Учебно-методическая работа - Кабардино
advertisement
Учебно-методическая работа: СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЦИТОГЕНЕТИКА И КАРИОСИСТЕМАТИКА ЖИВОТНЫХ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ для специальности 020201 – Биология Нальчик 2009 УДК 26.220.8 (075) ББК 504.064 С-12 Рецензент: д.б.н., проф., Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии О.О.Гетоков Составители: Р.И. Дзуев, В.Н. Канукова, А.А.Чепракова Учебно-методическое пособие составлено в соответствии с рабочей программой по курсу «Сравнительная цитогенетика и кариосистематика животных» (ДС.02.4) для студентов биологического и медицинского отделения. Рекомендовано РИСом университета УДК 26.220.8 (075) ББК 504.064 С-12 Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х. М. Бербекова, 2008 Содержание Введение 3 Тема 1. Приготовление препаратов хромосом у млекопитающих. 6 Различные методы окраски хромосомных препаратов Задание для самостоятельной работы по теме №1 Тема 2. Эволюционные преобразования кариотипа млекопитающих Задание для самостоятельной работы по теме №2 Тема 3. Кариотип как систематический признак. Хромосомный 29 29 35 36 полиморфизм у млекопитающих. Кариотипическая и морфологическая изменчивость млекопитающих Кавказа Задание для самостоятельной работы по теме №3 Тема 4. Особенности кариотипической эволюции млекопитающих в горах 41 42 Кавказа Задание для самостоятельной работы по теме №4 Литература 49 50 Введение Кариология млекопитающих - одно из быстро развивающихся направлений териологических исследований. Библиография, выполненных в этой области работ, к настоящему времени насчитывает более 1000 названий, причем подавляющее большинство их относится к последним 15-20 годам. Бурное развитие кариологии млекопитающих объясняется, во-первых, методическим прогрессом, позволившим получать надежные фактические данные, и, вовторых, эффективностью этих данных в решении ряда проблем териологии и в целом общей биологии. Открытие в природных популяциях видов-двойников у млекопитающих позволило по-новому оценить значение кариологических исследований в систематике, биогеографии и филогении этой группы животных. Без привлечения кариологических данных, как отмечает академик В.Е.Соколов в предисловии к монографии В.Н.Орлова и др. "Сравнительная цитогенетика и кариосистематика млекопитающих" (М.: Наука, 1983), "... ныне ни одно новоописание не может считаться совершенным". Отечественные исследователи в истории развития цитогенетики позвоночных животных выделяют три периода, в основном связанные с прогрессом методов исследования. Например, В.Н.Орлов и др. (1983) к первому периоду относят работы, опубликованные в 30-, 40- и 50-е годы, и указывают на весьма низкий методический уровень в те годы. Второй период охватывает 50-70-е годы и связан с существенным методическим прогрессом в технике приготовления хромосомных препаратов: обработка клеток в гипотоническом растворе (Makino, Nishimura, 1952), использование спирт-уксусной смеси для фиксации (Sashs, 1953), предварительная колхицинация (Ford, Hamerton,1956), методика "высушенных" препаратов (Rothfels et al, 1958) и т.д.; все это произвело настоящую революцию в цитогенетике млекопитающих. В этот период наиболее бурно развивались исследования хромосомного набора рутинным методом; он был исследован более чем у 1200 видов млекопитающих. Третий период начался с начала 70-х годов, он связан с разработкой и внедрением различных методов дифференциальной окраски хромосом ("полосатые", хромосомы). Благодаря этим методам в последние годы получена возможность прямой идентификации хромосом на основе выявления специфического рисунка поперечной исчерченности, что позволило проследить эволюцию кариотипа как в пределах вида, так и в таксонах более высокого ранга (род, семейство, отряд и т.д.). Некоторые из этих методов (С и О -окраски) оказались наиболее надежными систематическими признаками при исследовании ряда видов-двойников у млекопитающих. В истории кариологии известный цитогенетик и эволюционист М.Дж.Д.Уайт ( White, 1973) предлагает различать шесть уровней развития: 1) альфа-кариология - позволяет определять число и относительные размеры хромосом; 2) бета-кариология -дает возможность изучения относительной длины плеч хромосом м выявления центромер, а также определения половых хромосом; 3) гамма-кариология - пользуется методами дифференциальной окраски хромосом и дает возможность составления карта-дисков; 4) дельта-кариология - связана с определением локализации сателлитиой ДНК ядрышкообразующих районов и локусов, кодирующих синтез рРНК; 5 и 6) эпсилон и дзета кариологии - позволяют выявлять активно работающие участки, что позволяет составлять карты строения и функционирования хромосом. Таким образом, все исследования по сравнительной кариологии; и большая часть исследований по цитогенетике млекопитающих выполняются с использованием метода анализа метафазных хромосом. Живые ткани животных, обладающие наиболее высокой митотической активностью (костный мозг, селезенка, печень и др.) можно успешно использовать для приготовления хромосомных препаратов. В предлагаемых вниманию читателей методических указаниях представлены наиболее общепринятые методы, позволяющие любому исследователю быстро и надежно получать микропрепараты хромосом; проводить их анализ, кариотипирование (применительно в основном к млекопитающим, в том числе и человеку), с которым в настоящее время приходится иметь дело и биологу, ведущему исследования по фундаментальным проблемам организации хромосом, врачу-цитогенетику, занимающемуся изменчивостью и диагностикой хромосомных болезней человека, а также систематику эволюционисту, изучающему кариотип как систематический признак, для исследования филогении животных; а также интерпретацию результатов. А также данные по эволюционным преобразованиям кариотипа; оценка кариотипа как систематико- таксономического признака. Каждый раздел снабжён заданиями для самостоятельной работы, которые призваны способствовать углублению знаний студентов в области сравнительной кариосистематики. Тема 1. Приготовление препаратов хромосом у млекопитающих. Различные методы окраски хромосомных препаратов Оборудование и химреактивы, необходимые для приготовления и анализа микропрепаратов хромосом у млекопитающих: Оборудование: Микроскоп МБР-1 или 6, "Ergoval", медицинские шприцы (1 см и 2 см с иглами разного диаметра), центрифужные пробирки, пастеровские пипетки, плитка электрическая, водяная баня, химические стаканчики (50, 100, 150, 200 мл), ножницы, скальпели, пинцеты, зажим, предметные и покровные стекла, спиртовка, термометр (спиртовой), мерные пипетки (5-10 см), мерные стаканы (50, 100, 250 мл), флакон для фиксатора (желательно с притертой пробкой), пробки резиновые, бумага фильтровальная и оберточная, холодильник, термостат, рН-метр, фотоаппарат типа "Зоркий", пленка "Микрат 200", клей ДВА, ватман. Химреактивы: колхицин, метиловый и этиловый (гидролизный) спирт, КС1, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода, канадский бальзам, ксилол, гепарин, фитогемагглютинин (ФГА) Фирмы Ditco или Gibco, раствор трипсина (0.25% и 0,025%), антибиотики (смесь пенициллина и стрептомицина, например, Gibco), среда питательная Игла, Эрла, Хенкса или среда 199, соляная кислота, серная кислота, гидроксид бария (Ва(ОН) 2.8Н20), NaCl (химически чистый), цитрат натрия трехзамещенный, краситель азур эозин по-Романовскому, КН3РО4, Na 2 HP04 . Как показано во введении, история развития цитогенетики млекопитающих млекопита ющих иллюстрирует определенную зависимость этой дисциплины от прогресса в области методов исследования и их модификации. Экспериментальное исследование хромосом может быть сведено к трем основным этапам: 1) приготовление хромосомных препаратов; 2) разли чные метафазных хромосом в митозе и 3) изучение числа, формы и размеров хромосом (анализ). По приготовлению хромосомных препаратов существует большое число методов, но в нашем руководстве мы сочли целесообразным дать описание трех наиболее общепринятых методов: способы окраски 1) «высушенных» препаратов (Ford, Наmerton, 1956; Rothfels et а1, 1958): 2) кратковременной культуры клеток (Козловский, 1973; Орлов и др., 1983); 3) культуры лейкоцитов периферической крови «макрометод» (Мооrhead е1 а1, 1960; Орлов и др., 1983; Макгрегор, Варли, 1986). Различия между «прямым» и культуральным методами касаются лишь первого этапа работы, а именно способа получения материала, из которого будут приготовлены препараты хромосом. Начиная с момента получения суспензии клеток в гипотоническом растворе, непосредственное приготовление хромосомных препаратов остается в сущности неизменным. Ниже приводится краткое описание вышеперечисленных методик с некоторыми нашими модификациями применительно как для работы в полевых условиях, так и в лаборатории. Метод вводится «высушенных», 0,04 %-ый грамм живого этапа с желательно веса водный животного. промежутком держать раствор вниз 15-20 головой, препаратов. колхицина Колхицин минут. как Животным из расчета можно При это от вводить введении показано внутрибрюшинно 1 до по 2 см3 частям колхицина на рис. 1. на 100 в два животного В этом случае внутренние органы зверька оказываются «спавшими» вниз к диафрагме, что позволяет не задевать их иглой шприца во время колхицинации. 1. Сделайте животному внутрибрюшинную инъекцию колхицина. 2. Отпрепарируйте после забоя животного бедренную кость и очистите ее от прилегающих тканей. Осторожно удалите ножницами верхушечные части эпифизов, срезая их в наиболее широкой части утолщения кости. 3. Вставляя медицинский шприц с соответствующей иглой в костно-мозговую полость и пропуская через нее 0,56 %-ый раствор КС1, промойте в центрифужную пробирку костный мозг. 4.После мокрого завершения предметного фиксации стекла с нанесите суспензию клеток на поверхность холодного и помощью пастеровской пипетки и высушите препарат на воздухе (Подробнее см. в тексте). Рис.1 Схематическое изображение метода получения препаратов митотических хромосом из клеток костного мозга млекопитающих Через 0,5-12 часа зверька с помощью эфира умерщвляют, извлекают бедренную кость животного (если зверьки малого размера, то обе бедренные кости), быстро и тщательно очищают ее от мышц и сухожилий. Затем осторожно обрезают эпифизы (дистальные части) кости, а костный мозг из части оставшихся эпифизов и диафиза вымывают при помощи медицинского шприца с соответствующей иглой 0,56 %-ым раствором хлорида калия (КСl-гипотонический раствор) в центрифужную пробирку (рис. 1). Полученную суспензию выдерживают в этой гипотонической среде 5-10 минут (лучшие результаты дает 7 минут) при 37° С. В течение этого времени клетки костного мозга дважды ресуспензируются с помощью пастеровской пипетки с тем, чтобы разбить глыбки костного мозга. По окончании инкубации суспензию клеток осаждают центрифугированием на электрической или ручной (в полевых условиях) центрифуге со скоростью 800-1000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Затем надосадочную жидкость осторожно сливают и заменяют свежеприготовленным холодным (+4°С) фиксатором, состоящим из смеси метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (из расчета 3 части метанола на 1 часть уксусной кислоты). Первая фиксация длится 30 минут в холодильнике или в холодном месте, после чего фиксатор осторожно сливают, чтобы не взболтать осадок. Если осадок разбился, то необходимо повторное центрифугирование в течение 3-5 минут. Затем производят замену фиксатора на «свежий» (из холодильника). Время остальных фиксации (второй, третьей и т.д.) варьируется в пределах от 1 часа до суток (в зависимости от того, как скоро нужно получить микропрепараты). После окончания фиксации старый фиксатор осторожно сливают и заменяют холодным свежеприготовленным фиксатором, в котором тщательно расуспензируется осадок с помощью пастеровской пипетки. Количество последнего фиксатора регулируется в зависимости от количества полученного исследователем осадка (т.е. костного мозга). Полученная таким образом фиксированная клеточная суспензия имеет на свету матовый или слабомолочный цвет, после тщательного перемешивания полученной смеси одну- две капли наносят на холодные и влажные предметные стекла методом раскапывания с высоты около 7-10 см. Специально обработанные предметные стекла хранятся в дистиллированной воде в холодильнике или при невысокой температуре (+4°С). После нанесения клеточной суспензии на предметные стекла (обычно готовят 5-10 стекол для каждого зверька), фиксатор на части препаратов поджигают, а другая часть высушивается на воздухе при комнатной температуре. Метод выжигания позволяет улучшить разброс хромосом в случае, когда гипотоническая обработка оказывается недостаточной. Высушенные на воздухе препараты нужны для дифференциальной окраски хромосом (G- и Сисчерченность). Хромосомные препараты из кратковременной культуры клеток Этот метод позволил нам получить хорошие хромосомные препараты из пунктата костного мозга, взятого прижизненно (енотовидная собака, норка, дикий кабан и др.) при отстрелах диких животных, а также вообще из забитых животных, после смерти которых прошло от одного до десятка часов (в зависимости от температуры при которой хранился материал). Здесь дается методика, предложенная Херцогом и Хёном (Нerzog, Ноhn, 1969), с некоторой модификацией А.И. Козловского (1974) и В.Н. Орлова и др. (1983); нами также внесены некоторые методические изменения. У отстрелянных крупных животных (тур, косуля, кабан и др.) извлекают из грудины и ребер при помощи костномозговой иглы костный мозг и помещают в раствор, состоящий на 85 % из среды 199 и на 15 % из инактивированной телячьей сыворотки или в центрифужные пробирки с добавлением стандартной среды 199 на растворе Хенкса для культуры тканей, доводят объем питательной среды в пробирках (в последнем случае) до 10 мл; пробирки помещают в термостат и выдерживают 35 минут при 37°С. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,20 мл 0,04 %-го водного раствора колхицина, после чего продолжают инкубацию в термостате еще 40 минут. По окончании ее, пробирки помещают в центрифугу и центрифугируют 5 минут при 500- 1000 об./мин. Затем надосадочную жидкость удаляют, а к осадку добавляют предварительно подогретый до 37°С гипотонический раствор (0,075 М раствор хлорида калия), около 3 мл. Полученный осадок ресуспензируют, после чего половину содержимого пробирки переливают в чистую пробирку. Благодаря таким манипуляциям появляется возможность варьировать время гипотонического воздействия, и тем самым устанавливать оптимальный режим обработки. Все пробирки вновь помещают в термостат и при 37°С выдерживают еще 25-30 минут. Затем пробирки с содержимым вновь центрифугируют 5 минут, после чего очень осторожно, по каплям, к осадку добавляют 3 мл холодного свежеприготовленного уксусно-метилового фиксатора (1 часть уксусной кислоты и 3 части метилового спирта). Через 10-15 минут фиксатор с соблюдением всех предосторожностей, указанных выше, сливают и заменяют на свежий. Замену фиксатора с интервалами 30-40 минут повторяют еще 3 раза. Общее время фиксации осадка составляет около 1,5 часа, дальнейшее приготовление методике «высушенных» препаратов. хромосомных препаратов производится по обычной Хромосомные препараты из культуры лейкоцитов периферической крови В стерильные пенициллиновые флаконы с гепарином вносят по 10-20 мл периферической крови, взятой из вены; ее тщательно перемешивают-это дает возможность предупредить свертывание крови (каждый флакон должен содержать 10-20 ед. гепарина в расчете на 1 мл крови и 10 мл раствора Хенкса). Затем флаконы с цельной гепаринизированной кровью ставят в холодильник на 0,5-1 час при + 4°С. За это время кровь разделяется на два слоя: в нижнем находятся в основном эритроциты, а верхний обогащен лейкоцитами. После расслоения берут по 1 мл плазмы с лейкоцитами из верхнего слоя и вносят в стерильные флаконы при стерильных условиях. Полученную плазму смешивают с питательной средой (среда 199 или Игла с глутамином) в соотношении: 1 часть плазмы и 3 части питательной среды. Затем на 10 мл этрй.смеси добавляют 0,2 мл фитогемагглютининат ФГА М фирмы Well-come или Difco и антибиотики (пенициллин из расчета 100 ед. на 1 мл, стрептомицин - 50 ед. на 1 мл). Полученную взвесь клеток культивируют в термостате при 37° С в течение 72 и более часов, при этом флаконы плотно закрывают стерильными резиновыми пробками. Часть плазмы хранят в холодильнике (+ 4°С) и вводят в культуру спустя 3-5 суток, т.е. когда становятся известными результаты первого анализа. Далее: за 1-1,5 часа до фиксации в культуру вводят подогретый до 370 С раствор колхицина (0,002 %-ый раствор) из расчета 0,5 г на 1 мл среды. Начиная с этой процедуры и в последующем можно не соблюдать стерильность. После инкубации с колхицином культуру разливают в центрифужные пробирки по 3 мл и центрифугируют 5 минут при 800-1300 об./мин. В дальнейшем можно следовать стандартной методике «высушенных» препаратов, начиная с этапа фиксации и далее (описание см. выше). 1.2. Приготовление красителей и различные способы окраски хромосомных препаратов Важным стимулом для разработки различных методов окрашивания хромосом послужила необходимость располагать простыми и надежными методами определения гомологичных хромосом у исследуемых животных; количества, морфологии как аутосом, так и половых хромосом; а также для проведения кариотипирования. Для анализа хромосомного набора любого вида необходимо получение хорошо окрашенных хромосомных препаратов. Методически правильно рутинно окрашенные хромосомы под световым микроскопом без светофильтра имеют красно-фиолетовый цвет, с зеленым светофильтром, которым рекомендуется пользоваться при просмотре и фотографировании метафазных хромосом митоза, выглядят черными с четкими неразмытыми краями и хорошо различимыми хроматидами (рис.2). Рис. 2 Рутинная окраска метафазных хромосом Таlра саuсаsicа Sat. Методика окрашивания красителем Гимза является самым распространенным методом окрашивания хромосом, хотя точный механизм связывания красителя хромосомными компонентами остается неясным. Активными компонентами красителя Гимза являются: одна молекула эозина и две молекулы азура, которые при взаимодействии с хромосомным материалом (ДНК) дают окрашивание в пурпурно-красный цвет. Методика Гимза очень простая, но при ее использовании необходимо учитывать ряд важных моментов. Непосредственно перед окрашиванием готовят рабочий раствор из основного готового красителя Гимза (азур-эозин по Романовскому): смешивают 5-7 мл раствора Гимза и 100 мл дистиллированной воды и добавляют 0,5-1 мл 0,1 %-го раствора углекислого натрия (Ма2СО3) так, чтобы реакция красителя была близкой к нейтральной. Возможно приготовление рабочего раствора не на дистиллированной воде, а на 0,01 М фосфатном буфере, рН 6,8: смешивают 31,3 мл Ка2НР04 с 22,8 и 0,5 М Ка2НР04 и доводят объем раствора до 500 мл дистиллированной водой. Для окраски препаратов можно использовать также растворы азура-11 и эозина, которые готовят из сухого порошкообразного материала. Заблаговременно в отдельных сосудах (желательно из темного стекла) готовят исходные растворы красителей: а) 100 мг сухого азура-11 на 100 мл дистиллированной воды, б) 100 мг сухого водорастворимого эозина на 100 мл дистиллированной воды, для «созревания» эти растворы необходимо оставить на свету, выдержать 15 дней, периодически взбалтывая. В наших опытах мы наблюдали, что краски, приготовленные заранее, красят лучше, чем свежие. Непосредственно перед окрашиванием готовят рабочий раствор, состоящий из 3 частей исходного раствора эозина, 6 частей исходного раствора азура-11 и 10 частей дистиллированной или водопроводной воды. В первом случае, т.е. при использовании дистиллированной воды, в рабочий раствор необходимо добавить 0,5-1 мл (на 100 мл красителя) 0,1 % -го раствора углекислого натрия (Ка2СОз). Препараты для окрашивания погружают в один из указанных выше растворов красителя, налитого в химический стакан, который желательно накрыть сверху крышкой. Продолжительность окрашивания 10-15 минут. В связи с тем, что разные серии азур-эозина часто различаются по качеству, концентрацию рабочего раствора и соответственно время окрашивания препаратов рекомендуем подбирать эмпирически. По окончании окрашивания, т.е. перед изъятием препаратов из красителя, убедитесь в том, что на поверхности красителя не образовалась блестящая пленка, в последнем случае ее необходимо удалить. Самый простой способ удаления пленки-провести кусочком фильтровальной бумаги по поверхности раствора; после этого можно доставать препараты. Окрашенные препараты промывают в проточной воде, несколько раз в дистиллированной воде и высушивают на воздухе, защитив от попадания частиц пыли (можно прикрыть марлей). После полного высушивания препараты выдерживают в чистом ксилоле (2-3 мин). Если после окрашивания необходимо приготовить постоянный препарат, то проводят его заключение. Наиболее часто применяемой цитогенетиками средой заключения является бальзам, представляющий собой прозрачную желтоватого цвета древесную смолу. Различают два вида бальзама - канадский и пихтовый. Способ приготовления их одинаков: кусок (или куски) кристаллической смолы помещают в чистую сухую прозрачную стеклянную банку (желательно широкогорлую) и заливают ксилолом, ставят в термостат. Когда консистенция его будет напоминать жидкий мед, раствор готов к применению. Положив препарат в горизонтальном положении на стол тыльной стороной вниз, наносят каплю бальзама. Затем берут заранее приготовленное покровное стекло размером 24x24 мм (чистым пинцетом или осторожно двумя пальцами за боковые края, чтобы не загрязнить поверхность), ставят его на предметное стекло с любого конца (т.к. на препарат необходимо нанести как минимум два покровных стекла, чтобы впоследствии можно было охватить анализом большую часть его поверхности) под углом 45° и потихоньку опускают (рис. 3). Рис.3 Заключение цитогенетических микропрепаратов хромосом При этом воздух постепенно вытесняется и бальзам покрывает препарат тонким равномерным слоем. Покровные стекла должны быть абсолютно чистыми и сухими. Если бальзам вытек из-под покровного стекла, его нужно тут же стереть марлей (из 2-4-х слоев) слегка смоченной в ксилоле. Заключенный препарат помещают на специальный планшет и выдерживают в горизонтальном положении не менее 24 часов. После того, как бальзам загустеет, препарату можно придавать любое положение, но хранить желательно в защищенном от света и пыли месте, т.е. в специальных коробках с зубчатыми рейками, предназначенных для хранения микропрепаратов. Дифференциальные окраски хромосом. Различные виды дифференциальной окраски хромосом, хотя и имеют свою специфику, в конечном итоге они так или иначе выявляют дифференциацию эухроматина и гетерохроматина, т.е. распределение дифференциальных сегментов по длине хромосом. По словам Г. Макгрегора и Дж. Варли (1986); «…почти ничего не знаем о тех последовательностях ДНК и хромосомных структурах, которые связывают краситель в каждом из этих случаев. Ясно, однако, что изучение механизмов дифференциальной сегментации хромосом должно способствовать существенному прогрессу в понимании некоторых аспектов строения хромосомов». В настоящее время эти методы нашли широкое применение в исследованиях по эволюции кариотипов и филогении многих видов животных, в том числе и млекопитающих. Ниже приводится описание двух наиболее широко используемых методов дифференциальной окраски хромосом (G- и С-окраски), которые мы сопровождаем собственными комментариями по их модификации. На сегодняшний день убедительно показано, что характер поперечной исчерченности хромосом специфичен для каждой хромосомной пары, почти не зависит от степени спирализации хромосом, метода приготовления, а также сохраняется не только в перестроенных участках хромосом (внутри вида и у близких видов), но в случае значительного эволюционного консерватизма эухроматиновых частей геномов гомология прослеживается и внутри отрядов, даже между ними, что позволяет, во-первых, строго идентифицировать все хромосомные пары в кариотипе, и, во-вторых, проследить хромосомные перестройки почти на любом уровне организации жизни. Метод Гимза G -окрашивание Этот метод которая включает частично окрашивания в нарушает некоторые структуру и G-полос (сегментов). себя их участки, оказываются В предварительную структуру, видимо, но в обработку результате частично интенсивно окрашенными основе многочисленных хромосом, последующего восстанавливают в виде свою так называемых модификаций G-окраски лежит методика, предложенная М. Сибрайт (Seabrigt, 1971). Ниже приводится модификация, разработанная С.И. Раджабли и др. (1973). Препараты хромосом приготавливают по методике с гипотонической обработкой, фиксацией в смеси метанол-уксусная кислота (3:1) и высушиванием на воздухе затем их выдерживают при комнатной температуре 10-15 дней с целью их «старения». Препараты (1-2 стекла) опускают на 15-20 с. в химический стакан с 0,25 %-ым раствором трипсина, подогретым до 30°С. Затем достают их и ополаскивают в стаканчике с солевым буфером 2хSSС (в 1 л дистиллированной воды растворяют 17,53 г хлористого натрия (х.ч.) и 8,82 г трехзамещенного цитрата натрия, рН 6,8), а затем инкубируют в «свежем» растворе вышеприведенного буфера в термостате при 62-64° С в течение 1 часа. После инкубации в буфере препараты переносят в стаканчик с красителем (рабочим раствором), приготовленным на фосфатном буфере, рН 6,8 (приготовление фосфатного буфера описано выше). Окрашивают препараты красителем Гимза 10-15 минут. Если после окрашивания при просмотре препаратов под микроскопом сегментация не выявляется, то можно их «раскрасить» отмыванием в смеси метанол-уксусная кислота (3:1) в течение нескольких секунд и затем повторить обработку трипсином или увеличить время выдерживания в трипсине (20-30 с. и более) других стекол (препаратов). Время обработки трипсином, необходимое для получения хорошей сегментации хромосом, значительно варьируется, но в наших исследованиях -примерно 10- 15 с., во всех случаях лучше недообработать препарат трипсином, чем переобработать. В наших исследованиях мы также пользовались этим методом, разработав некоторые модификации. После обработки препаратов 0,25 %-ым раствором трипсина при 30-32° С в течение 5-30 с., мы ополаскивали их поочередно в трех стаканчиках со свежим солевым буфером (2xSSС) при комнатной температуре (22-24° С). После этого препараты переносили в стаканчик с красителем, приготовленным, так как описано выше. С-окраска Многочисленные модификации С-окраски основываются на методике А. Самнера (Sumner, 1972). Для С-окрашивания используют цитогенетические микропрепараты из клеток костного мозга или культуры тканей, приготовленные по методике высушивания на воздухе (см. выше). Высушивание стекол над пламенем спиртовки и долгое хранение препаратов не допускаются. Обычно качество дифференциального окрашивания выше, если используют не свежеприготовленные, т.е. этого же дня приготовления, а выдержанные некоторое время «старые» препараты (3-6 дней). Препараты, предназначенные для хранения должны быть сухими, их можно хранить при комнатной температуре или при 4° С, но при низком уровне влажности; следить за отсутствием пыли обязательно. Получение С-окраски возможно и после длительного хранения, однако в этом случае препараты должны храниться в 96° этиловом спирте. Инкубируют стекла (препараты) в 0,2 М соляной кислоте (НСl) при комнатной температуре в, течение одного часа. Более длительную обработку подбирают для длительно хранившихся препаратов, полученных из культуры тканей методом выжигания, более короткую - для препаратов из костного мозга высушенных на воздухе, и сроком хранения не более 6 дней. Эта обработка НСl не является обязательной, и при получении препаратов высокого качества ее можно исключить. Однако она способствует удалению с препарата избыточного белка без повреждения его качества и ее следует применять, если после фиксации на стекле остается много клеточных элементов и жира, что значительно ухудшает качество С-окрашивания. После этой обработки стекла хорошо ополаскивают в дистиллированной воде в стаканчиках (два, три и более раз) и помещают в горячий (50-60° С) свежеприготовленный 5 %-sqраствор гидроокиси бария (Ва(ОН)2-8Н20) на 5 - 15 мин, в зависимости от метода приготовления и возраста препаратов. Такой раствор гидроксида бария близок к насыщенному и на его поверхности в стаканчике образуется тяжелая пленка, которую следует удалить до извлечения препарата (проводят кусочком фильтровальной бумаги по поверхности раствора). Затем осторожно промывают стекла в трех-четырех сменах дистиллированной или кипяченой воды, охлажденной до 27-30° С. После этого препараты инкубируют в буферном растворе 2хSSС (0,3 М NаС1 и 0,03 М цитрат натрия, рН 7,0) в течение 1-1,5 часа при температуре 60-62° С в термостате. Промывают стекла (препараты) в дистиллированной воде. Препараты окрашивают в 2- 2 , 5 %-ом растворе красителя Гимза на фосфатном буфере в течение 1-1,5 часов (детали приведены выше). Затем промывают стекла дистиллированной водой, осторожно высушивают и приготавливают постоянный препарат, заключив его в какую-либо среду (см. выше раздел 1.2.) Приготовленные и окрашенные тем или иным методом препараты перед анализом и фотографированием метафазных пластинок желательно хранить не более 1-2-х месяцев, т.к. они (особенно дифференциально окрашенные) быстро выцветают и теряют качество. 1.3. Анализ хромосомных препаратов Поиск и фотографирование метафазных пластинок Для анализа хромосомных препаратов на уровне бета-кариологии (White, 1978) можно использовать биологические микроскопы любого типа и иммерсионные объективы 90-х или 100-х. Для анализа микропрепарата обычно предметное стекло просматривают «челноком» полностью, т.е. захватывая все участки, которые покрыты покровными стеклами. Поиск метафазных пластинок желательно проводить при малом увеличении микроскопа, которое вполне достаточно для обнаружения и даже при некотором навыке исследователя-для визуальной оценки их качества. Пригодной для анализа и фотографирования считается метафазная пластинка, в которой хромосомы лежат отдельно друг от друга, т.е. без больших налеганий, но и не слишком разбросано. В последнем случае возможна утрата некоторых хромосом и такие пластинки для анализа непригодны. Также обязательно, чтобы все хромосомы были контрастными и имели четкие контуры. Форма метафазной пластинки должна быть по периферии округлой или слабо овальной. Сами хромосомы не должны быть слишком спирализованы и, наоборот, иначе правильное определение их формы, особенно мелких хромосом, становится невозможным (рис.4). Для анализа дифференциально окрашенных хромосом обычно выбирают метафазные пластинки с более длинными хромосомами хроматиды которых лежат достаточно близко и параллельно друг другу. Рис. 4. Метафазные пластинки из костного мозга при нормальной гипотонической обработке различных видов млекопитающих: А, Б - Sorex саuсаsicа (самцы); В - Та1ра lеvаntis (самец); Г – Vespertilio murinus (самец) Начинающим кариологам можно рекомендовать: пока не приобретен необходимый опытнавык, следует просматривать под иммерсионным объективом все метафазные пластинки, встреченные на стекле. Местоположение встреченных метафазных пластинок обычно отмечают по осям координат на предметном столике, а данные записывают в (дневник). регистрационный журнал Также можно пользоваться методом метки тушью на самом препарате, т.е. рядом с метафазными пластинками тушью ставят черные точки (сверху, сбоку или снизу, кому как удобно) на поверхности покровных стекол. В первом случае кроме координат в журнал записывают число хромосом, подсчитанное на анализируемой метафазной пластинке. Также желательно схематично сделать наброски метафазной пластинки и отметить некоторые индивидуальные особенности отдельных хромосом: соотношение плеч, наличие вторичных перетяжек, спутников и так далее. На одном препарате (стекле), в зависимости от интенсивности митотической активности ткани исследуемого животного, можно обнаружить от единой до, десятков метафазных пластинок, для составления определенного представления о кариотипе изучаемого вида необходимо просмотреть достаточно большое число метафазных пластинок, в среднем 50, а иногда и больше. Это совершенно необходимо для точного определения модального числа, поскольку из-за методических и других погрешностей некоторые хромосомы могу «отлететь» в сторону и исчезнуть из поля зрения, что может привести к занижению числа хромосом в наборе. И, наоборот, могут возникнуть метафазные пластинки с большим числом хромосом. Это может быть результатом нерасхождения хромосом в митозе, а также присоединением к исследуемой метафазной пластинке части хромосом других метафазных пластинок. Чтобы точно установить диплоидное число у исследуемого объекта, по мнению В.И. Орлова и препаратах. др. (1983), необходимо Эти авторы считают, подсчитать что эта число бивалентов на мейотических процедура особенно желательна тогда, когда диплоидный набор включает большое число хромосом (несколько десятков пар) и особенно при наличии в кариотипах добавочных хромосом. Наиболее фотографируют В удачные под метафазные микроскопом с пластинки с модальным числом хромосом использованием микрофотонасадки (МФ-1, 2,.., 11). нашей работе мы пользуемся микроскопом МБИ-6. Для фотографирования митотических метафазных пластинок наиболее часто пользуются пленками типа «Микрат-200» или «Микрат300» 1.4. Описание числа, формы хромосом и кариотипирование Исследование хромосом любого живого организма, в том числе и млекопитающих связано с приготовлением препаратов, микроскопией и проведением соответствующих измерений хромосом, и в настоящее время можно считать, что существуют установившиеся правила описания и изучения хромосом. Метафазная хромосома, как правило, состоит из двух нитей, которые интенсивно окрашиваются основными красителями. Эти нити, называемые хроматидами, расположены параллельно и соединены между собой только в области первичной претяжки или центромеры (рис .5). Обычно гаплоидное число хромосом обозначают буквой n, соответственно диплоидное – 2n, триплоидное – 3n, тетраплоидное – 4n и т.д. У млекопитающих диплоидное число хромосом варьируется в широких пределах. Например, у млекопитающих Кавказа, кариотипы которых изучены, число хромосом колеблется от 24 у обыкновенного хомяка (Сricetus cricetus) до 72 у малоазийской песчанки (Меriones tristram) (см. прил. табл. 1). Рис. 5. Морфологические типы метафазных хромосом 1,2 - метацентрические (М), 3 - субметацентрические (S), 4 субтелоцентрические (81), 5 - акроцентрическая (А). Ц-центромера, Т - теломера, В - второричная перетяжка в районе теломеры. При исследовании хромосомного набора очень важно обращать внимание на число, форму и размеры хромосом, поскольку эти признаки отражают ход эволюции организмов, их видообразование. Определение формы хромосом в метафазе митоза наиболее просто и надежно, но при этом необходимо придерживаться общепринятых правил, форма хромосомы определяется исключительно положением центромеры. Обычно участок хромосомы от ее конца до центромеры называют плечом хромосомы (рис.5). Оба плеча хромосомы могут быть приблизительно равны или резко отличаться по длине. Для характеристики хромосомы вычисляют в основном три параметра, дающих представление о размере и форме хромосомы: относительную длину хромосомы, а также ее центромерный и плечевой индексы. Эти показатели характеризуют хромосому как таковую, безотносительно к другим, а также размер хромосомы по отношению к другим хромосомам в данном кариотипе. Центромерный индекс- определяют как отношение длины короткого плеча к длине целой хромосомы, выраженное в процентах. Плечевой индекс - отношение размера более длинного плеча хромосомы к размеру более короткого. Соответственно это отношение всегда больше 1. Относительную длину определяют как выраженное в процентах отношение длины данной хромосомы к общей длине всех хромосом в гаплоидном наборе (включая данную хромосому и Х-хромосому). Следует отметить, что относительную длину хромосомы можно использовать для приближенной оценки той доли, которую составляет данная хромосома от всего генома, т.е. что является параметром длины, а не объема или массы. В таблице 1 приведена классификация формы хромосом, принятая цитогенетиками мира. Подробное обсуждение представленных в ней терминов можно найти в работах В.Н. Орлова (1974), В.Н.Орлова и др. (1976; 1983), Г. Макгрегор и др. (1986), А Levan et а1. (1964). Таблица 1 Классификация хромосом по положению центромеры Положение центромеры Форма хромосомы 1 Почти срединное Метацентрическая М индекса 46-49 2 Субмедианное Субметацентрическая (более метацентрическая Sm 36-45 3 Субмедианное Субтелоцентрическая (менее метацентрическая) St 26-35 4 Субтерминальное Акроцентрическая А 15-30 № Символ (обозначение) Пределы для центромерного Пользоваться данными этой таблицы, то есть этой классификацией, имеет смысл лишь в том случае, если промерены хромосомы нескольких метафазных пластинок; при этом желательно, чтобы хромосомы были в них с одинаковой степенью спирализации. Другими словами, не следует пользоваться этой классификацией, если форма хромосом оценивается визуально, без промеров. Совокупность хромосом соматической клетки организма, т.е. его диплоидный набор, характеризующийся определенным числом, величиной и формой хромосом, называют кариотипом. Разложенные согласно величине и форме хромосомы называют кариограммой. Такую кариограмму получают, вырезая из микрофотографии метафазной пластинки отдельные хромосомы, не задевая их контур (границу) (приложение, рис. 1-6) т.е. с негатива метафазной пластинки делают фотоотпечатки, и из них вырезают хромосомы. При этом, если все хромосомы лежат отдельно, то достаточно сделать две фотографии, чтобы из одной вырезать отдельные хромосомы, а вторую использовать для общего вида метафазной пластинки. Если не удалось найти пластинку без налегания хромосом друг на друга, то необходимо сделать несколько фотоотпечатков метафазной пластинки. Гомологичные пары хромосом и тотально окрашенных метафаз подбираются по принципу подобия с учетом индивидуальных морфологических особенностей, а именно: размера, положения центромеры, наличия спутников, вторичных перетяжек. Если метафазные хромосомы окрашены дифференциально (G-полосы), то, учитывая расположение, количество и размеры полос. Половые хромосомы правильно можно идентифицировать только на метафазных пластинках самцов и то не всегда. Для точного определения гетерохромосом необходимо изучение дифференциально окрашенных хромосом как G-, так и С-методом. Существует несколько способов кариотипирования, т.е. разложения хромосомных пар. Из них наиболее приняты среди кариологов два: 1) по убывающей величине и 2) по морфологическим признакам. Затем их наклеивают на лист ватмана поливинилацетатным клеем. Половые хромосомы, как правило, помещают чуть в стороне от аутосомных пар, желательно в последнем ряду, для приготовления дубликата кариотипа оригинал следует переснять и приготовить фотоотпечатки или сделать ксерокопию. 1.5. Кариограммный анализ При исследовании хромосом, на наш взгляд, очень важно обращать внимание на их размеры, поскольку этот признак имеет большое значение в эволюции организмов, их видообразовании. Однако, с появлением дифференциальной окраски он утратил свое прежнее значение. Например, промеры необходимы для оценки полиморфных хромосом, которые нельзя считать малочисленными у животных, особенно обитающих в условиях гор. Для кариограммного анализа отбирают по пять метафазных пластинок самцов и самок каждого исследуемого вида или более, если в наличии материал только от животных какого-либо одного пола (желательно, если возможно, от одной особи). Существует несколько способов измерения хромосом, в любом случае необходимо иметь для микроскопии препараты высокого качества, т.е. хромосомы должны располагаться в одной плоскости и лежать достаточно свободно одна от другой, быть контрастными и иметь четкие контуры. Наиболее простым и быстрым методом является зарисовка хромосом при максимальном увеличении с помощью фотоувеличителя или световой камеры. Сначала обводят на бумаге контуры всех хромосом, лежащих в поле зрения, затем точно отмечают в каждой из них местоположение центромеры. Промеры производят либо на рисунках хромосом, либо прямо на проекции, без зарисовывания хромосом, в этом случае для промеров хромосом пользуются кронциркулем. Также существует способ измерения длины хромосом и их плеч под микроскопом с использованием окуляр-микрометра как в относительных единицах, так и в микронах. Независимо от способа измерений, определяют, как пра (вило, три специальных параметра, дающих представление о размерах и форме хромосомы: относительная длина хромосомы, а также центромерный и плечевой индексы. Методы вычисления этих параметров изложены выше (гл. 1, раздел 1.4). При проведении сравнительного анализа кариотипов близких видов или кариологически отличающихся популяций одного вида обычно пользуются методом наложения поликариограмм. Рис. 6. Идиограмма бурозубки Волнухина (по Козловскому, 1973) Этот метод позволяет более надежно определять гомологичные пары хромосом в том случае, когда сравниваются выборки, степень спирализации метафазных хромосом в которых варьирует в достаточно узком диапазоне. На основании средних значений индексов, полученных методом статистической обработки материалов по общепринятой методике Н.А. Плохинского (1970) (полученные данные могут быть оформлены в виде таблиц), можно построить идиограмму, которая схематично изображает гаплоидный набор исследуемого вида. Идиограмму и поликариограмму строят как показано на рис. 6 и 7, где каждая хромосома Рис. Кариотип E.concolor: а – рутинная окраска; б – С-метод представлена в первом случае вертикальным столбиком длина которого пропорциопальна относительной длине данной хромосомы, а положение центромеры и другие морфологические особенности (наличие спутников, вторичных перетяжек и т.д.) точно указаны, вертикальные столбики располагают в порядке убывания их длины слева направо и всегда более коротким плечо м вверх. Нельзя строить идиограмму на основе данных, полученных при изучении одного препарата. Она должна строиться на основе средних значений длин обоих плеч хромосомы, полученных при измерении большого числа метафазных пластинок, взятых от нескольких осо бей исследуемого вида, популяций. Задание для самостоятельной работы по теме №1 1. Изучить 50 метафазных пластинок домовой мыши по препаратам, хранящимся в зоологическом музее КБГУ. Составить суждение о стабильности или вариабельности кариотипа у данного вида в пределах г.Нальчик. Анализ препаратов провести, пользуясь материалами, изложенными в настоящих методических указаниях. 2. Из имеющихся фотоотпечатков метафазных пластинок составить идиограмму хромосомного набора домовой мыши. 3. С помощью окуляр-микрометра под микроскопом провести измерения длины хромосомы, вычислить цетромерный и плечевой индексы. Составить кариограмму гаплоидного набора хромосом самцов и самок домовой мыши. Тема 2. Эволюционные преобразования кариотипа млекопитающих Организация эукариотической хромосомы не подверглась существенным изменениям в течение фанерозя. По данным Э.А.Гилевой (1990), об этом свидетельствует единство субмикроскопического строения и типов спонтанных перестроек хромосом у всех ныне живущих эукариот, а также принципиальное сходство молекулярной организации генома даже у очень отдаленных в систематическом отношении организмов. Э.А.Гилева (1990) обращает внимание на то, что на первый взгляд кажется, что этому утверждению об эволюционной стабильности эукариотической хромосомы противоречат специфические цитогенетические особенности, наблюдаемые у некоторых групп эукариот. Однако эти особенности обычно носят более или менее частный ха рактер и (что еще важнее), как правило, не являются уникальными: они могут наблюдаться у филогенетически весьма удаленных организмов (Раджабли и др., 1977; Агаджанян и др., 1984; Графодатский и др., 1987; Гилева, 1990 и др.). В качестве примера такого рода Э.А.Гилева (1990) приводит в своей работе резкое увеличение количества генет ического материала за счет полиплоидизации или иных механизмов у высших растений и низших позвоночных (Оно, 1973; White, 1973); независимая гетероморфизация половых хромосом у многих эукариот (Гилева, 1981); препятствующая появлению G-исчерченности высокая конденсированность хроматина у высших растений и амфибий и, возможно, у прямокрылых насекомых (Anderson et al., 1982; Carbaso, 1987, цит. по: Э.А.Гилева, 1990). По мнению этих авторов, такие конвергенции проще всего могут быть объяснены тем, что в хо де эволюционного процесса у многоклеточных животных и растений происходила в основном реализация широких структурно-функциональных возможностей, изначально присущих эукариотической хромосоме, при сохранении общего плана ее строения и функционирования. Как считает Э.А.Гилева (1990), эволюционной трансформации подвергалась главным образом не организация хромосомы, а организация кариотипа. Фактически под хромосомной эволюцией понимаются процессы, связанные с преобразованием взаимного расположения отдельных участков генома и ведущие на цитологическом уровне к изменению числа хромосом и их формы, а также процессы, вызывающие изменения абсолютного и относительного количества эухроматина и гетерохроматина и модифицирующие число и локализацию ядрышковых организаторов. (Она считает, что вопрос о том, может ли характер дифференциального окрашивания хромосом изменяться без перемещения хроматина, остается пока открытым). Таким образом, понятие "хромосомная эволюция", по мнению автора, используется как синоним понятия "эволюция хромосомных наборов", причем эволюционными считаются лишь те изменения, которые сопровождают видообразование и возникновение высших таксонов. Внутривидовая вариабильность перечисленных цитогенетических характеристик обозначается термином "хромосомная изменчивость", но этот термин, как отмечает Э.А.Гилева (1990), достаточно часто (особенно в англоязычной литературе) используется и по отношению к межвидовым различиям кариотипов, что связа но отчасти с существованием форм, имеющих неудовлетворительный таксономический статус, - видов in status noscendi, "полувидов" и т.д. Далее автор отмечает, что объемы понятий "хромосомная эволюция" и "хромосомная изменчивость" частично совпадают, от ражая этим самым отсутствие четких границ между цитогенетическими преобразованиями генома на разных уровнях таксономической интеграции. Для исследования внутривидовой хромосомной изменчивости она предлагает выделить два класса феноменов: внутрипопуляционный полиморфизм и географическую (межпопуляционную) изменчивость. Во втором издании классического труда М.Д.Д.Уайта "Цитология животных и эволюция" (White, 1954, цит. по: Э.А.Гилева, 1990) приводится следующее определение для обозначения хромосомного полиморфизма: "... определяется как присутствие в популяции двух и более альтернативных типов одной или нескольких хромосом с частотами, превышающими частоту спонтанных мутаций". Между тем, как отмечает Э.А.Гилева (1990), в последующие годы термин "хромосомный полиморфизм" все чаще использовался как в связи с географической изменчивостью хромосомных наборов, так и по отношению к внутрипопуляционной хромосомной изменчивости неальтернативного типа. Расширение понятия "хромосомный полиморфизм" за счет включения в него неальтернативной изменчивости кариотипов Э.А.Гилева (1990) считает необратимым, также она отмечает, что не случайно в третьем издании "Цитология животных и эволюция" М.Д.Д.Уайт предлагает следующую формулировку: "... Под цитологическими и хромосомно полиморфными популяциями или видами мы понимаем таки е, которые в норме постоянно содержат несколько разных типов особей, кариотипы которых различаются видимым образом, исключая, естественно, хромосомные разницы между полами" (White, 1973). По мнению вышеприведенного автора (Гилева, 1990), вопрос терминологии в данном случае не является чисто формальным и, что применяя один и тот же термин для обозначения разных явлений, легко запутаться в существенных различиях между ними. Та кую опасность она видит и по отношению к внутри- и межпопуляционной хромосомной изменчивсти, тем более что оба феномена возникают на основе одного и того же элементарного эволюционного материала - спонтанных хромосомных мутаций. При этом она обращает внимание на то обстоятельство, что нельзя забывать, что факторы, обеспечивающие становление и поддержание систем внутрипопуляционного полиморфизма и географической изменчивости, могут существенно различаться. Так, благодаря различиям в масштабах внутри- и межпопуляционных градиентов ландшафтно-экологических условий и неселективных факторов поддерживается хромосомное разнообразие внутри популяций и между ними. Как отмечают Э.А.Гилева (1990), Е.Ю.Иваницкая (1990) и другие, внутривидовая изменчивость хромосомных наборов наблюдается практически во всех достаточно хорошо изученных в цитологическом отношении группах организмов, хотя истинная частота ее встречаемости, по-видимому, остается неизвестной и скорее всего, заниженной, поскольку большая часть кариотипов изучена лишь с помощью методов, обладающих низкой разрешающей способностью. Они также считают, что внутрипопуляционный хромосомный полиморфизм может быть не выявлен, если видовой кариотип, как это нередко бывает, описывается на основании изучения лишь 1 - 2 особей. Вывод о цитогенетическом мономорфизме той или иной популяции, по их словам, следует считать обоснованным только после кариотипирования нескольких десятков особей из этой популяции. Отсюда ясно, что для выявления географической изменчивости хромосомных наборов необходимо провести исследования более чем в одной популяции рассматриваемого вида, но к сожалению, в большинстве случаев цитогенетическому анализу подвергаются представители одной популяции. В настоящее время, когда известны хромосомные наборы более 2000 видов и внутривидовых форм млекопитающих, в том числе и Кавказа, большинство которых исследовано с применением различных методов окраски хромосом, все большую актуальность приобретают работы, посвященные выявлению закономерностей хромосомной изменчивости и эволюции. Видимо, внутрипопуляционный полиморфизм и географическая изменчивость кариотипов у млекопитающих Кавказа могут быть оценены приблизительно и, скорее всего, будут занижены, поскольку в большинстве случаев исследования были проведены только с помощью рутинной окраски хромосом. Между тем, использование методов дифференциальной окраски позволило подтвердить, что основными типами хромосомных перестроек, участвующих в эволюции кариотипов и формообразовании систем внутривидовой изменчивости у млекопитающих, являются транслокации типа робертсоновских и тандемных слияний и диссоциаций, перицентрические инверсии и диминуации или добавки гетерохроматиновых плеч, т.е. перестройки, обнаруживаемые, как правило, и при рутинной окраске. По мнению Э.А.Гилевой (1990), хотя рутинная окраска хромосом не позволяет обнаружить парацентрические и часть перицентрических инверсий, изменчивость диплоидного числа (2n) и числа хромосомных плеч (NF) можно использовать в первом приближении как характеристику внутривидовой изменчивости хромосомных наборов, имея в виду, что оценка ее частоты будет, видимо, несколько занижена. Существуют различные мнения о том, чем обусловлена скорость морфологической и хромосомной эволюции млекопитающих: характером их социальной структуры (Wilson et al., 1975; Buch et al., 1977; Bengsson, 1980 цит. по: Иваницкая, 1990), потенциальной способностью кариотипа или отдельных хромосом к тем или иным типам перестроек, т.е. существование внутренних факторов, способствующих мутабильности или ограничивающих ее (Ляпунова и др., 1988; Иваницкая, 1990 и др.), экологическими факторами среды обитания (высотно-поясная структура, сейсмичность района, повышенная радиация и т.д.) (Темботов и др., 1976, 1983, 1988; Воронцов и др., 1984; Токтосунов, 1984, 1990; Ахвердян, 1989; Ахвердян и др., 1988, 1992; Гилева, 1990; Дзуев, 1989, 1990, 1994 и многие другие). Задание для самостоятельной работы по теме №2 1. Заполните таблицу: классификация мутаций по характеру изменения генетического материала Виды мутаций Характер изменений Механизм генетического нарушений Примеры материала 1. Генные (точечные) Хромосомные а) делеции б) дупликации в) инверсии г) транслокации 3. Геномные а)полиплоидии б) анеуплоидии 2. Изучите кариограммы четырёх видов Pitymys Кавказа: P.schelkovnikovi, P. Majori, P.daghestanicus и P.nasarovi, и сделайте вывод об основных хромосомных перестройках, связанных с эволюцией этой группы млекопитающих. Для проведения анализа воспользуйтесь монографией Р.И.Дзуева «Хромосомные наборы млекопитающих Кавказа» (1998). Тема 3. Кариотип как систематический признак. Хромосомный полиморфизм у млекопитающих. Кариотипическая и морфологическая изменчивость млекопитающих Кавказа Кариологический анализ представителей отряда насекомоядные Кавказа, проведенный нами и другими териологами, с учетом градиента высоты местности в различных частях Кавказа показал, что по всем изученным видам отсутствует внутрипопуляционный хромосомный полиморфизм, связанный с изменением числа и морфологии аутосом и половых хромосом. Между тем, выявлена широкая морфологическая изменчивость по всем изученным параметрам тела и черепа почти у всех исследованных к настоящему времени видов (Дзуев, 1982 - 1994; Темботов, 1984; Темботова, 1987; Соколов, Темботов, 1989 и др.). У ежей Кавказа (белогрудый и ушастый) нами обнаружены совершенно разные темпы морфологической и кариотипической дивергенций. Эти два вида ежей, морфологически дивергировавших до уровня рода, имеют в диплоидных наборах 48 хромосом почти с одинаковой морфологией аутосом и половых хромосом. Тогда как для рода Talpa этого же отряда для двух кариологически изученных видов показана видоспецифичность хромосомного набора (2n = 38, NF = 66 у кавказского крота и 2n = 34, NF = 66 у малого крота), а по морфологическим признакам во многих регионах Кавказа они перекрывают друг друга (Дзуев, 1980, 1989, 1994; Соколов, Темботов, 1989). Если сравнивать характер их популяционной изменчивости с характером высотной и горизонтальной неоднородности ландшафтов, то легко заметить определенную зависимость первой от второй, изменение меристических показателей происходит в определенной зависимости от градиента высоты местности, а также от повышения сухости ландшафтов с северо-запада на юго-восток. При этом принципиально важно, что хромосомный набор малого крота стабилен на всем протяжении ареала, а у кавказского крота обнаружен полиморфизм. Летучие мыши, для большинства видов которых, в том числе и кавказских, характерен колониальный образ жизни, имеют, кроме того, специфические особенности социальной структуры популяций, сопряженные с градиентом высоты местности, сочетающиеся с разной степенью оседлости и различиями в репродуктивных стратегиях. В целом образ жизни и социальная структура популяций летучих мышей теоретически должны способствовать фиксации хромосомных перестроек и кариотипической дифференциации. Однако в группах летучих мышей разного таксонного ранга (от семейства до рода) нами и другими териологами выявлены разные уровни кариотипической дифференциации. Например, характерная черта группы подковоносых летучих мышей - это существенные морфологические различия между видами и совершенно одинаковые наборы хромосом (2n = 58, NF = 64). Исключение составляет малый подковонос: 2n = 56, NF = 64. Аналогичную картину мы обнаружили, сравнивая друг с другом представителей семейства Vespertilionid ae - род Myotis и Pipistrellus, виды этих родов кариологически мономорфны (все пять кариологически изученных нами кавказских видов имеют в диплоидном наборе 44 хромосомы с NFa = 50). Тогда как для представителей трех других родов этого семейства показана вариация хромосомных чисел от 32 до 50. Внутрипопуляционный и межпопуляционный полиморфизм с учетом градиента местности у кариологически изученных видов летучих мышей Кавказа нами и другими териологами не обнаружен. Таким образом, анализ имеющихся к настоящему времени данных дает основание утверждать, что в целом для представителей отрядов насекомоядные и рукокрылые млекопитающие Кавказа нет определенных связей между скоростью и степенью хромосомной дифференциации в группах разного таксономического ранга и особенностями их высотного распространения и уровня морфологической дифференциации. В общем плане наибольшее число полиморфных видов обнаружено в отряде грызунов. Из 46 - 47 видов по И.М.Громову и др. (1963) для фауны Кавказа, кариологическому анализу подверглись почти все виды и внутривидовые формы (44 вида), хромосомный полиморфизм, в той или иной форме, обнаружен у 20,4% видов от их общего числа. На наш взгляд, для рассмотрения хромосомной дифференциации грызунов в связи с высотно-поясной структурой горных ландшафтов Кавказа, весьма показательны группы Pitymys и Sicista. Они являются такими же самобытными, автохтонными и эндемичными, как и многие другие виды кавказского перешейка. Видимо, корни филогенетического дерева этих групп уходят в третичный период. В группе кавказских Pitymys в настоящее время выявлено 13 кариотипических форм, описано четыре вида: два лесных и два субальпийских (11 кариоморф), а для последней группы также показана возможность выделения еще как минимум четырех видов (Иванов и др., 1972; Хатухов, 1982; Хатухов и др., 1978; Темботов и др., 1982; Ляпунова и др., 1988; Мамбетов, Дзуев, 1988 а,б, 1990; Ахвердян, 1989; Ахвердян и др., 1992; Дзуев, 1994 и др.). Этими авторами установлено, что лесному поясу Большого и Малого Кавказа свойствен отдельный вид - P.majori с 2n = 54, NF = 60. Все кариологически изученные животные имели стабильный кариотип. Другой вид - P.schelkovnikovi имеет 2n = 54, NF = 62. Это эндемик горно-лесного пояса Талыша, по многим признакам отличающийся от других представителей Pitymys. Группа субальпийских кустарниковых полевок Большого и Малого Кавказа образует, по мнению М.Р.Ахвердяна и др. (1990) надвид P.daghestanicus со стабильным NF = 58 и различиями в 2n. Именно в пределах данного надвида обнаружено нами и другими кариологами существование робертсоновского веера, который к настоящему времени представлен одиннадцатью кариоморфами (2n = 54, 53, 52, 46, 45, 44, 42 "А" и "Б", 40 и 38). Группа Pitymys Кавказа, как это видно из вышеизложенного, подверглась как горизонтальной, так и вертикальной дифференциации кариотипов. В плане обсуждаемой проблемы очень интересными оказались также кариологические исследования мышовок Кавказа (Соколов и др., 1980, 1981, 1982, 1986, 1987, 1988; Дзуев, 1988 а,б, 1994; Баскевич, 1990 и др.). Вместо одного вида одноцветных мышовок Кавказа, который признавался всеми териосистематикам - как отечественными, так и зарубежными, в последнее время появилось серьезное основание признавать существование в рассматриваемом регионе, кроме мышовки Штранда и степной мышовки, целого ряда "хромосомных" видов-двойников (четыре), приуроченных к субальпийскому поясу: кавказская мышовка - Sicista caucasica (2n = 32, NF = 48), которая происходит с высоты 1550 - 1800 м н.у.м.; клухорская - S.kluchorica (2n = 24, NF = 44), отловленная на высоте более 2200 - 2800 м н.у.м.; казбегская - S.kazbegica (2n = 42, NF = 52), описана в субальпийском поясе на высоте 2200 м н.у.м. (внутри этого вида В.Е.Соколовым и др. (1992) обнаружен хромосомный полиморфизм как по числу хромосом в наборе 2n = 40, так и по количеству плеч хромосом NF = 50 на высоте около 2500 м); армянская - S.armenica (2n = 36, NF = 52), она была отловлена также в субальпийском поясе на высоте около 2200 м н.у.м. Как видно, при резкой хромосомной дифференциации одноцветных мышовок Кавказа, их морфологические отличия уловить почти невозможно. Хромосомный полиморфизм, затрагивающий отдельные аутосомы и Y-хромосому обнаружен у обыкновенной полевки на Кавказе. При этом морфологические показатели этого вида подвержены минимальной популяционной изменчивости. Полиморфизм связан с перицентрической инверсией среди мелких аутосомных пар (Kral, Lyapunova, 1975; Дзуев, Малкаров, 1976; Малыгин, 1983; Ляпунова и др., 1986; Ахвердян, 1989 и др.); по строению Y-хромосомы выделены две группы. У зверьков первой группы Y-хромосома представлена мелким метацентриком, у второй - такого же размера акроцентриком. Обнаружена определенная приуроченность этих групп полевок к различным биотопам: формы 2n = 46, NF = 62 и 70 - более ксерофитным (Дзуев и др., 1976; Дзуев, 1994; Ляпунова и др., 1986 и др.). Высокая степень соответствия географической изменчивости и высотно -поясной структуры выявлена нами и другими исследователями кавказского региона по морфологическим показателям у водяной полевки. Как известно, на обширной территории Предкавказья описано всего два подвида (Arvicola terrestris cubanensis и A.t.turovi), а в субальпийском поясе Большого и Малого Кавказа зарегистрировано пять подвидов: A.t.rufescens, A.t.ognevi, A.t.djukovi, A.t.kuruschi и A.t.persicus при этом подвидовые границы почти совпадают с границами вариантов поясности и они населяют соответственно: эльбрусский, терский, дагестанский, шемахо-кобыстанский и карабах-зангезурский варианты. Реальность существования этих подвидов подтверждена А.К.Темботовым и др. (1974, 1988), подтверждаются также нашим материалом. С таким мнением совпадают результаты сравнительного анализа фенетических различий методом главных компонент (Хатухов, Фалеев, 1982). Между тем, в диплоидном наборе всех кариологически изученных зверьков содержится 36 хромосом, а число плеч хромосом равно 66, т.е. водяная полевка обладает стабильным кариотипом. Исключение составляет A.t.kuruschi, у которой Г.Н.Кулиев (1979) обнаружил основное число плеч хромосом равное 72. В данном случае мы имеем еще один пример, когда морфологическая дифференциация заметно опережает хромосомную изменчивость. Как видно морфологические наибольшему из вышеизложенного показатели, полиморфизму изученных в материала, хромосомные млекопитающих субальпийском поясе. Однако Кавказа, эти наборы и подвержены изменчивости - кариотипическая и морфологическая, происходят независимо друг от друга. Суммируя результаты анализа соотношения хромосомной и морфологической изменчивости млекопитающих Кавказа на внутривидовом уровне, можно отметить, что пока нет уверенности считать существенным вклад структурных преобразований кариотипа в эволюционную трансформацию морфологических признаков. Другими словами, как это показано в работе Э.А.Гилевой (1990), причинная связь между этими двумя формами изменчивости минимальная, а соответствие между ними у 20,4% форм млекопитающих, является следствием случайного совпадения или погрешностью методического подхода. Видимо, процессы дифференциации хромосомных наборов и морфологии животных на ранних этапах эволюционной дивергенции млекопитающих протекают независимо. К аналогичному выводу пришла Э.А.Гилева (1990) по другим группам млекопитающих. Задание для самостоятельной работы по теме №3 1. Изучите материал по морфологической изменчивость водяной полёвки Кавказа, содержащийся в статье А.М.Хатухова и В.Фалеева «Сравнительный анализ фенетических различий водяной полёвки методом главных компонент» (1982). 2. Пользуясь монографией Р.И.Дзуева «Хромосомные наборы млекопитающих Кавказа» (1998), составьте суждение об особенностях кариотипа водяной полёвки в пределах Кавказа. 3. Сопоставьте данные о морфологической и кариологической изменчивости водяной полёвки и сделайте вывод о соотношении этих типов изменчивости у данного вида в горах Кавказа. Тема 4. Особенности кариотипической эволюции млекопитающих в горах Кавказа В эволюционных исследованиях важное место занимает изучение хромосомного полиморфизма и роли хромосомных перестроек в становлении репродуктивной изоляции. Так, у Erinaceus преобладают кариологические особенности, обусловленные различным распределением структурного гетерохроматина (Соколов и др., 1992). У кротов Кавказа эволюция кариотипа, по-видимому, шла по пути разделений хромосом (Дзуев, 1980, 1982). Два вида кавказских кротов (T.caucasica и T.levantis), имеющие соответственно 38 и 34 хромосомы в наборах при одинаковом NF = 66, очень четко выводятся один из другого с помощью разделения хромосом. Суть этой перестройки сводится к центрическому разделению одной пары суб- или метацентрических аутосом на две пары акроцентрических элементов. Однако число хромосомных плеч в обоих случаях остается неизменным. В пользу разделения хромосом у малого крота Кавказа в ходе эволюции кариотипа и образования нового вида (T. caucasica) в кариотипе которого содержится пять пар акроцентрических хромосом, говорит то обстоятельство, что он (T. levantis), по всем имеющимся у нас материалам и палеозоологическим данным, является реликтом третичного периода (Верещагин, 1959; Дзуев, 1980, 1982). В отличие от малого, кавказский крот имеет в рассматриваемом регионе ограниченное распространение, т.е. "неразвитый" ареал, занимающий Западный Кавказ и прилегающие районы. В научной литературе содержатся данные о возможности разделения метацентрических элементов на акроцентрические в эволюции кариотипа млекопитающих. По И.В.Картавцевой (1988), эволюция кариотипа песчанок рода Meriones Кавказа шла по пути разрывов метацентрических хромосом и образования акроцентрических элементов. В группу видов, возникших таким путем, она относит: M.meridianus (2n = 50), M.tristrami (2n = 72) и, возможно, M.crassus (2n = 60) по данным дифференциальной окраски хромосом. Сравнивая хромосомные наборы изученных видов рукокрылых и сопоставляя их с литературными данными (как при рутинной, так и дифференциалной окраске хромосом), Р.И.Дзуев (1995) пытался выявить возможные пути эволюции кариотипов этих видов. В семействе Verspertilionidae поздний кожан (Eptesicus serоtinus) имеет примитивный кариотип, видимо, близкий к предковому - 2n = 50, NF = 52, т.е. все аутосомы акроцентрические. По М.Д.Фаттаеву (1978) обнаруженная гомология дифференциально-окрашенных хромосом позволяет предположить, что все остальные кариотипы изученных представителей этого семейства произошли от "пре дкового" кариотипа, в котором все хромосомы являются акроцентриками. По роду Rhinolophus нами исследованы три вида. В кариотипах этих видов содержится три пары крупных метацентриков. Сопоставление фундаментальных чисел дает основание присоединиться к мнению Е.Капанна и М.В.Цивители (Capanna, Civitelli, 1970), что эти хромосомные пары образовались за счет робертсоновской транслокации из различных пар хромосом "предкового" кариотипа. Эти выводы подтверждаются гомологией картин G -полос на хромосомах 1, 2, 3 пар мета- и субметацентриков P. kuhli, P.nathusii и P.pipistrellus и соответствующих акроцентриков позднего акроцентрические хромосомы кариотипах дифференциальной окраски в хромосом кожана первых (Фаттаев, (Фаттаев, двух 1978), 1978). видов, по образовались Мелкие данным за счет перицентрической инверсии в одной паре акроцентриков. По данным М.Д.Фаттаева (1978), это 24 и 23 пары акроцентриков. Хромосомный набор P.pipistrellus, в отличие от предыдущих видов этого рода, в диплоидном наборе содержит 42 хромосомы при NFа = 50. В образовании кариотипа этого вида от "предкового", кроме выше приведенных соединений акроцентрических элементов, имели место соединения еще, как минимум, в двух парах акроцентрических аутосом. Сравнение кариотипов P.kuhlii и P.nathusii пока зывают, что репродуктивный барьер между этими видами образовался за счет точковых мутаций, так как они идентичны как по диплоидному числу, числу плеч и морфологии аутосом и половых хромосом, так и по G-исчерченности, которая получена для этих видов М.Д.Фаттаевым (1978). Аналогичная картина эволюции кариотипа для изученных видов рода Myotis обнаружена нами и другими исследователями (Фаттаев, 1976, 1978; Capanna et al., 1970). Сравнивая наши данные по кариотипам изученных родов гладконосых летучих мышей с литературными сведениями, можно прийти к следующей вероятной схеме эволюции кариотипа этого семейства. Представители рода Eptesicus, на наш взгляд, имеют "архаичный" кариотип, так как, по нашим данным, в кариотипе E.serotinus все аутосомы акроцентрические. Исходя из этого, мы расположили этот ряд на низшей ступени родословного древа. На следующих ступенях, в порядке увеличения количества двуплечих хромосом, расположены роды Miniopterus, Myotis, Pipistrellus. На самой вершине схемы расположены роды Barbastella и Plecotus. Интересна стабильность кариотипа внутри родов этого семейства. Повидимому, существуют внутренние факторы, способствующие мутабильности или ограничивающие ее. Замечено широкое распространение среди Vespertilionidae маркерной маленькой метацентрической пары хромосом, которая присутствует в родах Pipistrellus, Nyctalus, Myotis, Plecotus и Vespertilio. На наш взгляд, это должно способствовать группированию родов и выяснению порядка происхождения родов и видов. В научной литературе по кариологии содержатся сведения о кариотипах шести видов подковоносых летучих мышей (Capanna et al., 1970; Фаттаев, 1978). Диплоидное число и основное число плеч в пределах семейства варьирует незначительно, особенно на Кавказе: 2n = 56 - 58 при NF = 64 66. Исходя из этого, авторы пришли к выводу о медленной эволюции кариотипов в этом семействе. Сравнивая наши результаты с их данными, мы пришли к заключению, что при дифференциации кариотипов изученных нами видов основную роль сыграли точковые мутации и частично робертсоновские транслокации и перицентрические инверсии. К аналогичному выводу пришел и М.Д.Фаттаев (1978). Таким образом, сравнительный кариологический анализ родов и видов семейств гладконосых и подковоносых летучих мышей, полученных нами и другими исследователями, обнаруживает высокую гомологию кариотипов внутри этих групп. Исходя из этих материалов, видимо, можно поддержать гипотезу ряда авторов о монофилетическом происхождении летучих мышей этих семейств. В плане эволюции кариотипа и видообразования млекопитающих в горах Кавказа очень интересной, на наш взгляд, оказалась группа одноцветных мышовок Кавказа. Кариоло гические исследования этой группы показали существование на Кавказе, кроме степной и мышовки Штранда, еще четырех "хромосомных" видов, приуроченных к субальпийскому поясу: казбегская мышовка - 2n = 42, NF = 52, внутри этого вида обнаружен полиморфизм как по числу, так и по количеству хромосомных плеч, 2n = 40, NF = 50 (Соколов и др., 1992). Проведенный этими авторами, сравнительный анализ G-окрашенных хромосом 40 и 42хромосомной форм казбегской мышовки показал гомологию гетерохромосом и большинства аутосом, исключение составляет пятая пара двуплечих хромосом у 40-хромосомной кариоморфы, которая соответствует хромосомам пятой пары 42-хромосомной казбегской мышовки после тандемной транслокации на акроцентрические хромосомы 20 -ой пары. Следующие "хромосомные" виды имеют 2n = 36, NF = 52 (армянская мышовка). Нет сомнения в том, что в кариотипической эволюции этой группы млекопитающих основную роль, вероятно сыграла высотно-поясная структура горных ландшафтов. В пользу этого говорит и то положение, что каждый "хромосомный" вид приурочен к определенному типу поясности. Вероятно, в образовании кариотипов этих видов имел место ряд центрических разделений двуплечих хромосом с последующей транслокацией робертсоновского и тандемного типов, а также перицентрической инверсией. В настоящее время у систематиков не вызывает противоречий суждение том, что эти четыре хромосомные формы одноцветны х мышовок достигли уровня "хороших" видов (Соколов и др., 1980-1992; Дзуев, 1988 а,б, 1994; Темботов и др., 1988 и др.). На основании имеющихся к настоящему времени данных о кариотипах кавказских млекопитающих мы построили гистограмму распределения 2n, которая существенно не отличается от таковой, полученной Р.Маттеем (Mathey, 1976) и Е.Ю.Иваницкой (1990), и представляет собой нормальное распределение почти симметричное относительно пика: по 10 видов 2n = 44 и 54, два вида с минимальным значением 2n = 24 и по одному виду с 2n = 68, 70 и 72 (видов с 2n = 62, 64 и 66 не зарегистрировано) (рис. 100). Как видно из гистограммы, 2n большинства форм расположено в пределах 36 - 56 и по обе стороны от этих значений наблюдается почти одинаково повышение и снижение диплоидных чисел хромосом. Полученную картину распределения 2n можно, видимо, интерпретировать следующим образом: эволюция кариотипов млекопитающих Кавказа шла главным образом в сторону уменьшения числа хромосом преимущественно за счет тандемных слияний (центромерно-центромерных, центромернотеломерных и теломерно-теломерных). Подводя итоги всему вышеизложенному, следует отметить, что взаимодействие равнинных и горных ландшафтов оказывает существенное влияние на эволюцию кариотипа как в высотном, так и в горизонтальном направлениях. Более того, у ряда (видов) групп млекопитающих (Sicista, Pitymys, Microtus) эта изменчивость более резко выражена в субальпийском высокогорье, чем в нижележащих лесном и лесостепном поясах. В настоящее время, по имеющимся у нас данным и литературным сведениям о соотношении хромосомной и морфологической изменчивости млекопитающих на внутривидовом уровне, пока нет основания считать сколько-нибудь важным вклад структурных преобразований хромосомного набора в изменчивость морфологических признаков. Другими словами, нами не обнаружено каких-либо закономерных взаимосвязей между этими двумя показателями у изученных видов. Между тем, нами выявлена определенная закономерность: виды со стабильными морфологическими параметрами или виды двойники обладают полиморфным кариотипом и, наоборот, виды у которых экзофенотипические признаки подвержены заметной географической и популяционной изменчивости имеют на всем протяжении ареала стабильный кариотип. Нами подтверждается на основе кариологических исследований млекопитающих Кавказа мнение Э.А.Гилевой о том, что эволюционный потенциал внутривидовой хромосомной изменчивости реализуется двумя путями. Во-первых, некоторые из микроэволюционных макроэволюции хромосомных цитогенетических наборов. Во-вторых, феноменов многие являются системы основой хромосомной изменчивости, по всей вероятности, выступают в качестве одного из факторов видообразования, участвуя в образовании репродуктивной изоляции и/или модифицируя фенотипические характеристики носителей разных структурных вариантов хромосом. Выявленные нами случаи полиморфизма по центрическим транслокациям у млекопитающих Кавказа, позволяют проследить одну общую закономерность, а именно, размах хромосомной изменчивости всегда много шире между популяциями, чем в пределах одной популяции и нередко между видами. Это справедливо, видимо, в отношении Pitymys Кавказа. Наши данные и литературные сведения свидетельствуют о том, что у млекопитающих Кавказа встречаются почти все типы хромосомных перестроек, известные к настоящему времени. Для каждого рода этого класса, вероятно, характерны специфические черты эволюции кариотипа. Высокая стабильность диплоидных чисел, а также основного числа плеч хромосом у большинства исследованных (видов) групп млекопитающих, дает основание предполагать, что микроэволюционные процессы, происходящие в различных популяциях этих групп, основываются главным образом на генной дифференцировке и существенно не затрагивают морфологическую структуру хромосом. Задание для самостоятельной работы по теме №4 1. Пользуясь монографией Р.И.Дзуева «Хромосомные наборы млекопитающих Кавказа» (1998), изучите кариотипы рукокрылых Кавказа. 2. Ознакомьтесь с материалами по эволюции кариотипа рукокрылых, содержащимися в данных методических указаниях и статье Фаттаева (1978). 3. Составьте вероятную схему эволюции рукокрылых Кавказа по кариологическим данным. Литература Бобринский Н.А., Кузнецов Б.А., Кузякин А.П. Определитель млекопитающих СССР. М.: Просвещение, 1965, с. 381. Воронцов Н.Н. Значение изучения хромосомных наборов для систематики млекопитающих // Бюлл. МОИП, отд. биол., 1958. т. 63, с. 5-36. Громов И.М., Гуреев А.А., Новиков Г.А. и др. Млекопитающие фауны СССР. М.-Л.: Наука, 1963 ч.1 и II с. 639. Гуральник П.И. Хромосомный набор и систематика млекопитающих. Итоги науки, сер. биол.: Зоология, М.:ВИНИТИ, 1967. т. 20. с. 107-147. Дзуев Р.И. Закономерности хромосомной изменчивости млекопитающих в горах Кавказа.// Дисс. ... доктора биол. наук, Екатеринбург, 1995. с. 576. Дзуев Р.И. О сопряженности хромосомной и морфологической изменчивости млекопитающих в горах Кавказа // Материалы респуб. научно-практ. конф: Актуальные вопросы химии, биологии и экологии в КБР. Нальчик, 1997. с. 37-42. Дзуев Р.И. Хромосомные наборы млекопитающих Кавказа. Нальчик: Эльбрус, 1998. 256с. Козловский А.А. Результаты кариологического обследования аллопатрических форм малой бурозубки (Sorex minutus) // Зоол. журн., 1973. т. 52. вып. 3. с. 390-398. Заславский М.А. Новый метод изготовления чучел животных. Скульптурная таксидермия. Л: Наука, 1971. Козловский А.А. Возможности посмертного определения кариотипа у мелких млекопитающих // Зоол. журн., 1974. т. 53. вып. 12. с. 1871-1872. с.206. Макгрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных. М.: Мир, 1986, с. 267. Орлов В.Н. Кариосистематика млекопитающих. М.: Наука, 1974. с. 207. Орлов В.Н., Чудиновская Г.А., Крюкова Е.П. Исследование хромосомных наборов млекопитающих. М.: МГУ, 1976. с. 3-36. Орлов В.Н., Булатова Н.Ш. Сравнительная цитогенетика и кариосистематика млекопитающих. М.: Наука, 1983. с. 405. Плохинский Н.А. Биометрия М.: МГУ, 1970. с. 3-247. Раджабли СИ., Крюкова Е.П. Сравнительный анализ дифференциальной окраски хромосом двух видов хомячков, даурского и китайского //Цитология, 1973. т. 15. с. 1513-1527. Темботов А. К. Определитель млекопитающих Северного Кавказа. Нальчик, Эльбрус, 1965, с.'741-80|., Туров С.С. Набивка чучел птиц. М: Наука, 1950, с. 3-30. Шварц С.С, Смирнов B.C., Добринский Л.Н. Метод морфологических индикаторов. Свердловск, 1968. с. 346. Ford C.E., Hammerton J.L. A colhicine hypotonic citrate squash sequence for mammalian chromosomes //Stain Technol., 1956.vol. 31, p. 247-251. Levan A., Fredga K., Sanderson A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. - Hereditas, 1964. Vol.60, p.269-271. Makino S., Nishimura I. Water preteatment squash tehnique //Stain Technol. 1952. vol. 27. №1. p. 1-7. Moorhead P., Nowell P., Mellman W, et. al. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral blood // Exp. Ctll Res., 1960. vol. 20. p. 613-616. Matthey R. The chromosome formulae of eutherian mammals. In: Cytotaxonomy and vertebrate evolution / Ed. A.B.Chiarelli, E.Capanna. 1.; N.Y.: Acadd. Press, 1973. p. 532-616. Sachs L. Simple methos for mammalian chromosomes. - Stain Technol., 1953. vol.28, p.169. Seabrigt M. A. Rapid banding technique for human chromosomes //Lancet, 1971. vol. 2, № 7731. p. 971-972. Summer A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin // Exp. Ctll. Res., 1972. vol. 75, №3, p. 304-306. Rothfels K., Siminovitch L. Air drying technique for flattening chromosomes in mammallian cells grown in vitro. Stain. Technol., 1958, vol. 33, p. 73. White M.J.D. Models of speciation// Science, 1973. v. 159. p. 1065-1070. White M.J.D. Modes of Speciation. San-Francisco: W.H.Freeman and Co., 1978. p. 445.
