(размер 6.73 MB)
advertisement
1 ЭВОЛЮЦИЯ И МЕТАБОЛИЗМ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ О. В. Мосин, И. Игнатов (Болгария) Метилотрофы – аэробные хемогетеротрофные микроорганизмы, представленные кокковидными и палочковидными подвижными формами, являются обитателями водоемов и почв различного типа, где идут процессы разложения органических веществ с образованием одноуглеродных С1-соединений, способных ассимилироваться метилотрофами. Эти микроорганизмы выделяют из почвы, сточных вод, содержащих гниющие растительные остатки, из рубца жвачных животных и др. Метилотрофные бактерии в последнее время привлекают все большее внимание биотехнологии как источники целого класса природных биологически активных соединений – кормового белка и незаменимых аминокислот, пигментов, липидов и полисахаридов. Генноинженерные методы манипуляции геномом метилотрофов позволяют создать векторы экспрессии человеческих инсулинов на основе микробной ДНК метилотрофов. В настоящей статье приводятся данные по метаболизму метилотрофных бактерий и их биотехнологическому использованию. Methylotrophs - aerobic hemoheterotrophic microorganisms submitted by cocci and bacilli mobile forms, are inhabitants of reservoirs and soils of various type, where there are going on processes of decomposition of organic substances with formation of the one-carbon С1compounds, capable to be assimilated by methylotrophs. These microorganisms are allocated from soil ground, the sewage containing decomposing vegetative remainss, from ruminant paunch, etc. Метилотрофные bacteria recently draw the increasing attention of biotechnology as sources of the whole class of natural biologically active compounds - some fodder fiber and irreplaceable amino acids, pigments, lipids and policarbohydrates. Gene-engineering methods of manipulation with the methylotrophic genom allow to create expression vectors of human insulin on the basis of microbic DNA of methylotrophs. In present article there are submitted data on a metabolism of methylotrophic bacteria and their biotechnological use. Метилотрофы – таксономическая неоднородная группа хемогетеротрофных микроорганизмов представленная облигатными и факультативными метилотрофными бактериями и дрожжами, способными ассимилировать углерод из более восстановленных, чем СО2 одноуглеродных С1-соединений - формальдегид (НСОН), муравьиная кислота (НСООН) и соединений, содержащих метильную группу (СН3-), а также соединений, содержащих две или более метильные группы, не связанные непосредственно друг с другом, например, диметиловый эфир СН3-О-СН3 [1]. В природе из соединений этого класса наиболее широко распространен природный газ метан (CH4), который встречается 2 в залежах угля и нефти и в больших количествах синтезируется метанобразующими бактериями в анаэробных условиях. При распаде пектинов и других природных органических веществ, содержащих метиловые эфиры, образуется метанол (СН3ОН) и этанол (СН3СН2ОН), которые также являются субстратом для роста метилотрофных бактерий. В тканях растений и животных содержатся другие субстраты метилотрофных бактерий – метилформиат (СН3СООН) метиламины (CH3NH2), диметиламины (CH3)2NH, триметиламины (CH3)3N) и их оксиды. Ассимиляция С1-соединений микробной клеткой почти всегда сопряжена с дыханием и осуществляется строгими аэробами. Единственное исключение составляет ассимиляция метанола метанобразующими бактериями в анаэробных условиях. Окислять метан способны только прокариоты. Среди анаэробов такой способностью обладают, метанобразующие архебактерии, сульфатвосстанавливающие эубактерии, многие хемотрофные эубактерии и фототрофные эубактерии. Метиловый спирт также может служить субстратом и для некоторых дрожжей. К метилотрофам относят облигатные и факультативные аэробные эубактерии, обладающие способностью использовать в качестве источника углерода и энергии одноуглеродные соединения. Круг таких микроорганизмов широк. Они представлены различными грамположительными и грамотрицательными формами - представителями семейств Pseudomonas, Bacillus, Hyphomicrobium, Protaminobacter, Arthrobacter, Nocardia и др. [2]. Истинные метилотрофные бактериии принадлежат к семейству Methylococcaceae, включающее роды Methylococcus, представленный вегетативными клетками, напоминающими кокки и коккобациллами (0,7-1,5 × 1,0-1,5 мкм) и Methylomonas, представленный монадами и палочками (0,5-1,0 × 0,7-2,0 мкм). Основным признаком при выделении в это семейство является морфологические особенности и способность использовать метан в качестве единственного источника углерода и энергии в аэробных условиях [3]. Метилотрофы, отнесенные к семейству Methylococcaceae, грамотрицательные эубактерии с разной морфологией и размерами клеток, подвижные или неподвижные. Некоторые штаммы образуют цисты. Интерес к изучению метилотрофов связан не только с особенностями их метаболизма, но и с перспективами их практического использования в биотехнологии как продуцентов полноценного кормового белка и незаменимых аминокислот, в т. ч. лейцина 3 и фенилаланина [4], а также их изотопно-меченых аналогов [5]. Перевариваемость биомассы метилотрофных бактерий составляет 85-98%, а производительность, измеренная уровнем конверсии метилового спирта составляет 37,6-67,5% (табл. 1) [6]. Как было показано нами, благодаря активному росту в минимальных средах с метанолом, высоким выходам биомассы и уровню биоконверсии метанола в компоненты клеточной биомассы (при эффективности конверсии 15,517,3 г. сух. биомассы на 1 г потребленного субстрата) метилотрофные бактерии рассматриваются как дешевые источники дейтерированного белка и аминокислот [7]. Традиционным подходом при этом является выращивание метилотрофных бактерий в средах 2% CD3OD и 98% D2О (табл. 2). Рентабельность получения микробного белка определяется для метилотрофов, в основном, стоимостью такого недорогого и доступного субстрата, каким является метанол. Таблица 1. Параметры роста различных метилотрофных бактерий [6]. Штаммы Молярный бактерий выход Удельная Уровень сухой скорость роста, конверсии биомассы, ч-1 г/моль метанола углерода Количество потребленного азота, % метанола, % Рибулозо-5-монофосфатный путь ассимиляции углерода Pseudomonas C. 17,3 0,49 67,5 13,2 Pseudomonas 17,0 0,63 66,5 11,0 15,7 0,52 62,0 11,7 methanolica Methylomonas methanolica Cериновый путь ассимиляции углерода Pseudomonas 1 12,1 0,17 47,5 11,37 Pseudomonas 12,1 0,14 47,5 11,48 9,8 0,09 37,6 11,20 0,11 51,0 9,40 0,15 51,0 10,60 135 Pseudomonas AM1 Pseudomonas M- 13,1 27 Pseudomonas roseus 13,1 4 Таблица 2. метилотрофной Аминокислотный бактерии состав белкового гидролизата факультативной Brevibacterium metjylicum, полученный с максимально дейтерированной среды с 2% CD3OD и 98% D2О и уровни дейтерированности молекул [7]. Аминокислота Содержание, % Количество атомов Уровень от сухого веса 1 г дейтерия в биомассы дейтерированности углеродный скелет молекул, % от общего молекулы количества атомов водорода Глицин 9.69 2 90.0 Аланин 13.98 4 97.5 Валин 3.74 4 50.0 Лейцин 7.33 5 49.0 Изолейцин 3.64 5 49.0 Фенилаланин 3.94 8 95.0 Тирозин 1.82 7 92.8 Серин 4.90 3 86.6 Треонин 5.51 Метионин 2.25 Аспарагин 9.59 2 66.6 Глутаминовая 10.38 4 70.0 Лизин 3.98 5 58.9 Аргинин 5.27 Гистидин 3.72 кислота Промышленное значение также имеет осуществляемая метилотрофами биотрансформация: иммобилизованные бактерии, клеточные экстракты и очищенные ферменты окисления С1-соединений, в первую очередь метанолдегидрогеназа, катализируют окисление ряда органических соединений с короткой цепью, ароматических и ациклических углеводородов, фенолов, спиртов и гетероциклических углеводородов [8]. Биотрансформация приводит к получению продуктов, имеющих промышленное значение, например, получение из пропилена и пропиленоксида субстрата для синтеза 5 синтетических полимеров. При определенных условиях выращивания метилотрофных бактерий до 60% их биомасы составляет поли-β-гидроксибутират – биополимер, имеющий промышленное значение как заменитель пластмасс [9]. Содержание фосфолипидов – кардиолипина, фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в клеточных мембранах метилотрофных бактерий достигает 810% от веса сухой биомассы, что делает актуальным использование метилотрофных бактерий в качестве источников недорогих фосфолипидов для косметической промышленности, медицины и диагностических целей [10]. Кроме того, некоторые метилотрофы являются источниками цитохрома С, что позволяет заменить использующийся в кардиологии препарат цитохрома С, источником которого является сердечная мышца млекопитающих [11]. Метилотрофы могут служить основой для создания генно-инженерных штаммовпродуцентов эукариотических белков медицинского и ветеринарного назначения. Уровень экспрессии некоторых генов, например, интерферонов α1 и αf в клетках метилотрофов выше, чем в E. coli [12]. Кроме того, метилотрофы способны синтезировать пигменты различной природы (меланины, каротиноиды, продигинины), выполняющие различные защитные функции в клетке [13]. Пигменты метилотрофных бактерий представляют интерес в плане их практического использования: каротиноиды используются в качестве провитаминов в составе кормовых добавок и пищевых красителей. Меланогенные метилотрофы могут использоваться радиопротекторных для и получения диоксифенилаланина, гуминоподобных веществ. Интерес антиканцерогенных, к использованию метилотрофных бактерий в биотехнологии возрастает благодаря разработке новых современных технологий химического синтеза метанола. ОБЛИГАТНЫЕ МЕТИЛОТРОФЫ По способности утилизировать углерод метилотрофы подразделяются на две основные таксономические подгруппы микроорганизмов - облигатные и факультативные метилотрофы [14]. Облигатные метилотрофы способны расти только на метане; из других субстратов их рост могут поддерживать лишь метанол и диметиловый эфир. Факультативные метилотрофы способны расти не только на метаноле и метиламинах, но и 6 не на метане и некоторых полиуглеродных соединениях. Часто они растут также на муравьиной кислоте и на небольшом числе простых С2- и С4- соединений (табл. 3). Таблица 3. Субстраты облигатных и факультативных метилотрофов (на примере характерных преставителей каждой группы) [14]. Субстраты Облигатные Факультативные метилотрофы метилотрофы (Methylomonas) (Hyphomicrobium) С1-соединения Метан (СН4) + - Диметиловый эфир (СН3-О- + - + + Муравьиная кислота (НСООН) - + Этиловый спирт (С2Н5ОН) - + Уксусная кислота (CH3COOH) - + β-оксимасляная кислота - + СН3) Метиловый спирт (СН3ОН) С2-соединения С4-соединения (CH3CH (OH) CH2COOH) Первая облигатная бактерия Methylomonas methanica, грамотрицательная палочка с полярными жгутиками, была описана почти 100 лет назад и в течение нескольких десятилетий оставалась единственной известной бактерией, способной окислять метан (рис. 1). Развитие и усовершенствование методов накопления и очистки окисляющих метан бактерий в последнее время привело к открытию большого числа новых микроорганизмов, сходных по свойствам, но разнообразных по структуре. 7 Рис. 1. Микрофотография палочковидной облигатной метилотрофной бактерии Methylomonas methanica [15] Характерной особенностью метилотрофов является наличие в клетке развитой системы внутрицитоплазматических мембран, которые могут быть разделены на два типа: внутрицитоплазматические мембраны I типа представлены стопками плотно упакованных везикулярных дисков, распределенных по всей цитоплазме; внутрицитоплазматические мембраны II типа имеют вид ламелл, расположенных по периферии цитоплазмы клетки [16]. По топологии и строению эти мембранные системы напоминают внутрицитоплазматические мембраны некоторых нитрифицирующих бактерий. 8 Рис. 2. Электронные микрофотографии тонких срезов клеток трех облигатных метилотрофов с внутрицитоплазматическими мембранными системами двух типов. A. Methylococcus; мембранная система типа I; Б. Methylomonas; мембранная система типа I; В. Methylosnus; мембранная систематипа II [16] Исходя из структурных особенностей внутриплазматических мембран, все облигатные метилотрофные бактерии можно разделить на две основные группы – палочковидные и кокковидные бактерии. Некоторые из них образуют устойчивые к высушиванию покоящиеся клетки, которые по свой структуре напоминают цисты, аналогичные азотфиксирующей бактерии Azotobacter и экзоспоры, представляющие собой небольшие сферические клетки, отпочковавшиеся от полюсов родительской клетки [17] (рис. 3). 9 Рис. 3. Электронная микрофотография экзоспор Methylosinus. На вставке - микрофотография отпочковывающихся экзоспор [17]. Наилучшими субстратами для всех облигатных метилотрофных бактерий является метан и метанол. Скорость роста бактерий на метаноле не велика. Облигатные метилотрофы способны окислять лишь немногие из органических субстратов, не способных поддерживать их рост. К таким соединениям относятся муравьиная кислота (НСООН), которую они окисляют до СO2, этилен (С2Н4), этиловый спирт (СН3СН2ОН), окисляемые до ацетальдегида (СН3СНО). В качестве источников азота эти бактерии могут использовать как нитрат, так и аммиак. Однако аммиак, являясь ингибитором окисления метана, снижает скорость роста бактерий, если его концентрация в среде превышает 0,05%. В содержащих аммиак средах образуются следовые количества нитрата. Таким образом, окисляющие метан бактерии являются нитрификаторами, хотя научные данные о том, что они могут получать энергию при таком незначительном в количественном отношении окислении аммония, не многочисленны. ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ МЕТИЛОТРОФЫ Хотя облигатные метилотрофы способны расти только за счет ассимиляции метанола в качестве единственного источника углерода, накопительные культуры при потреблении этого субстрата обогащаются микроорганизмами другого типа, так называемыми факультативными метилотрофам. Эти бактерии, в отличие от облигатных метилотрофов, способны наряду с метаном и метанолом ассимилировать в качестве источников углерода другие одноуглеродные и некоторые полиуглеродные соединения. 10 Лучше всего из факультативных метилотрофов изучена почкующаяся бактерия Hyphomicrobium. Она является мощным денитрификатором, и ее можно выделить из накопительной культуры, проводя инкубацию микроорганизмов в анаэробных условиях в среде, содержащей метиловый спирт и ионы аммония (табл. 3). Из аэробных накопительных культур с метанолом была выделена грамотрицательная палочковидная факультативная метилотрофная бактерия Brevibacterium methylicum, реализующая рибулозо-монофосфатный цикл ассимиляции углерода, продуцент фенилаланина и другие аналогичные по способу ассимиляции углерода бактерии [18]. В отличие от традиционных штаммов-продуцентов фенилаланина, у которых нарушены активности префенатдегидратазы или дезоксиарабиногептулозофосфатсинтетазы, уникальность выделенного нами штамма Brevibacterium methylicum состоит в том, что для биосинтеза L-фенилаланина необходим L-лейцин. Для его выделения и селекции исходный родительский штамм обрабатывали нитрозогуанидином с последующим скринингом колоний по признаку устойчивости к аналогу фенилаланина – метафторфенилаланину (50 мкг/мл). Выделенные на селективных средах аналогорезистентные мутанты Brevibacterium methylicum конвертировали метанол и накапливали до 1 г/л фенилаланина в культуральной жидкости, что важно для биотехнологического использования данного штамма. МЕТАБОЛИЗМ МЕТИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Процесс ферментативного окисления метана в клетках метилотрофных бактерий может быть представлен в виде следующей схемы: СН4 СН3ОН НСНО НСООН СО2 Начальная стадия окисления метана до метанола катализируется ферментом метанмонооксигеназой. В научной литературе описаны две формы этого фермента: связанная с внутрицитоплазматическими мембранами и растворимая метанмонооксигеназа [19]. Донором электронов для первой может быть восстановленный 11 цитохром или НАД.Н2, образующийся в результате обратного электронного транспорта, для второй - только НАД(Ф).Н2, или соединения, которые окисляются с его образованием. Последующие этапы ферментативного окисления метанола катализируются соответствующими дегидрогеназами, различающимися строением, природой акцепторов электронов и другими параметрами. Энергетическая эффективность окисления С1-соединений соответствующими дегидрогеназами определяется местом поступления электронов в дыхательные цепи, которые по составу переносчиков и их локализации на мембране похожи на таковые большинства аэробных эубактерий. В окислительном метаболизме С1-соединений участвуют НАД.Н+, флавины, хиноны, цитохромы b, с, а, о. Окисление метанола до формальдегида, катализируется ферментом метанолдегидрогеназой, содержащим в качестве простетической группы останок пирроло-хинолин хинона (коферментPQQ), сопровождается передачей электронов в дыхательную цепь митохондрий на уровне цитохрома с. Это приводит к синтезу одной молекулы АТФ (рис. 4). Рис. 4. Дыхательная цепь переноса электронов. Обозначения: Цит - цитохром, Q - хинон, Фл – флавопротеин. 12 Формальдегид у метилотрофов является ключевым метаболитом, на уровне которого расходятся конструктивные и энергетические пути [20]. Часть формальдегида превращается в вещества клетки по специфическим для метилотрофных бактерий ассимиляционным циклическим путям, большая часть окисляется с участием НАД +зависимой формальдегиддегидрогеназы до формиата, который затем с помощью формиатдегидрогеназы расщепляется на СО2. Окисление формальдегида и формиата, зависимое от НАД+, позволяет предполагать, что перенос пары электронов может быть связан с трансмембранным перемещением протонов с участием АТФ. Полученные экспериментальные данные указывают, однако, на меньшие выходы АТФ. Вопрос о том, на каком уровне передаются электроны от формальдегида и формиата в дыхательную цепь, не вполне ясен. Некоторые грамположительные метилотрофные бактерии используют для своего роста в качестве субстрата этиловый эфир (С2Н5-О-С2Н5). Это соединение расщепляется при окислении путем оксигенации, в результате чего образуются этиловый спирт (СН3СН2ОН) и ацетальдегид (СН3СНО): C2H5-0-C2H5 + 02 + НАД.Н + Н+ СН3СН2ОН + СН3СНО + НАД+ + Н2О Аналогичное окисление диметилового эфира метановыми бактериями может приводить к образованию метилового спирта и формальдегида, хотя механизм приведенной ниже реакции окончательно не изучен. СН3- О-СН3 + О2 + НАД.Н+ СН3ОН + НСНО + НАД+ + Н2О. В отличие от окисления метилового спирта, которое идет с участием фермента метанолдегидрогеназы, окисление первичных спиртов осуществляется пиридин- зависимыми дегидрогеназами. Эксперименты, проведенные нами по изучению за включением дейтерия в компоненты клеточной биомассы за счет ассимиляции дейтерометанола (CD3OD) при росте метилотрофных бактерий Methylobacillus flagelatum и Brevibacterium methylicum на водной среде с CD3OD, показали незначительное количество дейтерия, поступающее в молекулы с углеродом CD3OD (не более 5%) [21]. Полученный результат объясняется разбавлением дейтериевой метки за счёт протекания биохимических процессов, связанных с распадом CD3OD при его ассимиляции клеткой, так и реакциями изотопного 13 обмена и диссоциации в водной среде. Так, из четырёх атомов дейтерия в молекуле CD3OD, лишь один атом дейтерия при гидроксильной группе -OD самый подвижный и поэтому легко диссоциирует в водной среде с образованием CD3OH. Три оставшихся атома дейтерия в молекуле CD3OH входят в цикл ферментативного окисления метанола, который приводит к потере дейтериевой метки за счёт образования соединений более окисленных, чем метанол. В частности, такое включение дейтерия в компоненты клеточной биомассы подтверждает классическую схему ферментативного окисления метанола до формальдегида в клетках метилотрофов, который после этого ассимилируется РМФ-или сериновым путем фиксации углерода. АССИМИЛЯЦИЯ УГЛЕРОДА МЕТИЛОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ Метилотрофы способны образовывать углерод клетки из C1-соединений, как из органического субстрата, так и за счет ассимиляции СО2, образующегося при окислении С1-соединений в восстановительном пентозофосфатном цикле (цикл Кальвина), приводящему к фиксации углекислоты и образованию из нее молекулы гексозы [22]. Однако эксперименты с использованием С-меченых углеродных субстратов показали, 13 что основная масса углерода клетки происходит из окисляемого субстрата, а не из СО2. Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) также не играет существенной роли в системе катаболических путей метилотрофов: активность ферментов ЦТК цикла в клетках метилотрофов невысока. На самом деле источником углерода клетки является промежуточное соединение формальдегид, который у метилотрофов является ключевым метаболитом, на уровне которого расходятся конструктивные и энергетические пути, приводящие к двум основным путям ассимиляции C1-соединений в вещества клетки – рибулозомонофосфатному и сериновому циклам [23]. Ферменты, катализирующие биохимические реакции, специфичны для каждого цикла. Рибулозомонофосфатный путь, во многом аналогичен циклу Кальвина при ассимиляции СО2. Ключевыми реакциями рибулозомонофосфатного пути является присоединение формальдегида к рибулозо-5-фосфату, катализируемое гексулозофосфатсинтазой с образованием фосфорилированного сахара гексулозо-6фосфата, который затем изомеризуется во с участием фосфогексулозоизомеразы во фруктозо-6-фосфат (рис. 5, А). Затем фруктозо-6-фосфат подвергается фосфорилированию с участием фосфофруктокиназы. Образовавшийся фруктозо-1,6-дифосфат расщепляется 14 на две триозы: 3-фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА) и фосфодиоксиацетон, который используется в дальнейших ферментативных реакциях. 3-ФГА и фруктозо-6-фосфат участвуют в серии реакций, приводящих к регенерации акцептора формальдегида рибулозо-5-фосфата. пентозофосфатного Эти реакции цикла, аналогичны в котором таковым для происходит восстановительного катализируемое рибулозодифосфаткарбоксилазой акцептирование рибулозо-1,5-дифосфатом молекулы СО2 и последующее гидролитическое расщепление образовавшейся гексозы на 2 молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК), которые затем подвергаются серии последовательных ферментативных превращений, ведущих к образованию молекулы глюкозы (рис. 6). Однако, у метилотрофов восстановительный пентозофосфатный цикл не имеет широкого распространения и обнаружен только у отдельных представителей, способных расти автотрофно, а также у тех, кто может использовать муравьиную кислоту (НСООН) за счет ассимиляции СО2. Необходимым условием для роста метилотрофов на муравьиной кислоте является способность синтезировать два ключевых фермента данного цикла - фосфорибулокиназу и рибулозодифосфаткарбоксилазу. Рис. 5. Пути ассимиляции рибулозомонофосфатный формальдегида цикл: Ф1 - метилотрофами: Обозначения: гексулозофосфатсинтаза; Ф2 А - фосфогексулозоизомераза; Ф3 - фосфофруктокиназа; Ф4 - фруктозодифосфатальдолаза; прерывистой линией обозначены реакции регенерации рибулозо-5- фосфата, аналогичные 15 соответствующим реакциям ПФ цикла, изображенным на рис. 6; Б - сериновый цикл: Ф1 сериноксиметилтрансфераза; Ф2 - серинглиоксилатаминотрансфераза; Ф3 - оксипируватредуктаза; Ф4 - глицераткиназа; Ф5 - енолаза; Ф6 - ФЕП-карбоксилаза; Ф7 малатдегидрогеназа; Ф8 - малаттиокиназа; Ф9 - малил-КоA-лиаза. Рис. 6. Восстановительный пентозофосфатный цикл. Обозначения: Ф1 - рибулозодифосфаткарбоксилаза; Ф2 - 3-фосфоглицераткиназа; Ф3 - 3-ФГА-дегидрогеназа; Ф4 - триозофосфатизомераза; Ф5 - фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза; Ф6 - 1,6фосфофруктозофосфатаза; Ф7 - глюкозофосфатизомераза; Ф8 - глюкозо-6-фосфатаза; Ф9 транскетолаза; Ф10 - альдолаза; Ф11 - дифосфатаза; Ф12 - фосфопентозоизомераза; Ф13 фосфопентозоэпимераза; Ф14 - фосфорибулокиназа. Сериновый путь существенно отличается от РМФ пути ассимиляции углерода природой интермедиатов и ферментами (рис. 5, Б). Ключевым ферментом этого пути является сериноксиметилтрансфераза, которая катализирует образование серина из 16 глицина и формальдегида, находящегося в виде производного тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФ): HCOH-ТГФ + CH2NH2COOH СН2ОНСНNН2СООН+ТГФ Через цепь последовательных реакций трансаминирования серин превращается в оксипировиноградную кислоту, последовательное восстановление и фосфорилирование которой приводит к образованию 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК) (рис. 5, Б). Одна часть 3-ФГК используется для регенерации глицина, первичного акцептора С1, другая часть 3-ФГК под действием фермента енолазы превращается в фосфоенолпировиноградную кислоту (ФЕП) и участвует в последующих реакциях. Последующее карбоксилирование ФЕП с участием ФЕП-карбоксилазы приводит к синтезу молекулы щавелевоуксусной кислоты (ЩУК). Эта реакция примечательна тем, что в сериновый цикл вовлекается СО2. Затем ЩУК с участием малатдегидрогеназы превращается в малат, который в свою очередь под воздействием малил-КоA-лиазы расщепляется на глиоксиловую кислоту и ацетил-КоА. Последующая серия реакций приводит к регенерированию глицина, и, таким, образом, цикл замыкается (рис. 5, Б). Исследование распределения двух циклических путей ассимиляции углерода у факультативных и облигатных метилотрофов – РМФ- и серинового пути привело к интересной особенности строения внутиплазматической мембраны [24]. Так, ассимиляция формальдегида через рибулозомонофосфатный цикл характерна для метилотрофов, имеющих мембранную организацию I типа, а через сериновый - для метилотрофов с системой внутрицитоплазматических мембран II типа. Другая отличительная особенность заключается в том, что у факультативных метилотрофов чаще встречается сериновый путь. Среди облигатных метилотрофов сериновый путь функционирует только у тех организмов, которые обладают мембранной системой типа II (Methylosinus, Methylocystis), а рибулозомонофосфатный путь - у метилотрофов с мембранной системой типа I (Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus). ПРОИСХОЖДЕНИЕ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ Поскольку пищевые потребности хемоавтотрофов и метилотрофов весьма просты, их когда-то считали "примитивными" организмами, относящимися, возможно, к самым ранним формам жизни на Земле. Позднее представление об их месте в эволюции живых 17 организмов изменилось. Биохимический аппарат данных бактерий оказался таким же сложным, как и у большинства хемогетеротрофных бактерий [25]. Самые первые живые организмы на Земле возникли в анаэробных условиях, когда первобытный океан в изобилии содержал образованные ранее органические вещества. Богатая кислородом биосфера возникла гораздо позднее, около 2 млрд. лет назад. Этот важнейший геохимический переворот в эволюции объясняется фотосинтезом. При таком характере эволюции аэробные хемоавтртрофы и метилотрофы могли появиться на Земле только после того, как развился оксигенный фотосинтез. Можно предположить, что хемоавтотрофы и метилотрофы возникли из общих прокариотических микроорганизмов предшественников, которые осуществляли фотосинтез, но утратили аппарат фотосинтеза, а их цепи переноса электронов, функционировавшие при фотосинтезе, стали выполнять новую функцию ассимиляции С1-соединений. Некоторые представители этих двух основных групп прокариот, фотосинтезирующей и нефотосинтезирующей, обладают весьма интересными свойствами. К ним относятся наличие нескольких сложных, характерных для них типов систем внутренних мембран; отсутствие функционирующего цикла трикарбоновых кислот; наличие цикла Кальвина или его аналога, пентозофосфатного цикла; локализация в карбоксисомах ключевого фермента цикла Кальвина (рибулозодифосфаткарбоксилазы). Последние факты свидетельствуют о роли метилотрофов в эволюции микроорганизмов. Метилотрофы играют важнейшую роль в кругообороте метана и других С1-соединений в биосфере, которые поддерживаются на постоянном уровне главным образом за счет деятельности метилотрофов. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Гальченко В. Ф., Андреев А. В., Троценко Ю. А. Таксономическая идентификация метилотрофных бактерий. Пущино. ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1986, с. 95. 2. Романовская В. А., Мохамед эль Саид. Современное состояние класификации метилотрофных бактерий, Микробиология, 1988, Е 48, № 2, с. 97-108. 3. Троценко Ю. А. Биохимия и физиология метилотрофных микроорганизмов. Сборник научных статей АН СССР, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов, Пущино, 1987, с. 15. 18 4. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Акимова О.Л. Биосинтетическое получение дейтериймеченого фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum // Биотехнология. 1993. № 9. С. 1620. 5. Karnaukhova E.N., Mosin O.V., Reshetova O.S. Biosynthetic production of stable isotope labeled amino acids using methylotroph Methylobacillus flagellatum // Amino Acids. 1993. V. 5. N 1. P. 125. 6. Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. Convertion of stable isotope labeled methanol to components of bacterial biomass, in: 6 th Eur. Conf. of Biomass for Energy. Athens. Greece, 1991. P. 234. 7. Складнев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии – источники изотопномеченых 2Н- и 13 С-аминокислот // Биотехнология. 1996в. № 5. С. 25-34. 8. Гальченко В. Ф. Рост микроорганизмов на С1-соединениях. Пущино. ОНТИ НЦ БИ АН СССР, 1977, с. 10-14. 9. Suzuhi T., Yamahi T. Mass production of poli-beta-hydroxybutyric acid by fully automatic fed-batch culture of methylotrophs. Appl. Microbiol. And Biotechnol., 1986, V. 23, p. 322-329. 10. Андреев Л. В. Биосинтез и метаболизм липидов у микроорганизмов. Пущино. ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1979, с. 31. 11. Carver M.A., Jones C. W. The role of C-type cytochromes in the terminal respiratory chain of the methylotrophic bacterium Methylophilus methylotrophus. // Arch. Microbiol., 1983, V. 47, p. 275-280. 12. Чистосердов А. Ю. , Еремашвили М. Р. Экспрессия гена человеческого интерферона αF в облигатном метилотрофе Methylobacillus flagellatum KT. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1987, Т. 8, с. 36-41. 13. Феофилова Е. П. Пигменты микроорганизмов, Москва, Наука, 1974, с. 218. 14. Цыганков Ю. Д. Физиологическая характеристика метилотрофных бактерий. Биология термофильных микроорганизмов, Москва, Наука, 1986, с. 31-50. 15. Whittenbury R., Phillips К. С., Wilkinson Л. F., Enrichment, Isolation and some properties of methane-utilizing bacteria, J. Gen Microbiol., 61, 205 (1970).] 19 16. Davies S. L., Whittenbury R. Fine structure of metnane and other hydrocarbonutilizing bacteria, J. Gen. Microbiol., 61, 227 (1970).] 17. Whittenbury R., Davies S. L., Davey S. L., Exospores and cysts formed by methane utilizing bacteria, J. Gen. Microbiol., 61, 219 (1970). 18. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. V. 62. N 2. P. 225-229. 19. Anthony C. Bacterial Oxidation of Methane and Methanol. In: Advances in Microbial Physiology, A. H. Rose, D. W. Tempest (eds.), 1986. V. 27. p. 114-210. 20. Quayle I. R. The Metabolism of One-Carbon Compounds by Microorganisms, Adv. Microb. Physiol. 1972, V. 7, p. 119. 21. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич А.М., Швец В.И. Изучение биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтерометанол //Биотехнология. – 1996а. - N 3. - С. 3-12. 22. Trotsenko Y. A., Murrel J. C. Pathways of primary C1 assimilation and intermediary metabolism. Metabolosm of aerobic methanotrophs. In: Advances in Applied Microbiology, 2008, V. 63, London, Academic Press, Elsevier, p. 205-206. 23. Trotsenko Y. A., Khmelenina V. N., Beschastny A. P. The Ribulose Monophosphate (Quayle) Cycle: News and Views. Microbial Growth on C1 Compounds, in: Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Growth on C1 Compounds (Lindstrom M.E., Tabita F.R., eds.). 27 August – 1 September 1995. San Diego (USA). Kluwer Academic Publishers. Boston. 1995. 24. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs. Methylotrophic microorganisms. London, New York, Academic Press, 1982, p. 351-378. 25. Kelly D. P. Autotrophy: Concepts of Lithotrophic Bacteria and Their Organic Metabolism. // Ann. Rev. Microbiol. 1970, V. 25, p. 177. 20 METHYLOTROPHIC BACTERIA AND THEIR METABOLISM O.V. Mosin, Cand. Chem. Sci., Moscow State University of Applied Biotechnology I. Ignatov, Doctor of Sciences, The scientific research institute of biomedical studiws, Bulgaria Annotation Methylotrophs constitutied by aerobic hemoheterotrophic microorganisms submitted by cocci and bacilli analogous mobile forms, are inhabitants of natural reservoirs and soils of various types where there are going on the processes of decomposition of organic substances with formation of the one-carbon С1-compounds, capable to be assimilated by methylotrophs. These microorganisms are allocated from ground, the sewage containing decomposed vegetative remains, paunch of ruminants, etc. Methylotrophic bacteria recently draw the increasing attention of biotechnology as sources of the numerous class of natural biologically active compounds - fodder fiber and irreplaceable amino acids, pigments, lipids and policarbohydrates. Gene-engineering methods of manipulation with the genom of methylotrophs allow to create expression vectors of human insulin on the basis of microbic DNA of methylotrophs. In present article are submited the data on metabolism of methylotrophic bacteria and their biotechnological using. Сведения об авторах: О. В. Мосин, к. х. н., Московский государственный университет прикладной биотехнологии, mosin-oleg@yandex.ru И. Игнатов, биофизик, доктор Европейской академии Естественных наук (Германия), директор научно-исследовательского mbioph@dir.bk центра медицинской биофизики (Болгария),