Начало формы ШМАНОВ М.А.*, МУСТАФИН К.Г

ШМАНОВ М.А.*, МУСТАФИН К.Г.**, САРСЕНБАЕВ Б.А*
СИНТЕЗ ФИТОСИДЕРОФОР ДИКОРАСТУЩИМИ ЗЛАКАМИ
(*Институт физиологии, генетики и биоинженерии растений МОиН РК,
**Казахский Национальный Аграрный Университет МОиН РК)
Показан синтез фитосидерофор корневой системой дикорастущих злаков в условиях
дефицита железа в питательной среде. Определена перспективность растений
Agropyron repens, как модельной системы для изучения механизмов адаптации растений
к повышенным концентрациям тяжелых металлов в почве.
В последнее время внимание ученых привлекает способность растений очищать
загрязненные почвы от токсических концентраций тяжелых металлов. При этом процессе,
называемом фиторемедиацией, растения извлекают из почвы тяжелые металлы и
накапливают их в своих надземных органах в концентрациях, уровень которых в
значительной степени различается между популяциями и внутри каждой из них [1].
На загрязненных металлом почвах растения растут по- разному. Одни виды растений
эффективно предотвращают поступление металла в свои надземные части, при этом они
могут содержать большие количества металла в своих корнях [2]. Другие виды активно
накапливают металлы в своих надземных тканях и могут быть грубо разделены на две
группы: индикаторы и гипераккумуляторы. Содержание металлов в различных тканях
растений-индикаторов в целом отражает уровень металла в почве. Растениягипераккумуляторы могут накапливать металлы в своих надземных органах до уровня,
значительно превышающих концентрацию металла в почве или в других растениях,
произрастающих поблизости и совершенно не накапливающих металлы. По определению,
растение, содержащее больше чем 0,1% Ni, Со, Cu, Cr и Pb или 1% Zn в своих листьях,
называется гипераккумулятором, независимо от концентрации металлов в почве [2].
Почти все известные сегодня виды растений- гипераккумуляторов были обнаружены на
загрязненных металлами естественным или искусственным образом почвах и часто
произрастают вместе с другими видами. Фактически, все гипераккумулирующие металлы
растения эндемичны к этим почвам. Это указывает на то, что гипераккумуляция тяжелых
металлов эндемичными растениями является важной экофизиологической адаптацией к
стрессу и (или) свидетельствует о проявлении их устойчивости к тяжелым металлам [3].
Однако механизмы поступления ионов тяжелых металлов в растения еще полностью не
раскрыты. При недостатке растворимого железа в почве злаковые растения увеличивают
поступление ионов железа, выделяя из своих корней небелковые аминокислоты соединения класса мугинеевой кислоты под общим названием фитосидерофоры (PS),
которые мобилизуют нерастворимые ионы Fe3+ из почвы, образуя хелаты, способные
утилизироваться корнями [4, 5].
Образование фитосидерофор характерно для злаковых растений при утилизации железа
из почвы [6]. Однако эти соединения способны образовывать устойчивые комплексы не
только с железом, но и с Zn, Mn и Cu. Было также отмечено повышение синтеза
фитосидерофор при дефиците ионов цинка в питательной среде [7]. Поэтому были
высказаны предположения об универсальной роли фитосидерофор в утилизации ионов
тяжелых металлов злаковыми растениями из почвы [8].
Учитывая это, нами была поставлена задача - провести поиск видов растенийгипераккумуляторов ионов тяжелых металлов среди дикорастущих злаков,
произрастающих в экологически неблагополучных областях Казахстана с учетом их
способности продуцировать фитосидерофоры. По результатам морфологического анализа
и анализа содержания ионов тяжелых металлов в растениях были отобраны три наиболее
перспективных вида растений: Phleum pratensis, Bromus inernus, Agropyron repens [6]. Эти
виды растений анализировали на способность продуцировать корневой системой
фитосидерофоры класса мугинеевых кислот в условиях железодефицита.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работы проводили в тепличном помещении в начале летних месяцев по методике
Такаджи [7] с некоторыми модификациями. Растения выращивались гидропонным
способом в контролируемых условиях окружающей среды с 16/8 часовым фотопериодом,
влажностью 80% и при температуре день/ночь 25/17oC при постоянной аэрации
питательного раствора. В качестве контрольных растений по образованию мугинеевых
кислот был выбран местный сорт ячменя Бота. На способность выделять фитосидерофоры
анализировались Phleum pratensis, Bromus inernus и Agropyron repens.
Семена выбранных видов растений стерилизовали 5% раствором Н2О2 проращивали
между увлажненными дисками фильтровальной бумаги при 25oC в течение 24-48 час.
Затем их пересаживали на жестко закрепленные капроновые сетки, которые помещали на
12-литровые полиэтиленовые емкости с 10 литрами водопроводной воды. Растворы
непрерывно аэрировались. Через 10-15 дней при полном формировании первого листа
водопроводная вода заменялась разбавленной в 10 раз питательной средой Хогланда №2
без Fe. На ранней стадии образования второго листа этот раствор заменяли на
разбавленную в два раза питательную среду Хогланда №2 (pH 5,5), содержащую Fe(III)EDTA (10 мкM). Через три дня заменяли питательную среду на модифицированный полный
раствор Хогланда №2 (pH 6,5), который содержал: 6 мМ KNO3, 4 мМ Са(NO3)2, 2 мМ
MgSO4, 1 мМ NaH2PO4, 3 мкМ H3BO4, 0,5 мкМ MnSO4, 0,4 мкМ ZnSO4, 0,2 мкМ CuSO4,
0,05 мкМ H2MoO4. Далее растения выращивали при постоянной аэрации в течение 1-2
недель до сбора корневого экссудата при появлении выраженных признаков хлороза
листьев. На этой стадии первые и вторые листья растений были полностью зелеными, а
следующие листья - слегка хлоротичными.
Сбор корневого экссудата проводили следующим образом: питательный раствор меняли
на дистиллированную воду (для Hordeum vulgaris - 5л, а для Phleum pratensis, Bromus
inernus и Agropyron repens - 2л), растения находились в воде 4 часа. После этого, для
измерения сухого веса, отделяли корни, а растения возвращали на питательную среду для
повторного сбора корневого экссудата. Сухой вес корней определяли путем взвешивания
после сушки при 600С в течение 12 час. Полученный корневой экссудат немедленно
фильтровали и фильтрат концентрировали под вакуумом при 500C до конечного объема в
30-40 мл.
Сконцентрированные экссудаты анализировали на содержание мугинеевых кислот колорометрическим методом [10] с использованием 1,10-o-фенантролина. Для этого, к 10 мл
образца добавляли 0,5 мл 0,5М Na-ацетат (рН 5,6), 2 мл 5 мМ FeCl3 (рН 7,0) и
инкубировали при постоянном перемешивании 2 часа при 550С. По окончании инкубации
смесь фильтро-вали во флакон с 0,2 мл 3 М H2SO4. К 10 мл фильтрата добавляли 0,5 мл
8% солянокислого гидроксиламина, инкубировали при 550С в течение 20 мин., затем
добавляли 1 мл 2М Na-ацетата (рН 4,7) и 0,5 мл 0,25% о-фенантролина. Поглощение
измеряли спектрофотометри-чески при 508 нм. В качестве стандартного раствора
использовали раствор 10 мМ Fe2SO4.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее уже была описана взаимосвязь между секрецией мугинеевых кислот (МК) и
сидерофорами грибного происхождения, которые являются переносчиками железа [11].
Грис с авторами [12] показали, что содержание фитосидерофор класса мугинеевых кислот,
секретируемых корневой системой Hordelimus europaes, быстро увеличивалось в ответ на
дефицит железа и меди.
При оценке концентраций мугинеевых кислот в корневых экссудатах мы исходили из
предположения, что их связывание с ионами железа происходит в эквимолярном
соотношении. Различные виды трав продуцируют различные производные мугинеевых
кислот [7]. На первом этапе основной задачей для нас явилась оценка общего содержания
мугинеевых кислот, секретируемых различными видами трав. На основании этих данных
необходимо было оценить наиболее продуктивный вид, у которого корневой экссудат
связывает наибольшее количество железа на 1г сухого веса корней.
Как видно из таблицы растения Hordeum vulgaris продуцируют большее количество MК,
чем другие виды: 0,025 мг на 1 растение. Но на 1г сухого веса корней Agropyron repens
более продуктивен.
На основании полученных данных можно предположить, что растения Agropyron repens
способны более интенсивно утилизировать нерастворимое железо из почвы.
Таблица. Соотношение синтезированных МК с корневой массой.
Общее кол-во Сухой вес
МК (мг)
корней (г)
мг МК на 1 г
сухих корней
мг МК на 1
растение
Hordeum vulgaris 100
2,46±0,20
3,11
0,79±0,04
0,025
Phleum pratensis 100
0,06±0,003
0,09
0,65±0,08
0,001
Bromus inernus
100
0,53±0,04
1,02
0,52±0,07
0,005
Agropyron repens 100
0,82±0,05
0,46
1,77±0,08
0,008
Вид растений
Кол-во
растений
Общепризнано, что способность растений выделять фитосидерофоры в питательную
сре-ду в больших количествах напрямую связана с дефицитом ионов железа и,
предположитель-но, ионов цинка и меди. В настоящее время контрольным растением для
этих целей исполь-зуется культурное растение ячмень. Полученные нами результаты
показывают перспектив-ность использования дикорастущих злаков вида Agropyron repens в
дальнейших эксперимен-тах по изучению механизмов адаптации растений к повышенным
концентрациям тяжелых металлов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pollard, A.G., Baker, A.J.M. Quantitative genetics of zink hyperaccumulation in Thlaspi
caerulescens., New Phytology, 1996, 132, P.113-118.
2. Baker, A.J.M., Walker, P.L. Ecophysiology of metal uptake by tolerant plants. In "Heavy Metal
Tolerance in Plants: Evolutionary Aspects". Ed. Shaw, A.J. Boca Raton: CRC Press, 1990, P.155177.
3. Baker, A.J.M., Brooks, R.R. Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements
- a review of their distribution, ecology and phytochemistry. Biorecovery, 1989, №1, P.81-126.
4. Takagi, S., Nomoto, K., Takemoto, T. Physiological aspect of mugineic acid, a possible
phytosiderophore of gramineous plants. Journal of Plant Nutrition, 1984, № 7, P.469-477.
5. Romheld, V., Marschner, H. Mobilization of iron in the rizosphere of different plant species.
Advances in Plant Nutrition, 1986, №2, P.155-204.
6. Сарсенбаев Б.А., Атабаева С.Д., Киршибаев Е., Кенжебаева Ш.К., Усенбеков Б.Н.,
Асрандина С.Ш., Биотехнология. Теория и пратика, 2002, 2, C.118-123.
7. Takagi, S. Production of phytosiderophores. In: Iron Chelation in Plants and Soil
Microorganisms. Eds. L.L.Barton and B.C.Hemming, Academic Press, Inc., N.Y., 1993, P.111131.
8. Murakami, T., Ise, K., Haykawa, M., Kamei, S., Takagi, S. Stabilities of metal complexes of
mugeinic acids and their specific affinities for iron (III). Chemistry Letters, 1989, P.2137-2140.
9. Crowley, D.E., Reid, C.P.P., Szaniszlo, P.T. Microbial siderophores as iron sources for plants.
In: "Iron Transport in Microbes, Plants, and Animals" Eds. Winkelman, G. et al. Weinheim,
Germany; VCH, 1987, P.375-386.
10. Takagi, S. Naturally occurring iron-chelating compounds in oat- and rice-root washings.
I.Activity measurement and preliminary characterisation. Soil Sciencies and Plant Nutrition, 1976,
22, P.423-433.
11. Winkelman, G. Fungal siderophores - membrane reactive ionophores. Journal of Plant
Nutrition, 1982, 5, P.645-651.
12. Gries, D., Klatt, S., Runge, M. Copper-deficiency-induced phytosiderophore release in the
calcicole grass Hordelimus europaes. New Phytologist, 1998, 140, P.95-101.
***
?i?aeoie i?oaaa oaii? ?aoiniaaai ?a?aaeaa oaae?e anou? o??uiaan ?niiaieoa?ai" oaiu?
??eaniiaaai oeoineaa?ioi?a neioaci e??naoieaai. Oiiu?a?oa?u aou? iaoaeaa?au" ?i?a?u
eiioaio?aoeynuia aaaioaoeyeaio iaoaieciii ca?ooaoaa iiaaeuaie ??ea ?aoiiaa-?aoa?ai aeaaeu?-
Agropyron repens ?niiaiaiii" ia?niaeoeaoieiai aiu?oae?ai.
***
The synthesis of phytosiderophores by root system of wild species of graminaceous plants in
conditions of micronutrient Fe-deficiency was shown. The prospectivity of Agropyron repens
plants as model system for research of mechanisms of plants adaptation to high heavy metal
concentrations in soil was determined.