналитический обзор 1.1 Роль апоптоза в физиологических и патологических процессах Сегодня хорошо известно, что эмбрион использует апоптоз как часть своей программы развития для удаления зародышевых структур и построения новых органов [Ярыгин В.Н. 1999]. Апоптоз продолжает играть важную роль в постнатальной жизни, поддерживая тканевой гомеостаз и удаляя поврежденные и ненужные клетки. Во многих тканях взрослого организма, таких как соединительная или мышечная, частота апоптоза в нормальных условиях минимальна. Однако клетки в этих тканях могут запускать программу программированной гибели под воздействием специфических токсинов внешней среды, химиотерапии, радиации, окислительного стресса, гипоксии или воспаления [Баснакьян А.Г. 2001; Владимирская Е.Б. 1997; Метелица И.С. 1996; Новожилова А.П. 1996]. Другие ткани, в частности те, что состоят из гемопоэтических и эпителиальных клеток, имеют более высокую скорость клеточных обновлений, при которых многократные митозы уравновешиваются адекватным уровнем апоптоза. Такие ткани содержатся в органах иммунной системы, тонкой кишке, матке и яичниках. [Белушкина Н.Н. 2004; Метелица И.С. 1996]. Таким образом, апоптоз принимает участие в следующих физиологических и патологических процессах: 1. Запрограммированном разрушении клеток во время эмбриогенеза (включая имплантацию, органогенез). Несмотря на то, что при эмбриогенезе апоптоз не всегда является отражением «запрограммированной смерти клетки», это определение апоптоза широко используют различные исследователи [Ярыгин В.Н. 1996]. 9 2. Гормон-зависимой инволюции органов у взрослых, например, отторжение эндометрия во время менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессия молочной железы после прекращения лактации [Белушкина Н.Н. 2004; Метелица И.С. 1996]. 3. Удалении некоторых клеток при пролиферации клеточной популяции Гибели отдельных клеток в опухолях, в основном при ее регрессии, но также и в активно растущей опухоли [Белушкина Н.Н. 2004]. 4. Гибели клеток иммунной системы, как В-, так и Т-лимфоцитов, после истощения запасов цитокинов, а также гибели аутореактивных Т-клеток при развитии в тимусе [Белушкина Н.Н. 2004; Робинсон М.В. 1991; Bell C.G. 1995]. 5. Патологической атрофии гормон-зависимых органов, например, атрофии предстательной железы после кастрации и истощении лимфоцитов в тимусе при терапии глюкокортикоидами [Князькин И.В. 2007; Ackerman R.C. 1994; Higashijima T. 1997]. 6. Патологической атрофии паренхиматозных органов после обтурации выводных протоков, что наблюдается в поджелудочной и слюнных железах, почках [Arends M. J. 1991]. 7. Гибели клеток, вызванных действием цитотоксических Т-клеток, например, при отторжении трансплантата и болезни «трансплантат против хозяина» [Arends M. J. 1991]. 8. Повреждении клеток при некоторых вирусных заболеваниях, например, при вирусном гепатите, когда фрагменты апоптотических клеток обнаруживаются в печени, как тельца Каунсильманна [Буеверов А.О. 2000; Alonso С L. 2004]. 9. Гибели клеток при действии различных повреждающих факторов, которые способны вызвать некроз, но действующих в небольших дозах, например, при действии высокой температуры, ионизирующего излучения, противоопухолевых препаратов [Владимирская Е.Б.,1997, Сыркин А.Б.,1995]. 10 Таблица 1 - Некоторые проявления апоптоза при физиологических и патологических процессах. Процесс Проявление Запрограммированное разрушение клеток во время эмбриогенеза Удаление зародышевых структур Физиологическая инволюция органов Инволюция тимуса Повреждение паренхимы печени при вирусных гепатитах Гибели клеток, вызванных действием сенсибилизированных Т-клеток Тельца Каунсильманна Отторжение трансплантанта Физиологическая гормон-зависимая Атрезия фолликулов в яичниках в атрофия менопаузе Патологическая гормон-зависимая Атрофия предстательной железы атрофия после кастрации Снижение активности апоптоза при Опухолевый рост раке толстой кишки 1.2 Морфологические изменения при апоптозе Морфологический апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец («апоптотические тельца»), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками. Это энергозависимый процесс, посредством которого удаляются нежелательные и дефектные клетки организма. Он играет большую роль в морфогенезе и является механизмом постоянного контроля размеров органов [Апросина З.Г., 2000; Барышников А.Ю. 2002]. При некрозе клетки набухают, их митохондрии и другие органеллы расширяются (вследствие нарушения работы ионных каналов) и разрываются 11 внутриклеточные и плазматическая мембраны клетки (таблица 2). В результате этого активируются лизосомальные ферменты, а внутриклеточное содержимое, попадая во Классические внеклеточную среду, причины, вызывает воспалительные процессы. приводящие к некрозу клетки -гипертермия, ингибирование окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, гипоксия, действие комплемента или различных токсинов. Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне [Bell C.G. 1995; Golstein P. 1997]. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз – в отличие от некроза – никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление (таблица 2). Наиболее четко морфологические признаки выявляются при электронной микроскопии. Для клетки, подвергающейся апоптозу характерно (рисунок 1): Сжатие клетки. На ранних стадиях апоптоза плазматическая мембрана умирающей клетки остается интактной. Клетка посылает сигналы, и окружающие клетки узнают и фагоцитируют ее. Одним из таких сигналов является экспозиция на поверхности фосфатидилсерина. Это происходит до снижения митохондриального трансмембранного потенциала и высвобождения цитохрома С. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы. Этот 12 фермент вызывает прогрессивное образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия. Таблица 2 - Сравнительная характеристика некроза и апоптоза. Признак Индукция Распространенность Биохимические изменения Распад ДНК Целостность клеточной мембраны Морфология Воспалительный ответ Удаление погибших клеток Апоптоз Активируется физиологическими или патологическими стимулами Одиночная клетка Некроз Различная в зависимости от повреждающего фактора Группа клеток Энергозависимая фрагментация ДНК эндогенными эндонуклеазами. Лизосомы интактные. Нарушение или прекращение ионного обмена. Из лизосом высвобождаются ферменты. Внутриядерная конденсация с расщеплением на фрагменты Диффузная локализация в некротизированной клетке Сохранена Нарушена Сморщивание клеток и фрагментация с формированием апоптотических телец с уплотненным хроматином Нет Набухание и лизис клеток Обычно есть Поглощение (фагоцитоз) соседними клетками Поглощение (фагоцитоз) нейтрофилами и макрофагами Конденсация хроматина - это наиболее характерное проявление апоптоза. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро же может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм 13 конденсации хроматина изучен достаточно хорошо. Он обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований делится на 180-200. При электрофорезе фрагменты дают характерную картину лестницы. Эта картина отличается от таковой при некрозе клеток, где длина фрагментов ДНК варьирует. Для облегчения своего поглощения апоптотическая клетка уменьшает свой объем, выкачивая ионы (К , С1-, органические осмолиты), и сокращается, перестраивая цитоскелет. Кроме того, Также сокращение клетки обычно сопровождается уплотнением ядерного содержимого. Происходит агрегация хроматина и фрагментация ядра. Было показано, что после индукции апоптоза расщепление ДНК начинается с образования высокомолекулярных фрагментов длиной 50-300 т.п.н, что близко по размеру длине ДНК в петлях хромосом. Затем эти фрагменты обычно распадаются до нуклеосом и их олигомеров. Фрагментация ДНК в нуклеосомах происходит под действием кальций чувствительной эндонуклеазы. Эндонуклеаза в некоторых клетках находится постоянно (например, в тимоцитах), где она активируется появлением в цитоплазме свободного кальция, а в других клетках синтезируется перед началом апоптоза. Однако еще не установлено, каким образом после расщепления ДНК эндонуклеазой происходит конденсация хроматина. 1.3 Формирование в цитоплазме полостей и апоптотических телец Плазматическая мембрана клетки начинает образовывать пузырьки, что в отсутствие фагоцитоза приводит к формированию апоптозных телец, содержащих конденсированные или морфологически неизмененные органеллы. Формируются глубокие впячивания поверхности с образованием полостей, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной 14 апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра. Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками, или паренхиматозными, или макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство. Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на этих клетках: они захватывают и поглощают апоптотические клетки. Один из таких рецепторов на макрофагах – рецептор витронектина, который является интегрином и активирует фагоцитоз нейтрофилов. Рисунок 1 - Последовательность ультраструктурных изменений при апоптозе (справа) и некрозе (слева). 1 – нормальная клетка; 2 – начало апоптоза; 3 – фрагментация апоптотической клетки; 4 – фагоцитоз апоптотических телец окружающими клетками; 5 – гибель внутриклеточных структур при некрозе; 6 – разрушение клеточной мембраны. Таким образом, отличительной морфологической чертой апоптоза является коллапс ядра. Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденсированными областями (гетеро- и эухроматин), становится суперконденсированным в форме полумесяца по периферии ядра. Кроме того, важной особенностью этого процесса является то, что не происходит 15 повреждения мембран клетки. «Усыхание» хорошо выражено как в культуре клеток, так и в тканевых срезах, где апоптотическая клетка отделяется от соседних клеток. Далее апоптотическая клетка превращается в совокупность окруженных мембраной апоптозных телец различных по своему составу, которые фагоцитируются макрофагами или соседними клетками. Клетка на данном этапе еще живая (включение летального красителя трипанового синего не происходит). Видимо в этом и есть задача апоптоза - утилизация еще живых апоптозных телец, пока содержимое клетки не попадает во внеклеточную среду, не вызывая воспалительных явлений т.е. уничтожение клеток путем апоптоза обеспечивает минимальное повреждение тканей по сравнению с другими механизмами смерти. 1.4 Механизмы апоптоза 1.4.1 Стимулы и сигнальная передача программы апоптоза Внеклеточные сигналы, отвечающие за инициацию апоптоза в различных клетках могут быть физиологическими или патологическими. Например, при нормальном развитии и функционировании ткани, подавление ростовых факторов, гарантирующих выживание, или присутствие «лигандов клеточной гибели» являются механизмами избавления организма от ненужных и поврежденных клеток путем апоптоза. Однако множество внешних импульсов, таких как химиотерапия, радиация, повышенное окисление, токсины вызывают повреждение ткани также путем неадекватной активации апоптоза. Таким образом, существует множество сигналов и сигнальных путей активации апоптоза, они различны для разных клеточных типов или для одного типа, но разной стадии жизненного цикла клеток [Golstein P. 1997; Gong В. 1999; Hardwick J.M. 1997; Haunstetter A. 1998; Havrilesky L.J. 1996; Hay S. 2002]. 16 1.4.1.1 Рецепторы и лиганды клеточной гибели «Рецепторы клеточной гибели», расположенные на поверхности клетки, представляют собой подсемейство в составе 26-членного семейства рецепторов TNF (фактора некроза опухоли), для активации апоптоза неоходим цитоплазматический домен [Барышников В.В. 2002; Hengarten O.M. 2000; Hardwick J.M. 1997; Haunstetter A. 1998]. Это семейство у млекопитающих включает рецептор-1 TNF-альфа (TNFRI), р75-нейротрофин-рецептор (p75 NTR), Fas, рецептор TNF-альфасвязанного апоптоз-индуцирующего лиганда (DR4), рецепторы клеточной гибели-3 (DR3), - 5(DR5), -6 (DR6) [Banner D.W. 1993; Bardelli A. 1996; Bodmer J. 2000; Fadok V.A. 2001; Faubion W.A. 1999; Galle P.R. 1995; Griffith T.S. 2000]. В большинстве случаев активация рецепторов клеточной гибели с помощью их лигандов вызывает тримеризацию рецептора и образование сигнального комплекса, индуцирующего апоптоз (DISC) на цитоплазматической поверхности клеточной мембраны. Затем домены тримеризованного рецептора координируют взаимодействие ассоциированный, цитоплазматического участка каждого рецептора с адаптером FADD (Fas-содержащий домен клеточной гибели протеин). Fas часто вовлекает зимогенную форму проапоптотической цистеин-протеазы – каспазы-8, для дополнения DISC. Автопроцессинг прокаспазы-8 в ее активную форму приводит к быстрому инициированию клеточной гибели [Guo Y. 2002; Kirsch D.G. 2001; Liang Y. 2002; Zhang H. 2000]. 17 Рисунок 2 - Рецепторный путь апоптоза. Fas - член семейства рецепторов TNF, которые относятся к ТМ белкам I типа. Представители данного семейства характеризуются наличием последовательностей обогащенных от двух до пяти остатками цистеина во внеклеточной области, которые взаимодействуют с тримерньши лигандамниндукторами. Fas и некоторые члены данного семейства в цитоплазматической области содержит DD, необходимый для взаимодействия с адапторными молекулами и обязательный для индукции апоптоза [Siegel R.M. 2000; Tokano Y. 1996; Zhu N. 1997]. В норме Fas экспрессируется клетками нелимфоидного происхождения, такими как сердце, легкие, почки, кожа, яичники, печень, желудок, кишка и др. Также описаны функциональные растворимые формы Fasрецептора (sFas), которые образуются при альтернативном сплайсинге. sFas конкурирует с мембранно-связанным Fas-рецептором (Fas) за взаимодействие с лигандом и может ингибировать Fas-опосредованный апоптоз in vitro [Siegel R.M. 2000]. FasL относится к многочисленному семейству гомотримерных лигандов TNF. Подобно большинству членов семейства, FasL синтезируется в 18 виде ТМ молекулы (FasL); растворимый тример FasL (sFasL) образуется при расщеплении металлопротеиназой, Посттрансляционные модификации FasL (частичный протеолиз) оказывают сильное влияние на его активность, потому что только мембранно-связанный или мультимеризованный FasL стимулирует ПКГ, a sFasL ингибирует апоптоз, конкурируя с FasL за взаимодействие с Fasрецептором [Барышников В.В. 2002]. FasL экспрессируется активированными Т- и В-лимфоцитами, КК.-клетками, нейтрофилами. Кроме того, значительные уровни экспрессии мРНК FasL обнаружены в нелимфоидных тканях: иммуннопривелигерованиых (яички, матка и яичники) и тканях, которые приспособлены к частому проникновению лимфоцитов (тонкая и толстая кишка, легкое и печень) [Tokano Y. 1996; Zhu N. 199]. Взаимодействие FasL с Fas приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерными молекулами, FADD. Через адаптер к комплексу лиганд/рецептор присоединяются эффекторы - молекулы неактивных предшественников инициирующих каспаз - прокаспазы-8, что опосредуется при взаимодействии DED доменов FADD и прокаспазы-8 (рис.2) [Socie G. 2004; Vaux D.L. 1996]. В результате формируется молекулярный комплекс, DISC, в котором происходит активация каспаз [Werner A.B. 2002; Zhang H. 2000]. Образование DISC, инициирующего процесс апоптоза, происходит по двум механизмам. В клетках 1 типа генерируется достаточный уровень активированной каспазы-8, что позволяет активировать другие прокаспазные ферменты, функционирующие как конечные эффекторы апоптоза. В клетках 2 типа апоптоз, инициированный низким уровнем каспазы-8, активированной комплексом DISC, усиливается за счет дестабилизации митохондрий, с участием каспаза-8 – опосредованной активацией проапоптотического Bidпротеина. Тримеризованные рецепторы клеточной гибели подвергаются олигомеризации и располагаются на одном полюсе клеточной поверхности. Этот процесс, «образование шапки», возможно опосредуется церамидом, и облегчает аутокатализ прокаспазы-8 [Werner A.B. 2002]. Многие лиганды рецепторов гибели оказывают множественное действие, независимое от 19 апоптоза. Каким образом один лиганд – TNF-альфа – оказывает такой широкий спектр действий, включающий пролиферацию, апоптоз, активацию иммунных клеток, воспаление? Одним объяснением является взаимодействие специфических белков на или рядом с цитоплазматическими доменами рецепторов гибели, которое вызывает разное биологическое действие лигандактивированного рецептора [Sun X.-M. 2002; Werner A.B. 2002; Zhang H. 2000]. Рисунок 3 - Рецепторзависимые пути апоптоза. 20 Например, адаптерный белок TRAF2 (для TNF-альфа- рецепторассоциированного фактора 2) вызывает сигнальную трансдукцию TNFRI, активируя либо проапоптотический (JNK), либо антипапоптотический (NFkB) пути. Сфингозин-киназа взаимодействует с TRAF-2 в клетках HEK 293T, активируя NFkB, но не JNK. Наличие или отсутствие этого фермента влияет на ответ клетки на TNF-альфа. Конечно сигнальный путь, активируемый TNFальфа, подвержен влиянию большого количества других сигнальных механизмов, активируемых различными факторами[Owen-Shaub L. 1994; Siegel R.M. 2000]. 1.4.1.2 Митохондриальный путь апоптоза Апоптоз инициируется, когда клетка подвергается стрессу (отсутствие факторов роста, гипоксия, облучение) или при активации рецепторов клеточной гибели (например Fas). Такие стимулы клеточной гибели усиливаются путем активации большого числа механизмов сигнальной трансдукции, которая приводит к посттрансляционным изменениям или индукции транскрипции BH3-протеинов – внутриклеточный этап чувствительности [McDonnel J. 1996]. Большинство BH3-протеинов (Bim, Bad, PUMA, Nix; EGL-1 аналоги) олигомеризуются с антиапоптотическими Bcl-2-подобными протеинами (CED9 аналоги), освобождая проапоптотические мультидоменные Bcl-2 белки (Baxподобные, Drob1-аналоги) для вхождения в митохондрии после реолигомеризации [Liu X.-H. 1999; Lock R.B. 2000; Marani M. 2002]. Некоторые ВН3-протеины (например, Bid) напрямую олигомеризуются с Bax-подобными протеинами для облегчения вхождения в митохондрии. Митохондриальные взаимодействия затем приводят к высвобождению множества факторов апоптоза, включая Smac/DIABLO, Cyto c (цитохром с), Endo-G (эндонуклеаза G), фактор индукции апоптоза (AIF) и Omi в цитозоль. Smac/DIABLO (Hid, Grim и Reaper) нейрализуют IAP, Endo-G расщепляет ДНК, AIF и Omi гидролизуют белки и\или катализируют аспад ДНК. Освобождение цитохрома с 21 облегчает образование апоптосомы, многомерного белкового комплекса, состоящего из Apaf-1 (CED-4/Dapaf-1 аналог) и каспазы 9. В отсутствие летальных стимулов IAP блокируют образование апоптосомы и активность каспазы-3. Если апоптосома формируется, она активирует эффекторные прокаспазы (CED-3 и drICE аналоги), такие как прокаспаза-3, образуя активные ферменты, расщепляющие белки-мишени в клетках, способствуя апоптозу. У позвоночных существует 2 модели, объясняющие каким образом эффекторные каспазы активируются после связывания рецепторов клеточной гибели. В некоторых клетках процессы в митохондриях являются этапом, усиливающим распад клетки путем формирования апоптосомы (2 тип), а в других (тип 1) этого этапа нет. Точная роль высвобождения цитохрома с из митохондрии стала известна, когда аналог CED-4 позвоночных, Apaf-1 (апоптотический протеаза- активирующий фактор-1) был клонирован и функционально охарактеризован как часть тримерного белкового комплекса, состоящего из Apaf-1, Apaf-2 (цитохром с) и Apaf-3 (прокаспаза-9). Сегодня установлено, что индукция высвобождения цитохрома с из митохондрий проапоптотическими белками семейства Bcl-2 вызывает конформационные изменения [Liu X.-H. 1999; Lock R.B. 2000; Marani M. 2002]. Apaf-1, формируя каспазный домен (CARD). CARD Apaf1 затем взаимодействует с CARD неактивированного каспаза-9-зимогена. Результатом этого взаимодействия является формирование олигомеров прокаспазы-9, которые в свою очередь путем ауто- и транскатализа образуют протеолитический комплекс, называемый апоптосомой. После процессинга и полной активации каспаза-9 служит конечным ферментом протеолитического каскада, включающего в себя активацию множества эффекторных каспаз, осуществляющих апоптоз. С этой точки зрения, значение Apaf-1 у позвоночных заключается в связывании функционирования белков семейства Bcl-2 с активацией каспаз [Liu X.-H. 1999; Lock R. B. 2000; Marani M. 2002]. Каспазы расщепляют ключевые белки клетки, необходимые для поддержания ее функций и гомеостаза. Решение о выборе апоптоза принимается после 22 последней проверки, убеждающей в том, что клетка должна быть уничтожена. Одним возможным механизмом предотвращения клеточной гибели является предотвращение активации каспазного каскада [Krueger A. 1997; Inohara N. 1999]. Антиапоптотические протеины IAP, включающие в себя сюрвивин, ливин, Bruce, нейрональный IАР (NIAP), XIAP, IAP1, IAP2 у млекопитающих, способны предотвращать каспазный каскад за счет своей способности связывать и инактивировать некоторые каспазы. Каждый IAP содержит как минимум 2 независимых функциональных участка, называемых домены бакуловирусных последовательностей IAP (BIR). Среди известных IAP XIAP уникален в своей способности селективно связываться и инактивировать каспазу-9 за счет своего BIR3-домена; однако он также может связывать и нарушать активность каспазы-3 с помощью связывающего участка между BIR доменами 1 и 2. Значение этого заключается в возможности как минимум временного предотвращения апоптоза на уровне апоптосомы (каспаза-9) или вне ее (каспаза-3) [Eskes R. 2000]. Однако в клетках, подвергающихся апоптозу, защита IAP может быть преодолена как минимум двумя механизмами. Первый – белок Smac (вторичный митохондриальный активатор каспазы) и DIABLO (прямой IAPсвязывающий протеин) – взаимодействует с BIR-доменом IAP в районе его Nконца. Связывая IAP, Smac/DIABLO либо перемещают активированные каспазы, либо предотвращают связывание их с IAP, таким образом активируя каспазозависимый протеолиз и клеточную гибель [Adrain C. 2001]. Например, было показано, что Smac/DIABLO связываются с XIAP и предотвращают его взаимодействие с каспазой-9, что приводит к быстрому апоптозу под воздействием ультрафиолетового облучения. Второй механизм выведения антиапоптотических протеинов постмитохондриальной проверки – убиквитинпротеосомальный сигнальный путь. Каталитические механизмы, задействованные в этом процессе, активируются самими IAP, поскольку некоторые IAP обладают Е3-убиквитин-лигазной активностью [Северин С.Е. 1998]. 23 1.4.1.3 Сфингомиелиновый сигнальный путь Поскольку сфинголипиды традиционно рассматриваются как структурные компоненты клеточной мембраны, их метаболизм, приводящий к образованию церамида, сфингозина и сфингозин-1-фосфата (S1P), участвует в регуляции различных клеточных процессов. Церамид, вторичный мессенджер остановки клеточного цикла и апоптоза, может образовываться в клетках из сфингомиелина клеточной мембраны под воздействием сфингомиелиназы или путем синтеза de novo. Церамид в дальнейшем может изменяться под воздействием церамидаз в сфингозин, вторичный мессенджер, способный подавлять активность протеинкиназы С и активировать апоптоз. В отличие от проапоптотических свойств церамида и сфингозина, S1P, образующийся при фосфорилировании сфингозина сфингозинкиназой, признан сигнальной молекулой для клеточной пролиферации, роста и выживания[Arends M.J. 1991; Basanez G. 2001; Chen Z. 1996; Cohen G.M. 1997]. Идентифицированы некоторые механизмы, за счет которых накопление церамида ведет к апоптозу или остановке роста, в двух из них задействованы взаимодействия между МАРК и PI3-K/Akt – сигнальными путями. Например, церамид, вырабатываемый в ответ на различные стрессовые сигналы, такие как цитокиновые протеинкиназа атаки или радиация, (SAPK)/JNK-каскад. активирует Церамид стресс-активированная может также напрямую противодействовать PI3-K/Akt сигнальному муханизму выживания клетки, возможно путем активации фосфатазы или путем функциональной секвестрации антиапоптотических киназ в липидных микродоменах. Церамид также индуцирует протеолитическую деградацию Akt. Как обсуждалось ранее, потеря PI3-K/Akt-активности в результате всех этих эффектов церамида может привести к снижению фосфорилирования и активации некоторых ключевых регуляторов апоптоза. Избыточная экспрессия Akt может снижать продукцию церамида и блокировать церамид-индуцированный апоптоз. 24 Проапоптотическое митохондрии путем действие церамида дестабилизации их может мембран также или затронуть высвобождения апоптогенных факторов из их органелл. Церамид может усилить Baxиндуцированню проницаемость мембраны и привести к формированию пор, достаточных по размеру для высвобождения митохондриальных ионов и даже небольших белков, таких как цитохром с. Хотя эти неспецифические церамидные поры возможно прямо не влияют на высвобождение цитохрома с, они могут повышать проницаемость наружной мембраны митохондрий во время апоптоза. Церамид, образующийся во внешнем слое клеточной мембраны, вызывает полярное перераспределение и олигомеризацию («образование шапки») рецептора Fas [Arends M.J. 1991, Basanez G. 2001]. В этом случае на цитоплазматической поверхности клетки формируется суперкаталитический домен, могущий служить усиливающим этапом, необходимым для Fas-опосредованного апоптоза. Хотя церамид – это важная составляющая апоптотического ответа на стресс, он также служит в качестве предшественника синтеза антиапоптотического сигнального липида, S1P. Метаболическая конверсия церамида в S1P восприимчивость представления служит молекулярным переключателем, клетки к летальным факторам. том, как церамид провоцирует о снижающим Несмотря на развитие наши апоптоза, сравнительно немного известно о механизмах действия S1P. Понимание осложнено также таким фактом, что этот липид может служить сигналом как внутри, так и снаружи клетки [Arends M.J. 1991; Basanez G. 2001; Chen Z. 1996; Cohen G.M. 1997]. Снаружи S1P служит лигандом для рецепторов гена дифференцировки эндотелия (EDG) – семейства G-протеин парных рецепторов, экспрессирующихся на плазматической мембране большинства клеток. 5 EDGрецепторов, связывающих идентифицированы: S1P EDG1/S1P1, с наибольшей EDG5/S1P2, EDG3/S1P3, аффинностью, EDG6/S1P4, EDG8/S1P5. С другой стороны S1P известен как внутриклеточный вторичный мессенджер, блокирующий апоптоз. Хотя имеется немного информации 25 относительно механизмов этого последнего эффекта, некоторые факты известны. Во-первых, S1P взаимодействует (или напрямую активирует) с антиапоптотическими сигнальными путями (NFkB, ERK). Во-вторых, введение S1P в лимфоциты снижает экспрессию представителя проапоптотического семейства Bcl-2 - Bax, блокируя апоптоз [Liu X.-H. 1999; Lock R.B. 2000; Marani M. 2002]. В-третьих, S1P может оказывать свое антиапоптотическое действие, предотвращая стресс-индуцированные процессы в митохондриях (например, S1P блокирует высвобождение цитохрома с и Smac/DIABLO из митохондрий, предотвращая каскад каспазы). Наконец, S1P блокирует апоптоз в эндотелиальных клетках, повышая продукцию оксида азота. Понимание метаболизма сфинголипидов и тщательная оценка уровня эндогенных биоактивных сфинголипидов в клетке – необходимы, поскольку эти вторичные мессенджеры служат главным переключателем, регулируя многие аспекты клеточных функций и судьбы. 1.4.1.4 Взаимодействие различных путей апоптоза Следует отметить, что в ряде случаев апоптоз реализуется в результате комбинированного действия двух путей с участием рецепторов плазматической мембраны, и митохондриального цит с. Сетевая регуляция апоптоза усложняется существованием нескольких петель обратной связи. В 1998 группа исследователей, возглавляемая Peter Kramer и Marcus Peter сообщилили о существовании двух различных типов клеток, которые используют отличные пути передачи сигнала через Fas-рецепторы. Стимуляция Fas-рецептора ведет к активации каспазы-8, которая расщепляет и активирует эффекторные каспазы непосредственно (клетки I типа, например, тимоциты). Альтернативно, при малоэффективной активации каспазы-8 подключается митохондриальный путь апо птоза: каспаза-8, образовавшаяся в небольших 26 количествах, взаимодействует в цитоплазме с белком Bid, проапоптотическим членом семейства Вс1-2, и расщепляет его. С-концевой домен Bid далее перемещается к митохондриальной мембране, индуцируя высвобождение из митохондрий цит с и его связывание с Apaf-1 в цитоплазме (клетки II типа, например, гепатоциты). В связи с этим, Вс1-2 и/или Bel-XL ингибируют Fasопосредованный апоптоз в клетках II типа, но не I. Bcl-2-нечувствительные и ингибируемые пути сосуществовать в передачи пределах сигналов одной через клетки. Fas-рецептор Важно отметить, могут что физиологическая активация Fas вызывает апоптоз, который нечувствителен к Вс1-2 или Bcl-XL, а Fas-опосредованный апоптоз* стимулированный AT, блокируется Вс1-2 и/или Bcl-XL [Johnson A. L. 1999; Kim T.-H. 2000; Krueger A. 1997]. Активная каспаза-3 инициирует петлю амплификации апоптотического сигнала, которая ведет к дополнительному расщеплению прокаспазы-8; IAP может быстро ингибировать каспазу-3 и предотвращать расщепление прокаспазы-8. Т.е., уровень IAP косвенно влияет на количество расщепленной прокаспазы-8 при стимуляции клеточных рецепторов гибели. Следовательно, относительные уровни активной каспазы-3, IAP и Smac определяют уровень апоптоза, индуцированного лигандами гибели. Кроме того, каспаза-3 также может активировать каспазу-9, Bid и др. [Kirsch D.G. 2002; Kluck R.M. 2000; Krueger A. 2001; Liang Y. 2002]. Таким образом, как только активируются инициирующие каспазы, по любому из сигнальных путей, пути сходятся на эффекторных каспазах (каспазы-3 и -7), которые составляют протеолитический остов ПКГ: каскадный механизм активации каспаз лежит в основе амплификации и интеграции апоптотического сигнала. Каждый из 27 путей апоптоза модулируется регуляторными полипептидами, такими как с-FLIP (внешний путь) или членами семейства Вс1-2 (внутренний путь) [Liang Y. 2002]. Таким образом, вопросы о молекулярных механизмах регуляции апоптоза, в частности о биохимических процессах, приводящих к необратимым изменениям и характерным апоптоз-специфическим морфологическим перестройкам в клетке, об их генетическом контроле и значении апоптоза для нормальной жизнедеятельности организма и при патологии, еще далеки от разрешения. Имеющиеся на сегодняшний день сведения о существенной роли нарушения регуляции апоптоза при различных заболеваниях свидетельствуют о определяющей роли апоптоза в патогенезе этих заболеваний. Выяснение новых подробностей в процессе регуляции апоптоза будет способствовать обнаружению новых биохимических и патогенетических закономерностей, знание которых позволит создать новые средства диагностики и лечения заболеваний. 1.4.1.5 Эффекторная фаза апоптоза и разрушение клеточных белков: каспазы У млекопитающих идентифицировано как минимум 14 CED-3 аналогов, большинство из которых участвует в процессе апоптоза. Эти аналоги, называемые каспазы 1-14 (цистеин-аспартат-специфичные протеазы), транслируются в неактивных формах, которые далее активируются путем частичного протеолиза. Механизмы активации каспаз подразделяют эти ферменты на 2 различные категории. Первая, включающая каспазы-2, -8, -9, 10, - инициаторные каспазы [Барышников В.В. 2002; Северин С.Е. 1998]. Эти ферменты обладают уникальными структурными доменами, облегчающими аутокатализ, процесс, необходимый для объединения белков в единый комплекс. Например, каспазы-8 и –10, каждая, содержат N-концевой 28 эффекторный домен, позволяющий этим каспазам взаимодействовать с рецепторами клеточной гибели (Fas, TNFRI) с помощью адаптерного белка FADD [Cohen G.M. 1997]. Инициаторные каспазы-2 и –9, каждая, содержат CARD. Каспаза-9 взаимодействует с Apaf-1 в процессе апоптоза, что опосредуется высвобождением цитохрома с из митохондрий [Bantel H. 2001; Basanez G. 2001]. Эти взаимодействия происходят за счет присутствия CARD как в каспазе-9, так и в Apaf-1. Активация каспазы-12, другой инициаторной каспазы, как недавно было показано, происходит путем, не зависимым от митохондрии и Apaf-1, в ответ на повреждение на уровне эндоплазматического ретикулума. После процессинга активные инициаторные каспазы активируют вторую линию ферментов своего семейства – инициаторные каспазы (каспаза-3, -6 и –7) [Bantel H. 2001; Basanez G. 2001; Bodmer J. 2000; Cohen G.M. 1997]. Активные эффекторные каспазы селективно гидролизуют широкий спектр полипептидных целей, включая протеин-киназы, белки сигнальной трансдукции, компоненты цитоскелета, ингибиторы дезоксирибонуклеаз. Т.о., активация каскада эффекторных каспаз не только делает клетку неспособной выполнять свои функции и поддерживать гомеостаз, но и облегчает разрушение и упаковку клеточных структур в небольшие тельца, ограниченные мембраной, готовые к фагоцитозу – конечному этапу апоптоза. Zhаng et al [2000, 2001] использовали модель клеточных рецепторов гибели in vivo, чтобы продемонстрировать, что удаление одной из каспаз (-9 или –3) путем удаления ее гена откладывает гибель гепатоцитов. Иммуноблот-анализ различных представителей семейства каспаз выявил, что каспазы-2, -6 и –7 активировались в экстрактах, приготовленных из клеток, не имеющих каспаз –9 или –3. Из этого исследования был сделан вывод о том, что митохондриальный путь активации каспаз (формирование апоптосомы и активация каспазы-9) может вовлекать в себя одновременную активацию различных альтернативных инициаторных и эффекторных каспаз, вплоть до количества, достаточного для эффективного уничтожения и удаления клеточных структур путем апоптоза. 29 1.4.2 Протеинкиназы в механизме апоптоза 1.4.2.1 Митоген-активируемая протеинкиназа Связь суперсемейства митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК) с апоптозом отмечается в большом количестве публикаций, причем отмечено как активирование, так и блокирование клеточной гибели. Эта группа белков состоит из трех семейств: внеклеточные сигнальные киназы (антиапоптотические) – ERK, проапоптотические или стресс-активируемые р38 МАРК и проапоптотические или стресс-активируемые JNK [Cohen G.M. 1997]. Активация каждого семейства происходит в каскаде фосфорилирования, что в свою очередь приводит к посттрансляционным изменениям молекул-мишеней, изменениям экспрессии генов или обоим изменениям. В настоящей главе внимание сфокусировано на семействе JNK и его роли в качестве проксимального медиатора апоптоза. Однако необходимо отметить, что роль JNK в активации апоптоза зависит от типа клетки и вида стимула. Было предположено, что влияние активации JNK на апоптоз зависит от активности других сигнальных путей, например ERK или NFkB-опосредованных, что позволяет предположить, что активация JNK облегчает, но не обязательно инициирует процесс апоптоза[Cohen G.M. 1997]. На сегодняшний день открыто 3 гена, кодирующих 10 вариантов мРНК для JNK, – такая избыточность затрудняет изолированное изучение влияния JNK только на апоптоз. Кроме того, киназы, фосфорилирующие и таким образом активирующие JNK, тоже весьма разнообразны. Каспаза катализирует расщепление регулирующих JNK-путь киназ, что усиливает апоптоз. Ассоциация адаптерного протеина Daxx с активированным Fas также инициирует активацию JNK. Однако значение этих событий для апоптоза, т.е. требовала или нет активация апоптоза в этой модели участия JNK – достоверно не выяснено. Эксперименты на моделях с отсутствием отдельных генов JNK не смогли показать дефектов в процессе апоптоза. Однако мыши с отсутствием и 30 JNK1 и JNK2 погибали в эмбриогенезе из-за нарушений нейронального апоптоза. Эмбриональные мышиные фибробласты (MEF) с отсутствием JNK1 и JNK2 резистентны к стресс-индуцируемому, но не опосредованному через клеточные рецепторы гибели апоптозу. Было показано, что такие MEF не способны высвобождать цитохром с из дестабилизированных митохондрий – необходимый шаг в стресс-индуцируемом апоптозе, который можно обойти при 1 типе апоптоза, индуцированном рецепторами клеточной гибели [Werner A.B. 2000, 2001]. 1.4.2.2 Фосфатдилинозитол 3’-киназа (PI3-K) и Akt Клеточный сигнальный механизм выживания, связанный либо с рецепторами ростовых факторов (например рецептор тирозин-киназы), либо с другими антиапоптотическими сигнальными механизмами (протеинкиназа А, NFkB) [Yamamoto K. 1999]. Большое число исследований подтвердило, что PI3K активируется путем экспрессии на цитоплазматической поверхности плазматической мембраны, что ведет к лигандной активации рецепторов ростовых факторов, или путем прямого взаимодействия с Ras протоонкогеном. Активированная PI3-K катализирует образование 3’-фосфорилированных фосфоинозитидов из фосфолипидов клеточной мембраны. Эти липидные молекулы затем связываются и таким образом активируют серин\треонинкиназу, 3’-фосфоинозитид-зависимую киназу-1 (PDK-1), которая является основным ферментом, способным активировать разнообразные киназы, включая Ak[].t. В физиологических условиях активированная ростовыми факторами Akt служит для фосфорилирования белков, поддерживающих основные функции клеток, такие как транспорт и окисление глюкозы. В частности, активация рецептора инсулин-подобного фактора роста-1 (ИПФР-1) его лигандом индуцирует Akt-опосредованное фосфорилирование киназы-3 гликоген-синтетазы. Фосфорилирование переносчика глюкозы (Glut-4) Akt приводит к eго транслокации на клеточную поверхность и утилизации глюкозы 31 [Yamamoto K. 1999]. Нарушения Akt-сигнального пути обычно происходят при нарушении гомеостаза и вызывают апоптоз путем блокирования жизненнонеобходимых обменных процессов (например легочного дыхания) и активирования компонентов механизма апоптоза [Adrain C. 2001]. Стрессиндуцированный механизм связан с повреждением клетки или потерей факторов роста – он может ослабить или полностью блокировать Aktсигнальный механизм. Было продемонстрировано, что различные регуляторы апоптоза зависят от активности Akt на уровнях транскрипции или посттрансляционных изменений. В частности, представители семейства факторов транскрипции Forkhead после фосфорилирования Akt остаются связанными с другими цитозольными белками (14-3-3 протеины) [Adrain C. 2001]. Однако в отсутствии Akt-опосредованного фосфорилирования факторы транскрипции Forkhead могут транслоцироваться в ядро и повышать экспрессию проапоптотических регуляторных генов, таких как лиганд Fas. Другой пример – активность проапоптотического ВН3-протеина, Bad, регулируется его статусом фосфорилирования [Adrain C. 2001; Antonsson В. 2001; Basaflez G. 2001]. В клетках, поддерживаемых достаточным уровнем факторов роста, активация Akt ведет к зависимой от фосфорилирования секвестрации Bad 14-3-3 протеинами. Однако потеря Ask-сигнального пути или повышение фосфатазной активности приводит к высвобождению Bad, делая его свободным для взаимодействия с другими представителями семейства Bcl-2, облегчающего апоптоз. Akt также напрямую взаимодействует с прокаспазой-9. Точный механизм, путем которого каспаза-9 инактивируется из-за фосфорилирования Akt, неизвестен, но предполагается, что каталитическая активность каспазы-9 блокируется напрямую[Basaflez G. 2001]. Участок фосфорилирования Akt (RXRXXS/T) идентифицирован в других белкахрегуляторах апоптоза на каждом уровне апоптотического каскада (каспаза-8, Bcl-2, Apaf-1, IAP, каспаза-7). 32 1.4.3 Белки – регуляторы апоптоза Все факторы, усиливающие или ослабляющие апоптоз, могут действовать прямо на механизм гибели клетки, опосредованно, путем влияния на регуляцию транскрипции. В некоторых случаях влияние этих факторов на апоптоз является решающим (например, при глюкокортикоид-зависимом апоптозе тимоцитов), а в других не имеет особой важности (например, при Fas- и TNFзависимом апоптозе). В процессе регуляции принимает участие большое количество веществ. Наиболее изученными из них являются вещества из семейства bcl-2 [Adrain C. 2001; Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. 1.4.3.1 Представители семейства Bcl-2 Митохондрии являются центром клетки, принимающим решение о запуске механизма ее гибели. Мембрана митохондрий разрывается, что приводит к образованию реактивных форм кислорода и высвобождению апоптогенных факторов, служащих сигналом для активации финальной (эффекторной) стадии апоптоза. Точные механизмы, за счет которых повышается проницаемость мембраны митохондрий, до конца не выяснены. Предложено несколько моделей. Большинство из них учитывают действие семейства регуляторных белков Bcl-2, которые самостоятельно или с помощью других белков митохондрий (переносчик аденилового нуклеотида ANT, потенциал-зависимый анионный канал VDAC) нарушают митохондриальный гомеостаз. Идентифицированы аналоги Bcl-2 млекопитающих, эти белки являются ключевыми регуляторами апоптоза. Они состоят из двух антагонистических групп: антиапоптотические белки (Bcl-2, Bcl-x, Bcl-w, Bcl-B, Mcl-1, A1/Bfl-1) и проапоптотические[Adrain C. 2001; Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. Последняя группа подразделяется в зависимости от числа Bcl-2-гомологичных (ВН) доменов. Те, что содержат от двух до четырех ВН-доменов – т.н. 33 мультидоменные представители семейства (Bax, Bak, Mtd/Bok, Boo/Diva, Bclrambo, Bcl-x-short) – действуют иначе, чем те, что содержат только ВН3-домен (Bad, Bid, Bik/NBK, Bim, Bmf-1, Hrk/DP5, Map-1, Nix, Nip3, Noxa, PUMA). Раньше считали, что Bcl-2 и подобные белки работают как реостат, и баланс между про- и антиапоптотическими белками определяет судьбу клетки [Almawi W.Y. 2004; Aschoff A.P. 2001]. Однако сегодня известно, что регуляция апоптоза представителями семейства Bcl-2 более сложна, помимо механизма реостата включает в себя стимул-специфическую модификацию ВН3-белками. Во многих случаях ВН3-белки служат внутриклеточными сенсорами, которые могут активироваться либо на этапе транскрипции (Nip3, Nix, PUMA, Noxa, Hrk), либо после транскрипции (Bad, Bid, Bik, Blk, Map-1) через множество механизмов сигнальной трансдукции [Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. После активации эти белки вступают во взаимодействия со своими мультидоменными собратьями. В зависимости от вида ВН3-белка, эти взаимодействия могут либо облегчить введение проапоптотических мультидоменных белков семейства Bcl-2 через митохондриальную мембрану, нарушая ее целостность и потенциал покоя, необходимый для окислительного фосфорилирования, либо нивелировать действие антиапоптотических белков семейства Bcl-2 [Almawi W.Y. 2004; Aschoff A.P. 2001]. Однако сегодня известно, что ВН3-белки способны взаимодействовать с мультидоменными представителями семейства Bcl-2 без последующих посттрансляционных изменений. Bcl-2 ген впервые был описан как ген, который транслоцируется в клетках фолликулярной лимфомы и ингибирует апоптоз.. Гомологичные гены были также обнаружены в некоторых вирусах. Все вещества, относящиеся к данному классу делятся на активаторы и ингибиторы апоптоза. К ингибиторам относятся: bcl-2, bcl-xL, Mcl-1, bcl-w, аденовирусный E1B 19K, Эпштейн-Баррвирусный BHRF1 [Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. К активаторам относятся bax, bak, Nbk/Bik1, Bad, bcl-xS [Bardelli A. 2000]. Члены этого семейства взаимодействуют друг с другом. Одним из уровней регуляции 34 апоптоза является взаимодействие белок-белок. Белки семейства bcl-2 формируют как гомо- так и гетеродимеры. Например, bcl-2-ингибиторы могут образовать димеры bcl-2-активаторами. Таким образом, жизнеспособность клеток зависит от соотношения активаторов и ингибиторов апоптоза. Например, bcl-2 взаимодействует с bax; при преобладании первого жизнеспособность клетки повышается, при избытке второго – уменьшается. К тому же белки семейства bcl-2 могут взаимодействовать с белками, не относящимися к этой системе. Например, bcl-2 может соединятся с R-ras, который активирует апоптоз. Другой белок, Bag-1, усиливает способность bcl-2 ингибировать апоптоз [Bardelli A. 2000]. В настоящее время принято считать, что гены, участвующие в регуляции роста и развития опухолей (онкогены и гены-супрессоры опухолей), играют регулирующую роль в индукции апоптоза. К ним относятся: bcl-2 онкоген, который ингибирует апоптоз, вызванный гормонами и цитокинами, что приводит к повышению жизнеспособности клетки; Белок bax (также из семейства bcl-2) формирует димеры bax-bax, которые усиливают действие активаторов апоптоза [Basaflez G. 1999; Bardelli A. 2000]. Отношение bcl-2 и bax определяет чувствительность клеток к апоптотическим факторам и является «молекулярным переключателем», который определяет, будет ли происходить рост или атрофия ткани. За исключением гена, кодирующего 2’-5’ олигоаденилат-синтетазу, экспрессия которого индуцируется интерфероном-бета, большинство ВН3-генов экспрессируются в результате повреждения клетки, вызванного гипоксией, повреждением ДНК или отсутствием определенных цитокинов. После активации амфифильный альфа-участок многих ВН3-белков взаимодействует с гидрофобной частью антиапоптотических белков семейства Bcl-2, вызывая их реолигомеризацию и отщепление от проапоптотических мультидоменных представителей семейства [Antonsson B. 2001; Aschoff A.P. 1999]. В этом случае ВН3-белки служат как внутриклеточные лиганды, связывающиеся и блокирующие антиапоптотические Bcl-2-подобные белки, что позволяет 35 проапоптотическим мультидоменным представителям семейства, таким как Bax и Bak, дестабилизировать митохондрии и индуцировать апоптоз. 1.4.3.2 ВН3-белки Bim и Bmf - проапоптотические представители семейства ВН3, модицицируемые после трансляции [Eskes R. 1999]. В здоровых клетках эти белки подавлены функционированием динеинового двигательного комплекса микротрубочек и актин-миозинового двигательного комплекса. Сигналы, инициирующие высвобождение Bim или Bmf из цитоскелета, различны и включают в себя отмену действия цитокинов, потерю клеточного контакта, химические вещества, разрушающие микротрубочки (таксол), ультрафиолет. Как многие другие ВН3-белки, Bim и Bmf активируются каспазо-независимым путем. Однако, помимо посттрансляционной активации, экспрессия bim-гена повышается на уровне транскрипции при уменьшении количества факторов роста в нейронах и гемопоэтических клетках. Более того, Bim транскрибируется из одного гена в виде трех различных изоформ (BimEL, BimL, BimS) – в разных типах клеток[Eskes R. 1999]. Смысл в том, что одна изоформа действует как киллер, а другие либо действуют как менее эффективные киллеры, либо как антагонисты. Соответственно, изменения в экспрессии этих изоформ могут оказывать значительные эффекты на восприимчивость клеток к апоптозу. Второй пример - Bad, ВН3-белок, облегчает олигомеризацию и инактивацию антиапоптотических Bcl-2-подобных белков. Активность Bad регулируется факторами роста. В их присутствии Bad фосфорилируется с помощью P13-k/Akt сигнального пути и связывается 14-3-3-белками. В отсутствии достаточного количества факторов роста дефосфорилирование Bad приводит к его отсоединению от 14-3-3-белков и проникновению в митохондрию, где он нарушает действие Bcl-2 Bcl-xlong белков[Eskes R. 1999]. 36 Третий пример: Bid – ВН3-белок, связывающийся с активированным поверхностным рецептором клеточной гибели, таким как Fas [Eskes R. 2000]. Подобно Bim, Bmf и Bad, он активируется после трансляции путем частичного протеолиза, образуя форму tBad, проникающую в митохондрии. В митохондрии tBid взаимодействует с проапоптотическими мультидоменными представителями семейства Bcl-2 (Bax и\или Back) и облегчает их внедрение в мембрану митохондрии. За исключением Мар-1, Bid – единственный ВН3белок, функция которого осуществляется посредством взаимодействия с проапоптотическими, а не антиапоптотическими мультидоменными представителями семейства Bcl-2 [Finucane D. 2001; Eskes R. 2000]. Ген Р53-модулятора апоптоза (PUMA) кодирует синтез множества вариантов протеинов, который индуцируется во многих типах клеток за счет активации р53, происходящей в ответ на повреждение генома. Подобно большинству других ВН3-белков, изоформы PUMA связывают Вcl-2-подобные белки, локализованные в митохондриях, что индуцирует высвобождение цитохрома с и активирует быструю клеточную гибель. В дополнении к PUMA, подобным действием обладает Noxa. Nix и bNip3 также представляют собой транскрипционно-регулируемые Bcl-2-белки, хотя регулирование транскрипции этих генов напрямую направляется действием гипоксияиндуцируемого фактора 1-альфа в условиях ограниченного кислородного голодания клетки [Farid P. 2000]. ВН3-белки образуют определяющий, подвергнется потенциальные гибельные внутриклеточный клетка стимулы апоптозу центр или (активация нет управления, в рецепторов ответ на гибели, интерферон-бета, гипоксия, повреждение ДНК, недостаток факторов роста) [Farid P. 2000; Feudis P. 2000]. Механизмы активации ВН3-белков разнообразны и включают в себя: транскрипцию, фосфорилирование /дефосфорилирование, протеолиз и изменения цитоскелета. Большинство ВН3-белков служит для инактивации антиапоптотических блокирующее взаимодействие с Bcl-2 – белков, проапоптотическими 37 прдупреждая их мультидоменными представителями семейства, такими как Bax. Только Bid и Map-1 напрямую взаимодействуют с проапоптотическими Bax-подобными белками, облегчая их внедрение в митохондриальную мембрану. В любом случе, влияние ВН3белков приводит к дестабилизации митохондрий и высвобождению большого числа апоптогенных факторов, активирующих или ускоряющих конечную фазу апоптоза. Проапоптотические 1.4.3.3 белки, высвобождаемые дестабилизированными митохондриями Воздействие проапоптотических белков семейства Bcl-2 на митохондрии приводит к высвобождению межмембранных белов, которые организуют конечную фазу апоптоза. Некоторые из этих белков в норме функционируют внутри митохондрий как посредники окислительно-восстановительных реакций, но при высвобождении в цитозоль, они меняют свою функцию на проапоптотическую [MacFarlane M. 2002]. Некоторые высвобождаемые белки, такие как AIF, Omi, Endo-G проявляют нуклеолитическую или протеолитическую активность и вызывают прямое разрушение клетки [Cеверин Е., 1998]. Например, AIF первоначально был идентифицирован как полипептид, индуцирующий конденсацию хроматина и высокомолекулярную фрагментацию (более 50 kb) ДНК, не зависимую от каспазы. Инактивация гена, кодирующего AIF у мышей показала, что этот белок необходим для первого этапа клеточной гибели, происходящего во время эмбрионального морфогенеза и кавитации. Сериновая эндопротеаза, Omi – это проапоптотический белок, взаимодействующий с Х-связанным белком-ингибитором апоптоза (XIAP) и другими IAP, что обеспечивает полную активацию эффекторного каспазного каскада [MacFarlane M. 2002]. Omi также может индуцировать клеточную гибель в присутствии всех каспазных ингибиторов, за счет своего N-концевого домена, обладающего каталитической серинопротеазной активностью. Endo-G, также митохондриального происхождения, после высвобождения перемещается 38 в ядро, где катализирует распад ДНК каспаза-независимым путем. Другие белки, высвобождаемые из митохондрий в процессе апоптоза, служат либо кофакторами, либо компонентами многомерных белковых структур, называющихся апоптосомы. 1.5 Генетический контроль апоптоза, генетическая регуляция апоптозной активности Регуляция зависит от активности ряда апоптоз-специфических белков, кодированных такими генами как Вах, Fast, TRAIL, FADD; генами доменов смерти (death domens - DD), связанных с другими рецепторами, генами каспаз, апоптозиндуцирующего фактора (AIF) и, возможно, с некоторыми другими генами [Hengarten O.M. 2000; Kagawa Sh. 1999; Kaklamanis L. 1998]. Продукт р53 гена следит за целостностью генома при митозе. При нарушении целостности генома клетка переключается на апоптоз. Наоборот, белок bcl-2 ингибирует апоптоз. Таким образом, недостаток р53 или избыток bcl-2 приводит к накоплению клеток: эти нарушения наблюдаются в различных опухолях. Ген р53 является геном супрессии опухолей, поэтому в эмбриогенезе особой роли не играет, но необходим для супрессии опухолевого роста. Мыши, у которых отсутствовали оба р53 гена, проявляли чрезвычайно высокую склонность к развитию злокачественных опухолей в результате полного или частичного нарушения апоптоза предопухолевых клеток [Bu S.Z. 1999; De Angelis P.M. 1998; Diebold J. 1998]. Усиленный синтез белка, кодируемого bcl-2 геном, приводит к подавлению апоптоза и, соответственно, развитию опухолей; данный феномен обнаружен в клетках В-клеточной фолликулярной лимфомы. При нейродистрофических заболеваниях отмечается нарушение функции гена (iap-гена), сходного с ингибитором апоптоза бакуловирусов. потенциал гена Вах исследуется в нескольких лабораториях [Antonsson B. 2000; De Angelis P.M. 1999; Eskes R. 2000]. При использовании гена Вах в качестве токсического гена, 39 гиперэкспрессия которого может либо непосредственно привести к гибели опухолевых клеток, либо к их сенсибилизации к цитотоксическим препаратам, в качестве индукторов апоптоза используют либо химиотерапевтические препараты, либо лиганды "рецепторов смерти", либо другие апоптозиндуцирующие гены. Так трансфекция гена Вах индуцировала гибель клеток опухоли яичника уже в результате только гиперэкспрессии этого гена при транзиторной трансфекции [Farid P. 2001]. Гибель трансфицированных этим геном опухолевых клеток других типов (аденокарцинома желудка, карциномы головы и шеи) с гиперэкспрессией гена Вах достигалась только при одновременном действии таких противоопухолевых препаратов как таксол [Feudis P. 2001; Farid P. 2001; Frankel A. 1998], при действии ионизирующего излучения [Gong В. 2000; Белушкина Н.Н. 2004] или при котрансфекции гена Вах и гена каспазы 8 [Gong В. 2000] или гена Вах и гена TNF-связанного апоптоз-индуцирующего лиганда (TRAIL) [Hengarten O.M. 2000; Huang X. 2002]. Однако, для некоторых типов клеток (злокачественная глиома) показано, что гиперэкспрессия гена Вах может не влиять ни на их жизнеспособность, ни на их чувствительность к химиотерапевтическим препаратам [Huang X. 2002]. Важно подчеркнуть, что в ряде работ отмечена высокая устойчивость нормальных клеток организма, в частности мезенхимальных, к действию гена Вах [Huang X. 2002]. Гепатотоксический эффект гена Вах, отмеченный при системном введении бинарной аденовирусной конструкции, содержащей этот ген, удалось устранить при введении генетической конструкции непосредственно в опухоль вместо внутривенного введения. Для селективного ингибирования экспрессии генов в настоящее время часто используют технику антисмысловых олигонуклеотидов (антисенсов) [Белушкина Н.Н. 2004]. Использование антисенсов приводит к уменьшению синтеза определенных белков, что влияет на регуляцию процесса апоптоза. Механизм действия их основан на связывании соответствующих нуклеотидов с последующим блокированием комплементарных участков 40 (пар Уотсона- Крика) олигонуклеотиды на называются РНК или ДНК. антисенсами Эти антисмысловые и могут быть синтезированы лабораторным путем в соответствии со специфическими областями енома инфекционного агента. Стабильный одноцепочечный синтетический олигонуклеотид связывается со специфическим комплиментарным участком матричной РНК (мРНК), блокируя ее способность к трансляции. На примере генов Bcl-2 и Вах была продемонстрирована возможность регуляции апоптоза. Ген Bcl-2 был клонирован в ретровирусный вектор и осуществлена трансфекция конструкцией. Изучен опухолевых уровень индукции клеточных линий апоптоза и полученной выживаемость трансфицированных линий клеток под действием цитотоксических препаратов. Повышение экспрессии гена Bcl-2 в результате трансфекции приводило к устойчивости клеток к действию цитотоксических препаратов в результате подавления процессов апоптоза [Huang X. 2002; Huh W.K. 2001; Ionov Y. 2000]. 41 Глава 2 Выбор и обоснование оптимального варианта направления исследования 2.1 Апоптоз при вирусных парентеральных гепатитах Вирусные гепатиты (ВГ) являются одной из важнейших медикосоциальных проблем в современном мире. По данным ВОЗ вирусным гепатитом В инфицировано около 2 млрд. человек. Вирусный гепатит С (ВГС) широко распространён в различных странах мира. Сегодня уже известно о существовании 500 -700 млн. человек – носителей HCV (10% всей популяции человечества); около 70% всех умерших от хронических заболеваний печени приходится на долю ВГС [И.В. Волчек с соавт. 2003; Ю.В. Лобзин и соавт., 2003]. В России эпидемиологическая ситуация по вирусным гепатитам и в прошлом и в настоящем остаётся неблагополучной. Сохраняется большой массив больных хроническим ВГВ и носителей НВ – вируса, являющихся основными источниками HBV – инфекции. Количество носителей HBsAg в нашей стране превышает 5 млн. человек [Ю.В. Лобзин и соавт. 2003; И.В. Шахгильдян и соавт. 2005]. В структуре заболеваемости вирусными гепатитами в последние годы неуклонно растёт доля гепатита С. Особенностью ХГС является длительный период бессимптомного течения, что затрудняет своевременную диагностику заболевания и осложняет эпидемиологическую ситуацию. В связи с широким распространением этих заболеваний, ростом заболеваемости, особенно среди лиц молодого возраста, детей и подростков, тяжести исходов в виде цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы и недостаточно эффективным лечением в настоящее время ведется интенсивное изучение проблемы вирусных гепатитов [А.А. Баранов, Б.С. Каганов, В.Ф. Учайкин и соавт. 2004; А.Р. Рейзис и соавт. 2006 г; М.М. Котович 2003]. По современным воззрениям, в патогенезе, развитии и течении вирусных 42 гепатитов особое место занимает апоптоз (программированная смерть клетки) [Е.В. Дмитриева 2003; А.Н. Маянский 2005; C.B. Thompson 1995; D.W. Banner et al. 1993]. Апоптоз считают филогенетически более новым видом клеточной смерти, эволюционировавшим как механизм антивирусной защиты. Все больше исследований посвящается выяснению роли апоптоза при различных патологических состояниях, в том числе при вирусных гепатитах [T. Nasir et al 2002; N. Hayashi et al 1997] Долгое время основной формой гибели клеток печени при различных заболеваниях считался некроз. Открытие апоптоза стимулировало изучение роли этого явления в патологии печени, в результате чего было обнаружено, что апоптоз может играть важную роль в развитии острых и хронических вирусных гепатитов [T. Patel et al 1999; C. Rust, G.J. Gores 2000]. Нормальная клетка печени имеет программу пролиферации, обусловливающую её размножение, и программу апоптоза. Судьба клетки, а значит, органа и организма в целом, в большой мере зависят от того, в каком взаимодействии работают эти программы [Е.В. Дмитриева, 2003 г.]. Но если механизмы пролиферации сравнительно хорошо изучены, то регуляция апоптоза изучена недостаточно. При вирусных гепатитах изменения касаются не только клеток печени, главной мишени апоптоза, но и иммунокомпетентных клеток крови, в частности, лимфоцитов [G.Y.Chen et al 2005]. Репликация вируса в гепатоцитах и клетках крови приводит к нарушению клеточного метаболизма, усилению перекисного окисления липидов, повышению проницаемости клеточных мембран, повреждению лизосом, нарушению энергетического обмена и структуры ДНК (однонитевые разрывы с образованием мелких фрагментов) [Н.Н. Белушкина 2005; S.Nagata 2000]. Вышеперечисленные признаки клеточных изменений являются признаками усиленного апоптоза. Как при любом инфекционном процессе, в патогенезе вирусных гепатитов огромное значение имеет иммунный ответ организма. Если при гепатите А происходит адекватное уничтожение инфицированных гепатоцитов, 43 в связи с чем процесс не переходит в хронический, то при вирусных гепатитах В и С поражение печеночной клетки иммуноопосредованно, что наряду с апоптозом обусловливает наклонность этих гепатитов к хроническому течению. В этой связи приобретает особое значение изучение апоптоза в иммунокомпетентных клетках [T.H. Griffith et al 1995; В.П. Лесков и соавт. 1997; D. Klintman et al 2004]. В последние годы делаются попытки медикаментозного воздействия на апоптоз, что могло быповлиять на характер течения вирусных гепатитов [P. Botarelli et al. 1993; R. Sacco et al. 2003]. Точные механизмы повреждающего действия при HCV-инфекции неизвестны. Персистенция вируса ГС имеет характерные черты - длительное латентное течение с закономерным бурным прогрессированием патологического процесса и смертельным исходом в финале, как правило, через много лет после первичного инфицирования. За эти свойства вирус ГС получил название «ласковый убийца» [Соринсон С.Н. 1997]. Установлено, что вирус ГС не имеет интегративных форм, так как в его жизненном цикле нет ни матричной, ни промежуточной ДНК. Анализ специфических популяций Тклеток дает основание предполагать иммунологическую опосредованность повреждения печени, зависящую от особенностей развития инфекции (медленная репликация, мутирование вируса). Вирус ГС отличается высокой степенью изменчивости с образованием мутантных штаммов, которые и обеспечивают длительное персистирование вируса путем его "ускользания" от иммунного ответа [Соринсон С.Н. 1997; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. 2000]. Еще одним механизмом вирусной персистенции при ВГС, как и при ВГВ, может быть способность возбудителей к внепеченочной репликации, в частности, в циркулирующих макрофагах-моноцитах. В этом случае вирусы становятся недосягаемыми для иммунного контроля. Персистенция вирусов в организме является важнейшим звеном патогенеза хронических вирусных гепатитов. В соответствии с современными представлениями ИЛ-1β, ФНО-α и ИФН-γ относятся к группе провоспалительных цитокинов, индуцирующих и 44 стимулирующих воспаление путем активации клеточно-опосредованного иммунитета с одной стороны, и ИЛ-4 - один из противовоспалительных цитокинов, ограничивающих воспаление, но активирующих гуморальный иммунитет, с другой стороны. ИЛ-1β эндогенный биологически активный медиатор неспецифического действия, один из первых включается в ответную защитную реакцию организма при вирусной инфекции. ИЛ-1β активирует Т- и В-лимоциты, усиливает их цитотоксические свойства, инициирует синтез ФНОα и других цитокинов [Кетлинский С.А., Калинина Н.М. 1995]. ФНО-α многофункциональный цитокин с выраженной плейотропностью, играет ключевую роль в развитии местных и общих, системных патологических процессов. Доказана его роль в регуляции интенсивности воспаления, иммунного ответа, активации Т- и В-лимфоцитов, естественных клетоккиллеров, а также в осуществлении гепатотоксических эффектов, в том числе путем активации апоптоза поврежденных (в том числе вирусами) клеток [Козлов В.А. 2000; Сек Ок Сун, Шапиро И.Я. 2002]. Известно, что функциональное состояние иммунной системы организма играет большую роль в развитии инфекционного процесса, который в свою очередь действует угнетающе на иммунную систему организма, нарушая регуляцию иммунных реакций [Орреnheim J., Feldmen M. 2000]. Дисфункция иммунитета имеет большое значение в патогенезе инфекционных заболеваний и это особенно касается системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), играющих важную роль в поддержании синусоидными, гомеостаза или организма. Данная непаренхиматозными, система клетками, а представлена именно - эндотелиальными клетками синусоидов, звездчатыми клетками Ито и купферовскими клетками печени [Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Фрейдлин И.С. 1999]. Синусоидные клетки являются основой воспалительных реакций, которые реализуются путем выработки этими клетками цитокинов. Мишенью "цитокиновой атаки" служат преимущественно гепатоциты, которые также экспрессируют провоспалительные цитокины [Фрейдлин И.С. 1999; Орреnheim J., Feldmen M. 2000]. 45 Изучение патогенеза поражения печени при инфекции вирусом гепатита В показало, что этот вирус сам по себе не является цитотоксическим. Лизис инфицированных гепатоцитов, элиминация вируса и исход острого вирусного гепатита В зависят от иммунного ответа хозяина, при этом критически важной в детерминировании течения и исходов HBV- инфекции является система эндогенного интерферона [Апросина З.Г. 1997]. При остром вирусном гепатите В активная репликация вируса приводит к синтезу всех вирусных белков. Основным вирусным антигеном-мишенью является HBcAg. В процессе репликации он концентрируется на поверхности гепатоцитов, стимулирует повышенную продукцию эндогенного интерферона, что ведет к скоплению цитотоксических Т-клеток, ЕК, К-киллеров. При благоприятном течении острого вирусного гепатита В иммунная система обеспечивает элиминацию инфицированных клеток еще до того, как произошла окончательная интеграция вирусного генома в клеточный. Виремия и присутствие в печени вирусных антигенов (HBeAg, пpe-S, HBcAg) кратковременны. Немаловажное значение в элиминации вируса имеют провоспалительные цитокины ФНО-а и ИЛ-1в, продуцируемые макрофагами [Guidotti L.G. 1996]. Именно биологический цикл развития вируса гепатита В определяет характер и силу иммунного ответа макроорганизма и является ответственным за формирование клинических вариантов вирусной инфекции: латентное течение; острый, хронический гепатит; цирроз; гепатоцеллюлярный рак печени [А.Г. Рахманова, Т.П. Демиденко, Н.И. Кузнецов, Е.В. Степанова 1998]. В большинстве случаев хронического поражения печени, в том числе при инфекции гепатотропными вирусами, основным механизмом гибели клеток служит апоптоз. За много лет до открытия апоптоза был описан характерный гистологический признак вирусного гепатита - округлые гомогенные эозинофильные образования, часто содержащие пикнотичное ядро. Эти образования, названные тельцами Каунсильмена, представляют собой не что иное, как гепатоциты в состоянии апоптоза [Аруин Л.И. 1998]. 46 Апоптозу принадлежит важнейшая роль в регуляции как физиологических, так и патологических процессов [Аббасова С.Г. с соав. 1999; Аруин Л.И. 1998; Hayashi N., Mita E., 1997; Kawahara H. еt al. 1994]. И подавление, и неадекватное усиление апоптоза ведет к патологическим изменениям органов и тканей. В то время как избыточная активация апоптоза, наблюдаемая, в частности, при инфицировании клеток печени гепатотропными вирусами, обусловливает разрушение печеночной ткани, ослабление апоптотической гибели клеток (вызванное, проапоптогенный белок к примеру, р53) служит мутацией одним из гена, кодирующего ведущих факторов канцерогенеза. Недостаточная изученность многих аспектов патогенеза хронических вирусных гепатитов, особенно хронического гепатита С (ХГС) во многом сказывается на решении таких важнейших медицинских задач, как создание вакцины, определение прогноза естественного течения болезни, раннее прогнозирование успеха противовирусной терапиии, наконец, разработка новых препаратов этиотропного и патогенетического действия. Установлено, что вирус гепатита иммуноопосредованное С (HCV) повреждение обусловливает клеток печени, преимущественно формирование воспалительного инфильтрата и фибротические изменения печени, ведущие у 20% пациентов к развитию цирроза. По современным представлениям, среди механизмов повреждения гепатоцитов при ХГС существенная роль отводится апоптозу [Bantel H. et al. 2001; Kountouras J. et al. 2003]. Апоптоз представляет собой основной путь уничтожения инфицированных вирусом клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). В ЦТЛ-опосредованном апоптозе можно выделить 5 ключевых этапов: 1) распознавание антигена на поверхности клетки-мишени ЦТЛ и его конъюгация с клеткой-мишенью; 2) активация ЦТЛ; 3) запуск апоптоза при помощи комплекса Fas/FasL либо гранзимперфоринового пути; 4) отсоединение ЦТЛ; 5) гибель клетки-мишени путем осмотического лизиса и апоптоза. 47 Передача апоптотического сигнала осуществляется посредством каскадной активации каспаз (относятся к семейству протеаз), подобно каскаду реакций коагуляции, и приводит к расщеплению клеточных структур. ЦТЛ- опосредованный апоптоз инициируется активацией «рецепторов смерти», которые запускают механизм клеточной гибели посредством каспазного каскада. Вначале активируются каспазы 8 и 10, на следующих этапах – каспазы 3, 6 и 9, обозначающиеся как эффекторные ввиду их непосредственного участия в уничтожении клетки. Установлено наличие двух путей активации эффекторных каспаз –внешнего и внутреннего. Первый, к которому относится ЦТЛ-опосредованный апоптоз, обусловлен активацией «рецепторов смерти», второй – дисфункцией митохондрий [Cohen G.M. 1997; Rust C., Gores G.J. 2000]. Выявлены восемь рецепторов, вовлеченных во внешний путь, из которых наиболее изучен рецептор фактора некроза опухоли-α 1-го типа (TNF-R1) и рецептор Fas (CD95/APO-1). Fas, он же APO-1 или CD95, относится к мембранным белкам I типа (молекулярная масса от 42 до 50 кДа, 325 аминокислот). Взаимодействие TNF-α и Fas с соответствующими рецепторами ведет к активации каспазы 8, которая содержит N-конец Fas-ассоциированного белка с доменом смерти (FADD) и осуществляет связь рецепторов с эффекторными каспзами (Аббасова С.Г. с соавт.,2000). Второй путь апоптоза запускается высвобождением цитохрома C из митохондрий. В цитоплазме цитохром С связывается с белком Apaf-1, формируя комплекс, который связывается с каспазой 9 и инициирует ее активацию. В дальнейшем второй путь повторяет первый, так как каспаза 9 активирует эффекторные каспазы, как было описано ранее [Rust C., Gores G.J. 2000)]. Апоптозу принадлежит ключевая роль в регуляции лимфоцитарного пула на стадиях созревания и активации. Выраженность экспрессии генов Bклеточной лимфомы/лейкемии-2 (Bcl-2) или Bcl-xL находится в обратной корреляционной зависимости с чувствительностью клеток к апоптозу. 48 Усиленная экпрессия Bcl-2 или Bcl-xL приводит к увеличению продолжительности жизни созревающих лимфоцитов и усилению иммунного ответа. Напротив, снижение экспрессии этих генов ведет к сокращению жизни как созревающих, так и зрелых лимфоцитов. В отличие от Bcl-2 и Bcl-xL усиление экспрессии белка Bax активирует апоптоз. Результаты иммуногистохимических исследований показали, что на поверхности Т-лимфоцитов, формирующих воспалительный инфильтрат в печени при ХГС, увеличена экспрессия Fas-лиганда (FasL). Секретируемый FasL, высвобождаемый из активированных Т-лимфоцитов, может служить апоптотическим сигналом для гепатоцитов, несущих на своей поверхности Fasрецептор. У больных ХГС выявлено усиление Fas-опосредованного апоптоза гепатоцитов, при этом экспрессия FasL нарастает параллельно прогрессированию заболевания [Faubion W.A., Gores G.J., 1999]. Лимфоциты, инфильтрирующие печень, распознают присутствие вирусных антигенов на гепатоцитах, активируются и экспрессируют FasL на своей поверхности. С другой стороны, инфицированные гепатоциты усиливают экспрессию рецепторов Fas и повышают чувствительность к Fas-опосредованномуапоптозу [Faubion W.A., Gores G.J., 1999; Su F., Schneider R.J., 1997). Активация иммуноопосредованного апоптоза при ХГС подтверждается, кроме того, данными о повышении уровня перфорина/гранзима В у пациентов с циррозом печени в исходе ХГС в отличие от цирроза, вызванного невоспалительными заболеваниями, а также в отсутствие поражения печени [Kountouras J., Chatzopoulos D., Zavos 2003]. В периферической крови спонтанный апоптоз Тлимфоцитов у пациентов, инфицированных HCV, также значительно повышен относительно здоровых лиц [Toubi E., Kessel A., Goldstein L. et al. 2001]. Core-протеин HCV, хотя и является структурным компонентом вируса, может выполнять регуляторную функцию, усиливая или ингибируя апоптоз. В ряде исследований проапоптогенную, так установлено, и что этот антиапоптогенную 49 белок роль в выполняет как зависимости от экспериментальных условий и типа используемых клеток, в то время как белки NS3 и NS5А проявляют только антиапоптотический эффект [Calabrese F., Pontiso P., Perrenazzo E. et al. 2000]. Модуляция апоптоза может включать в себя внутриклеточное связывание core-протеина с рецепторами TNF, Fas или лимфотоксина β или замещение со бой сигнальных молекул, таких как TNF-рецептор-ассоциированный фактор-2 (TRAF-2) или TNF-рецептор-ассоциированный домен смерти (TRADD). Было доказано, что core-протеин может ингибировать или активировать транскрипционный фактор NFkB, а также модулировать чувствительность гепатоцита к действию цитокинов. При этом одни авторы отметили усиление такой чувствительности, а другие – ее снижение или отсутствие существенных изменений [Bantel H., Lugering A., Poremba С. et al. 2001]. Кроме того, последние исследования показали, что core-протеин взаимодействует in vitro и ингибирует РНК-зависимую протеинкиназу (PKR), которая также вовлечена в процесс апоптоза. Таким образом, белок HCV может модулировать апоптоз гепатоцитов при помощи прямых и непрямых механизмов. Принятая в настоящее время концепция механизмов иммунного ответа также показывает, что секреция таких цитокинов, как интерферон-γ (IFN-γ), TNF-α и интерлейкин-12 (IL-12) ведет к активации Т-хелперов 1-го типа, которые осуществляют противовирусное действие (Th1-ответ). С другой стороны, секреция IL-10 обеспечивает стимуляцию гуморального звена иммунитета (Th2-ответ), что, возможно, играет определенную роль в регуляции апоптотических процессов [Fan X.G., Liu W.E., Li C.Z. et al. 1998]. Как отмечалось ранее, внешний путь апоптоза начинается с лигандрецепторного взаимодействия. Представление о функционировании рецепторов клеточной гибели служит теоретической базой для разработки оптимальной стратегии патогенетического лечения различных заболеваний, в том числе вирусных гепатитов. Данные литературы свидетельствуют, что при вирусном гепатите апоптоз может быть как результатом прямого воздействия вируса, так и опосредован иммунной реакцией. 50 Запуск процессов апоптоза при проникновении в гепатоцит вируса следует рассматривать как своего рода защитный механизм, поскольку в мертвой клетке репликация вируса становится невозможной. Поэтому «в интересах» вируса – подавить апоптоз и сохранить клетки жизнеспособными. И действительно, некоторые кодируемые вирусами белки осуществляется обладают антиапоптозной подавлением функции активностью, которая проапоптогенного (и противоопухолевого) белка р53, инактивацией каспаз, а также усиленной экспрессией мощного ингибитора апоптоза Bcl-2 [Hayashi N., Mita E., 1997; Sprinzl M.F., Rosset S., Male F.-F. et al. 2005]. Интересно, что в норме Bcl-2 обнаружен в печени только в эпителии желчных протоков, постоянно контактирующих с желчью, но не в гепатоцитах [Аруин Л.И. 1997]. О связи экспрессии Fas и последующего апоптоза с действием вируса гепатита С свидетельствует и то, что после успешного лечения α-интерфероном количество Fas-положительных клеток резко уменьшается и коррелирует как со снижением активности трансаминаз, так и с уменьшением выраженности портальной и лобулярной лимфоидной инфильтрации ткани печени [Toubi E., Kessel A., Goldstein L. et al. 2001]. Результаты исследований А.О. Буеверова и А.Е. Грязина (2006) указывают на значительные различия в реализации механизмов уничтожения инфицированных вирусом гепатоцитов при хронических гепатитах В и С. При ХГС степень экспрессии Fas и FasL лимфоцитами воспалительного инфильтрата достоверно превышала таковую при ХГВ: 2,3±0,2 по сравнению с 0,9±0,2 для Fas и 2,5±0,2 по сравнению с 1,1±0,3 для FasL соответственно. Средний индекс TUNEL-положительных гепатоцитов, т. е. гепатоцитов в состоянии апоптоза, в биоптатах печени составил 32±7,1%, что достоверно превышает количество таковых при ХГВ (7,6±4,3%, р=0,01) и коррелирует с уровнем экспрессии FasL клетками лимфоидного инфильтрата [Е.В. Дмитриева и соавт. 2003]. Полученные данные подтверждают ведущую роль клеточного Fasопосредованного иммунного ответа организма на антигены вирусов гепатитов 51 В и С в повреждении гепатоцитов. Обнаружено, что при ХГВ даже обширный воспалительный инфильтрат содержит мало лимфоцитов, экспрессирующих FasL, поэтому ЦТЛ практически «безоружны» в окружении инфицированных вирусом клеток. При ХГС активированные Т-лимфоциты обладают мощным цитотоксическим потенциалом в виде высокого уровня экспрессии FasL для уничтожения инфицированных гепатоцитов, экспрессирующих белок Fas. Принципиальных различий в степени экспрессии Fas гепатоцитами у больных обеих групп выявлено не было (А.О. Буеверов). Важно подчеркнуть, что при хронических вирусных гепатитах сами лимфоциты становятся объектом цитотоксического действия собственного FasL или FasL гепатоцитов. Это подтверждается как экспрессией FasL на гепатоцитах, так и экспрессией Fas на ЦТЛ, достоверно более высокой при ХГС по сравнению с ХГВ [Е.В. Дмитриева и соавт. 2003]. Экспрессия Fas-R на мембране гепатоцитов индуцируется рядом провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины (ИЛ-1, -2, -6), интерфероны (ИФН-γ), факторы некроза опухоли (TNF-α) и др. Таким образом, вероятно, что воспаление любой природы может способствовать Fas-Rзависимому повреждению печени. Более того, цитокины стимулируют увеличение количества молекул Fas-L на Т- и NK-лимфоцитах. Внутриклеточный домен TNF-R1 также интенсивно экспрессируется на гепатоцитах и клетках Купфера. Его экспрессия резко повышается при гепатите любой этиологии (вирусный, алкогольный, аутоиммунный и др.). Исследования F. Su и соавторов [1997] продемонстрировали, что НВх-протеин вируса гепатита В сенсибилизирует культуру гепатоцитов к TNF-α-индуцированной цитотоксичности. Персистенция HBsAg также сенсибилизирует гепатоцит к TNF-опосредованному апоптозу. Следует заметить, что даже в здоровой печени NK- и CD8+-T-лимфoциты печеночных синусоидов содержат больше мРНК ИЛ-15, -18, TNF-α, ИФН-γ по сравнению с периферическими клетками, что свидетельствует о повышенной готовности к осуществлению апоптоза гепатоцитов в случае возникновения их 52 изменений, например, при инфицировании вирусом [Jonsson J.R., EdwardsSmith C.J., Catania S.C. et al. 2000]. О связи экспрессии Fas и последующего апоптоза с действием вируса гепатита С свидетельствует и то, что после успешного лечения а-интерфероном количество Fas-положительных клеток резко уменьшается и коррелирует как со снижением активности трансаминаз, так и с уменьшением выраженности портальной и лобулярной лимфоидной инфильтрации ткани печени [Okazaki M., Hino K., Fujii К et al. 1996]. Наконец, продуцируемый преимущественно макрофагами в избыточных количествах TNF-α также ведет к апоптозу клеток путем взаимодействия с соответствующим рецептором. Имеющиеся данные о роли апоптоза при возникновении острых гепатитов крайне скудны. Обнаружено повышение экспрессии Fas белка в гепатоцитах у 3-х пациентов с фульминантной формой печеночной недостаточности, обусловленной вирусной (гепатит В) инфекцией [Rivero V., Grespo J., Casafront F. 1998]. Большинство выживших печеночных клеток оказались TUNEL-положительными, что свидетельствует о вовлечении Fasмедиированного апоптоза в патологический процесс при острых гепатитах [Rivero V., Grespo J., Casafront F. 1998]. Терапевтическое воздействие на систему АРО-1\Fas, по-видимому, можно достичь путем инактивации антигенами рецепторов АРО-1\Fas или их лигандов [Galle P.R., Hofmann W.I., Walczak H. et al., 1995, Hiramatsu N., Hayashi N., Katayama K. et al. 1994]. Однако возникает проблема направленной доставки антител в печень, чтобы избежать их повреждающего действия на нормальные органы и ткани [Hiramatsu N., Hayashi N., Katayama K. et al. 1994]. Являясь универсальным биологическим механизмом, апоптоз при вирусных гепатитах может приводить к избыточной гибели не только гепатоцитов, но и других клеточных популяций, отражая либо системный иммуновоспалительный ответ на инфекцию, либо внепеченочную персистенцию вируса. В связи с этим определенный интерес представляют исследования А.О. Бееверова и А.Е. Грязина (2006) апоптоза периферических 53 лейкоцитов при хроническом гепатите. У больных хроническими гепатитами В и С и у здоровых доноров определялось количество лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови в состоянии апоптоза непосредственно после выделения и после 24-часовой инкубации в культуральной среде методом проточной цитофлюориметрии, а также повреждение ДНК по скорости щелочной денатурации. Даннные исследования показали, что апоптоз как лимфоцитов, так и гранулоцитов был достоверно выше у больных ХГВ по сравнению с контролем как непосредственно после выделения, так и после суточной инкубации. Более интенсивный переход клеток в апоптоз наблюдался в подгруппе больных гепатитом С, хотя здесь следует учитывать роль разного количества пациентов в подгруппах (12 с гепатитом В, 22 с гепатитом С). Выявлена также корреляция между степенью повреждения ДНК лимфоцитов и гранулоцитов и накоплением клеток в состоянии апоптоза после инкубации [Буеверов А.О., Тихонина Е.В., Москалева Е.Ю. и др. 2000]. Помимо этого, после суточной инкубации количество лейкоцитов обеих популяций в апоптозе достоверно коррелировало с сывороточной концентрацией TNF-α [Boueverov A.O., Mammaev S.N., Tikhonina E.V. et al. 2000]. Полученные результаты свидетельствуют об усилении программированной гибели клеток периферической крови у больных хроническим вирусным гепатитом, что может отражать как повреждающее действие гепатотропных вирусов на лейкоциты (или их костномозговые предшественники), так и влияние системного действия провоспалительных цитокинов. Косвенным подтверждением последнего механизма служит корреляция интенсивности апоптоза с сывороточным уровнем TNF-α - наиболее мощного цитокина с проапоптогенным эффектом. В связи с этим, определенный интерес представляют исследования механизмов, ведущих к апоптозу клеток печени при хроническом вирусных гепатитах В и С. Диагностическая значимость оценки уровня цитокинов заключается в констатации самого факта повышения или снижения уровня цитокинов у данных больных с конкретным заболеванием, в определении связи 54 этих изменений с течением заболевания, а также в возможном использовании сведений о цитокинах для оценки степени апоптоза и эффективности проводимого лечения. Несмотря на многочисленные исследования, остается открытым вопрос о том, возможно ли оценить степень активности воспаления и фиброгенеза в печени на основании определения сывороточных и местных концентраций цитокинов с различным спектром действия, что в конечном итоге может способствовать разработке новых подходов к лечению заболеваний печени. 2.2 Апоптоз при герпетических и папилломавирусных инфекциях По данным ВОЗ заболевания, передаваемые вирусом герпеса, занимают 2-е место (15,8%) после гриппа (35,8%) как причина смерти от вирусных инфекций. На территории России и в странах СНГ от хронической герпетической инфекции страдает не менее 22 миллионов человек [Маянский А.Н. 2005]. Среди вирусных инфекций, поражающих генитальные органы, герпетическая инфекция встречается наиболее часто. Этому возбудителю принадлежит преобладающая роль в этиологии спонтанных абортов и преждевременных родов, в нарушении эмбрио- и органогенеза, врожденной патологии новорожденных. В 85-99% случаев первичная инфекция у них протекает бессимптомно. Антитела к цитомегаловирусу выявляют у 10-15% подростков. К возрасту 35 лет эти антитела выявляют уже у 40% людей. Одной из наиболее часто встречающихся форм рецидивирующей герпес-вирусной инфекции, вызванной вирусами простого герпеса (ВПГ) 1,2 типа, является генитальный герпес. За последние десять лет отмечено значительное увеличение частоты генитального герпеса, регистрирующейся в разных странах, что в значительной мере связано с распространением бессимптомной и недиагностированной форм герпетической инфекции [Исаков В.А. 2006]. По данным проведенных исследований более 80% сексуально активного населения России инфицированы генитальным 55 герпесом, при этом клинические проявления в виде рецидивов отмечаются в 50-75% случаев [Исаков В.А. 2006]. Вирус простого герпеса обуславливает патологию беременности и родов, иногда приводя к спонтанным абортам, гибели плода, или вызывает генерализованную инфекцию новорожденных [Кузьмин В.Н. 2000]. До настоящего времени остается непонятной несостоятельность иммунного надзора при рецидивах герпетической инфекции и неонатальном герпесе. При исследовании зависимости тяжести заболевания от уровня антител получены результаты, указывающие на то, что у детей с признаками инфекции титры были низкими, а у детей, имевших контакт с ВПГ при рождении и не имевших признаков заболевания, отмечались высокие титры вируснейтрализующих антител. У новорожденных с диссеминированной инфекцией в первую неделю часто отсутствуют специфические антитела. Поздние проявления заболевания и более высокие уровни антител при энфефалитах у детей позволили S.Kohl (1990) предположить, что часть случаев вирусных энцефалитов у новорожденных обусловлена реактивацией вируса, а не первичной инфекцией. Проблема герпетической инфекции состоит в том, что иммунная система реагирует только на свободные вирусные частицы или антигенные детерминанты (внеклеточное расположение), но на латентные вирусы, «укрывшиеся» в нервных клетках ганглиев периферической нервной системы и фагоцитах, иммунная система не реагирует. Иммунные дефекты выявляются только под антигенной нагрузкой. Апоптоз при интергративных вирусных инфекциях, таких как ВПГ-1,2 и ЦМВИ, является одним из защитных механизмов [Hardwick J.M. 1995]. Формирование противогерпетического иммунитета происходит как при манифестном, так и при бессимптомном течении. Способность к длительному персистированию возможна в многочисленных механизмов, связи с наличием воздействующих у на герпес-вирусов формирование противовирусной иммунной защиты и способствующих уклонению вируса от иммунологического надзора. В ряду факторов, играющих основную роль в 56 противовирусной защите стоят цитотоксические лимфоциты, естественные киллеры, макрофаги, специфические антитела, система интерферона и интерлейкинов [Чередеев А.Н. 1998; Ellermann-Eriksen. S et al. 2005; Smith A.E. 2000]. В результате длительных мутаций вирусами герпеса выработаны многочисленные способы уклонения от иммунного контроля, касающиеся как нарушения работы клеточного звена защиты, цитокиновой сети, уклонения от апоптоза. Индуцированная вирусами иммунная недостаточность способствует их активной репликации в течение длительного времени. Цитокиновый ответ составляет основу специфических иммунных реакций и оказывает непосредственное влияние на механизмы иммунорезистентности при герпес-вирусной инфекции. Апоптоз реализуется в том числе через рецепторы к иммуноцитокинам, в частности, через рецепторы к ФНО [Hardwick J.M. 1995]. Синтез таких цитокинов как ИФН-α, ИФН-γ, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО-α при ВПГ-инфекции приводит к активации основных антигенпрезентирующих клеток и развитию Th1-клеточного противовирусного иммунного ответа [Кетилинский 2000; Ковальчук Л.В. и др., 2004; Paludan S. 2000; Imanishi J. 2000; Salazar-Mather T. et al. 2000; Mogensen S. et al. 2004]. В работах Ершова Н.Н. и соавторов показано, что у пациентов с высокой частотой рецидивов менее одного года отмечено увеличение суммарного содержания лимфоцитов с фенотипом CD8 + и CD16+, выполняющих цитотоксическую функцию, в фазу активации герпес-вирусной инфекции. При течении генитального герпеса с высокой частотой рецидивов более одного года содержание этих клеток достоверно снижается. В период обострения герпес-вирусной инфекции показатели интерферонового статуса у всех больных генитальным герпесом были снижены за счет индуцированной альфа- и гамма-фракции интерферона. При сравнении показателей цитокинового профиля пациентов с рецидивирующей генитальной герпесвирусной инфекцией в начале рецидива можно наблюдать следующие закономерности: - у пациентов с первичным обострением тенденция к превалированию ИФН-α, ИЛ-18, ИЛ-8, ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-2 – что указывает на 57 активацию макрофагально-моноцитарного звена и Th1-лимфоцитов; у пациентов с рецидивирующим герпесом и длительностью инфекции более 5 лет тенденция к превалированию ИФН-α, ИЛ-1β, ИЛ-18, ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-4 – что указывает на активацию макрофагально-моноцитарного звена и Th2- лимфоцитов [Ершов Н.И. и др. 2001]. Роль ФНО в развитии рецепторзависимого апоптоза при ВПГ-инфекции не ясна, так как в литературе имеются противоречивые сведения как по концентрациям ФНО-α в крови, так и по концентрации сывороточных маркеров апоптоза. В тоже время не выяснена корреляция между общим цитокиновым профилем пациентов с герпетической нфекцией и активностью апоптоза в зависимости от способа терапии. Поэтому, актуальной задачей остается изучение механизмов функционирования апоптоза при рецидивирующей герпес-вирусной инфекции и поиск новых препаратов с противовирусной и иммуномодулирующей активностью, регулирующих активность апоптоза для лечения этого заболевания. Наряду с этим, ВПГ-инфекция может индуцировать функциональные повреждения в неспецифических иммунных эффекторных клетках (изменяет многие функции макрофагов, включая угнетение хемотаксиса, снижение фагоцитоза; при острой инфекции возможно значительное угнетение бласттрансформации лимфоцитов и продукции цитокинов). Другой особенностью процессов апоптоза при герпетических инфекциях является способность вирусных частиц блокировать защиту организма [Hardwick J.M. 1995]. Некоторые вирусы успешно живут в апоптотических клетках, это представляет определенную опасность для организма и является существенным моментом в патогенезе заболевания [Белушкина Н.Н. 2004]. Это происходит за счет того, что многие вирусы кодируют белки, ингибирующие апоптоз. При этом реализуются в основном две возможности: с помощью гомологов Вс1-2 (структурных или функциональных) и с помощью ингибиторов 58 каспаз. Блок апоптоза усиливается вирусами за счет деградации р53 [Eliopoulos A.G. 1995; Hardwick J.M. 1995]. К вирусам, герпесвирусов ингибируюшим Эпштейн-Барр, апоптоз, кодирующий относится белок вирус семейстсва HMRFI, являющийся гомологом Bcl-2. Аналогичным механизмом ингибирования апоптоза обладают различные вирусы герпеса человека. Способность ингибировать апоптоз позволяет вирусам закончить цикл репликации до гибели клетки [Белушкина Н.Н. 2004; Hardwick J.M. 1995]. Таким образом, вирусы могут индуцировать или блокировать апоптоз в зараженной клетке, как за счет специфического действия продуктов вирусных генов, так и в результате изменения свойств поверхностной мембраны клетки, что делает ее мишенью для цитотоксических иммунокомпетентных клеток. Изучение механизмов цитопатического действия вирусов, а также нарушение регуляции ПГК в этом процессе крайне необходимо для понимания механизмов взаимоотношений: вирус - клетка-хозяин - макроорганизм. Геном HSV1 присутствовал, в основном, у EBV-инфицированных больных. Кроме того, данные больные имеют более тяжелое клиническое течение лимфомы (средней и высокой степени злокачественности), по сравнению с теми больными, у которых присутствовал только геном EBV [Sinkovics J.G. 1995]. Таким образом, наличие коинфекции вирусами герпетической группы может быть показателем степени обострения и/или прогрессирования данного заболевания. В работах Белушкиной Н.Н. (2004) было обнаружено, что количество лимфоцитов, находящихся в состоянии апоптоза у пациентов с EBV практически не отличалось от величины, наблюдаемой у здоровых доноров (1,1 -2,2% и 1,6% от общего числа клеток, соответственно). Усиления спонтанного апоптоза в лимфоцитах пациентов с коинфекцией, содержащих в геноме лимфоцитов геном вируса HTLV1 (1,2% и 1,1 клеток от общего числа клеток у пациентов EBV+ (HTLV1+ и EBV+) соответственно), обнаружено не было. Отсутствие изменения количества лимфоцитов в состоянии апоптоза в периферической крови обследуемых пациентов относительно группы доноров 59 может быть связано с тем, что в периферической крови апоптозные клетки быстро фагоцитируются макрофагами, что не позволяет зарегистрировать это явление в периферической крови. Инфекция распространена вируса и у папилломы подавляющего человека большинства достаточно женщин широко проходит транзиторно. Однако у части инфицированных женщин возникают дисплазии шейки матки, которые чаще всего регрессируют и лишь 1% легких дисплазий переходит в рак. Персистенция вируса с длительной активной экспрессией вирусных онкогенов инициирует многостадийный процесс, в результате которого клетки эпителия шейки матки приобретают генетические и эпигенетические нарушения, способствующие опухолевой прогрессии. Эти нарушения затрагивают гены, контролирующие иммунный ответ, регуляцию клеточного цикла, апоптоз. Этиологию неопластических заболеваний шейки матки в настоящее время многие связывают с инфицированием ее тканей вирусом папилломы. Так, A.Sanchez-Perez и соавт. (2001) считают, что вирус папилломы человека типа 16 (HPV-16) как опухолевый вирус ДНК является ответственным за развитие рака шейки матки. По мнению C.Kim и соавт. (2001), инфицирование папилломатозным вирусом (HPV) четко связано с возникновением рака шейки матки, а выявление гипоксии опухоли имеет прогностическое значение при этом заболевании матки у человека. Геном ВПЧ разделен на 3 функционально активных региона: Long control region (LCR), early (E), late (L). Область LCR участвует в регуляции транскрипции вирусных генов [Shoji Y.,1996]. Регион Е включает ранние гены (Е-6, Е-7, Е-1, Е-2, Е-4, Е-5), кодирующие ранние белки. Поздние гены (L-l, L-2) кодируют структурные белки вириона. Три ранних гена (Е-1, Е-2, Е-4) контролируют функции, необходимые для репродукции вируса, причем Е-2 обладает функциями регулятора транскрипции вирусной ДНК, которая начинается в регуляторной области LCR. Гены Е-5, Е-6, Е-7 обладают активностью, стимулирующей пролиферацию и трансформацию клеток [Sanchez-Perez A.M. 1997]. Инициирующим фактором выступают мутации в 60 различных участках Е-1, в результате чего ДНК ВПЧ внедряется в хромосомы клетки хозяина [Sanchez-Perez A.M. 1997]. После интеграции циркулярная ДЖ открыта в области Е-1 и Е-2 генов, что заканчивается их разрушением, приводящим к неконтролируемой экспрессии генов Е-6, Е-7 и соответственно к повышению синтеза белков Е-6, Е-7. Протеины Е-6, Е-7 названы онкобелками, так как их мишенями являются белки — супрессоры опухолевого роста — р53 и pRb, участвующие в регуляции апоптозаВ нетрансформируемых HPVинфицированных клетках, по данным A. Sanchez-Perez и соавт. (1997), HPV Е2 протеин регулирует транскрипцию вирусных онкогенов Е2 и Е7. Злокачественная трансформация обычно сопровождается деструкцией гена Е2 и затем нарушением регуляции экспрессии Е6 и Е7. Авторы показали, что повторное внедрение протеина HPV-16 Е2 в HPV-16-трансформированные линии клеток рака шейки матки приводит к снижению скорости роста, а отсутствие сывороточных факторов роста - к гибели клеток через апоптоз. Экспрессия Е2 повышает уровень E6/E7 mRNA. Это приводит к увеличению уровня Е7 протеина, что, в свою очередь, вызывает повышение содержания свободного E2F и стимуляцию апоптозной гибели клеток. Полученные авторами данные показывают, что разрушение гена E2 приводит к появлению HPV-трансформированных клеток, которые менее подвержены апоптозу и, следовательно, более склонны образовывать опухоль шейки матки. C. Kim и соавт. (1997) исследовали зависимость между гипоксией и апоптозом на эпителиальных клетках человека, экспрессирующих онкопротеины HPV-16 высокого риска. In vitro гипоксия стимулировала индукцию p53 и апоптоз в первичных эпителиальных клетках шейки матки с генами HPV E6 и E7, но не с фибробластами шейки матки, инфицированными E6 и E7. Линии клеток дериватов HPV-зависимой плоскоклеточной карциномы шейки матки человека были значительно менее чувствительны к апоптозу, вызванному гипоксией, по-видимому, за счет того, что они приобретали дополнительные генетические изменения, которые снизили чувствительность к апоптозу. Хотя этот процесс длительного культивирования клеток приводит к 61 селекции субпопуляций эпителиальных клеток, экспрессирующих HPV протеин и имеющих сниженный апоптозный потенциал, экспозиция этих клеток в условиях гипоксии ускоряет процесс селекции. Полученные результаты указывают на роль вызванной гипоксией селекции клеток со сниженным апоптозным потенциалом при развитии опухоли у человека и могут частично объяснить, почему опухоли шейки матки со сниженным содержанием кислорода более агрессивны. Y. Shoji и соавт. (1996) поставили цель выяснить роль апоптоза в развитии рака шейки матки, включая интраэпителиальные неоплазии, микроинвазивную карциному и инвазивную плоскоклеточную карциному, и отношение их к клеточной пролиферации и к инфекции HPV. Выявлена значительная положительная корреляция между степенью гистологической злокачественности при интраэпителиальной неоплазии и степенью инвазии опухоли в строму. Апоптоз при злокачественной неоплазии шейки матки может быть тесно связанным с дифференциацией и прогрессированием злокачественных клеток. Однако не представляется вероятным, что HPV сам по себе имеет прямое отношение к путям управления апоптозом. Согласно последним молекулярным исследованиям онкопротеинов Е6 и Е7, HPV высокого риска сможет значительно изменять нормальную регуляцию клеточного цикла. Изменения регуляции клеточного цикла могут отражать изменения в балансе между ростом клеточной массы и потерей клеток вследствие апоптоза в клеточной популяции, экспрессирующей Е6 и/или Е7. C.Isacson и соавт. (1996) провели изучение кинетики клеточной пролиферации и апоптоза при неоплазме шейки матки и сравнили риск изменений, вызванных HPV. Индекс клеточной пролиферации, по данным определения ядерного антигена Ki67, повышается параллельно с увеличением степени поражения. Апоптоз не наблюдался в нормальных эпителиальных клетках, очень редко находили апоптозные клетки при низкой степени поражения. Однако выявлен низкий, но доступный измерению апоптозный индекс в поражениях высокой степени, который коррелировал со степенью поражения. Не обнаружено 62 заметной связи между пролиферацией и апоптозным индексом при поражениях легкой степени. Эти данные подтверждают, что степень апоптоза при поражениях вследствие папилломатозной инфекции коррелируют скорее с пролиферативной активностью, чем с типом инфекции. С целью оценки трансформации клеточных характеристик неопластических изменений в эпителии шейки матки H.Furuya и соавт. (1995) исследовали популяции клеток в состоянии апоптоза и на фоне пролиферативных циклов в нормальном и диспластическом эпителии, при карциноме in situ и при инвазивной карциноме. Относительное содержание клеток в состоянии апоптоза снижалось по мере прогрессирования процесса и было максимально низким при карциноме in situ, чем при дисплазии. Наоборот, относительное содержание клеток в цикле пролиферации повышалось по мере прогрессирования процесса и было выше при дисплазии, чем в норме. Отношение в процентах ДНК к ФР превышало 1 при нормальной шейке матки и при дисплазии, но было меньше 1 при карциноме in situ и инвазивной карциноме. Не выявлена выраженная корреляция между ДНК и GF. Полученные данные позволяют предположить, что снижение интенсивности апоптоза может отражать атипичные изменения в клетках шеечного эпителия в процессе их неопластических изменений и что пролиферативная активность в месте неопластического процесса возникала у больных с диспластическими изменениями шеечного эпителия в периоде перехода в карциному in situ. Определенное внимание уделяется изучению эффективности химиотерапии злокачественных новообразований шейки матки с учетом роли апоптоза клеток. Так, K. Butz и соавт. (1996) показали, что лечение генотоксическим агентом, таким, как митомицин С и цисплатин, приводит к выраженной регрессии экспрессии вирусного онкогена l E6/E7 в HPV16- и HPV18-позитивных линиях раковых клеток рака шейки матки. Кинетический анализ выявил, что снижение экспрессии E6/E7 не является обязательным предшественником индукции p21WAF1. Авторы нашли, что ген bax может быть следствием генотоксического стресса у части, но не у всех, линий HPV63 позитивных раковых клеток. Обработка ДНК повреждающими агентами может приводить к апоптозной смерти HPV-позитивных раковых клеток, независимо от их способности продуцировать p53 ген bax. Способность раковых HPVпозитивных клеток вызвать апоптозную смерть клеток в ответ на повреждение ДНК может расцениваться как следствие на молекулярном уровне терапевтического эффекта генотоксических влияний в лечении рака шейки матки. G.Garzetti и соавт. (1996) изучали отношения между экспрессией протеина p53, апоптозом аутологичных опухолевых клеток и клиническим ответом на неоадъювантную химиотерапию у больных аденокарциномой шейки матки. В исследование включены 14 женщин со II стадией плоскоклеточного рака. Больные получали комбинированную химиотерапию, состоящую из 3 циклов цисплатина (80 мг/м2) и блеомицина (30 мг/м2). После химиотерапии больным выполняли радикальную операцию. У 10 (71,4%) больных получен клинический эффект (у 2 полный и у 8 частичный), в то время из остальных 4 (28,6%) у 3 не было изменений и у 1 - отмечалось ухудшение после химиотерапии. Выявлена выраженная корреляция между сверхэкспрессией p53 и чувствительностью к химиотерапии. У больных с положительным результатом лечения обнаружена более высокая частота появления p53 положительных клеток, чем у больных с отрицательным результатом лечения (p=0,05). Проведенные исследования определили взаимосвязь экспрессии p53 и чувствительности к цисплатину при локальной развитой карциноме шейки матки, подтверждая положение, что цитотоксическое действие цисплатина может активировать управляемый р53 апоптоз. По данным M. Ueda и соавт. (1997), в культуре клеток рака шейки матки (ОМС-1 плоскоклеточный рак и ОМС-4 аденокарцинома) после внутривенного введения 5-фторурацила в дозе 0,1-10 мг/мл наступила дозозависимая ингибиция числа живых клеток и повышение поглощения 6-3Hдезоксиуридина в ДНК. Эти результаты хорошо коррелируют с показателями апоптоза клеток, определяемого in situ методом TUNEL. Флоуцитометрический 64 анализ показал, что экспрессия Fas антигена клетками повышается при инкубации с 10 мг/мл 5-фторурацила. Более того, TUNEL срезов тканей резецированной матки показал, что апоптоз появляется более часто у больных, леченных до операции 5-фторурацилом по 500 мг/м2 в сутки в течение 8 дней, по сравнению с больными, не получавшими препарат. Эти данные указывают, что достигаемый терапевтический уровень препарата тормозит рост клеток и синтез ДНК и приводит к гибели апоптозных клеток. 65 Глава 3 План проведения экспериментальных и теоретических исследований Программируемая клеточная гибель или апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточной популяции в многоклеточном организме. Вирусы способны оказывать иммуносупрессивное действие, направленность которого может быть связана как с клеточным иммунитетом, так и с нарушением синтеза цитокинов и снижения апоптической активности зараженных клеток. Проблема развития процесса вирогении в случае таких хронических вирусных инфекций как вирусные гепатиты В, С, герпетические инфекции, когда, несмотря не отсутствие активной репликации вируса, клетки макроорганизма «заражены» геномом вируса. Перспективной задачей современной иммунологии является поиск путей модуляции механизма работы клеток в направлении регуляции апоптоза. План проведения исследований: - Обзор теоретических и экспериментальных работ по исследуемой научной теме; - Выбор и обоснование принятого направления и способов решения поставленных задач; - Проведение патентных исследований по теме НИР; - Разработка общей методики проведения исследований; - Разработка клинических карт для каждой нозологической формы; - Изучение уровня sFAS, ФНОα, ИЛ-2, TRAIL в крови и других биологических жидкостях пациентов с диагностированными хроническими вирусными инфекциями с высоким онкогенным риском; - Определение диагностической значимости секретируемых регуляторов активности апоптоза. Важность выбора объекта исследования (биологической жидкости) в каждой нозологической группе пациентов отдельно; 66 - Проведение и сравнительная характеристика ферментов трансфераз при парентеральных гепатитах. 67 Глава 4 Экспериментальные и теоретические исследования 4.1 Клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика обследованных групп больных хроническим вирусным гепатитом В, С Под нашим наблюдением находилось 155 больных хроническими вирусными гепатитами в возрасте от 18 до 76 лет, которые проходили стационарное лечение в ЦПБ СПИД и ИЗ МЗ и СР КБР. Преобладали лица мужского пола (88%). Из них – 76 больных с хроническим вирусным гепатитом В, 37 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С и 38 – с хроническим вирусным гепатитом – mixt. При хроническом гепатите В длительность заболевания к моменту поступления составляла 7,8 года, при хроническом гепатите С – 11,2 года и при хроническом вирусном гепатите-mixt – 5,6 года. Обращает на себя внимание тот факт, что при всех этиологических формах вирусного гепатита преобладают мужчины, но в группе больных с вирусным гепатитом С и микст гепатитом В+С, процентная доля мужчин значительно выше, чем женщин (75% и 94% соответственно). При остром вирусном гепатите В преобладание мужчин составляет 65%. Другой характерной особенностью парентеральных гепатитов являлось преобладание среди заболевших лиц молодого возраста от 15 до 30 лет. При хроническом гепатите В таких больных было 37 человек (48%), вирусном гепатите С-19 пациентов (56%) и микст-гепатите В+С-22 (63%). Процентная доля больных от 31 года до 50 лет составила соответственно: при ВГВ-29%, ВГС-33% и ВГВ+С-25% больных. Больший процент больных старше 50 лет определялся у больных вирусным гепатитом В-21%, у больных вирусным гепатитом С этот процент составил-11% и у больных вирусным гепатитом В+С - 12% Основной причиной возрастных и половых отличий в группах мы видим в различном уровне сопутствующей наркомании. Известно, что наркомания в России не только растет, но и молодеет, увеличивается доля возрастной группы 68 17-18 лет. В группе больных хроническим вирусным гепатитом В внутривенное употребление наркотиков отмечено у 24% больных, в группе больных с вирусным гепатитом С - у 38% пациентов, а у больных микст-гепатитом В+С эти цифры соответствуют уже 50%. Следовательно при суррогатной опийной наркомании инфицирование HCV происходит с большей интенсивностью, по сравнению с HBV. Социальный состав больных вирусными гепатитами показан в таблице 2, из которой следует, что среди обследованных имелись представители разных социальных групп. Однако значительная доля, особенно при HCV- и микстинфекции приходилась на неработающий контингент (45% и 60% соответственно). В большинстве случаев это не безработные в обычном понимании этого слова, а лишившиеся работы именно в связи с наркоманией и представители так называемого «челночного» бизнеса. Следовательно, сопутствующая «инъекционная» наркомания влияла не только на уровень заболеваемости парентеральными гепатитами, но во многом определяла возрастную, половую и социальную структуру заболевших. Каждый пятыйшестой больной вирусным гепатитом был учащийся или студент. Проведенный нами анализ возможных путей и факторов передачи возбудителей инфекции показал, что кроме инфицирования во время введения наркотических препаратов через необработанные шприцы и иглы (24% у больных ВГВ, 38%-у инфицированных HCV и 50% у больных ВГВ+С), заражение вирусными гепатитами происходило в стационарах и поликлиниках при заборе крови для анализов и проведении оперативных вмешательств (40% при вирусном гепатите В, 29%-при вирусном гепатите С и 35% у пациентов с микст-гепатитом В+С). Примерно в одинаковом процентном соотношении заражение вирусными гепатитами происходило при гинекологических и стоматологических манипуляциях (18% ВГВ, 20% ВГС и 17% ВГВ+С). 69 Таблица 2- Социальный состав больных вирусными гепатитами. Профессия, Острый ГВ Острый ГС ВГВ+ВГС социальная категория Количество больных, % Рабочие 6,4 8,4 12 Служащие 16,6 10,2 3 Мед. работники 4,8 4,7 3 Школьники и 6,4 4,7 4 Студенты ВУЗов 12,7 10,3 15 Пенсионеры 7,9 11,2 - Милиционеры и 10,2 5,5 3 Неработающие 35 45 60 Итого 100 100 100 учащиеся ПТУ военнослужащие Половой путь заражения отмечался у больных вирусными гепатитами В и С (12% и 7% соответственно). Не установленный путь инфицирования оказался также у больных вирусным гепатитом В и С и составил по 6%. Значительная доля заражения во время внутривенного введения наркотиков в общей структуре путей передачи при сочетанном варианте вирусного гепатита приводило к относительному уменьшению удельного веса других путей инфицирования. Клиническая характеристика больных с вирусными гепатитами показала, что с легким вариантом течения наблюдалось 19,8% больных вирусным гепатитом В, 37,9% с вирусным гепатитом С и 32% с сочетанным гепатитом. Среднетяжелое наблюдалось у 58,7% ВГВ, 52% с ВГС и 40% с ВГВ+С и тяжелое- у 21,5% больных с хроническим вирусным гепатитом В, 10,1%- с 70 вирусным гепатитом С и 28%-с вирусным гепатитом В+С. Следовательно, легкая форма чаще встречалась при вирусном гепатите С. 12% 6% 18% 24% 20% 7% 6% 38% 29% 40% 35% 15% 50% вирусный гепатит С вирусный гепатит В+С вирусный гепатит В наркомания шприцевой гинекологические и стоматологические манипляции половой неуточненный Рисунок 4 - Частота путей инфицирования у больных вирусными гепатитами. С наибольшей частотой среднетяжелая форма заболевания регистрировалась у больных острым вирусным гепатитом В, как в «чистом» варианте, так и в сочетании с HCV-инфекцией. Тяжелая форма чаще всего встречалась при микст-гепатите В+С (таблица 3). Таблица 3 - Распределение больных вирусными гепатитами по тяжести заболевания. Острый ГВ Форма тяжести легкая среднетяжелая тяжелая Итого Количество больных абс. 25 74 27 126 % 19,8 58,7 21,5 100 Острый ГС Количество больных абс. % 41 37,9 56 52 11 10,1 108 100 ВГВ+ВГС Количество больных абс. % 32 32 40 40 28 28 100 100 Возможное влияние сопутствующей патологии на тяжесть процесса было примерно равнозначно в исследуемых группах (таблица 4). Сопутствующие 71 заболевания внутренних органов встречались при остром ГВ в 32,5%, при ВГСв 34,3% и при микт-инфекции- в 21% случаев. Таблица 4 - Сопутствующие вирусным гепатитам заболевания внутренних органов. Нозологические формы Острый ГВ Острый ГС ВГВ+ВГС Количество больных, % Нет 67,5 65,7 Заболевания органов дыхания Бронхиальная астма Туберкулез легких 1,6 79 0,9 0,8 Болезни сердечно-сосудистой системы Гипертоническая болезнь Ишемическая болезнь сердца 0,8 2,7 3 2,7 3 Болезни органов пищеварения Язвенная болезнь Хронический холецистит Хронический панкреатит 4,8 1,8 3 7,9 12,9 8 1,6 3,7 Заболевания мочевыводящей системы Хронический пиелонефрит Сахарный диабет Итого 11,9 8,3 4 3,1 100 1,3 100 100 Преобладание среди заболевших лиц молодого возраста во многом определяло структуру сопутствующей патологии, которая не имела принципиальных различий в представленных клинических группах. Болезни сердечно-сосудистой системы диагностировались в единичных случаях (2,73%), а ведущей являлась гастроэнтерологическая 72 патология, которая встречалась при ВГВ в 14,3%, ВГС- в 18,4% и при микст-гепатите- в 11% случаев, а также патология почек: хронический пиелонефрит встречался у 11,9% больных вирусным гепатитом В, 8,3% вирусным гепатитом С и у 4% больных микст-гепатитом В+С. Анализ преджелтушного периода различных типов ВГ выявил следующие различия между ними. При вирусных гепатитах чаще встречался короткий преджелтушный период: при остром вирусном гепатите В (76%), при вирусном гепатит С (51%) и микст-гепатите В+С (55%). Длительность преджелтушного периода от 8 до 14 дней чаще наблюдалась при вирусном гепатите С и сочетанном гепатите (36% и 25% соответственно), чем при остром вирусном гепатите В (16%). Достаточно редко продолжительность преджелтушного периода превышала две недели при всех исследованных формах вирусного гепатита (по 4% при ВГВ, 7% при ВГС и 8% при ВГВ+ВГС). Чаще преджелтушный период отсутствовал при вирусном гепатите С и сочетанном варианте вирусного гепатита (6% и 12% соответственно), тогда как при вирусном гепатите В только в 4% случаев. Средняя продолжительность изучаемого периода при сочетанном гепатите (6±0,2, Р<0,001) достоверно превышала аналогичные показатели при вирусном гепатите В (5±0,2) и вирусном гепатите С (5±0,2). Достоверной разницы между длительность преджелтушного периода у больных острым вирусным гепатитом В и С получено не было (Р>0,05) (таблица 5). Таблица 5 - Распределение больных вирусными гепатитами по длительности преджелтушного периода. Тип вирусного гепатита Длительность преджелтушного периода Отсутствуе 1-7 дней 8-14 дней 15 и более Средний т показатель абс. % абс. % абс. % абс. % Xm Острый ГВ 5 4 96 76 20 16 5 4 50,2 Острый ГС 7 6 55 51 39 36 7 7 50,2 Острый 12 12 55 55 25 25 8 8 60,2 ГВ+ ГС 73 Выделение ведущего синдрома преджелтушного периода при различных типах ВГ во многих случаях представляло значительные трудности. Такие симптомы диспепсического и астено-вегетативного синдромов, как общая слабость, снижение аппетита, головная боль встречались достаточно часто при всех представленных типах вирусных гепатитов, причем в различных сочетаниях. Примерно с одинаковой частотой у больных регистрировался диспепсический вариант преджелтушного периода: у больных вирусным гепатитом В и В+ С по 35%, и у больных вирусным гепатитом С- в 34% случаев. Артралгический вариант чаще встречался при остром вирусном гепатите В (23%) по сравнению с вирусным гепатитом С и микст-гепатитом В+С (10% и 9% соответственно). Астено-вегетативный вариант чаще встречался при при вирусном гепатите С (25%), в отличие от ВГВ (9%) и сочетанного гепатита (10%). Гриппоподобный вариант преджелтушного периода наблюдался с одинаковой частотой у обследуемых групп. Смешанный вариант наблюдался реже у больных вирусным гепатитом С (17%) (таблица 6). Таблица 6 - Распределение вариантов преджелтушного периода у больных вирусными гепатитами. Синдромы Острый ГВ Острый ГС ВГВ+ВГС Количество больных, % Диспепсический 35 34 35 Артралгический 23 10 9 9 25 10 Гриппоподобный 8 8 8 Смешанный 21 17 26 Отсутствует 4 6 12 100 100 100 Астеновегетативный Итого 74 Ухудшение самочувствия после появления желтухи отмечали у себя 76% больных острым вирусным гепатитом В и 91% сочетанным гепатитом В+С, что намного превышало этот показатель у больных вирусным гепатитом С (50%). В то время как почти у трети больных вирусным гепатитом С (29%) с появлением желтухи самочувствие хотя и незначительно, но улучшалось и этот показатель был значительно выше, чем у больных острым гепатитом В и микст-гепатитом (3% и 2% соответственно), у остальных больных самочувствие после появления желтухи не изменялось. В разгар заболевания желтуха являлась наиболее типичным признаком вирусных гепатитов и ее интенсивность, как правило, соответствовала тяжести болезни. Средняя продолжительность желтушного периода при остром вирусном гепатите В и гепатите-микст превышала аналогичный показатель при вирусном гепатите С. Средняя продолжительность желтушного периода в легких случаях была достоверно короче, чем при других степенях тяжести. Представленные материалы относительно продолжительности желтушного периода при вирусных гепатитах требуют коррекции, так как в определенном проценте случаев больные покидали стационар самовольно или выписывались за грубые нарушения больничного режима, иногда до нормализации лабораторных показателей, в том числе уровня общего билирубина в сыворотке крови. Чаще всего это были лица больные наркоманией или употребляющие наркотики. Статистической же обработке подверглись случаи только с достоверно установленными сроками желтушного периода. А так как относительное число больных в представленных группах, досрочно покинувших стационар, было примерно на одном уровне, то установленный нами факт меньшей продолжительности желтушного периода у больных вирусным гепатитом С в сравнении с моно- и микстинфекцией острого гепатита В можно считать доказанным (таблица 7). Симптомы диспепсического и астенического характера (общая слабость, снижение аппетита, тошнота, головная боль) оставались ведущими в желтушный период заболевания, и частота их регистрации во многих случаях 75 не отличалась в сравниваемых группах. Однако имелись и определенные различия. Так, при моно инфекции вирусом В, а также при его сочетанной форме, чаще регистрировался такой признак интоксикации, как рвота (42% и 37% соответственно). Таблица 7 - Продолжительность желтушного периода у больных вирусными гепатитами. Форма тяжести Достоверность Продолжительность в днях, Xm Острый ГВ Острый ВГВ+ВГС ГС легкая 15,73,3 13,21,2 16,11,8 не достоверно среднетяжелая 26,41,9 20,01,6 30,91,8 1 и 2, 2 и 3 тяжелая 40,45,9 31,21,3 56,86,7 2 и3 Примечания: 1- острый ГВ; 2-Отсрый ГС; 3-ВГВ+ВГС В желтушный период больные чаще, по сравнению с предыдущим этапом заболевания, жаловались на кожный зуд. Этот симптом также характерен для острого вирусного гепатита В и и его сочетанной формы (19% и 15% соответственно), по сравнению с вирусным гепатитом С (9%). Продолжительность кожного зуда у больных с этими вариантами гепатита не превышала 7-8 дней в большинстве случаев. Экзантема у больных в виде уртикарной сыпи чаще регистрировалась у больных ГВ и микст-гепатитом (8% и 6%) против 2% у больных гепатитом С. Лихорадка в желтушный период у больных острым вирусным гепатитом В встречалась в 50% случаев, что чаще, чем в других наблюдаемых группах. Температурная реакция, возникшая впервые непосредственно в разгар желтушного периода, чаще всего являлась или симптомом сопутствующей патологии (обострение хронического холецистита, панкреатита, пиелонефрита и др.) или свидетельствовала о возможном развитии тяжелой формы заболевания. Катаральные явления 76 регистрировались примерно с одинаковой частотой в исследованных клинических группах. Увеличение лимфатических узлов- достаточно редкий признак вирусных гепатитов и определялся чаще при микст-гепатите (21%), тогда как при ГВ и С он наблюдался примерно с одинаковой частотой (6% и 8% соответственно). Спленомегалия по данным УЗИ несколько чаще наблюдалась при микст-гепатите и вирусном гепатите С (13% и 19%). Головокружение-симптом, который при вирусном гепатите является отражением энцефалопатического синдрома, чаще регистрировался при остром гепатите В в его «чистом» и сочетанном вариантах по сравнению с моноинфекцией, вызванной HCV (в 17%, 21% и 3%). Мышечно-суставные боли также являлись более характерным признаком острого гепатита В и его сочетанного варианта, по сравнению с вирусным гепатитом С. Этот симптом регистрировался в 25% случаев при ВГВ и микст-гепатите и в 6% при вирусном гепатите С. При сочетанной форме вирусного гепатита со стороны сердечнососудистой системы умеренная гипотония определялась у 31% больных, а брадикардия- у 39%. Тогда как у больных вирусным гепатитом В этот показатель соответственно равнялся 19% и 40%; у больных вирусным гепатитом С гипотония наблюдалась у 11% пациентов, а брадикардия - у 29%. Таким образом, следует отметить, что брадикардия и гипотония у больных вирусным гепатитом С отмечалась реже. На спонтанные ноющего, тупого характера боли в животе, чаще в правом подреберье и эпигастрии, жаловались большинство пациентов в исследуемых группах, причем этот признак при гепатите-микст определялся чаще, чем при вирусном гепатите В и С (79% и 64%, 52% соответственно). Характер и локализация болей свидетельствовали, прежде всего, о воспалительном отеке печени и растяжении глиссоновой капсулы. Печень выступала из-под края реберной дуги при всех исследуемых формах вирусного гепатита, примерно, с одинаковой частотой ( при ВГВ в 85% случаев, при ВГС и при микст-гепатите в 88%). При смешанной форме вирусного гепатита гепатомегалия была более значительная, чем при моноинфекциях. Так, более 3 77 см печень выступала у больных сочетанной формой гепатита в 34% случаев, значительно больше, чем при вирусном гепатите В и С (12% и 18% соответственно) (таблица 8). Таблица 8 - Основные симптомы объективного обследования печени у больных вирусными гепатитами. Показатель Боль при пальпации Острый ГВ Острый ГС Острый ГВ+ГС абс. % абс. % абс. % 81 64 56 52 79 79 Увеличение размеров относительно реберной дуги до 1 см 19 15 13 12 13 13 1-3 см 92 73 76 70 53 53 больше 3 см 15 12 19 18 34 34 Темная моча в разгар заболевания являлась почти постоянным симптомом при вирусных гепатитах, однако у наблюдаемых нами больных ВГС этот признак фиксировался только у 80% больных, тогда как у больных вирусным гепатитом В и микст-гепатитом данный признак фиксировался у 99% и 97% больных соответственно. Данный факт объяснялся более легким течением вирусного гепатита С и, следовательно, менее продолжительным нарушением пигментного обмена в печени. Об этом же свидетельствовало и более редкое обесцвечивание кала у больных вирусным гепатитом С (39%) в сравнении с аналогичными показателями у больных острым гепатитом В (52%) и гепатитом-микст (54%) (таблица 9). Если рассматривать особенности биохимических изменений у больных вирусными гепатитами, можно отметить следующие особенности. В 1-2 неделю заболевания, т.е. в периоде разгара заболевания уровень общего билирубина у больных вирусным гепатитом В достоверно выше, чем у больных 78 вирусным гепатитом С, а у больных сочетанной формой этот показатель достоверно выше, чем у больных вирусным гепатитом С и гепатитом В. Таблица 9 - Частота симптомов желтушного периода у больных вирусными гепатитами. Симптомы и синдромы Острый ГВ Острый ГС ВГВ+ВГС абс. % абс. % абс. % Слабость 124 98 105 97 100 100 Снижение аппетита Тошнота 99 78 100 93 95 95 85 67 88 81 72 72 Рвота 53 42 32 30 31 31 Лихорадка 64 50 43 39 28 28 Катаральные явления Кожный зуд 9 7 7 6 6 6 24 19 10 9 15 15 Сыпь 11 8 3 2 6 6 Мышечно-суставные боли Головная боль 32 25 7 6 25 25 45 35 27 25 37 37 Головокружен ие Гипотония 22 17 4 4 21 21 24 19 12 11 31 31 Брадикардия 51 40 32 29 39 39 Спленомегалия 10 8 14 13 19 19 Увеличение ЛУ Понос 8 6 9 8 21 21 8 8 6 5 5 5 Геморрагическ ий синдром Темная моча 16 12 12 11 12 12 125 99 87 80 97 97 Ахолия кала 66 52 53 39 54 54 79 В период угасания клинических симптомов, параллельно улучшению общего состояния больных, происходит достоверное снижение уровня общего билирубина, причем при математической обработке полученных данных в 3-4 неделю заболевания исследуемые значения остаются достоверно выше у больных сочетанной формой гепатита, чем у больных острым вирусным гепатитом В и С, у уровень билирубина у больных ГВ достоверно выше, чем у больных ГС. В периоде ранней реконвалесценции, перед выпиской больных из стационара происходит дальнейшее значительное снижение уровня билирубина, который не имеет достоверной разницы у больных в зависимости от этиологической принадлежности гепатита. Таким образом, достоверно более высокие значения уровня общего билирубина наблюдались у больных сочетанной формой вирусного гепатита В+С, а более низкие значения исследуемого показателя определялись у больных острым вирусным гепатитом С. И тот и другой факт, по литературным данным указывал на тяжесть заболевания. В первом случае- как показатель тяжелой интоксикации, во втором- как неблагоприятный прогностический признак (таблица 10). В периоде разгара заболевания, в 1-2 неделю обследования у больных вирусными гепатитами происходит повышение активности трансаминаз, причем уровень АлАТ достоверно выше у больных сочетанной формой гепатита В+С, чем у больных острым ГВ и ГС, а показатель АлАТ у больных острым вирусным гепатитом С достоверно выше, чем у больных вирусным гепатитом В. Уровень АсАТ в этом периоде достоверно выше у больных вирусным гепатитом В и сочетанной формой В+С, по сравнению с гепатитом С. В периоде угасания клинических симптомов, параллельно снижению уровня общего билирубина происходит снижение активности трансаминаз. В этот период достоверно более высокие показатели АлАТ наблюдаются у больных острым вирусным гепатитом С, тогда как у больных вирусным гепатитом В и микст-гепатитом В+С эти значения не имеют между собой достоверной разницы. Тогда как наиболее высокие показатели АсАТ определяются у больных острым вирусным гепатитом В, а у больных вирусным гепатитом С и микст-гепатитом исследуемые данные достоверной разницы не имели 80 Таблица 10 - Показатели содержания общего билирубина в сыворотке крови у больных вирусными гепатитами в динамике заболевания (ммоль/л). Период n Острый ГВ Острый ГС Острый ГВ+ГС Xm n Xmin-Xmax Xm n Xmin-Xmax Xm 99,65,2 10 5,5-281,4 825,5 99 5,5-266,6 1114 заболевания Xmin-Xmax 1-2 неделя Достовер- 12 4,4- 6 283,8 8 Р1-Р20,05 ,2 Р2-Р30,01 Р1-Р30,05 ность 3-4 неделя Достовер- 10 5,5- 8 240,8 57,13,7 Р1-Р20,001 91 5,5-166,8 35,23, 67 12,9- 81,4 3 275,2 6,4 Р2-Р30,001 Р1-Р30,001 ность 5-6 неделя 70 1,8- 30,32,2 59 2,2-58,4 192,6 Достовер- 32,03, 37 11,0-89,4 2 Р1-Р20,05 31,6 3,2 Р2-Р30,05 Р1-Р30,05 ность Примечания здесь и в таблицах 11-13: Р1-Р2- достоверность различий между показателями у больных острым вирусным гепатитом В и С; Р2-Р3- достоверность различий показателей между больными острым вирусным гепатитом С и микст-гепатитом В+С; Р1-Р3достоверность различий между показателями у больных острым вирусным гепатитом В и микст-гепатитом В+С. В периоде ранней реконвалесценции происходит дальнейшее снижение активности ферментов. На 5-6 неделе обследования больных достоверно более высокие значения активности АлАТ продолжали оставаться у больных сочетанной формой гепатита В+С. У больных вирусным гепатитом В и С этот показатель не имел различий. Та же тенденция определялась при изучении активности АсАТ. Достоверно более высокие значения были у больных микстгепатитом В+С и у больных вирусным гепатитом С. Таким образом, даже перед выпиской больных из стационара наблюдается достоверно более высокая гиперферментемия у больных моноинфекцией HCV и сочетанной формой вирусного гепатита В+С, что 81 указывает на отсутствие биохимического благополучия у этих групп больных (таблица 11). Таблица 11 - Показатели активности АлАТ и АсАТ в сыворотке крови больных вирусными гепатитами в динамике заболевания (ммоль/л/экв. х час). Тип вирусного гепатита 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 Период заболеван ия 1-2 неделя n АлАТ Xm АсАТ Xm 126 108 100 2,30,09 1,80,09 2,30,08 0,001 0,05 0,01 1,70,12 2,10,09 1,60,08 0,01 0,05 0,001 1,50,1 1,30,1 1,70,1 0,05 0,05 0,01 1,20,04 0,90,05 1,20,04 0,001 0,05 0,001 0,80,05 0,80,05 0,90,03 0,05 0,05 0,05 0,60,05 0,80,06 0,80,05 0,01 0,01 0,05 3-4 неделя 108 91 67 5-6 неделя 70 59 37 Изучая динамику изменения показателей тимоловой пробы у больных вирусными гепатитами были получены следующие данные. В периоде разгара заболевания, на 1-2 неделе обследования больных происходит повышение значений тимоловой пробы. Причем достоверно более высокие данные были у больных острым вирусным гепатитом В и сочетанной формой гепатита В+С, по сравнению с острым вирусным гепатитом С. В периоде спада желтухи, на 3-4 неделе исследования, параллельно улучшению общего самочувствия больных, снижению уровня общего билирубина и активности трансаминаз, происходит снижение значений тимоловой пробы. Причем, сохраняется та же тенденция, 82 что и в периоде разгара, т.е. достоверно более высокие значения определяются у больных моноинфекцией HBV и сочетанной формой гепатита В+С. Пред выпиской больных из стационара, на 5-6 неделе обследования больных сохраняются повышенные значения тимоловой пробы, которые не имеют достоверной разницы в исследуемых группах (таблица 12). Таблица 12 - Показатели тимоловой пробы у больных вирусными гепатитами в динамике заболевания (ед.). Тип вирусного гепатита 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 n 126 108 100 Период заболевания 1-2 неделя 108 91 67 3-4 неделя 70 59 37 5-6 неделя Тимоловая проба Xm 12,30,5 7,10,4 11,60,5 0,001 0,05 0,001 11,70,5 9,20,6 11,40,4 0,001 0,05 0,001 8,50,4 8,40,4 7,80,4 0,05 0,05 0,05 На 5-6 неделе заболевания, перед выпиской больных из стационара, нормализация протромбинового индекса происходила у всех больных вирусным гепатитом С, у 90% больных острым вирусным гепатитом В и у 77% больных гепатитом-микст В+С. Т.е. в периоде ранней реконвалесценции достоверно более низкие показатели протромбинового индекса определялись у больных сочетанной формой вирусного гепатита В+С (таблица 13). 83 Таблица 13 - Протромбиновый индекс у больных вирусными гепатитами в динамике заболевания (%). Тип вирусного гепатита 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 1. Острый ГВ 2. Острый ГС 3. Острый ГВ+ГС Р1-2 Р1-3 Р2-3 n Период заболевания 126 108 100 1-2 неделя 108 91 67 3-4 неделя 70 59 37 5-6 неделя Протромбиновый индекс Xm 680,9 711,4 661,4 0,05 0,05 0,001 681,3 691,3 611,2 0,05 0,001 0,001 720,6 730,6 681,5 0,05 0,05 0,001 Результаты определения протромбинового индекса представлены в таблице. Снижение протромбинового индекса (менее 70%) наблюдалось на 1-2 неделе заболевания у 53% больных острым вирусным гепатитом В, 36% больных острым вирусным гепатитом С и 45% пациентов с микст-гепатитом В+С. В периоде разгара заболевания наиболее низкие значения исследуемого показателя у больных сочетанной формой гепатита В+С. У больных острым вирусным гепатитом В и С показатели протромбинового индекса на 1-2 неделе заболевания достоверной разницы не имели. На 3-4 неделе заболевания острым вирусным гепатитом С и микстгепатитом В+С регистрировалось снижение значений протромбинового индекса по сравнению с предыдущим периодом. Как и в периоде разгара заболевания показатели ПТИ были достоверно более низкими у больных с 84 сочетанной формой вирусного гепатита В+С, по-сравнению, с острым вирусным гепатитом В и С. Достоверной разницы значений протромбинового индекса у больных острым вирусным гепатитом В и С получено не было. Определение белков сыворотки крови методом электрофареза на ацетатцеллюлозной пленке не выявило существенных протеинологических сдвигов у больных парентеральными гепатитами в изучаемых группах. При сравнении средних показателей содержания общего белка сыворотки крови и его важнейших фракций у больных с различными этиологическими типами вирусного гепатита достоверного уровня значимости на 1-2 и 3-4 неделях заболевания не получено. При сравнительном анализе средних показателей содержания общего холестерина и -липопротеидов в сыворотке крови существенных, диагностически значимых нарушений липидного обмена на основании этих данных не получено. Отдельные различия групповых средних показателей изучаемых тестов нельзя использовать при индивидуальной диагностике ВГ, так как в 95% случаев показатели находились в пределах одних и тех же границ. Известно, что участие в поддержании углеводного обмена относится к очень устойчивым функциям печени [231]. По нашим наблюдениям, средние показатели содержания глюкозы в крови больных не выходили за пределы нормальных величин у больных во всех представленных клинических группах, на всех этапах обследования. При этом достоверного уровня значимости при сравнении показателей у больных различными этиологическими вариантами ВГ не получено. Повышение активности щелочной фосфатазы, одного из экскреторных ферментов, обнаружено в разгар заболевания обнаружено примерно в половине случаев в каждой клинической группе: при остром ГВ в 53,4%, при вирусном ГС- в 47,8% и гепатите-микст- в 54,1% случаев. Максимальный показатель фермента при остром вирусном гепатите В составил 2900 ед/л, остром вирусном гепатите С-1800ед/л и при микст-гепатите В+С-2500 ед/л (при 85 нормальных показателях от 350 до 850 ед/л). Однако, средние показатели активности фермента у больных различными этиологическими вариантами ВГ между собой статистически были неотличимы, незначительно превышая верхнюю границу нормы в группах больных моно- и микст-инфекцией острого ГВ. Известно, что различные биохимические показатели отражают тяжетсь ВГ, однако ни один из них в отдельности не может быть использован в качестве абсолютного критерия тяжести заболевания [201]. Диагностическая значимость изученных нами биохимических тестов была равноценна при различных представленных этиологических типах ВГ, в том числе и при остром ГВ. В то же время, в классических трудах по гепатологии уже дана достаточно исчерпывающая характеристика биохимическим показателям крови при различных формах тяжести ГВ [22, 146, 231, 248]. Диагностическим критерием острого вирусного гепатита В было нахождение в сыворотке крови специфических маркеров: австралийского антигена и антител к сердцевинному антигену. Маркеры инфицирования вирусным гепатитом В (HBsAg, anti-HBcorAg IgM, anti-HBsAg, HBeAg) выявляли с помощью тест-систем 2 и 3 поколения производства фирм «Teknika» (Голландия), «Diagnostics Pasteur» (Франция) согласно инструкциям к коммерческим препаратам. Положительные результаты на наличие HBsAg устанавливали с помощью HBsAg-ИФА подтверждающих тестов (Hepanostika HBsAg Uniform II, comfirmatory). В настоящее время широкое распространение получили методы индикации IgM anti-HBcorAg как основного серологического маркера острой HBV-инфекции. Его определение позволяет дополнительно подтверждать вирусный гепатит В у 7,5-12% больных в случае отсутствия HBsAg в сыворотке крови [224]. У всех больных определялся IgM anti-HBcorAg, в то время как HBsAg идентифицировался лишь у 83% больных гепатитом В. Больные были обследованы на anti-HAV, anti-HDV и anti-HCV для исключения суперинфекции. У 12% больных IgM anti-HBcorAg определялись с anti-HBsAg. 86 Диагноз острого вирусного гепатита С (ВГС) выставлялся в соответствии с рекомендациями ведущих гепатологов на основании общепринятых критериев: наличие «точки отсчета» по данным эпидемиологического анамнеза, укладывающейся в сроки, характерные для острого гепатита; клинико-биохимический синдром острого гепатита, при отсутствии указаний на подобные заболевания в прошлом (выявление признаков нерезко выраженной желтухи: субъиктеричность склер, потемнение мочи и посветление кала, легкое пожелтение слизистых и кожи, увеличение печени и селезенки; значительное повышение АлАТ (в 5 раз и больше); индикация специфических антител к вирусу гепатита С класса cor IgM и IgG с показателями коэффициента anti-HCV IgG/IgM в пределах 3-4 УЕ при отсутствии anti-HCV NS4; обнаружение HCV-РНК в крови. Ànti-HCV cor IgM были обнаружены в ИФА с использованием тестсистем 2 и 3-го поколения «Вектор Бест» (Россия) только у 62% больных. Для подтверждения диагноза острый гепатит С у части больных проводилась полимеразная цепная реакция для обнаружения РНК-ВГС с использованием стандартизированного набора «Roche Dignostic Systems» (Франция), которая была положительна у 38% пациентов. Anti-HCV NS4 были отрицательны в исследуемой группе. Сочетанный вирусный гепатит В+С выставлялся на основании: наличие «точки отсчета» по данным эпидемиологического анамнеза, укладывающейся в сроки, характерные для острого гепатита; клинико-биохимический синдром острого гепатита, при отсутствии указаний на подобные заболевания в прошлом (выявление признаков выраженной желтухи: потемнение мочи и посветление кала, пожелтение слизистых и кожи, увеличение печени и селезенки; значительное повышение АлАТ (в 5 раз и больше); 87 индикация специфических маркеров обоих гепатитов- HBsAg, anti-HBcorAg IgM, HBeAg, anti-HBeAg, антител к вирусу гепатита С класса cor IgM и IgG с показателями коэффициента anti-HCV IgG/IgM в пределах 3-4 УЕ при отсутствии anti-HCV NS4, обнаружение HCV-РНК в крови. Инструментальное обследование предусматривало УЗИ печени, желчного пузыря, поджелудочной железы и селезенки. Для диагностики сопутствующих заболеваний применялся комплекс клинических и лабораторно- инструментальных методов исследования, который изменялся в зависимости от конкретных условий. Лечение больных осуществлялось по общепринятой схеме. Базис-терапия включала в себя диету: стол №5, комплекс витаминов в терапевтических дозах, средства нормализующие препятствующие эубиотики деятельность дисбактериозу, (бифидумбактерин, желудочно-кишечного накоплению кишечных лактобактерин, тракта, эндотоксинов- колибактерин). Больные принимали лактулозу, при необходимости- ферменты (панкреатин, мезимфорте и др.), симптоматические средства. Синдромальная терапия включала в себя купирование интоксикационного синдрома за счет включения в лечение кристаллоидных растворов: глюкозы, солевых растворов и коллоидных растворов: белковых препаратов (альбумин), факторов свертывания (свежезамороженная и антигемофильная плазма). При развитии геморрагического синдрома в лечение включали гемостатические средства (децинон, аминокапроновая кислота, викасол). Холестатический синдром купировали за счет назначения абсорбентов (холестерамин, билигнин, полифепан, энтеросгель), а также препаратов ненасыщенных жирных кислот (урсофальк, хенофальк и др.). При вирусном гепатите, осложненом вторичной бактериальной назначали антимикробные средства (ампициллин, клафоран и др.). 88 инфекцией 4.1.2 Клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика обследованных групп больных герпетической инфекцией (вирус простого герпеса -1,2 типа и цитомегаловирусная инфекция) Под наблюдением рецидивирующей находилось генитальной 70 пациентов герпес-вирусной с хронической инфекцией (ВПГ-1,2). Критериями выбора пациентов для обследования являлись: 1) наличие различной частоты рецидивов генитального герпеса – от 2 до 12 и более раз в год; 2) продолжительность генитальной герпес-вирусной инфекции более одного года; 3) обследование в фазе обострения процесса или в периоде продромы, не более 48 часов от момента появления высыпаний; 4) отсутствие приема иммуномодулирующей терапии в течение последних 3 месяцев. Диагноз ВПГ-1,2 верифицирован на основании клинической картины и данных лабораторного обследования, согласно рекомендациям 5-го международного форума (IHMF-1997) по диагностике генитального герпеса. По тяжести клинического течения ВПГ-1,2 инфекции легкая форма (1-2 рецидива в год) диагностирована у 10 пациентов (22,5 %) исследуемой группы, средняя (35 рецидива в год) - у 40 (70,83 %), тяжелая (6-12 и более рецидивов в год) - у 20(6,67 %) (таблица 14). Клиническое обследование включало: анамнез жизни и заболевания, выявление сопутствующей патологии, аллергологический анамнез, а также регулярный осмотр мест поражения. При осмотре выяснялись жалобы пациента (зуд, жжение, общее состояние, температура, миалгия и др.), оценивалось состояние кожных покровов и слизистых (наличие везикулезных элементов, изъязвлений, эпителизации, отечности, гиперемии). Длительность генитальной герпес-вирусной инфекции у всех больных, включенных в исследование, составила в среднем 4,0±2,5 года. У 7,5% пациентов длительность заболевания 89 не превышала 1,5 года, около 40% пациентов страдали заболеванием от 1,5 до 3-х лет, у 21,6% – генитальный герпес наблюдался от 3 до 5 лет, у 19,4% – от 5 до 8 лет, а 12,5% пациентов – более 8 лет. Таблица 14 - Характеристика по полу и возрасту пациентов с герпетической инфекцией. Группа ВПГ-1,2 1 ВПГ-1,2 2 ВПГ-1,2 3 ЦМВИ Количество рецидивов в год Количество пациентов Возраст Пол 1-2 10 23-49 М 7 Ж 14 3-5 40 20-48 15 27 6 и более 20 24-48 17 30 - 40 22-42 11 29 По локализации у 50,7% пациентов высыпания возникали только в области гениталий, у 15,3% женщин и 21% мужчин наблюдалось экстрагенитальное поражение с очагами в области ягодиц, параанальной, лобковой области и внутренней поверхности бедер. Смешанное поражение (генитальная и экстрагенитальная локализация) выявлено у 34,0% женщин и 12% мужчин. Провоцирующими рецидивы факторами являлись взаимосвязь с менструальным циклом у женщин, стресс, переутомление, переохлаждение. Анализ ранее проводимой терапии у обследуемых пациентов показал, что около 38% пациентов использовали только местную терапию (мазь с ацикловиром, растворы антисептиков). Около 50% пациентов использовали ациклические нуклеозиды, в 55% раннее проводилась комплексная терапия с подключением ациклических нуклеозидов и иммуномодуляторов (препараты интерферонов, индукторы интерферонов). Также наблюдалось 40 человек с диагностированной цитомегаловирусной (ЦМВИ) инфекцией, из них 29 женщин и 11 мужчин. Цитомегаловирусная инфекция лабораторно была подтверждена с помощью 90 РИФ у 19% больных, ПЦР — у 65% пациентов, методом иммуноблотинга антитела класса М к специфическим и высокоспецифическим белкам выявлены в 18% случаях, антитела класса G — в 34% случаях, с помощью ИФА антитела класса М выявлены у 10 (25%) человек. Средний титр антител класса IgM составил 1/275, минимальный — 1/100, максимальный — 1/800). Антитела класса IgG выявлены в 24 (60%) случаях (средний титр антител составил 1/3586, минимальный — 1/100, максимальный — 1/12800). ЦМВ инфекция в основном была выявлена при клинико-лабораторном обследовании при выявлении причин бесплодия (25%) и привычного невынашивания беременности (20%), 5% пациентов имели жалобы на частые рецидивирующие респираторные инфекции (от 4 до 8 раз в год). Помимо пациентов с герпетической инфекцией под наблюдением находились больные с папилломавирусной инфекцией (ВПЧ) (таблица 15). Таблица 15 - Характеристика по полу и возрасту пациентов с ВПЧ инфекцией. Группа пациентов С ВПЧ высокого онкогенного риска С ВПЧ низкого онкогенного риска Всего Количество пациентов Пол Возраст, лет 54 М 5 Ж 49 19-42 42 11 29 21-44 96 16 78 - У всех пациентов ВПЧ-инфекция подтверждалась ПЦР-анализом. Цитологические изменения при кольпоскопии у женщин с ВПЧ высокого онкогенного риска (койлоцитарная атипия, наличие в мазках двухъядерных и многоядерных клеток, амфофилия цитоплазмы и пр.) были обнаружены у 48 пациенток (50 %). При расширенной кольпоскопии изменения, характерные для папилломавирусной инфекции, были 91 выявлены и подтверждены гистологическим методом у 68 женщин (100 %), причём у 18 (31 %) обследуемых присутствовали признаки дисплазии слабой степени, а у двух (3%) – дисплазии воспалительный умеренной тип мазка. степени. При ВПЧ У всех низкого обследованных онкогенного был риска цитологические изменения при кольпоскопии не зарегистрированы. В 45% случаев клиническим проявлением ВПЧ высокого онкогенного риска инфекции являлись остроконечные кондиломы (папилломы), представляющие собой бородавчатые разрастания на короткой ножке. Папилломы располагались в виде скоплений в 14% и в 31% в виде единичных образований. Чаще всего остроконечные кондиломы располагались в области входа во влагалище, на больших и малых половых губах, реже - на шейке матки, а также на промежности и вокруг заднепроходного отверстия. В 5% случаев проявлением ВПЧ инфекции высокого онкогенного риска являлись папиллярные кондиломы, которые представляли собой гладкие бородавки, располагающиеся в области входа во влагалище, на больших и малых половых губах у женщин, в параанальной области у мужчин. Субклиническая форма ВПЧ-инфекции высокого онкогенного риска проявлялась в виде плоских кондилом в 14% сучаев. Плоские кондиломы располагались на шейке матки и реже - во влагалище в виде единичных (4%) или множественных разрастаний (10%). Субъективных жалоб пациенты с субклинической формой ВПЧ не предъявляли. При латентной форме ВПЧинфекции не имелось клинических проявлений. Анализ ранее проводимой терапии у обследуемых пациентов показал, что около 48% пациентам комплексной терапии не проводилось. Около 50% пациентов использовали иммуномодуляторы (препараты интерферонов, индукторы интерферонов). Оценку содержания сывороточного растворимого Fas-рецептора (sFas), TRAIL и ФНО-α проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (см.ниже). Все пробы исследовались в динамике (в течение 30 дней): с момента поступления в стационар (или рецидива инфекции) и спустя месяц после проводимой комплексной терапии. 92 В группу контроля вошли 30 здоровых доноров, не имеющих антител к ВПГ-1, ВПГ-2 и ЦМВ в сыворотке крови и не содержащих ДНК ВПГ, ЦМВ и других инфекций, передающихся половым путем, в половом тракте. 4.2 Лабораторные методы исследования Показатели апоптоза измерялись в следующих биологических материалах: сыворотка крови, уретральное и вагинальное отделяемое. 4.2.1 Метод определения sFAS Для определения использовались 96 луночные тест-системы Bender MedSystems. Определение растворимого sFAS проводили по следующим образом: 1. .Промывали ячейки планшета дважды Промывочным буфером. 2. Добавляли по 100 мкл Разбавителя образцов в ячейки, предназначенные для Стандартов. 3. Вносили по 100 мкл Разбавителя образцов в ячейки «Бланк». 4. Вносили по 90 мкл Разбавителя образцов в ячейки, предназначенные для образцов. 5. Вносили по 10 мкл каждого образца в дублях в соответствующие ячейки. 6. Приготовили стандартные разведения добавлением 100 мкл разбавленного Стандарта sAPO-1/Fas в ячейки А1 и А2, создавая разведения стандарта sAPO-1/Fas в диапазоне от 1000 до 16 пг/мл переносом по 100 мкл из ячейки в ячейку. Удалили и выбросили 100 мкл жидкости из последних ячеек (G1, G2). 93 7. Приготовили биотиновый конъюгат. Добавили по 50 мкл разбавленного биотинового конъюгата, готового для использования, во все ячейки, включая Бланк. 8. Закрыли планшет плёнкой и инкубировали 1 час при температуре 37ºС. 9. Приготовили стрептавидиновый конъюгат. 10.Полностью удалили содержимое ячеек и промыли ячейки 4 раза Промывочным буфером. 11.Вносили по 100 мкл стрептавидинового конъюгата во все ячейки. Закрыли планшет плёнкой и инкубировали 1 час при температуре 37ºС. 12.Приготовили использования. Субстратный раствор за несколько минут до Полностью удалили содержимое ячеек и промыли ячейки 4 раза Промывочным буфером. Внесли по 100 мкл Субстратного раствора во все ячейки, включая Бланк. Инкубировали при комнатной температуре 15 минут (18°- 25°C). Добавили по 100 мкл стоп-раствора во все ячейки, включая Бланк. Определили оптическую плотность ячеек при 450 нм против «Бланка» при длине волны сравнения 610-650 нм. 4.2.2 Ход определения содержания TRAIL-связанного апоптоз индуцирующего лиганда А. Приготовление и разбавление стандартов 1. Восстанавливающий стандарт (3000 пкг/мл) соединить со стандартным разбавливающим буфером. Перемешать и оставить на 10 минут. Использовать не позже 1 часа после приготовления. 2. Добавить 300 мкл стандартного разбавляющего буфера в каждую из 6 ячеек, обозначенных 1500; 750; 375; 187,5; 93,7; 46,8 пкг/м TRAIL. 94 3. Сделать серийные разведения, как описано выше. В. Разбавление и хранение стрептавидин-hrp Нужно иметь ввиду, что 100 кратный стрептавидин-hpr разбавляется в 50% растворе глицерола и это вязкий раствор. Для того, чтобы сделать точные разбавления, довести раствор до комнатной температуры. Осторожно перемешать и пипетировать стрептавидин-hpr медленно. Убирать излишек раствора с помощью фльтровальной бумаги. 1. Растворить 10 мкл 100 кратного стрептавидина-hpr в 1 мл растворителя стрептавидин-hpr для каждого стрипа. Отметьте рабочее разведение. 2. Неиспользованный раствор хранить в холодильнике. С. Разбавление промывающего буфера Довести 25 кратный раствор до комнатной температуры и хорошо перемешать. Добавить к 1 объему 24 дистиллированной воды. Рабочий раствор можно хранить в холодильнике 14 дней. ПРОВЕДЕНИЕ ПРОЦЕДУРЫ И ПОДСЧЕТ 1. Сыворотку или плазму разбавляют 1-2 стандартным разбавляющим буфером 2. Добавить 100 мкл стандартного разбавляющего буфера в нулевую ячейку 3. Добавить 100 мкл стандартов или проб в соответствующие ячейки 4. Накрыть и оставить в инкубаторе 2 часа при комнатной температуре 5. отмыть 4 раза 6. добавить 100 мкл биотинилированного анти TRAIL 7. инкубировать 1 час при комнатной температуре 8. промыть 4 раза 9. добавить 100 мкл стрептавидин-hpr 95 10. 30 минут инкубировать при комнатной температуре 11. промыть 4 раза 12. добавить 100 мкл стабилизирующего хромогена. Жидкость в ячейках начнет синеть 13. 30 минут инкубировать при комнатной температуре в темном месте 14. добавить 100 мкл стоп-раствора в каждую ячейку 15. подсчитать оптическую плотность при длине волны 450 нм 4.2.3 Определение фактора некроза опухоли α(ФНОα) в сыворотке крови Для изучения содержания ФНОα использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа («Протеиновый контур», Спб, Россия). Таблица 16 - Показатели сывороточных маркеров апоптоза в группе здоровых доноров, (пкг/мл). Сывороточные показатели апоптоза Показатели контрольной группы ФНО α 18,0±2,0 sFas 1250,5 ± 135,5 TRAIL 199,0±5,3 Исследуемый образец (сыворотка, раневое отделяемое) в количестве 50 мкл вносили в 50 мкл инкубационного буфера и выдерживали при комнатной температуре 2часа. Затем удаляли содержимое ячеек и промывали 4 раза. Добавляли биотинилированный конъюгат в объеме 100мкл и инкубировали 2 часа при комнатной температуре. После четырехкратного промывания добавляли 100мкл стрептавидинового конъюгата и спустя 30 минут 100мкл хромогенного раствора. После 30 минутной инкубации добавляли 100мкл стоп-раствора и считывали оптическую плотность при 450нм. 96 Для сопоставления показателей пациентов с данными маркеров апоптоза у здоровых людей провели исследование 15 доноров (таблица 16) У пациентов с герпетической и папилломавирусной инфекций помимо показателей сыворотки крови измерялист показатели вагинального отделяемого (у женщин) и уретры (у мужчин). В связи сэтим были изучены маркеры апоптоза в этих биологических жидкостях у доноров (таблица 17). Таблица 17 - Показатели маркеров апоптоза в вагинальном и уретральном отделяемом в группе здоровых доноров (пкг/мл). Показатели апоптоза ФНО α sFas TRAIL Биологический Показатели контрольной материал группы вагинальный секрет 13,0±2,0 уретральный секрет 15,0±2,0 вагинальный секрет 1000,5 ± 150,5 уретральный секрет 1300,5 ± 100,5 вагинальный секрет 145,0±25,0 уретральный секрет 160,0±15,0 Статистическая обработка полученных результатов При математической обработке результатов исследований были использованы следующие методы: расчет средних значений и доверительный интервал, рассчитанные по данным n измерений. Доверительный интервал оценивали с использованием Статистическую обработку и критерия расчет Стъюдента корреляционного проводили с использованием программы Microsoft Excel. 97 для р<0.05. коэффициента Глава 5 Результаты исследований 5.1 Cывороточные показатели апоптоза при парентеральных гепатита Исследование содержания в сыворотке крови расворимых мембранных маркеров апоптоза — растворимого FAS лиганда (sFASL), индуцирующего апоптоз TNF-зависимого лиганда для рецепторов DR4 и DR5 TRAIL и концентрацию фактора некроза опухоли-α осуществляли посредством иммуноферментного энзим-связанного иммуносорбентного анализа (enzymlinked immunosorbent assay — ELISA) c использованием коммерческих наборов Для оценки ФНО- индуцированного апоптоза в крови у больных вирусными гепатитами был изучен уровень растворимого FAS лиганда, позволяющий оценить активность апоптоза в исследуемых группах. В динамике заболевания вирусными гепатитами обследовано 155 больных хроническими вирусными гепатитами. Из них – 76 больных с хроническим вирусным гепатитом В, 37 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С и 38 – с хроническим вирусным гепатитом – mixt. Обследование проводилось в разгар клинических проявлений, при поступлении в стационар и через зо дней после начала стационарного лечения. В качестве контрольной группы было обследовано 15 практически здоровых людей, являющихся донорами республиканской станции переливания крови. При изучении ФНО-индуцированного пути апоптоза у больных вирусным гепатитом В были выявлены следующие закономерности. При поступлении в стационар, когда максимально выраженными были симптомы интоксикации, иногда - желтуха и, соответственно, биохимические показатели цитолитического, мезинхимально-воспалительного и холестатического синдромов, у больных из данной группы отмечалось существенное повышение концентрации исследуемого фактора. В периоде купирования клинических и 98 биохимических изменений, на 30-е сутки после поступления показатели FASL достоверно снижались, но не приходили в норму. У больных хроническим вирусным однонаправленные изменения концентрации гепатитом С отмечались FASL, как и у больных хроническим вирусным гепатитом В. При поступлении в стационар, когда у больных отмечается интоксикация и соответственно изменения биохимических показателей было выявлено закономерное повышение содержания FASL в сыворотке крови. В периоде купирования клинических и биохимических изменений показатели FAS лиганда достоверно снизились, но не приходили в норму. Из таблицы 18 видно, что изменения содержания FASL связаны с этиологической структурой гепатитов. При гепатите С выявляется достоверно более высокая концентрация изучаемого показателя по сравнению с данными при остром вирусном гепатите В и у больных mixt-гепатитом. Причем стоит отметить, что даже через 30 дней изучаемый показатель в группе больных ХГС – самый высокий в представленных группах. При изучении концентрации ФНО в плазме крови были получены сопоставимые с показателями FASL результаты. Имеет место достоверное повышение концентрации интерлейкина во всех периодах обследования в трех представленных группах. Однако, в отличие от данных по FASL, наиболее высокие результаты ФНО в сыворотке крови наблюдались в группе больных с хроническим вирусным гепатитом В, достоверно отличающиеся от показателей в группе с ХВГС и mixt-гепатитами. Такой результат, по-видимому, является следствием выраженности некровоспалительных процессов у больных ХВГВ. При изучении концентрации еще одного растворимого лиганда из группы ФНО-индуцирующих апоптоз – TRAIL были получены следующие данные. В отличие от полученных повышенных показателей FASL и ФНО в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами, для показателей TRAIL имелась противоположная тенденция. Во всех периодах обследования в представленных группах пациентов имело место достоверное снижение 99 концентрации исследуемого фактора. Причем, следует отметить, что самые низкие значения из представленных регистрировались в группе больных с хроническим вирусным гепатитом С, в отличие от группы пациентов с хроническим вирусным гепатитом В и хроническими mixt-гепатитами. Таблица 18 - Показатели содержания ФНО-α, sFas и TRAIL в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами, (пкг/мл). группа пациентов вирусные гепатиты показатель ХВГВ ХВГС ХВГmixt здоровые доноры (n=15) ФНО α (n=30; 17) sFas (n=46; 22) TRAIL (n=29;18) ФНО α (n=20;14) sFas (n=20;15) TRAIL (n=15;11) ФНО α (n=27;19) sFas (n=25;17) TRAIL (n=15;12) ФНО α sFas TRAIL При поступлении в стационар 55,0±1,61,3 Через 30 суток 1739,0±64,71,3 1652,0±123,51,3 119±13,01,3 107±16,21 41,0±3,31 35,0±1,21 2366,0±85,71 2317±74,61 55±19,61 78±22,41 48±1,91 49±3,61,3 2177±73,31 1488±154,41,2,3 112±21,71 105±24,31 18,0±2,0 1250.5 ± 135.5 199±5,3 - 64,0±2,11,2,3 Примечания к таблице: 1 - достоверность различий по отношению к показателям доноров, р<0,001; 2- достоверность различий по отношению к показателям предыдущего периода, р<0,001, 3достоверность различий к показателям у больных ХВГС, р<0,001 Следует отметить, что при исследовании сывороточных маркеров апоптоза у всех групп пациентов с хроническими вирусными гепатитами нет достоверной разницы представленных показателей в зависимости от периодов 100 обследования. То есть имеет место монотонная тенденция и при обострении воспалительного процесса и после полученного симптоматического лечения. Интересные данные были получены при исследовании сывороточных маркеров апоптоза в зависимости от степени биохимической активности в исследуемых группах пациентов с хроническими вирусными гепатитами. Наиболее выраженные изменения изучаемых показателей были получены в группе с высокой степенью биохимической активности (таблица 19). Наблюдалась та же тенденция, что и при анализе группы пациентов в общих группах. Достоверно более высокие показатели концентрации sFAS были получены во всех периодах заболевания у больных с хроническим вирусным гепатитом С с умеренной и высокой степенью биохимической активности, по сравнению с группами больных с хроническим вирусным гепатитом В и mixtгепатитами. С другой стороны, у этой группы больных были получены достоверно более низкие показатели растворимого TRAIL при всех вариантах биохимической активности. Как и в таблице 18, наиболее высокие показатели концентрации ФНО-α были выявлены в группе больных с хроническим вирусным гепатитом В, по сравнению с данными у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С и mixt-гепатитами при всех степенях биохимической активности. Таблица 19 - Показатели содержания ФНО-α, sFas и TRAIL в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами в зависимости от степени биохимической активности (пкг/мл). группа пациентов показатель При Через 30 суток поступлении в стационар вирусные ХВГВ ФНО α (n=8; 7) 37,0±2,21,3,4 44,0±1,71,3,4 гепатиты миним. sFas 1535,0±85,33 1484,0±111,5 степени (n=8; 8) активности TRAIL 151±17,01,3 131±15,41 101 (n=7;7) ХВГС ФНО α миним. (n=13;11) степени sFas активности (n=12;13) TRAIL 26,0±2,31,4 31,0±1,91 1921,0±65,71,4 1746,0±71,31,4 72±21,41 94±18,21 42±1,61,3 44±2,71,3 1815,0±76,31,4 1380,0±123,12,3,4 134±31,51,3 125±31,31 52±0,91,3 61±0,71,3 1723,0±42,31,3 1592±36,21,3 132±2,61,3 109±3,21,2,3 (n=13;11) ХВГ-mixt ФНО α миним. (n=11;10) степени sFas активности (n=11;11) TRAIL (n=9;10) ХВГВ ФНО α (n=49; умерен. 47) степени sFas активности (n=48; 38) TRAIL (n=47;37) ХВГС ФНО α (n=9; 7) 40±4,31 38±5,21 умерен. sFas 2268,0±76,81 2367,0±74,91 степени (n=8; 8) активности TRAIL 54±5,91 79±4,61,2 (n=9;7) ХВГ-mixt ФНО α (n=10; 7) 49±3,91 50±4,21,3 умерен. sFas 2023,0±62,11,3 1495,0±68,72,3 степени (n=9; 8) активности TRAIL 109±33,61,3 103±36,71,3 63±1,31,3,4 78±1,51,2,3,4 1874,0±64,11,3 1795±56,91,3,4 (n=10;7) ХВГВ ФНО α (n=19; высокой 17) степени sFas 102 активности (n=18; 17) 102±4,71,3,4 92±5,41,3,4 56±1,71,4 32±2,71,2 2512,0±62,41 2722,0±69,41,2,4 45±3,21,4 63±2,81,2,4 62±2,11,3,4 58±2,81,3 2179,0±58,61,3 1659,0±62,11,2,3 98±5,81,3 88±4,71,3 здоровые доноры 18,0±2,0 - (n=15) 1250.5 ± 135.5 - 199±5,3 - TRAIL (n=17;19) ХВГС ФНО α (n=15; высокой 13) степени sFas активности (n=14; 12) TRAIL (n=15;11) ХВГ-mixt ФНО α (n=17; высокой 15) степени sFas активности (n=16; 15) TRAIL (n=17;14) Примечания к таблице: 1 - достоверность различий по отношению к показателям доноров, р<0,001; 2- достоверность различий по отношению к показателям предыдущего периода, р<0,001, 3достоверность различий к показателям у больных ХВГС, р<0,001; 4- достоверность различий по отношению к показателям с умеренной степенью биохимической активности в каждой группе. 5.2 Показатели апоптоза при герпетической и папилломавирусной инфекциях 5.2.1 Cывороточные показатели апоптоза при герпетической и папилломавирусной инфекциях Нарушение реализации апоптоза является также основой формирования хронических инфекционных процессов, в том числе и вирусной природы 103 Внедрение вируса в клетку макроорганизма — это, прежде всего, «сигнал тревоги», активизирующий врожденные механизмы, направленные на элиминацию инфектогена, среди которых ключевую роль играет гибель инфицированных клеток. Участие апоптоза в удалении вируссодержащих клеток имеет важное биологическое значение, поскольку фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического материала в другие интактные клетки. Показано, что при вирусных инфекциях сосуществуют факторы, индуцирующие и ингибирующие программированную клеточную смерть. Вирусная интервенция индуцирует активацию элиминирующих защитных реакций организма, биологическим смыслом которых является удаление вируса и зараженных им клеток как генетически чужеродного объекта. Иммунный ответ против внутриклеточных вирусов связан с активацией цитотоксических Тлимфоцитов, распознающих инфицированные клетки по представленным вирусным пептидам и убивающих их, индуцируя цитолиз или апоптоз. В интересах вируса — подавить апоптоз и сохранить жизнеспособность клетки. Таким образом, исход инфекционного процесса связывают с результатом противостояния антиапоптотической способности вирусов и активации физиологической гибели инфицированной клетки как части защитного механизма организма. Ответственным за нарушение генетического контроля клеточного цикла может стать интеграция вирусного генома в геном клеткимишени. Подобными свойствами обладают ДНК-содержащие, к которым относятся в том числе герпесвирусы, вирус папилломы человека. Существует несколько механизмов запуска апоптоза в том числе через рецепторы к иммуноцитокинам (ФНО-α) и через специфические рецепторы «смерти». Рецепторы трансмембранные cмерти (death гликопротеиды, receptors) которые, представляют собой взаимодействуя со специфическими лигандами, передают апоптотический сигнал в клетку и вызывают активацию каспаз. Fas способен запускать в клетке апоптоз при взаимодействии с Fas-лигандом (FasL). Представляя собой трансмембранный белок, FasL может существовать и 104 в растворимой форме (sFasL), отщепляющейся от мембранного Fas (mFasL) с помощью металлопротеиназы. Как представлено на рисунке 5 при ВПГ 1,2- инфекции отмечалось повышение уровня sFasl в момент рецидива при: легкой степени на 42%, средней степени тяжести на 35%, тяжёлой степени на 26%. «Растворимый sFas в сыворотке крови пациентов с герпетической инфекцией» 2500 ПкГ/мл 2000 1500 ВПГ 1,2 в момент рецидива 1000 через 30 суток 500 0 ВПГ легкая степень ВПГ средняя степень ВПГ тяжелая степень ЦМВИ доноры Рисунок 5 –Растворимый sFas в сыворотке крови пациентов с герпетической инфекцией. Через 30 суток, на фоне проводимой терапии, уровень sFasl значительно снизился, но превышал уровень контрольной группы (р<0,01). При ЦМВИ в момент рецидива значение sFasl на 75% выше уровня контрольной группы и сохраняет свой уровень повышенным на 15% через 30 суток с момента лечения (р<0,01). Таким образом, при различных типах герпетической инфекции активируется способность организма элиминировать вирус. В тоже время способность в апоптозу при тяжелых формах ВПГ-1,2 инфекции меньше, чем при более легких формах (средней и легкой степени тяжести). Для папилломавирусов доказана их способность индуцировать образование неопластических процессов у человека. На основании этой способности их 105 принято подразделять на разновидности низкого (3,6,11,13,32,34 тип), среднего (30,35,45,52,53) и высокого (16,18,31,33,39,50,59) онкогенного риска. В последнее время с раком цервикального канала шейки матки связывают около 20 типов ВПЧ. Наиболее часто среди них выявляются ВПЧ-16 и 18 типов. Обращают на себя внимание данные, полученные при исследовании сыворотки крови пациентов ВПЧ с разной степенью онкогенного риска. Так, при ВПЧ16,18 типа sFasl в момент рецидива снижен на 22% по сравнению с донорской группой (рисунок 6) . «Растворимый sFas в сыворотке крови пациентов с папиломавирусной инфекцией» ПкГ/мл 1600 1400 1200 1000 ВПЧ в момент рецидива через 30 суток 800 600 400 200 0 ВПЧ 16,18 ВПЧ 10,13 доноры Рисунок 6 – Растворимый sFas в сыворотке крови пациетов с папиломавирусной инфекцией. Через 30 суток с момента лечения изменений не отмечалось. Сниженное количество sFas приводит к уменьшению возможности клетки запустить апоптоз и, таким образом, увеличению «живучести» интрегративных вирусов. Возможно, одним из механизмов антиапоптической активности является описанная в литературе способность папилломавирусов взаимодействать с геном р53 и подавлять транскрипционную активность белков, входящих в состав Fas. В случае инфицирования ВПЧ низкого онкогенного риска (10,13 106 типы) на фоне комплексной терапии (на 30 сутки) уровень sFas приближался к норме(рисунок 7). «Фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) в сыворотке крови пациентов с герпетической инфекцией» 60 ПкГ/мл 50 40 30 ВПГ 1,2 в момент рецидива 20 через 30 суток 10 0 ВПГ легкая степень ВПГ средняя степень ВПГ тяжелая степень ЦМВИ доноры Рисунок 7 – Фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) в сыворотке крови пациетнов с герпетической инфекцией. TRAIL (Apo2L) (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), это лиганд DR3 и DR5 [Reed J.C., 2002]. Так же как и CD95L, Apo2L запускает быстрый апоптоз во многих злокачественных линиях клеток [Bodmer J.2004 , Huang X., 2002 , Norris J.S., 2001]. В случае хронических вирусных инфекций с высоким онкогенным риском роль TRAIL и участие этого рецепторного пути в активации апоптоза не ясно. 107 «Фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) в сыворотке крови пациентов с папиломавирусной инфекцией» 45 ПкГ/мл 40 35 30 25 ВПЧ в момент рецидива 20 через 30 суток 15 10 5 0 ВПЧ 16,18 типа ВПЧ 10,13 типа доноры Рисунок 8 – Фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) в сыворотке крови пациентов с папиломовирусной инфекцией. Сывороточные концентрации TRAIL в изученных группах пациентов оказались близки к нормальным значениям лишь в группе больных с ВПЧ низкого онкогенного риска и в группе пациентов с ВПГ-1,2 легкой степенью тяжести и ЦМВИ. Обращают на себя внимание выявленная тенденция к снижению TRAIL в сыворотке крови в случаях с более тяжелым течением инфекционного процесса (таблица 20). Резко сниженные показатели у пациентов с ВПЧ высокого онкогенного риска приводят к заключению о том, что отсутствие TRAIL-рецепторного апоптоза может быть одной из причин онкогенеза. Другими Известно, что регуляторами фактор процессов некроза апоптоза опухолей являются (ФНО) цитокины. продуцируется активированными макрофагами и Т-лимфоцитами в ответ на антигенную стимуляцию. Действие ФНО на клетку неоднозначно. На одни клетки основным эффектом ФНО является активация транскрипционных факторов NF108 kB и JNK (C-JUN NH2-terminal kinase), ведущих к индукции провоспалительных и иммуномодулирующих генов. В других клетках активация ФНО ведет к запуску программированной клеточной гибели. Таблица 20 - Показатели содержания TRAIL в сыворотке крови у больных хроническими герпетическими и папилломавирусными инфекциями, (пкг/мл). группа пациентов ВПГ-1,2 189,5±13,0 157,5±16,01,2 2 154,5±13,01 105,0±9,21,2 3 129,0±13,01 100,0±6,01,2 179,5±10,0 180,5±15,0 90,0±16,01 60,0±10,01 180,0±14,0 190,0±15,0 199±5,3 - высокого онкогенного риска низкого онкогенного риска доноры Через 30 суток 1 ЦМВИ ВПЧ при поступлении Примечания к таблице: 1 - достоверность различий по отношению к показателям доноров, р<0,001 ; 2 - достоверность различий по отношению к показателям предыдущего периода, р<0,001. Обнаружили, что при ВПГ1,2 и при ЦМВ инфекции уровень ФНО-α в момент рецидива значительно повышался, сохраняясь высоким через 30 суток с момента лечения рис.5. Значения ФНО-α коррелировали со степенью тяжести заболевания при ВПГ-1,2 типа (k-0,85). При ВПЧ высокого и низкого онкогенного риска ФНО-α повысился на 90% и 94%, соответственно, достоверного снижения ФНО-α на фоне комплексной противовирусной терапии не зарегистрировано. Таким образом, среди всех изученных групп пациентов наиболее снижена возможность организма элиминировать интегративный вирус ВПЧ с высоким онкогенным риском 16,18 типа, что выявлено по сниженному уровню 109 растворимого лиганда к sFas-рецептору и TRAIL. ФНО-α зависимые пути противовирусной защиты активированы во всех исследуемых группах больных с хроническими вирусными инфекциями, при этом уровень ФНО-α является показателем активности воспаления и коррелирует с тяжестью течения инфекционного процесса. что позволяет использовать его в качестве диагностического критерия при скрытых инфекциях. 5.2.2 Показатели апоптоза в отделямом половых органов при герпетической и папилломавирусной инфекциях Так как проявлениями герпетической и папилломавирусной нфекций являлись высыпания в генитальной области и образование кондлом (папиллом), представляло интерес изучить локальные показатели активности апоптоза у исследованных групп больных. Как и в сыворотке крови в отделяемом вагины и уретры паицентов с ВПГ-1,2 концентрации ФНОα коррелировали со степенью тяжести инфекционного процесса (таблица 21). При этом стоит отметить, что при тяжелоей форме герпетической инфекции (с количеством рецидивов до 12 и более в год) показатели ФНОα не приходят в норму, несмотря на полученную комлексную антивирусную терапию. Данные по sFas лиганду имели обратую корреляцию со степенью тяжести инфекции - количество sFas достоверно меньше в группах пациентов с более тяжелым течением инфекционного процесса (таблица 21). Полученные данные коррелирут в показателями sFas в сыворотке крови. TRAIL уничтожение – является рецепторным неоформированных клеток. лигандом, ответственным за Так герпес и как вирусы папилломавирусы являются интегративными вирусами с высоким онокгенным риском, особенно интересным было ииследовать концентрацию TRAIL местно. Было обнаружено, что количество TRAIL уменьшается при тяжелом течении 110 инфекционного процесса. Достоверное снижение количества TRAIL может служить одним из факторов риска развития канцерогенеза. При сравнительном анализе информативности различных биологических материалов – отделяемого из уретры и вагины, можно сделать вывод об одинаковой информативной ценности этих материалов для исследования. Таблица 21 - Показатели маркеров апоптоза в вагинальном и уретральном отделяемом в группе пациентов с герпетической инфекцией ВПГ-1,2 (пкг/мл). Показатели Биологический Показатели группа апоптоза материал контрольной пациентов группы ФНО α вагинальный 13,0±2,0 1 секрет 2 3 уретральный 15,0±2,0 1 секрет 2 3 sFas вагинальный 1000,5 ± 1 секрет 150,5 2 3 уретральный секрет 1300,5 ± 100,5 1 2 3 TRAIL вагинальный секрет 145,0±25,0 уретральный секрет 160,0±15,0 1 2 3 1 2 3 при Через 30 поступлении суток 19,0±2,0 33,0±2,01 50,0±5,01 17,0±2,0 25,0±3,01 65,0±7,51 1050,5 ± 150,5 950,5 ± 150,5 750,5 ± 110,51 1000,5 ± 150,5 1050,5 ± 150,01 950,5 ± 115,51 155,0±25,0 105,0±25,01 75,0±25,01 165,0±15,0 120,0±15,01 107,0±15,01 13,0±2,0 23,0±2,01,2 43,0±2,01 15,5±2,0 19,0±2,01 45,0±2,01, 2 1010,5 ± 150,5 1000,5 ± 150,5 900,5 ± 100,51 1200,5 ± 100,0 1250,5 ± 100,0 1500,5 ± 170,52 145,0±21,0 130,0±22,0 85,0±25,01 160,0±10,0 136,0±14,0 120,0±15,01 Примечания к таблице: 1 - достоверность различий по отношению к показателям доноров, р<0,001 ;2- достоверность различий по отношению к показателям предыдущего периода, р<0,001. 111 Показатели апоптической активности в вагинальном и уретральном отделяемом у пациентов с ЦМВИ в разные сроки наблюдения в пределах нормы (р>0,001) (таблица 22). Таблица 22 - Показатели маркеров апоптоза в вагинальном и уретральном отделяемом в группе пациентов с цитомегаловирусной инфекцией ВПГ-1,2(пкг/мл). Показатели Биологический Показатели апоптоза материал контрольной группы ФНО α вагинальный 13,0±2,0 секрет уретральный 15,0±2,0 секрет sFas вагинальный 1000,5 ± секрет 150,5 уретральный 1300,5 ± секрет 100,5 TRAIL вагинальный 145,0±25,0 секрет уретральный 160,0±15,0 секрет При Через 30 поступлении суток 19,0±2,01 13,0±2,0 17,0±2,0 15,5±2,0 1200,5 ± 150,5 1350,5 ± 110,5 155,0±25,0 1250,5 ± 130,5 1320,5 ± 104,5 145,0±21,0 165,0±15,0 160,0±10,0 Примечания к таблице: 1 - достоверность различий по отношению к показателям доноров, р<0,001 ;2- достоверность различий по отношению к показателям предыдущего периода, р<0,001. Достоверно повышено количество ФНО α в срок обращения, при этом на фоне проводимой комплексной терапии через 30 суток происходит нормализация концентрации этого цитокина (таблица 22). При сравнении данных, полученных при исследовании сыворотки крови и отделяемого половых органов у пациентов с ЦМВИ можно выявить генерализованный характер этой скрытой инфекции (в том числе передающейся половым путем). Сыворотные показатели ФНО α и sFas достоверно отичались от нормы, в то время как локальные маркеры апоптоза практически не изменены. 112 Таблица 23 - Показатели маркеров апоптоза в вагинальном и уретральном отделяемом в группе пациентов с папилломавирусной инфекцией, пкг\мл. Показатели апоптоза ФНО α Биологический материал вагинальный секрет уретральный секрет sFas вагинальный секрет уретральный секрет TRAIL вагинальный секрет уретральный секрет Показатели контрольной группы 13,0±2,0 15,0±2,0 1000,5 ± 150,5 1300,5 ± 100,5 145,0±25,0 160,0±15,0 группа пациентов ВПЧ высокого онкогенного риска ВПЧ низкого онкогенного риска ВПЧ высокого онкогенного риска ВПЧ низкого онкогенного риска ВПЧ высокого онкогенного риска ВПЧ низкого онкогенного риска ВПЧ высокого онкогенного риска ВПЧ низкого онкогенного риска ВПЧ высокого онкогенного риска ВПЧ низкого онкогенного риска ВПЧ высокого онкогенного риска ВПЧ низкого онкогенного риска при Через 30 поступл суток ении 15,0±2,0 13,0±2,0 13,0±2,0 13,0±2,0 17,0±2,0 15,0±3,0 15,0±3,0 14,0±2,0 750,5 ± 110,01 800,5 ± 120,51 750,5 ± 130,51 1100,5 ± 110,52 900,5 ± 110,51 1000,5 ± 100,01 1150,5 ± 1250,5 ± 150,0 100,0 55,0±5,5 45,0±5,01 1 145,0±2 5,01 135,0±22, 0 65,0±15, 60,0±10,01 01 160,0±1 2,0 156,0±13, 0 Примечания к таблице: 1 - достоверность различий по отношению к показателям доноров, р<0,001 ;2- достоверность различий по отношению к показателям предыдущего периода, р<0,001. 113 ВПЧ – является инфекцией, для которой доказана роль в развитии канцерогенеза (рак шейки матки) [Скрипкин А.В. 2001]. Основной локализацией онкологического процесса является шейки матки, реже яичники. В связи с вышеизложенным, маркеры апоптоза, являющиеся показателями контроля клеточной пролиферации, исследованные локально в отделяемом половых органов у пациетов с данной инфекцией. Обнаружено, что уровень ФНО α не изменен, что свидетельстует, вопервых, об отсутсвии воспаления, и, во-вторых, содеет служить одной из причин снижения активности апоптоза, так как в рецепторзависимом пути запуска апоптоза задействована группа ФНО рецепторов (таблица 23). sFas в вагинальном отделяемом женщин с ВПЧ разной степени оенкогенного риска достоверно снижен. У пациенток с инфекцией низкого онкогенного риска на фоне проведенной комплексной антивирусной терапии происходит нормализация уровня sFas. При вирусной инфекции с высоким онкогенным риском изменений концентрации sFas не неблюдалось (таблица 23). При папилломавирусной инфекции у мужчин уровень sFas достоверно выше, по срвнению с группой женщин (p<0,001). Однако, при вирусной инфекции, вызванной 16,18 типами ВПЧ нормализации уровня sFas также не отмечено. TRAIL, член семейства ФНО, способен эффективно индуцировать апоптоз опухолевых клеток при отсутствии побочного цитотоксического эффекта [Bodmer J. 2002]. Доказательством прямого или опосредованного участия TRAIL в патогенезе ВПЧ служат данные, полученные при инфекции разного онкогенного риска. Так, при вируснойинфекции с низким онкогенным риском уровень TRAIL практически не изменен. При инфекции с высоким онкогенным риском обращают на себя внимание сниженные ан 58-64% концентрации, не нормаидизующиеся, несмотря на проведенную терапию (таблица 23). 114 Заключение Система программируемой клеточной смерти - существенный фактор иммунитета, поскольку гибель зараженной клетки может предотвратить распространение инфекции по организму. Другое дело, что некоторые инфекционные агенты выработали специальные меры для предотвращения преждевременной гибели зараженных клеток. Нарушения системы программируемой гибели клетки - причина серьезной патологии. Ослабление способности к апоптозу может вести к развитию злокачественных опухолей. Некоторые заболевания, в частности дегенеративные повреждения нервной системы, - результат избыточного апоптоза. В настоящее время растворимые мембранные молекулы клеток иммунной системы, особенно маркеры активации и апоптоза, исследуются при аутоиммунных, инфекционных, онкологических заболеваниях [Alonso С L. 2004; Bantel H. 2001; Batteux F. 2001; Bennett M.R. 2001; Zhu N. 1998]. У некоторых вирусов выработались специальные приспособления, направленные на подавление апоптоза в заражаемых клетках. В одних случаях в вирусном генетическом материале закодированы вещества, которые и по строению, и по функции очень похожи на клеточные антиапоптозные белки-регуляторы (такие как, например, уже упоминавшийся Bcl-2 или белки, подавляющие активность протеаз). В других - вирус на правах «оккупанта» насильственно стимулирует синтез клеткой ее собственных анти-апоптозных белков. Так или иначе, создаются предпосылки для беспрепятственного размножения вируса [Белушкина Н.Н. 2004; Hardwick J.M. 1997]. Роль участия растворимых форм мембранных молекул иммунных клеток и активации апоптоза в патогенетическом механизме развития хронических вирусных инфекций с высоким онкогенным риском является одним из этапов изучения патогенетической роли апоптоза при интергративной вирусной инфекции. 115 Результаты исследования кратко отражены в табличном материале – таблицы 24, части А, B, C. В своем исследовании мы попытались проанализировать сывороточные показатели ФНО-индуцированного пути апоптоза. Повышение концентрации ФНО-α в сыворотке крови при вирусных гепатитах были обнаружены во многих исследованиях, как маркера некробиотических процессов, развивающихся в ткани печени [Котович М.М. 2003]. Поэтому логично, что наиболее высокие показатели получены у больных хроническим вирусным гепатитом В. Что, по-видимому, отражает преобладание некротических процессов над апоптическими механизмами у этой группы пациентов. О чем косвенно свидетельствует и более низкие показатели sFAS и высокие TRAIL у больных этой группы. Снижение интенсивности апоптоза, возможно, косвенно подтверждает и более высокий онкогенный потенциал этого вируса. С другой стороны, более высокое содержание sFAS и низкое – TRAIL в сыворотке крови у больных хроническим вирусным гепатитом С может свидетельствовать об интенсивности образования домена смерти DR-5, который активно связывает TRAIL, в связи с чем снижается его концентрация в сыворотке крови. Повышенное содержание sFAS как будто бы свидетельствует о снижении активности апоптоза, но не стоит забывать о множестве клеток иммунной системы, которые способны образовывать FAS-рецепторы, помимо гепатоцитов, которые принимают активное участие в формировании иммунного ответа у больных этой группы. В процессе апоптоза происходит гибель и этих клеток, в связи с чем может повышаться концентрация FASлиганда, что лишний раз обосновывает необходимость исследования маркеров апоптоза в различных биологических объектах, помимо сыворотки крови. Следовательно, актуальной задачей следющего этапа работы при исследовании патологии печени, будет изучение тканевых маркеров. Разнонаправленные данные, полученные в группе больных хроническими mixt-гепатитами требуют дальнейшего изучения и более тщательной группировки этих пациентов по этиологическому фактору. Результаты работы 116 по распределению больных по биохимической активности процесса свидетельствуют о параллелизме между интенсивностью цитолиза гепатоцитов с одной стороны и апоптоза, и некроза в этих клетках с другой стороны, у больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии с парентеральным механизмом заражения. Полученные данные папилломавирусной нарушений (по инфекции показателям исследования активности демонстрируют крови), так наличие и апоптоза как локальных при системных (одинаковыя информативная ценность отмечена как для вагинального, так и для уретрального отделяемого). Сравнительные показатели активности sFAS системы в крови и отделяемом половых органов показали разнонаправленные изменения. В крови отмечено повышение количества sFAS, локально концентрация sFAS, наоборот, достоверно снижена. Возможно, полученные результаты можно объяснить лимфотропным действием вируса. Продуктивная вирусная инфекция приводит к гибели лимфоцитов, что может являться также одной из причин повышения sFAS. При инфекции 16, 18 типов снижение интенсивности апоптоза может отражать атипичные изменения в клетках шеечного эпителия у женщин в процессе их неопластических изменений и риск развития неопластического процесса. Дальнейшее выявление причин снижение активности апоптоза – изменения рецепторного фенотипа клеток, генное воздействие - создаст условия для повышения эффективности диагностики, лечения и профилактики этих заболеваний. При герпетической инфекции наиболее выраженные изменения выявлены при тяжелых формах течения ВПГ-1,2 типа. Причинами тяжелого течения инфекицонного процесса могут служить сниженный иммунитет и угненетие защитных противирусных апоптоззависимых процессов. Таким образом, при хронических вирусных инфекциях с выоким онкогенным риском выявлены изменения активности апоптоза. Наиболее выраженные изменения парентеральным обнаружены механизмом при инфицирования, 117 хронических гепатитах герпетической с инфекцией средней и тяжелой степенью тяжести, папилломавирусной инфекции 16, 18 типов. Наиболее перспективными областями для дальнейшего исследования являются: исследование прогностической значимости показателей апоптоза, изучение причин «неотвечаемости клеток» на апоптозные лиганды (рецепторный фактор, генный фактор). Кроме того, многообещающими являются также подходы, связанные с регуляцией апоптоз-специфических генов и реализующиеся, в частности, в генной терапии - одной из самых перспективных областей современной медицины - при лечении заболеваний, вызванных нарушением функционирования 118 отдельных генов. Таблица 24 - Сравнительные результаты активности маркеров апоптоза в сыворотке крови и других биологических жидкостях при хронических вирусных инфекциях с высоким онкогенным риском часть А хроническая инфекция гепатиты парентеральным механизмом инфицирования ФНОα sFAS TRAIL с ХВГВ в крови ХВГС в крови ХВГ – микст в крови ХВГВ – хронический вирусных гепатит В; ХВГС – хронический вирусный гепатит С; ХВГ – микст – хронический вирусный гепатит В+С; - средняя степень изменеия; - высокая степень изменения показателя; - нет достоверных изменений. 119 возможные причины предположительные последствия преобладание некробиотических процессов над апоптозом в ткани печени основная патогенетическая роль апоптоза в процессах поражения печени сходство патогенеза с ХВГВ риска развития онкологических процессов развитие внепеченочных поражений риска развития онкологических процессов, сочетание печеночных и внепеченочных поражений часть В хроническая инфекция подгруппа биологический ФНОα материал ВПГ-1,2 1 sFAS TRAIL возможные причины компенсирован ная защитная реакция кровь пол.орг. 2 понижение активности апоптоза (предположите льно за счет вирусных белков, интегрированн ых генов) понижение активности апоптоза (предположите льно за счет вирусных белков, интегрированн ых генов) компенсированн ая защитная реакция кровь пол.орг. 3 кровь пол.орг. Цитомегаловирусная инфекция активация воспаления, ,риск онкогенеза активация воспаления, ,риск онкогенеза активация воспаления, риск пол.орг. онкогенеза невелик ВПГ-1,2: 1 -легкой степени тяжести; 2-средней степени тяжести; 3-тяжелой степени тяжести. ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция - кровь предположитель ные последствия активация воспаления, риск онкогенеза невелик 120 часть С хроническая подгруппа инфекция Папилломавирусная инфекция биологический ФНОα материал высокого онкогенного риска кровь отделяемое половых органов низкого онкогенного риска кровь отделяемое половых органов 121 sFAS TRAIL возможные причины предполож ительные последстви я блокирование апоптоза вирусом(пред положительн о за счет вирусных белков, интегрирован ных генов) компенсирова нная защитная реакция, запуск апоптоза через sFAS системное и локальное снижение активности апоптоза, риск онкогенеза активация противовирус ной защиты риск онкогенеза невелик Список использованных источников 1 Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е. Система FAS–FASL в норме и патологии // Вопр. биол., мед., фарм. химии. – 1999. –№ 3. – С. 3–17 2 Апросина З.Г.Апоптоз//Русск. мед. журн.- 1996. -T.4.-N 3. -с. 174-177 3 Аруин Л.И. Апоптоз и патология печени // Рос.журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 1998.– Т. 8, № 2. – С. 6–10 4 БарановА.А., Б.С. Коганов, В.Ф. Учайкин и др Диагностика и лечение хронических вирусных гепатитов В, С,D у детей.//Вопр. соврем. педиатрии.2004.-№6.-С.35-38 5 Барышников. А.Ю. , Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза //Москва.-2002. - С. 327 6 Баснакьян А.Г., Басков А.В., Соколов Н.Н., Борщенко И.А. Апоптоз при травматическом повреждении спинного мозга: перспективы фармакологической коррекции// Вопросы медицинской химии.- 2000.- № 5 7 Белецкий И.П., Сорокина О.В., Никонова Л.В. Генная терапия на основе системы Fas-aHTHreH-Fas-лиганд // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии - 1999. - №4. - С. 40-49 8 Белушкина Н.Н.. Особенности регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях. Автореф. дис..доктора биол. наук.-М., 2005.- С. 32 9 Буеверов А.О., Тихонина Е.В., Москалева Е.Ю. и др. Апоптоз периферических лейкоцитов при хронических вирусных гепатитах // Росс. ж. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2000. - №6. - С. 30-33 10 Вирусные гепатиты: Клиника, диагностика, лечение (под ред. Лобзина Ю.В.),2003-СПб:»Фолиант». С. 125 11 Владимирская Е.Б., Масчан А.А., Румянцев А.Г. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста. Гематол трансфузиол 1997; 5: С. 4-9 122 12 Волчек И.В., Нестеров Н.Н., Сологуб Т.В., Белопольская М.А., Александрова В.И., Иванова В.В. Опыт использования препаратов рекомбинантных интерферонов для индивидуализированной монотерапии больных с хроническим гепатитом С. Terra med.. 2003, N 2, С. 3-5 13 Дмитриева Е.В Дмитриева и др .Роль системы Fas/Fasl в индукции апоптоза гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах . // Архив патологии. - 2003. - N 6. - С. 13-17 14 Ершов Н.Н. и др. Интерфероновый статус пациентов с герпетической инфекцией// Цитокины и воспаление.- 2004.- Т.4.- № 1.- С. 5-8 15 Жданов Р.И. Генная терапия: надежды и реалии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 1999. - №4. - С. 3-б 16 Змызгова А.В., Москалева Е.Ю., Максимов С.Л, и др. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и показатели клеточного иммунитета больных вирусным гепатитом В // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -1999, №2, С. 16-19 17 Исаков В.А. Герпетическая инфекция\\Наука.-2007.- С. 237 18 Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета// Иммунология.1995.- № 3.- С. 30-44 19 Князькин И.В., Цыган В.Н. Апоптоз в онкоурологии\\Наука.- 2007.С. 237 20 Козлов В.А. Некоторые аспекты проблемы цитокинов// Цитокины и воспаление.- 2002.- Т.1.- № 1.- С. 5-8 21 Котович М. М. Роль этиотропной и патогенетической терапии в клинической и морфологической эволюции хронических гепатитов у детей. Автореф. дисс...докт. мед. наук. М., 2003 – С. 27 22 Лесков В. П., Чередеев А. Н. и др. Клиническая иммунология для врачей – М.: Фармарус Принт, 1997.- С. 297 123 23 Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Сравнительная морфология апоптоза и некроза клеток опухолей. Тезисы 1 Белорусского съезда патологоанатомов и судебных медиков. Минск 1990-1991; 2: 299-300. 24 Маянский А.Н. Лекции по иммунологии.-Нижний Новгород: НГМА,2005.-2 С. 70 25 Маянский А.Н., Маянский Н.А., Абаджиди М.А., Заславская М.И. Апоптоз: начало будущего. Ж микробиол 1997; 2: С. 88-94 26 Метелица И.С. Иммунологический фенотип лимфоцитов периферической крови при патологии женской репродуктивной системы. Дис. ... канд. мед. наук. М 1996; С. 95 27 Нестерова М.В., Чо-Чанг Ю.С., Северин Е.С. Роль антисмысловых олигонуклеотидов в регуляции клеточных процессов. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 1998. - №4. С.3-14 28 Новиков В.В., Барышников А.Ю., Караулов А.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. Иммунология. 2007; 4: С. 249–253. 29 Новиков В.В., Евсегнеева И.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы при социально-значимых заболеваниях. Сообщение II. Исследование их роли при вирусных инфекциях. Рос. биотерапевтический журнал. 2005; 3: 1 С. 31–142 30 Новожилова А.П., Плужников Н.Н., Новиков В.С. и др. Программированная клеточная гибель. СПб: Наука 1996; С. 276 31 Райхлин Н.Т., Смирнова Е.А., Перевощиков А.Г. Апоптоз и его роль в механизмах регуляции роста опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью. Арх патол 1996; 2: С. 3-8 32 Рахманова А.Г., Яковлев А.А., Виноградова Е.Н.//Хронические вирусные гепатиты,- С.Пб.-1997. - С. 29 33 Рейзис А.Р., Н.В.Матанина, Д.А.Шмаров. Апоптоз лимфоцитов периферической крови в патогенезе вирусных гепатитов и антиапоптотическое 124 действие урсодезоксихолевой кислоты.// Ж.Инфекционные болезни, г. Москва, 2006г., № 2, С. 5-9 34 Робинсон М.В., Труфакин В.А. Апоптоз клеток иммунной системы. Успехи соврем биол. 1991; 111: 2: С. 246-259 35 Романенко А.М. Апоптоз и рак. Арх патол 1996; 3: С. 18-22 36 Северин СЕ. Биохимия и медицина - новые подходы и достижения. М.: Русский врач, 1998.- С. 96 37 Сек Ок Сун, Шапиро И.Я. Цитокиновый статус при различных вариантах течения цирроза печени. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2002. - ХХII том. - С. 28 38 Селицкая Р.П., Богодельникова И.В., Конова И.А. и др. Оценка экспрессии активационных маркеров на клеточных элементах очага туберкулезного воспаления в легком. Туберкулез и экология 1996; 2: С. 37-39 39 Скрипкин Ю.К. и др. Инфекции, передаваемые половым путем.Медпресс.-2001.- С. 202-212 40 Сладкова Л. В., Москалева Е. Ю., Посыпанова Г. А. и др. Устойчивость В-клеточных линий человека с разным уровнем экспрессии Вс12 к противоопухолевым препаратам / / Вопр. биол., мед. и фарм. химии. — 2000. — № 3. —С. 25-29 41 Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты.-СПб:Фолиант,1997.- С. 174 42 Сыркин А.Б., Герасимова Г. К., Барышников Ю. А. и соавт. Экспериментальная химиотерапия злокачественных опухолей на современном этапе. Вопр онкол 1995; 2: С. 41-45 43 Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы.- СПб.:Наука, 2000. - С. 231 44 Умнова Н.В., Москалева Е.Ю., Порошенко Г.Г. Репарация ДНК у больных хроническими неспецифическими воспалительными заболеваниями легких. Бюлл экспер биол и мед 1986; 107: 12: С. 743-745 45 Фрейдлин И.С.Проблемы апоптоза //Тихоокеанский медицинский журнал. - 1999. - №3. - С. 6-10 125 46 Хоменко А.Г., Ковальчук Л.В., Мишин В.Ю. и др. Повышенный апоптоз иммунокомпетентных клеток как один из возможных механизмов в развитии иммунодефицита у больных остропрогрессирующим туберкулезом. Пробл туб 1996; 6: С. 6-10 47 Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Патогенетический принцип оценки иммунной системы "Современные человека: проблемы современные аллергологии, проблемы. клинической Сб. трудов иммунологии и иммунофармакологии", 1-я нац. конф. Росс. ассоц. аллергологов и клинических иммунологов. М 1997; С. 74-80 48 Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Хухлович П.А., Ершова О.Н. с соавт. Современная эпидемиологическая характеристика парентеральных вирусных гепатитов (гепатитов В и С) в Российской Федерации.// В кн.: «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тез. докл. VI всеросс. научно-практ. конференции. – М., 24-25 мая 2005.– С. 380–384 49 Ярыгин В.Н., Кораблев А.В. Значение программированной гибели эндотелия в построении внутриорганного кровеносного русла в эмбриогенезе человека. Арх патол 1995; 6: С. 39-44 50 Ackerman R.C., Johnson G.A., Van-Kirk E.A. et al. Induction of apoptotic or lytic death in an ovarian adenocarcinoma cell line by antibodies generated against a synthetic N-terminal extracellular domain gonadotropin-releasing hormone receptor peptide. Cancer Lett 1994; 81: 2: P. 177-184 51 Ackermann Е. J., Taylor J. К., Narayana R. et al. The role of antiapoptotic Bcl-2 family members in endothelial apoptosis elucidated with antisense oligonucleotides // The journal of biological chemistry. -1999. -Vol. 274.- N. 16.-P. 11245-11252 52 Adrain C, Creagh E. M., Martin S. J. Apoptosis-associated release of Smac/DIABLO from mitochondria requires active caspases and is blocked by Bcl-2 // The EMBO journal.- 2001. - Vol. 20. - N. 23. - P. 6627-6636 53 Akshay KV., Oriinick J R. The molecular basis for apoptotic defects in 126 patients with CD95 (Fas/Apo-1) mutations// J Clin Invest. - 1999. - Vol. 103, №. 3. P. 355-363 54 Al Maini MH., Mountz JD., AlMohri HA., et a]. Serum levels of soluble Fas correlate with induces of organ damage in systemic lupus erythematosus// Lupus. 2000. - Vol. 9. -P.132-139 55 Almawi W.Y., Melemedjian O. K., and Abou Jaoude M. M On the link between Bcl-2 family proteins and glucocorticoid-induced apoptosis // J. Leukoc. Biol. - 2004, -V. 76. -P. 7-14 56 Alonso С L., C. Alonso Hardcover Viruses & Apoptosis By / March 2004 57 Ambar B.B., Frei K., Malipiero U. et al. Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand //Hum Gene Ther.1999,- V. 10.-P. 164-1-1648 58 Andrade F., Casciola-Rosen L., Rosen A. apoptosis in systemic lupus erythematosus. Clinical implications// Rheum Dis Clin North Am. - 2000. - Vol.26. P.215-227 59 Antonsson B. Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family "killer-proteins" and their victim the mitochondrion // Cell Tissue Res. - 2001. - Vol. 306. - N. 3. - P. 347361 60 Antonsson В., Montessuit S., Sanchez B. et al. Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells // The journal of biological chemistry.-2001.-Vol. 276.-N. 15-P. 11615-11623 61 Aoki K., Akyurek L.M., San H., et al. Restricted expression of an adenoviral vector encoding Fas ligand (CD95L) enhances safety for cancer gene therapy// Mol Ther. — 2000.-V.I.-P. 555-565 62 Arafat W.O., Gomez-Navarro J., Xiang J. et al. An adenovirus encoding proapoptotic Bax induces apoptosis and enhances the radiation effect in human ovarian cancer// Molecular Therapy.-2000.-V.l.-P. 545-554 63 Aral H., Gordon D., Nabel E. G., Nabel G. J. Gene transfer of Fas ligand induces tumor regression in vivo // Proc. nat. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94, N 25. - P. 13862-13867 127 64 Arends M. J., Wyllie A. H. Apoptosis. Mechanism and role in pathology // Inlern. Rev. Exp. Pathol. -1991. - Vol.32. - P.223-254 65 Aschoff A. P., Ott U., Funfstuck R. et al. Colocalisation of Bax and Bcl-2 in small intestine and kidney biobsies with different degrees of DNA fragmentation // Cell Tissue Res.-1999.-Vol. 296.-P. 351-357 66 Ashkenazi A., Pai, R.C., Fong S. et al. Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand// Clinical Investigation. - 1999.- V. 104. -P. 155-162 67 Bamberger A.M., Schulte H.M., Thuneke I. et al. Expression of the apoptosis-inducing Fas ligand (FasL) in human first and third trimester placenta and choriocarcinoma cells. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 9: 3173-3175 68 Banner DW, D'Arcy A, Janes W et al. Crystal structure of the soluble human SS kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation.- Cell.-1993.-V.73.-P. 431-445 69 Bantel H., Lugering A., Poremba C. et al. Caspase activation correlates with the degree of inflammatory liver injury in chronic hepatitis C virus infection //Hepatology. – 2001. – Vol. 34. – P. 758–767 70 Bardelli A. HGF receptor associates with the anti-apoptotic protein Bag-1 and prevents cell death // The EMBO journal. -1996. - Vol. 15. - P. 6205-6212 71 Basaflez G., Nechushtan A., Drozhinin 0. et al. Bax, but not Bcl-XL, decreases the lifetime of planar phospholipid bilayer membranes at subnanomolar concentrations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96. - N. 10. - P. 54925497 72 Basanez G., Zhang J., Chau B. N. et al. Pro-apoptotic cleavage products of Bcl-XL form cytochrome c-conducting pores in pure lipid membranes // The journal of biological chemistry. - 2001. - Vol. 276. - P. 31083-31091 73 Batteux F., Tourneur L, Trebeden H. et al. Gene therapy of experimental autoimmune thyroiditis by in vivo administration of plasmid DNA coding for Fas ligand // J. Immunol. — 1999. — Vol. 162, N 1. - P. 603-608 74 Baumann H., Gearing D., Ziegler S. F. Signaling by the cytoplasmic domain of hematopoietin receptors involves two distinguishable mechanisms in 128 hepatic cells // J. Biol. Chem. — 1994.- Vol. 269, N 23. - P. 16297-16304 75 Bell C.G. Apoptosis in T and B lymphocytes life cycles. Biochim Soc Trans 1995; 23: 2: P. 214 76 Bellgrau D., Gold D., Selawry H. et al. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection // Nature. — 1995. — Vol. 377, N 6550. - P. 630-632 77 Bennett M.R. Apoptosis in the cardiovascular system// Heart,- 2002.-V. 87.№ 5.-P. 480-487 78 Berke G. Killing mechanisms of cytotoxic lymphocytes. Curr Opin Hematol 1997; 4: P. 32-40 79 Berman M. L, Silhavy T. J., Enquist L. W. Experiments with gene fusions. — New York, 1984 80 Biswas S. K., Huang J., Persaud S., and Basu A. Down-regulation of Bcl-2 is associated with cisplatin resistance in human small cell lung cancer H69 cells //Mol. Cancer Ther,-2004. -V.3. -P. 327-334 81 Bodmer J. TRAIL receptor-2 signals apoptosis through FADD and caspase8 //Nature Cell Biology. - 2000. - V. 2.- P. 241-243 82 Botarelli P., Brunetto M.R., Minutello M.A. et al.T-cell response to hepatitis C virus in different clinical courses of infection // Gastroenterology. – 1993. – Vol. 194. – P. 580–587 83 Boueverov A.O., Mammaev S.N., Tikhonina E.V. et al. Enchanced apoptosis of peripheral blood leucocytes in chronic viral hepatitis // Gut. - 2000. Vol.47 (suppl. 3). - P. 181 84 Bu S.Z., Yin D.L., Ren X.H. et al. Progesterone induces apoptosis and upregulation of p53 expression in human ovarian carcinoma cell lines. Cancer 1997; 79: 10: P. 1944-1950 85 Burke F., East N., Upton C. et al. Interferon gamma induces cell cycle arrest and apoptosis in a model of ovarian cancer: enhancement of effect by batimastat. Eur J Cancer 1997; 33: 7: P. 1114-1121 129 86 Butz K., Geisen C., Ullmann A. et al. Cellular responses of HPV-positive cancer cells to genotoxic anticancer agents: repression of E6/E7-oncogene expression and induction of apoptosis. Int J Cancer 1996; 68: 4: P. 506-513 87 Calabrese F., Pontiso P., Perrenazzo E. et al. Liver cell apoptosis in chronic hepatitis C correlates but not biochemical activity or serum HCV-RNA levels// Hepatology. – 2000. – Vol. 31. – P. 1153–1159 88 Chen W., Liu Y., Glund C. Bile acids for viral hepatitis , 2003. Cochrane Database Syst Rev 2003, (2).-P.1256-1264 89 Chen Z., Naito M., Mashima T., Tsuruo T. Activation of actin-cleavable interleukin 1beta-converting enzyme (ICE) family protease CPP-32 during chemotherapeutic agent-induced apoptosis in ovarian carcinoma cells. Cancer Res 1996; 56: 22: P. 5224-5229 90 Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis //Biochem. J. – 1997. – Vol. 326. – P. 1–16 91 De Angelis P.M., Stokke Т., Thorstensen L. et al. Apoptosis and expression of Bax, Bcl-X, and Bcl-2 apoptotic regulatory proteins in colorectal carcinomas, and association with P53 genotype/phenotype // Mol. Pathol. - 1998. - Vol. 51. - N. 5. - P. 254-261 92 Debernardis D., Sire E.G., De-Feudis P. et al. p53 status does not affect sensitivity of human ovarian cancer cell lines to paclitaxel. Cancer Res 1997; 57: 5: P. 870-874 93 Deshane J., Grim J., Loechel S. et al. Intracellular antibody against erbB-2 mediates targeted tumor cell eradication by apoptosis. Cancer Gen Ther 1996; 3: 2: P. 89-98 94 Diebold J., Baretton G., Felchner M. et al. bcl-2 expression, p53 accumulation, and apoptosis in ovarian carcinomas. Am J Clin Pathol 1996; 105: 3: P. 341-349 95 Dutton G. Debating Gene Therapy's Future // Genetic Engineering News. 2000. -V.20. -№1 96 Eissa S., Seada L.S. Quantitation of Bcl-2 protein in bladder cancer tissue by 130 enzyme immunoassay: comparison with Western blot and immenohistochemistry // Clinical chemistry. - 1998. - Vol. 44. - N. 7. - P. 1423-1429 97 Eliopoulos A.G., Kerr D.J., Herod J. et al. The control of apoptosis and drug resistance in ovarian cancer: influence of p53 and bcl-2. Oncogene 1995; 11: 7: P. 1217-1228 98 Eskes R., Antonsson B.,Osen-Sand A. et al, Bax-induced cytochrome с release from mitochondria is independent of the permeability transition pore but highly dependent on Mg2+ ions // The journal of cell biology. -1998. - Vol. 143. - P. 217-224 99 Eskes R., Desagher S., Antonsson B. Bid induces the oligomerization and insertion of Bax into the outer mitochondrial membrane // Molecular and cellular biology. - 2000. -Vol. 20. -N.3.- P. 929-935 100 Fadok V.A., Bratton D.L., Henson P.M. Phagocyte receptors for apoptotic cells: recognition, uptake, and consequences// J. CHn. Invest,- 2001.-V. 108.-№7.P. 957-962 101 Fajac A., Da-Silva J., Ahomadegbe J.C. et al. Cisplatin-induced apoptosis and p53 gene status in a cisplatin-resistant human ovarian carcinoma cell line. Int J Cancer 1996; 68: 1: P. 67-74 102 Fan X.G., Liu W.E., Li C.Z. et al. Circulating Th1 and Th2 cytokines in patients with hepatitis C virus infection// Mediators Inflamm. – 1998. – Vol. 7. – P. 295–297 103 Farid P., Gomb S.Z., Peter I. et al. Bcl-2, p53 and Bax in thyroid tumors and their relation to apoptosis // Neoplasma. - 2001. - Vol. 48. - N. 4. - P. 299-301 104 Faubion W.A., Gores G.J. Death receptors in liver biology and pathobiology // Hepatology. – 1999. – Vol. 29. – with histological P. 1–4 105 Ferrandina G., Melichar B., Loercher A. et al. Growth inhibitory effects of sodium phenylacetate (NSC 3039) on ovarian carcinoma cells in vitro. Cancer Res 1997; 57: 19: P. 4309-4315 106 Ferraro E., Corvaro M., Cecconi F. Physiological and pathological roles of Apafl and apoptosome// J.Cell.MoLMed.- 2003.- V.7.-P. 21-34 107 Feudis P., Vignati S., Rossi C, et al,, Driving p53 response to Bax 131 activation greatly enhances sensitivity to taxol by inducing massive apoptosis.//Neoplasia. - 2000. - Vol.2. - P.202-207 108 Filippovich I.V., Sorokina N.I., Robillard N., Chatal J.F. Radiationinduced apoptosis in human ovarian carcinoma cells growing as a monolayer and as multicell spheroids. Int J Cancer 1997; 72: 5: P. 851-859 109 Finucane D. M., Bossy-Wetzel E., Waterhouse N. J. et al. Bax induced caspase activation and apoptosis via cytochrome с release from mitochondria is inhibitable by Bcl-XL // The journal of biological chemistry. - 1999. - Vol. 274. - N. 4. - P. 2225-2233 110 Frankel A., Buckman R., Kerbel R.S. Abrogation of taxol-induced G2-M arrest and apoptosis in human ovarian cancer cells grown as multicellular tumor spheroids. Cancer Res 1997; 57: 12: P. 2388-2393 111 Furuya H., Yabushita H., Noguchi M., Nakanishi M. Apoptosis and cell growth fraction in normal, dysplastic and neoplastic squamous epithelium of uterine cervix. Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi 1995; 47: 2: P. 141-148 112 Galle P.R., Hofmann W.I.,Walczak H. et al. Involved of the CD 95 (APO1/Fas) receptor and ligand in liver damage J. Exper. Med. —1995. —182. —Р. 12231230 113 Gamnann A., Tews D.S., Mayer E. et al. Expression of apoptosis-related proteins, p53, and DNA fragmentation in sarcomas of the pulmonary artery // Cancer. - 2001. - Vol. 92.-N. 5. -P. 1237-1244 114 Garzetti G.G., Ciavattini A., Provinciali M. et al. Expression of p53 and apoptosis of tumor cells in locally advanced cervical carcinoma after cisplatin based neoadjuvant chemotherapy. Anticancer Res 1996; 16: 5B: 3229-3234 115 Gibb R.K., Taylor D.D., Wan T. et al. Apoptosis as a measure of chemosensitivity to cisplatin and taxol therapy in ovarian cancer cell lines. Gynecol Oncol 1997; 65: 1: P. 13-22 116 Golstein P. Controlling cell death// Sceince 1997, v.275, P. 1081-1082 117 Gong В., Chen Q., Endlich B. et al. Ionizing radiation induced Bax mediated cell death is dependent on activation of cysteine and serine proteases // Cell 132 Growth & Differentiation. -1999.-Vol. 10. -P. 491-502 118 Gotlieb W.H., Watson J.M., Rezai A. et al. Cytokine-induced modulation of tumor suppressor gene expression in ovarian cancer cells: up-regulation of p53 gene expression and induction of apoptosis by tumor necrosis factor-alpha. Am J Obstet Gynecol 1994; 170: 4: P. 1121-1128 (discussion 1128-1130) 119 Griffith T.S., Anderson R.D., Davidson B.L., Williams R.D., and Ratliff, T.L, Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis // Journal of Immunology. - 2000. - V. 165. P. 2886-2894 120 Griffith T.S., Brunner T., Fletcher S.M., Green D.R., Ferguson T.A. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege.// Science.- 1995.-V. 270.-P. 5239 121 Griffith T.S., Brunner Т., Fletcher S.M., Green D.R. and Ferguson T.A. Fas Hgand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege// Science.- 1995.-V. 270.-P. 1189-1192 122 Gross A., Jockel J., Wei M.C., Kosmeyer SJ. Enforced dimerization of Bax results in its translocation, mitochondria! disfunction and apoptosis. // EMBOj. 1998. -Vol.17.- P. 3878-3885 123 Gross A., McDonnell J. M., Korsmeyer S. J. Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis // Genes Dev. - 1999. - Vol. 13. - N. 15. - P. 1899-1911 124 Gu J., Zhang L,, Huang X., Lin T. et al. A novel single tetracyclineregulative adenoviral vector for tumor-specific Bax gene expression and cell killing in vitro and in vivo //Oncogene. -2002.-V. 18-21(31).-P. 4757-4764 125 Guo Y., Srinivasula S. M., Druilhe A. et al. Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria // The journal of biological chemistry. - 2002. - Vol. 277. - P. 13430-13437 126 Guo В., Godzik A., Reed Y.R. Bcl-G, a novel pro-apoptotic member of the Bcl-2 family // The journal of biological chemistry. - 2001. - Vol. 276. - N. 4. - P. 2780-2785 133 127 Hardwick J.M. Virus-induced apoptosis // Adv. Pharmacol. -1997, v,41, P. 295-336 128 Harris M. H., Heiden M. G. V., Kron S. J. et al. Role of oxidative phosphorylation in Bax toxicity // Molecular and cellular biology. - 2000. - Vol. 20. N. 10. - P. 3590-3596 129 Haunstetter A., Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease// Circ. Res.- 1998-V. 82.- №11 .-P. l 111-1129 130 Havrilesky L.J., Elbendary A., Hurteau J.A. et al. Chemotherapy-induced apoptosis in epithelial ovarian cancers. Obstet Gynecol 1995; 85: 6: P. 1007-1010 131 Havrilesky L.J., Hurteau J.A., Whitaker R.S. et al. Regulation of apoptosis in normal and malignant ovarian epithelial cells by transforming growth factor beta. Cancer Res 1995; 55: 4: P. 944- 948 132 Hay S., Kannourakts G. A time to kill: viral manipulation of the cell death program// J. Gen. Virol..- 2002.-V. 83.-P. 1547-1564 133 Hayashi N., Mita E. Fas system and apoptosis in viral hepatitis // J. Gastroenterol. Hepatol. – 1997. – Vol.12. – P. 223–226 134 Hayashi, N., E. Mita. Fas system and apoptosis in viral hepatitis. J, Gastroenterol. Hepatol. 12: S223-S226,1997 135 Heatley M.K. A high apoptotic index occurs in subtypes of endometrial adenocarcinoma associated with a poor prognosis. Pathology 1997; 29: 3: 272-275 136 Heatley M.K. Association between the apoptotic index and established prognostic parameters in endometrial adenocarcinoma. Histopathology 1995; 27: 5: 469-472 137 Hedlund Т.Е., Meech S.J., Srikanth S., Kraft A.S., Miller G.J., Schaack J.B. and Duke R.C. Adenovirus-mediated expression of Fas ligand induces apoptosis of human prostate cancer cells //Cell Death Differ.- 1999.-V. 6. -P. 175-182 138 Heiden M. G. V., Chandel N. S., Li X. X. et al. Outer mitochondrial membrane permeability can regulate coupled respiration and cell survival // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - N. 9. - P. 4666-4671 139 Hengarten O.M. The Biochemistry of apoptosis // Nature. - 2000. 134 Vol.407.-P.770-775 140 Higashijima T., Kataoka A., Nishida T., Yakushiji M. Gonadotropinreleasing hormone agonist therapy induces apoptosis in uterine leiomyoma. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1996; 68: 1-2: 169-173 141 Hiramatsu N., Hayashi N., Katayama K. et al. Immunohistochemical detection of Fas antigen in liver tissue of patient with chronic hepatitis C // Hepatology —1994. —19. —Р. 1354-1359 142 Hirotani M., Zhang Y., Fujita N. et al. NH2-terminal BH4 domain of Bcl-2 is functional for heterodimerization with Bax and inhibition of apoptosis // The Journal of Biological Chemistry. - 1999. - Vol. 274. - N. 29. - P. 20415-20420 143 Hoetelmans R.W..M, Slooten H-J, Keijzer R. et al. Bcl-2 and Bax proteins are present in interphase nuclei of mammalian cells. //Cell death and Different. 2000, -Vol.7.-P.384-392 144 Holler N., Tardivel A., Kovacsovics-Bankowski M. et al. Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex // Molecular and Cellular Biology. - 2003. - Vol. 23. - N. 4. - P. 1428-1440 145 Honda Т., Kagawa S., Spurgers K.B. et al. A recombinant adenovirus expressing wild-type Bax induces apoptosis in prostate cancer cells independently of their Bcl-2 status and androgen sensitivity// Cancer Biol. Ther. - 2002.- V.1(2).-P. 163167 146 Hsu Y.-T., Youle R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family // The journal of biological chemistry. - 1997. - Vol. 272. - N. 21. -P. 13829-13834 147 Huang D.C.S., Hahne M., Schroeter M et al. Activation of Fas by FasL induces apoptosis by a mechanism that cannot be blocked by Bcl-2 or Bcl-XL // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96. - P. 14871-14876 148 Huang D.C.S., O'Reilly L. A., Strasser A. et al. The anti-apoptosis function of Bcl-2 can be genetically separated from its inhibitory effect on cell cycle entry // The EMBO journal. - 1997. -Vol. 16. - N. 15. - P. 4628-4638 135 149 Huang S.C., Chou C.Y., Lin Y.S. et al. Enhanced deoxyribonucleic acid damage and repair but unchanged apoptosis in uterine leiomyomas treated with gonadotropin-releasing hormone agonist. Am J Obstet Gynecol 1997; 177: 2: 417424 150 Huang X., Lin Т., Gu J. et al. Combined TRAIL and Bax gene therapy prolonged survival in mice with ovarian cancer xenograft //Gene Ther. - 2002.V.9(20).-P.1379-1386 151 Huh W.K., Gomez-Navarro J., Arafat W.O., Xiang J., Mahasreshti P.J., Alvarez R.D. Bax-induced apoptosis as a novel gene therapy approach for carcinoma of the cervix//! Gynecol Oncol. - 2001,- V.83(2).-P. 370-377 152 Hunt K.K., Deng J., Liu T.J. et al. Adenovirus-mediated overex-pression of the transcription factor E2F-1 induces apoptosis in human breast and ovarian carcinoma cell lines and does not require p53. Cancer Res 1997; 57: 21: 4722-4726 153 Hyer MX., Voelkel-Johnson C, Rubinchik S., Dong J, and Norris J.S. Intracellular fas ligand expression causes fas-mediated apoptosis in human prostate cancer cells resistant to monoclonal antibody-induced apoptosis // Mol Ther. - 2000. V. 2.-P. 348-58 154 Ilyas M., Нао X.P., Wilkinson K. et al. Loss of Bcl-2 expression correlates with tumour recurrence in colorectal cancer // Gut. - 1998. - Vol. 43. - N. 3. - P. 383387 155 Inohara N., Ekhterae D., Garcia I. et al. Mtd - a novel Bcl-2 family member activates apoptosis in the absence of heterodimerization with Bcl-2 and BclXL // The journal of biological chemistry. - 1998. - Vol. 273. -N. 15. - P. 8705-8710 156 Ionov Y., Yamamoto H., Krajewski S. et al. Mutational inactivation of the proapoptotic gene Bax confers selective advantage during tumor clonal evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - N. 20. - P. 10872-10877 157 Isacson C., Kessis T.D., Hedrick L., Cho K.R. Both cell proliferation and apoptosis increase with lesion grade in cervical neoplasia but do not correlate with human papillomavirus type. Cancer Res 1996; 56: 4: 669-674 158 Jansson A., Sun X.F, Bax expression decreases significantly from primary 136 tumor to metastasis in colorectal cancer // J. Clin, Oncol. - 2002. - Vol. 20. - N. 3. - p. 811-816 159 Jen-old S., Koh LS, The role of apoptosis in autoimmunity: Immunogen, antigen, and accelerant// Seminars in Nephrology. - 1999. -Vol.19. -P.34-47 160 Jeremias, I, and Debatin, K.M. TRAIL induces apoptosis and activation of NF kappa В // European Cytokine Network. - 1998. - V. 9. -P. 687-688 161 Jeremy McNally et al. Fas ligand expression and function in systemic lupus erythematosus. J. Immunol. 1997; 159: 4628-4636 162 Johnson A. L. Editorial: Mcl-1 - just another antiapoptotic Bcl-2 homolog? // Endocrinology. - 1999. - Vol. 140. - N. 12. - P. 5465-5468 163 Jonsson J.R., Edwards-Smith C.J., Catania S.C. et al. Expression of cytokines and factors modulating apoptosis by human sinusoidal leucocytes // J. Hepatol. - 2000. - Vol.32. -P.392-398 164 Joyner A,L. Gene Targeting. Oxford. - 2003. - P. 293 165 Ju S T. et al. Fas (CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after activation. Nature 1995; P. 373-444 166 Kagawa S., Pearson S.A., Ji L. et al. A binariy adenoviral vector for expressing high levels on the proapoptotic gene bax.// Gene Ther. - 2000. - Vol.7. P.75-79 167 Kagawa Sh., Gu J., Swisher S., et al. Antitumor effect of adenovirusmediated Bax gene transfer on p53-sensitive and p53-resistant cancer lines. // Cancer Res. - 2000. -Vol.60.-P. 1157-1161 168 Kaklamanis L., Savage A.f Whitehouse R. et al. Bcl-2 protein expression: association with p53 and prognosis in colorectal cancer // Br. J. Cancer. - 1998. - Vol. 77.-N. 11.-P. 1864-1869 169 Kaliberov S.A., Buchsbaum D.J., Gillespie G.Y. et al. Adenovirusmediated transfer of BAX driven by the vascular endothelial growth factor promoter induces apoptosis in lung cancer cells // Mol. Ther. ~ 2002.- V.6(2). - P. 190-198 170 Kalkeri G, Khalap N, Garry RF et al. Hepatits С virus protein expression induced apoptosis in HepG2 cells//Virology 2001, 282(1), P. 26-37 137 171 Kang P.M., Izumo S. Apoptosis and heart failure: A critical review of the literature// Circ. Res.- 2000.-V. 86.- № 11.-P. 1107-1113 172Kang S. M, Schneider D. ., Lin Z. et al. Fas- ligand expression in islets of Langerhans does not confer immune privilege and instead targets them for rapid destruction//Nature Med. —1997. - Vol. 3, N 7. - P. 738-743 173 Karlsson L., Leser G., Ryd W., Horvath G. Estradiol induces DNA fragmentation in a human endometrial adenocarcinoma with estradiol-inhibited growth phenotype. Anticancer Res 1997; 17: 5A: P. 3259-3263 174 Kato N, Yoshida H, Kioko Ono-Nita S. et al. Activation of intracellular signaling by hepatitis В and С viruses: C-viral core is the most potent signal inducer/ZHepatology 2000, 32(2), P. 405-412 175 Kawaguchi Y., Takebayashi H., Kakizuka A. et al. Expression of Fasestrogen receptor fusion protein induces cell death in pancreatic cancer cell lines //Cancer Lett. — 1997. — Vol. 116.N 1. - P. 53-59 176 Kawahara H., Matsuda Y., Takase S. Is apoptosis involved in alcoholic hepatitis? // Alcohol. Alcohol. –1994. – Vol. 29 (suppl. 1). – Р. 113–118 177 Kerr Y.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26: 2: 239-257 178 Kim C.Y., Tsai M.H., Osmanian C. et al. Selection of human cervical epithelial cells that possess reduced apoptotic potential to low-oxygen conditions. Cancer Res 1997; 57: 19: 4200- 4204 179 Kim H, Lee H, Yun Y. X-gene product of hepatitis В virus induces apoptosis in liver cells//J Biol Chem 1998, 273(1), P. 381-385 180 Kim T.-H., Zhao Y., Barber M. J. et al. Bid induced cytochrome с release is mediated by a pathway independent of mitochondrial permeability transition pore and Bax//The journal of biological chemistry.-2000. -Vol. 275. -N. 50. - P. 3947439481 181 Kirsch D.G., Doseff A., Chau B. N. et al. Caspase-3-dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome с // The journal of biological chemistry. - 2001. 138 - Vol. 274.-N. 30.-P. 21155-21161 182 Kleinman D., Douvdevani A., Schally A.V. et al. Direct growth inhibition of human endometrial cancer cells by the gonadotropin-releasing hormone antagonist SB-75: role of apoptosis. Am J Obstet Gynecol 1994; 170: 1: Pt 1: 96-102 183 Klintman D.,X.Li, andH.Thorlacius Important Role of P-Selectin for Leukocyte Recruitment, Hepatocellular Injury, and Apoptosis in Endotoxemic Mice//Clin. Vaccine Immunol..- January 1.- 2004.-V.11(1).-P. 56 - 62 184 Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R. et al. The release of cytochrome с from mitochondria: a primary she for Bcl-2 regulation of apoptosis // Science, 1997. - Vol. 275.-P. 1132-1136 185 Kountouras J., Chatzopoulos D., Zavos C. Apoptosis in hepatitis C // J. Viral Hepatitis. – 2003. – Vol. 10. – P. 335–342 186 Krammer P. H. CD95's deadly mission in the immune system // Nature. 2000. -Vol. 407. - P. 789-795 187 Krueger A., Baumann S., Krammer P. H„ Kirchhoff S. FLICE-inhibitory proteins: regulators of death receptor-mediated apoptosis // Molecular and cellular biology. - 2001. - Vol. 21. - N. 24. - P. 8247-8254 188 Kuwano K., Kunitake R., Kawasaki M. et al. P21/Cip/Sdi1 and p53 expression in association with DNA strand breaks in idiopathic pulnonary fibrosis. Am J Responce Crit Care Med 1996; 154: 477-483 189 Kuwashima Y., Kobayashi Y., Kawarai A. et al. Apoptosis in human endometrial adenocarcinoma: comparison of nick end labeling and Le(y) antigen immunostaining method. Anticancer Res 1996; 16: 5B: 3225-3228 190 Kuwashima Y., Kobayashi Y., Kawarai A. et al. Expression of bcl-2 and apoptotic DNA fragmentation in human endometrial adenocarcinoma cells. Anticancer Res 1996; 16: 5B: 3221- 3224 191 Kuwashima Y., Kobayashi Y., Kawarai A. et al. Occurrence of apoptotic DNA fragmentation in quiescent and proliferating cells in human endometrial adenocarcinoma tissues and the influence of apoptosis-suppressing effects of bcl-2 products. Anticancer Res 1997; 17: 5B: 3737-3741 139 192 Lafon C., Mathieu C., Guerrin M. et al. Transforming growth factor beta 1-induced apoptosis in human ovarian carcinoma cells: protection by the antioxidant N-acetylcysteine and bcl-2. Cell Growth Differ 1996; 7: 8: 1095-1104 193 Lam M., Bhat M. В., Nunez G, et al. Regulation of Bcl-XL channel activity by calcium // The journal of biological chemistry. - 1998. - Vol. 273. - N. 28. - P. 17307-17310 194 Levine E.L., Renehan A., Gossiel R. et al. Apoptosis, intrinsic radiosensitivity and prediction of radiotherapy response in cervical carcinoma. Radiother Oncol 1995; 37: 1: 1-9 195 Li X. K., Okuyama ., Tamura A. et al. Prolonged survival of recipient rats with Fas-ligand-transfected liver allografts by using HVJ-liposome // Transplant. Proc. — 1998, —Vol. 30, N4 196 Liang Y., Nylander K. D,, Yan C, Schor N. F. Role of caspase 3-dependent Bcl-2 cleavage in potentiation of apoptosis by Bcl-2 // Mol. Pharmacol. - 2002. - Vol. 61. - P. 142-149 197 Lian-Jun Y., Wen-Liang W. Expression of Bcl-2 and Bax proteins in hepatocellular carcinoma tissue // J. Fourth Mil. Med. Univ. - 2002. - Vol. 23. - P. 337-340 198 Liu X,-H., CasteUi J. C, Youle R. J. Receptor-mediated uptake of an extracellular Bcl-XL fusion protein inhibits apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96. -N. 17.-P. 9563-9567 199 Lock R. B, Bcl-2 inhibits a Fas induced conformational change in the Bax N-terminus and Bax mitochondrial translocation // The journal of biological chemistry. -2000. - Vol. 275. -N. 23. - P. 17225-17228 200 Lorenz HM., Herrmann M, Winkler Т., et al. Role of apoptosis in autoimmunity//Apoptosis. - 2000. -Vol. 5. - P. 443 201 Lynch DH., Ramsdell F., Alderson MR. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses// Immunol Today. -1995. -Vol. 16. - P.569 202 MacFarlane M., Merrison W., Bratton S. B. et al. Proteasome-mediated degradation of Smac during fpoptosis: XIAP promotes Smac ubiquitination in vitro // 140 The journal of biological chemistry. - 2002. - Vol. 277. - P. 36611-36616 203 Marani M., Tenev Т., Hancock D, et al. Identification of novel isoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis // Molecular and cellular biology. - 2002. - Vol. 22. - N. 11. - P. 3577-3589 204 Mathieu C., Jozan S., Mazars P. et al. Density-dependent induction of apoptosis by transforming growth factor-beta 1 in a human ovarian carcinoma cell line. Exp Cell Res 1995; 216: 1: 13-20 205 McDonnel J., Bechm A., Sarkiss M. et al. Importance of the Bcl-2 family in cell death regulation// Experientia. - 1996. - Vol. 52. - P. 1008-1017 206 Mita E, Hayashi N, Lio S et al. Role of fas ligand in apoptosis induced by hepatits С infection // Biochem. Boiphis. Res. Commun. - 1994. - 204. - P. 468-474 207 Mitsades N., Poulaki V.t Tseleni-Balafouta S., Koutras D.A., and Stamenkovic L Thyroid carcinoma cells are resistant to FAS-mediated apoptosis but sensitive to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing Ligand // Cancer Research.- 2000.- V. 60. - P. 4122-4129 208 Miyawaki T., Uehara T., Nibu R. et al. Differential expression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulations in human peripheral blood. J Immunol 1992; 149: 3753-3758 209 Mullauer L., Gruber P., Sebinger D. et al. Mutations in apoptosis genes: a pathogenetic factor for human disease // Mutat Res. - 2001. - Vol. 488. - N. 3. - P. 211-231 210 Nagata S. Apoptosis by death factor // Cell. - 1997. - Vol. 88. - P. 355-365 211 Nagata S. Fas ligand- induced apoptosis// Ann. Rev. Genet. - 1999. -Vol. 33. - P. 29-55 212 Nagata,S. Apoptotic DNA fragmentation.// Exp. Cell Res.-2000.-V.- 256.P. 12–18 213 Narita M., Shimizu S., Ito T. et al. Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome с release in isolated mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95. - N. 25. - P. 1468114686 141 214 Nasir T., Arona H.S, Kaiser H.E. Apoptosis and pathogenesis of viral hepatitis C-an update in vivo.,2002.-Vol.14.-P.297-300 215 Nauman U., M. Weller. Retroviral BAX gene transfer fails to sensitise malignant glioma cells to CD95L-induced apoptosis and cancer chemotherapy.// Int. J. Cancer. 1998. - Vol.77. - P.645-648 216 Norris J.S., Hyer M.L., Voelkel-Johnson C. etal. The use of Fas Ligand, TRAIL and Bax in gene therapy of prostate cancer // Curr Gene Then- 2001,-V1(1),-P. 123-136 217 Okazaki M., Hino K., Fujii К et al. Hepatic Fas-antigen expression before and after interferon therapy in patients with chronic hepatitis С // Dig. Dis. Sci. 1996. - Vol.41. - P.2453-2458 218 Oridate N., Lotan D., Mitchell M.F. et al. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis in cervical carcinoma cells by retinoids: implications for chemoprevention. J Cell Biochem Suppl 1995; 23: 80-86 219 Ormerod M.G., O'Neill C., Robertson D. et al. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced cell death through apoptosis in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cell lines. Cancer Chemother Pharmacol 1996; 37: 5: 463471 220 Osaki M., Kase S.? Kodani I. et al. Expression of Fas and Fas ligand in human gastric adenomas and intestinal-type carcinomas: correlation with proliferation and apoptosis // Gastric cancer. - 2001. - Vol. 4. - N. 4. - P. 198-205 221 Owen-Shaub L. Fas/APO-1: a cell surface protein mediating apoptosis // Cancer Bull. - 1994. -Vol. 46. - P. 141-145 222 Pastorino J. G,, Tafani M., Rothman R. J. et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore // The journal of biological chemistry. - 1999. - Vol. 274. - N. 44, - P. 3173431739 223 Pastorino J.G., Chen ST., Tafani M. et al. The overexpression of Bax produces cell death upon induction of the mitochondrial permeability transition. // J. Biol. Chem. -1998. - Vol.273. - P.7770-7775 142 224 Patel T., Gores G.J., Steer C.J. Apoptosis and the liver:a mechanism of disease, growth regulation, and carcinogenesis// Hepatology. – 1999. – Vol. 30. –P. 811–815 225 Reed J.C. Apoptosis-based therapies // Nat. Rev. Drug Discov. - 2002. Vol.1. -N.2.-P.H1-121 226 Reed J.C. Potential functions of Bcl-2 family proteins. // Advances in pharmacology. - 1997. -Vol.41. - P. 510-514 227 Rehermann Bs Chang K, McHutchison JG. et al Quantitative analysis of the peripheral blood cytotoxic T lymphocyte response in patients with chronic hepatitis С virus infection//J.Clin.Invest. 1996. 98.1432-1440 228 Rivero V., Grespo J., Casafront F. Fulminant hepatitis by HBV. Role of Fas system. // Hepatology, —1998. —28 (Supple). —P. 482-483 229 Rust C., Gores G.J. Apoptosis and liver disease // Am.J. Med. – 2000. – Vol. 108. – P. 567–574 230 Ruvolo P.P., Deng X., May W.S. Phosphorylation of Bcl-2 and regulation of apoptosis//Leukemia.-2001.-Vol. 15.-N.4.-P. 515-522 231 Sacco R.L., Benson R.T., Kargman D.E., et al. // High density lipoprotein cholesterol and ischemic stroke in the elderly, The northen Manhattan stroke study. // JAMA.2003. — 60(Suppl 1) — S31-48. 49 232 Saegusa M., Kamata Y., Isono M., Okayasu I. Bcl-2 expression is correlated with a low apoptotic index and associated with progesterone receptor immunoreactivity in endometrial carcinomas. J Pathol 1996; 180: 3: 275-282 233 Sanchez-Perez A.M., Soriano S., Clarke A.R., Gaston K. Disruption of the human papillomavirus type 16 E2 gene protects cervical carcinoma cells from E2Finduced apoptosis. J Gen Virol 1997; 78 (Pt 11): 3009-3018 234 Sarraf С.E., Bowen I.D. Kinetic studies on a murine sarcoma and an analysis of apoptosis. Br J Cancer 1986; 54: 989-998 235 Schendel S. L., Xie Z., Montal M. O. et al. Channel formation by antiapoptotic protein Bcl-2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94. - P. 51135118 143 236 Schlesinger P. H., Gross A., X.-M. Yin et al. Comparison of the ion channel characteristics of proapoptotic Bax and antiapoptotic Bcl-2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997. -Vol. 94. -P. 11357-11362 237 Sheets E.E., Crum C.P., Yeh J. Association between cervical neoplasia and apoptosis as detected by in situ nuclear labeling. Gynecol Oncol 1996; 63: 1: 94100 238 Sheets E.E., Yeh J. The role of apoptosis in gynaecological malignancies. Ann Med 1997; 29: 2: 121-126 239 Shigekazu N. Apoptosis by death factor. Cell 1997; 88: 355-365 240 Shilkaitis A., Graves J., Mehta R. R. et al. Bcl-2 and Bax are differentially expressed in hyperplastic premalignant and malignant lesions of mammary carcinogenesis // Cell Growth Differ. - 2000. - Vol. 11. - P. 437-445 241 Shimizu S., Konishi A., Kodama T. et al, BH4 domain of antiapoptotic Bcl-2 family members closes voltage dependent anion channel and inhibits apoptotic mitochondrial changes and cell death // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - N. 7. - P. 3100-3105 242 Shimizu S., Tsujimoto Y. Proapoptotic ВНЗ-only Bcl-2 family members induce cytochrome с release, but not mitochondnal membrane potential loss, and do not directly modulate voltage-dependent anion channel activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. -VoI.97.-N. 2.-P. 577-582 243 Shinoura N., Yoshida Y., SadataA. et al. Apoptosis by retrovirus- and adenovirus-mediated gene transfer of Fas ligand to glioma cells; implications for gene therapy // Hum. Gene Ther. —1998. - Vol. 9, N 14. - P. 1983-1993 244 Shoji Y., Saegusa M., TakanoY. et al. Correlation of apoptosis with tumour cell differentiation, progression, and HPV infection in cervical carcinoma. J Clin Pathol 1996; 49: 2: 134-138 245 Siegel RM.,. Frederiksen J K., Zacharias D A., et al. Fas pre-association required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutationsZ/Science. -2000. -Vol. 288. -P.2354-2357 246 Silvestrini R., Veneroni S., Daidone M. G. et al. The Bcl-2 protein: a 144 prognostic indicator strongly related to p53 protein in lymph node negative breast cancer patients // J. Natl. Cancer Inst. - 1994. - Vol. 86. - P. 499-504 247 Sinkovics J. G., Horvath J. Can virus therapy of human cancer be improved by apoptosis induction? // Med. Hypothes. —1995. - Vol. 44, N 5. - P. 359-368 248 Smith A.E. Gene therapy - where are we // The Lancet. - 1999. - V.354. (Suppl. l).-P. l-4 249 Socie G., Mary J -Y.t Lemann M. Et al.Prognostic value of apoptotic cells and infiltrating neutrophils in graft-versus-host disease of the gastrointestinal tract in humans: TNF and Fas expression // Blood. - 2004. - V. 10. - P. 50-57 250 Soini Y., Paakko P. Extent of apoptosis in relation to p53 and bcl-2 expression in germ cell tumors. Human Pathol 1996; 27: 11: 1221-1226 251 Spinozzi F., Forenza N., Agen E. et al. CD30 Th2 allergen-specific Y T lymphocytes are increased in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of allergic asthma patients and sensitive to steroid-induced apoptosis. Eur Resp J 1995; 8: Suppl 19: 1874 252 Sprinzl M.F., Rosset S., Male F.-F. et al. Chronic viral infections causes an apoptosis resistant hepatocellular phenotype by induction of regeneration factors of the liver // Strack P.R. Apoptosis mediated by HIV protease is preceded by cleavage of Bcl-2 // Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, P. 9571-9576 253 Su F., Schneider R.J. Hepatitis B virus HBx protein sensitizes cells to apoptotic killing by tumor necrosis factoralpha // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. –Vol. 94. – P. 8744–8749 254 Su F., Schneider R.J. Hepatitis В virus HBx protein sensitizes cells to apoptotic killing by tumor necrosis factor alpha/TProc NatI Acad Sci 1997, 94(16), 8744-8749 255 Sun X.-M., Bratton S. B„ Butterworth M. et al. Bcl-2 and Bcl-XL Inhibit CD95-mediated apoptosis by preventing mitochondrial release of Smac/DIABLO and subsequent inactivation of X-linked inhibitor-of-apoptosis protein II The journal of biological chemistry. -2002. -Vol. 277. -P. 11345-11351 256 Tao X.-J., Tilly K. I., Maravei D. V. Differential expression of members of 145 the Bcl-2 gene family in proliferative and secretory human endometrium glandular epithelial cell apoptosis is associated with increased expression of Bax // Journal of clinical endocrinology and metabolism. - 1997. - Vol. 82. - N. 8. - P. P2738-P2746 257 Tecchio C, Huber V., Scapini P. et al. IFN-stimulated neutrophils and monocytes release a soluble form of TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/Apo-2 ligand) displaying apoptotic activity on leukemic cells // Blood. - 2004. -V. 103.-P. 3837-3844 258 Terradillos O, Pollicino T, Lecoeur H. p53-independent apoptotic effects of the hepatitis В virus HBx protein in vivo and in vitro//Oncogene 1998, 17(16). 21152123 259 Thompson C. B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science.,1995.- 5203.- 1456-1462 260 Tokano Y., Miyake S., Kayagaki., N et al. Soluble Fas molecule in serum of patients with systemic lupus erythematosus// J Clin immunol . -1996. -Vol.16. P.261-265 261 Toubi E., Kessel A., Goldstein L. et al. Enhanced peripheral T-cell apoptosis in chronic hepatitis C virus infection: association with liver disease severity //J. Hepatol. – 2001. – Vol. 35. – P. 774–780 262 Trauth B.C., Klas C., Peters A.M.J. et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science 1989; 245: 2: 301 263 Ueda M., Kumagai K., Ueki K. et al. Growth inhibition and apoptotic cell death in uterine cervical carcinoma cells induced by 5-fluorouracil. Int J Cancer 1997; 71: 4: 668-674 264 Uslu R., Jewett A., Bonavida B. Sensitization of human ovarian tumor cells by subtoxic CDDP to antifas antibody-mediated cytotoxicity and apoptosis. Gynecol Oncol 1996; 62: 2: 282-291 265 Vaux D.L., Strasser A. The molecular biology of apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996,v.93, P. 2239-2244 266 Wagenaar-Miller R,A,, Gorden L., Matrisian L.M. Matrix metalloproteinases in colorectal cancer: Is it worth talking about?// Cancer and 146 metastases reviews.-2004.-V.23.-P. 119-135 267 Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis // Genes Dev. 2001. -Vol. 15.-N,22.-P. 2922-2933 268 Wang Z.H., Ding M.X., Chew S.B. et al. Bcl-2 and Bax proteins are nuclear matrix associated proteins.// Anticancer Res - 1999. - Vol.19. - P.5445-5450 269 Werner A.B., Vries E., Tait S.W.G. et al. Bcl-2 family member Bfl-l/Al sequesters truncated Bid to inhibit its collaboration with pro-apoptotic Bak or Bax // The journal of biological chemistry. - 2002. - Vol. 277. - P. 22781-22788 270 Werner A.B., Vries E., Tait S.W.G. et al. TRAIL receptor and CD95 signal to mitochondria via FADD, caspase-8/10, Bid, and Bax but differentially regulate events downstream from truncated Bid // The journal of biological chemistry. - 2002. - Vol. 277. - P. 40760-40767 271 Wheeler J.A., Stephens L.C., Tornos C. et al. ASTRO Research Fellowship: apoptosis as a predictor of tumor response to radiation in stage IB cervical carcinoma. American Society for Therapeutic Radiology and Oncology. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1995; 32: 5: 1487-1493 272 White E. Regulation of apoptosis by transforming genes of the DNA tumor virus adenovirus//Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1993, 204(1), P. 30-39 273 Yamamoto K., Ichijo H., Korsmeyer S. J. BcI-2 is phosphorylated and inactivated by an ASKl/Jun N-terminal protein kinase pathway normally activated at G2/M // Molecular and cellular Biology. - 1999. - Vol. 19. - N. 12. - P. 8469-8478 274 Yamasaki F., Tokunaga O., Sugimori H. Apoptotic index in ovarian carcinoma: correlation with clinicopathologic factors and prognosis. Gynecol Oncol 1997; 66: 3: 439-448 275 Yang H.B., Chow N.H., Sheu B.S. et al. The role of Bcl-2 in the progression of the colorectal adenoma-carcinoma sequence // Anticancer Res. - 1999. - Vol. 19. - N. IB.-P. 727-730 276 Yang J., Liu X., Bhalla K. Et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome с from mitochondria blocked // Science. - 1997. - Vol. 275. - P. 11291132 147 277 Yunehara S., Nishimura Y., Kishi S., Ishii A. Expression and function of apoptosis antigen Fas on T cells in thymus and peryphery. Tiss antigens 1993; 42: 4: 253 278 Zhang H., Holzgreve W., Geyter C. Bcl-2-L-10, a novel anti-apoptotic member of the Bcl-2 family, blocks apoptosis in the mitochondria death pathway but not in the death receptor pathway // Human Molecular Genetics. - 2001. - Vol, 10. N. 21. - P. 2329-2339 279 Zhang H., Xu Q., Krajewski S. et al. Bar: An apoptosis regulator at the intersection of caspases and Bcl-2 family proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 2597-2602 280 Zhu N., Khoshnan A, Schneider R. et al. Hepatitis С virus core protein binds to the cytoplasmic domain of TNF receptor 1 and enhances TNF-induced apoptosis// J.Virol. 1998, 72(5), 3691-3697 148 Приложение 1 Отчет о патентных исследованиях Приложение 2 149
