Permanent algal culture of the Coccomyxa parasitica isolated from

Permanent algal culture of the Coccomyxa parasitica isolated from mollusc's tissues
and its parasitic impact.
Yu.N. Sokolnikova1, T.U. Magarlamov2, A.M. Stenkova3, V.V. Kumeiko1, 2
1
2
Far Eastern Federal University, Vladivostok 690950;
A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far Eastern Branch of Russian Academy
of Sciences, Vladivostok 690059;
3
G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of Russian
Academy of Sciences, Vladivostok 690022
Abstract
In natural populations of the bivalve Modiolus kurilensis were isolated individuals with
deformed shell and phytobiont inside. The microalgae were commonly observed in the
hemolymph and organs located in the posterior areas most exposed to light (the mantle, muscle
and gonad tissues) of the host. Method of effective production of these algae from mollusc
tissues was devised and applied for scale cultivation permanent culture which deposit in the
collection of the museum of A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology. Morphological
analysis of algae infested mollusc tissue and isolated ones were performed. It reveals an absence
of flagella and pyrenoids, presence single chloroplast and reproduction by autosporulation. This
reported the algae belong to Coccomyxa genus previously described. The small subunit (SSU)
18S rDNA complete sequence analysis of green microalgae has confirmed that they are
Coccomyxa parasitica. Green algae from M. kurilensis were identity to the Coccomyxa sp. from
Vityaz Bay 2011-4 JQ717057 (100% identity), very similar with C. parasitica from Flensburg
fjord 2 (EU127471) and Flensburg fjord 1 (EU127470) (99% identity). Descriptive analysis of
algal culture reveal time course of each life stage and dispore predominate over tetraspore.
Detailed of an invader-to-host relationship applying histological technique on semi-section were
done which revealed a histopathological changes in the affected individuals. Massive hemocyte
infiltration in an algal tissue depot and crucial histopathological changes in deposited tissue in
organs proves that the organism has a parasitic status.
Keywords: bivalve molluscs, algal culture, Coccomyxa, parasite, histology, pathology.
Введение
Морские
двустворчатые
моллюски
подвергаются
воздействию
различных
паразитов, которые могут вызывать физиологические отклонения, приводящие к
снижению популяции этих гидробионтов (Mydlarz et al. 2006, Гаевская 2006 и 2007). Хотя
сведения
об
инфицировании
моллюсков
микроводорослями
немногочисленны,
проведенные в этом направлении работы всё же позволили выделить некоторые общие
свойства распространения водорослей в организме хозяина. Так, при исследовании
заражения тридакны Symbiodinium microadriaticum (Trench 1981), мидии Chloricystis sp.
(Migunova 2000), гребешка (Naidu 1970) и различных представителей семейства Mytilidae
Coccomyxa sp. (Gray 1999, Rodriguez 2008, Zykov 2014) было выявлено, что колонии
водорослей сначала циркулируют в гемолимфе, а затем поселяются в органах наиболее
подверженных воздействию света (задний край мантии, задняя кишка ближе к анусу,
мускул-аддуктор и ткани гонады). Основными признаками C. parasitica являются:
отсутствие жгутиков и пиреноида, одиночный хлоропласт, размножение аутоспоруляцией.
В настоящее время ареал C. parasitica включает Балтийское море, атлантическое
побережье Канады (район о. Ньюфаундленд), юго-запад Атлантики (Фолклендские о-ва),
побережье Аргентины и Дальневосточное побережье Японского моря. При этом
большинство авторов указывают, что наиболее высокая заражённость гидробионтов
характерна для моллюсков, населяющих среднюю или нижнюю часть литорали (Bala,
1995, Rodriguez 2008, Crespo 2009, Zuykov 2014).
До сих пор не ясно физиологическое состояние, условия окружающей среды или
harmful algae играют ключевую роль в инвазировании моллюсков. В 1974 г. Stevenson и N
для решения этой проблемы предприняли попытку инфицирования гребешка в
лабораторных условиях, которого культивировали в насыщенных водорослями условиях.
Однако эта попытка не увенчались должным успехом, несмотря на тот факт, что в
желудке экспериментальных животных были обнаружены сфагоцитированные клетки
(Stevenson and South 1974). Некоторые авторы предполагают, что водоросли имеют
мощную клеточную стенку, которую не способны переварить гемоциты в процессе
фагоцитоза, и фагоциты, циркулируя с поглощенными водорослями, способствуют лишь
их распространению по организму (Gray 1999, Rodriguez 2008, Crespo 2009, Vazquez 2010,
Syasina 2012). В настоящее время нет однозначной информации о типе взаимоотношений
между моллюсками и C. parasitica, за исключением того, что водоросли оказывают какоето негативное влияние на хозяев. При слабой степени инфильтрации моллюсков
водоросли присутствуют только в гемолимфе, при более тяжелых случаях заражения
образуются колонии в тканях органов located in the posterior areas. Деформация раковины,
вызванная зелеными водорослями (Zuykov 2014), приводит к снижению фильтрационной
способности пораженных моллюсков (Naidu 1971, Gray 1999) и создает условия для
проникновения
других
паразитов.
Некоторые
авторы
указывают
на
медленное
вырождение пораженных тканей и органов. Так, у зараженных моллюсков отмечено
сокращение темпов воспроизводства (Gray 1999) и развития половой системы (Vaschenko
2013).
Жизненный цикл коккомиксы также исследован не в полной мере, но большинство
исследователей полагают, что эти водоросли являются факультативными паразитами и
проходят лишь определенные этапы жизненного цикла в моллюсках (Naidu 1971,
Stevenson and South, 1974, 1975, Gray et al. 1999, Mortensen et al. 2005, Rodriguez et al.
2008,. Crespo et al. 2009, Vazquez et al. 2010). Последнее упоминание о выделении и
культивировании C. parasitica датировано 1974 годом (Stevenson). Однако по данным
филогенетического анализа проведенным Rodriguez (2008), культура штамма 216/18,
хранящаяся в базе CCAP не C. parasitica.
Цель данной работы состояла в получении постоянной культуры водорослей C.
parasitica и исследовании ее паразитического влияния на двустворчатых моллюсков
Modiolus kurilensis. M. kurilensis один из доминирующих видов зообентоса мелководья и
литеральной зоны акваторий Японского моря.
Материалы и методы
Sampling. Specimens of infested M. kurilensis were randomly collected in Srednya Bay
of the Vostok Bay of the Sea of Japan from a depth of 1.5-2 m (420 53' 17.0" N, 1320 43' 17.8"
E). Collecting place characterized by periodic siltation and eutrophication (Naumov 2006). Shell
length of each bivalve was measured. For a comparative analysis molluscs without invasive
algae were caught from the Vostok Bay also.
Tissues analysis. For histological and ultrastructural assay 5 mm2 tissue fragments
(mantle, gill, gonad, kidney, digestive gland, muscle and hemolymph) were excised and
separately fixed in 2.5% glutaraldehyde buffered with artificial salt medium (ASW) at pH 7.5 for
1 h, washed three times in the same buffer, post-fixed in 1% osmium tetroxide at 4°C in the dark,
washed again, dehydrated in a solvent series: alcohol (10 to 96%) and acetone. At this time the
mixture of resins Epon 812 and Araldite M was prepared with the addition of DDSA 1.67:1:3.67
in the ratio, respectively. This formulation is most favorable composition for filling tissues of
marine animals. Samples were infiltrated for 1 h 30 min into mixtures of acetone: resin 2:1, 1:1,
1:2 (with added accelerator). Specimens were embedded in an Epon–Araldite mixture and semithin sections (0,75 μm) stained with methylene blue – azure II and basic fuchsin (Humphrey and
Pittman, 1974). The preparations were examined on a fluorescence microscope Zeiss
AxioImager A1, Germany. Ultrathin sections (65 nm) were prepared using a microtome Reichert
Ultracut S, mounted on a copper blend with butvara substrate, contrasted in 1% uranyl acetate
and examined in a Carl Zeiss LIBRA 120 transmission electron microscope.
Algal isolation and culture. Microalgae cells were isolated from hemolymph and
fragments of the mantle infested mollusc with the most intense color. Tissues specimens were
cut in small fragments (0.5 x 0.5 x 0.5 cm), mechanically homogenized using pestle and mortar.
0.5% trypsin solution prepared on ASW (tissue culture grade, 1:250, Difco, Invitrogen) was
added to the mass obtained, and limited digestion was done by mean of an incubation with a
gentle stirring for 10 min at 22 ºC. After this the suspension was lay off during 30 sec to reach
the pieces of mantle settled. The homogenous suspension was collected into a separate tube. The
sample was fractionated by isopycnic centrifugation in discontinuous density gradient of Percoll.
Percoll was diluted with physiological calcium and magnesium free salt solution to prepare 10,
15, 20, 25, 30, 35 and 40% solutions. Disaggregated tissue sample was layer on the top of the
preformed Percoll gradient, centrifuged at 800g for 12 min at 15 ºC. Cells concentrated at each
interface were collected separately with a syringe and washed three times with sterile-filtered sea
water by centrifugation under the same conditions.
Cumulative culture was obtained by inoculating selected microalgae suspension (100-200
million cells on 100 ml of medium) in enriched sterile liquid cultural medium f/2 (Guillard R.L.
and Ryther J.H., 1962) described on the website CCAP. Culture flasks were left in place not
exposed to the direct sun rays and gently stirred every 2 days. Cultures in liquid media were
maintained at grown at 20 – 22 0C with a 16-8 hour light-dark sequence. Quantitative account
and morphometric parameters of algal cells assayed in Gorjaev chamber every day for months
that growth curve to construct. Identification of the physiological state was performed by
analysis of color and intensity of fluorescence of the algal cells (Butler W.L. et al. 2002) in a
fluorescent microscope Zeiss Axio Imager А 1(Germany) used AxioCam MRc5 with fluorescent
filter (Zeiss BP 450-490/FT 510/LP 520).
DNA extraction, PCR, and sequencing. DNA was extracted from algal cultures using a
modified CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) method (Winnepenninckx et al.,
1993). The DNA concentration and integrity were determined by agarose gel electrophoresis.
PCR amplification of 18S rDNA gene was performed using the oligonucleotide primers 18beg-F
5’-CTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCAT-3’ and 18end-R 5’-TAGGTGGGAGGGTTTAACG
AACTT-3’, designed in this study. PCR conditions was as follows: initial denaturation at 95 °C
for 5 min followed by 30 cycles each at 94 0C for 20 s, 55 0C for 20 s, 72 0C for 1 min and a final
extension step at 72 0C for 5 min. Unincorporated primers and dNTPs were removed from PCR
products with Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (Thermo Scientific). Purified DNA was
completely sequenced using the additional sequencing primers 2EX-R 5’-TATTGGAGCTGGA
ATTACCGCG-3’ and 2EX-F2 5’-GGGAGTATGGTCGCAAGGCTGA-3’. Finally, almost
complete 18S rRNA (1728 bp) of green alga from M. modiolus was obtained and deposited in
GenBank under accession number XXXXXXXX.
Phylogenetic analysis. Phylogenetic trees were constructed in MEGA v.4.1 (Tamura et
al., 2007). We used neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987) and maximum parsimony (Eck and
Dayhoff, 1966) analysis. The reliability of the inferred trees was assessed by the bootstrap test
(1000 pseudoreplicates). The final alignment included 18S rRNA from other Trebouxiophyceae
deposited in GenBank for a total of 122 sequences, which as more as possible covered all class.
Результаты
У представителей двустворчатых моллюсков M. kurilensis, выловленных из
эвтрофицированных
вод
Японского
моря,
обнаружили
выраженную
инвазию
микроводорослей в различных органах и тканях. Был разработан метод, позволяющий
эффективно изолировать микроводоросли из тканей horse mussel, и получена постоянная
культура данной водоросли. Исследования жизненного цикла и морфологии водоросли, а
также
проведенный
генетический
анализ,
позволили
установить
ее
видовую
принадлежность, особенности роста и развития фаз жизненного цикла. Детальный анализ
образцов тканей пораженных моллюсков позволил установить характер паразитического
действия (parasitic impact) данной микроводоросли в организме хозяина, которые
затрагивают как внешние морфологические изменения, так и морфофункциональные
гистофизиологические перестройки.
Выловленные смешанные друзы представителей семейства Mytilidae содержали
моллюсков двух видов: Crenomytilus grayanus и Modiolus kurilensis. Однако только среди
представителей
модиолусов
каждой
друзы
были
обнаружены
животные
с
деформированной раковиной, длиной 86 – 126 мм, которая приобретала неправильную
для данного вида моллюсков сердцевидную форму с тупым задним краем и широкой
щелью между створками (рис. 1а). Иногда на раковине встречались сильно выступающие
концентрические линии скульптуры, свидетельствующие о неравномерном росте
моллюска.
В результате препарирования моллюсков с деформированной раковиной, а также
некоторых из них без выраженных нарушений внешней морфологии, было обнаружено,
что часть органов обильно ослизнены и имеют зеленую окраску (рис. 1а). При детальном
макроскопическом анализе тканей с разной степенью поражения интервентом, было
выявлено, что в первую очередь инфицируется водорослями гемолимфа (животные при
этом не имели видимых невооруженным глазом очагов инфильтрации водорослями в
других органах и тканях), далее задняя кишка (ближе к анусу) и уже позже заражению
подвергаются siphons, мантия, ткани гонады и мускула-аддуктора. При значительном
заражении мантия становится основным местом инфицирования, водорослевые колонии
на краю мантии становятся еще больше и с более плотной упаковкой.
Fig. 1. M. kurilensis infested C. parasitica with green areas on the posterior mantle, gonad and
deformation in the shell margin (arrow); the painted green hemolymph in the syringe (a). The
isolation of the algae from infested bivalve tissues in the density gradient medium of the Percoll
(b).
Был разработан эффективный метод для выделения культуры микроводорослей из
тканей моллюсков с применением механической и ферментативной дезагрегации тканей с
последующим фракционированием в градиенте плотности Percoll. Анализ препаратов
тканей, полученных механической
обработкой и трипсинизацией, показал,
что
примененные условия получения суспензий клеток являются минимальными и
достаточными для высвобождения большей части клеток водорослей из тканевых депо с
сохранением их целостности и жизнеспособности.
В ходе последующего центрифугирования полученных суспензий в градиенте
плотности Percoll были выделены 4 фракции (рис. 1б). Концентрация свободных клеток
водорослей увеличивалась с концентрацией градиента: фракция 20 – 25% содержала
главным образом гемоциты с фагоцитированными водорослями, фракция 25 – 30%
включала гемоциты с фагоцитированными водорослями, и свободные водоросли,
представленные в меньшем количестве, фракция 30 – 35% состояла из больших (6 – 10
мкм) клеток водорослей и не содержала гемоцитов, осадок на дне пробирки и взвесь во
фракции 40% содержали только маленькие (2 – 5 мкм) клетки водорослей. Благодаря
успешно разработанной методике выделения клеток водорослей в градиенте плотности
перколла из зараженных моллюсков, была успешно получена чистая культура
микроводорослей подлежащая длительному субкультивированию и депонированная в
коллекции.
Максимумы поглощения пигментов выделенных водорослей находились в красной
и сине-фиолетовой области спектра, а наибольшую флуоресценцию наблюдали в красной
области при возбуждении светом с длиной волны 650 – 680 нм, показывающее
преобладание хлорофилла в составе пигментов, что вместе с особенностями морфологии
свидетельствует о принадлежности выделенных водорослей отделу Chlorophyta (рис. 2а).
Fig. 2. Algal cells from an infested M. kurilensis showing by bright-field and fluorescent
microscopy with well-defined chloroplasts (a). Ultrastructure of algae cells (b): nucleus (N),
mitochondrion (M), chloroplast (Ch) with starch grains (St) and plastoglobula (Pg), vacuole (Vc)
and storage body (Sb). Scale bar: a = 10 µm; b = 2 µm.
Водорослевая
природа
организма
была
впоследствии
подтверждена
трансмиссионной электронной микроскопией (рис. 2б), которая показала, что клетки
представляют собой сферической или овальной формы одноклеточные эукариотические
водоросли 2-10 мкм в диаметре с морфологическими признаками, соответствующими
роду зеленых водорослей коккомикса. Для них характерно наличие одиночного ядра,
париетального чашеобразного хлоропласта, везикулярных тел, митохондрий, плотной
гранулярной цитоплазмы с липидными включениями и запасными тельцами, а также
отсутствие флагелл и пиреноидов.
Инокуляция 20 – 50 млн. выделенных клеток водорослей в 100 мл питательной
среды f/2 была неудовлетворительной концентрацией для получения жидкой субкультуры
– после нескольких месяцев культивирования видимого роста не наблюдалось. При
инокуляции бóльшего количества клеток (100 – 200 млн. клеток на 100 мл среды) выявили
стимуляцию активного роста субкультуры уже через несколько дней. Рост культуры
поддерживали при 20 – 220C с 16/8 часовым фотопериодом. При таких условиях в
лаборатории водоросли в жидкой культуре формировали колонии и давали начало
активно растущим субкультурам, постоянно сохраняющимся в коллекции.
Кривая роста культуры с исходной плотностью клеток 1млн/мл на рис. 3а
показывает, что в течение пяти дней культура находилась в латентной фазе – лаг фазе
(периоде адаптации), при которой происходило незначительное увеличение числа клеток.
Fig. 3. Growth curve of the C. parasitica culture (a) and morphological analysis of culture
phases by fluorescent (b) and electron microscopy (c). Designations: I – lag phase, II –
exponential phase, III – stationary growth phase and IV – death sphase; Ds – dispore, Ts –
tetraspore, YA – young alga, Ma – mature alga, OA – old alga. Scale bar: b = 20 µm, c = 2 µm.
Резкий подъем кривой (фаза экспотенциального роста, log-фаза) наблюдался в
основном в последующие дни, когда происходит активный рост культуры за счет
активной пролиферации клеток водорослей (рис. 3б). Водоросли размножались
споруляцией путем образования ди- и тетра- апланоспор (рис. 3с). Молодые клетки
маленьких размеров (3,7 ± 1,1 мкм) имели четко выраженный одиночный чашеобразный
хлоропласт по сравнению со старыми большими (8,5 ± 1,4 мкм) клетками с диффузным
хлоропластом. Апланоспорангий варьировал в размере от 2 до 9 мкм. Дескриптивный
анализ культуры водорослей показал, что диспоры доминируют по сравнению с
тетраспорами: частота встречаемости диспор составила 80,4 ± 6,3% среди всех делящихся
клеток и 24,8 ± 10,1% от общей биомассы клеток. Тетраспоры имели частоту
встречаемости 7,5 ± 5,4% от общей массы клеток. Стадия log-фаза завершалась на 16 день.
Стационарная фаза роста наступала на 17 сутки, во время которой клетки почти
прекращали делиться. При достижении концентрации клеток 140 млн./мл и накоплении
продуктов метаболизма происходило снижение общей биомассы водорослей, которое
после 33 суток культивирования приобретало катастрофический характер (фаза
отмирания).
In order to perform a genetic identification two new primers were designed to generate
partial small subunit (SSU) rRNA sequences of the green alga from M. kurilensis. To determine
the phylogenetic position of investigated green algae we constructed common phylogenetic tree
of all 18S rDNA Trebouxiophyceae presented in GenBank. The final length of aligned sequences
was adjusted to 1578 bp. The neighbor-joining phylogenetic tree is displayed in Figure 4. The
maximum parsimony tree was constructed to confirm the neighbor-joining phylogenetic
grouping and the last was preferred as more robust by bootstrap values. In the common
phylogenetic tree a number of Trebouxiophyceae families formed distinct clusters; there are
Coccomyxaceae, Ctenocladaceae, Oocystaceae and Prasiolaceae (Fig. 4.).
Fig. 4. Neighbour-Joining phylogenetic analyses of Trebouxiophyceae 18S rDNA genes. The
evolutionary distances were computed using the Kimura 2-parameter method and are expressed
in number of base substitutions per site. The percentages of replicate trees in which the
associated taxa clustered together in the bootstrap test are shown in nodes.
Fig. 5. Neighbour-Joining phylogenetic analyses of the Coccomyxaceae 18S rDNA genes.
Detailed phylogeny of the family Coccomyxaceae presented in fig. 5. All green algae of
the family divided into three groups one of which includes recently described members of C.
parasitica (Rodriguez et al., 2008; Vazquez et al., 2010). Our sequence is also located in this
group, confirming the identity of green algae from Crenomytilus grayanus to species C.
parasitica. Green algae from M. modiolus were identity to the Coccomyxa sp. from Vityaz Bay
2011-4 JQ717057 (100% identity), very similar with C. parasitica from the blue mussels from
Flensburg fjord 2 (EU127471) and Flensburg fjord 1 (EU127470) (99% identity).
Анализ гемолимфы зараженных моллюсков показал, что гемоциты окружают
конгломераты водорослей и фагоцитируют их (рис. 6).
Fig. 6. Hemocytes from infested M. modiolus containing variable number of algae cells: brightfield (a) and fluorescent (b) microscopy. Scale bar 20 µm.
Агрегации водорослей и инфильтрация гемоцитами с поглощенными клетками
микроводорослей были отмечены во всех исследованных органах моллюсков, за
исключением жабр и мускула-аддуктора. Фагоциты, наблюдаемые в инфицируемых
тканях (infested tissues), имели, как правило, округлую форму и содержали различное
число клеток водорослей (в одном гемоците можно было наблюдать до 8 клеток).
Электронная микроскопия подтвердила присутствие многочисленных клеток водорослей
в гемоцитах модиолусов (рис. 7).
Fig. 7. TEM photographs of algal cells phagocyted by hemocyte of the M. kurilensis.
Designations: nucleus (Nu), granules (Gr), residual body after digestion (RB), digestive vacuole
(DV), free alga (FA), phagocyted alga (PA). Scale bar 3 µm.
Сравнительный гистологический анализ тканей зараженных и незараженных
моллюсков показал их значительные различия, представленные в Таблице 1. Данные
исследования
мускула-аддуктора
не
представлены,
поскольку
никаких
гистоморфологических отклонений нами не было выявлено.
Table 1.
Description of the abnormalities in M. kurilensis affected organs.
Sample
Abnormality
Gills
Hemocytic infiltration; decrease the number of mucous cells occasionally;
degeneration of the intermedial epithelium (contact area).
Mantle
Deformation of the edge of the mantle; increase the number of mucous cells;
narrowing (сужение) of the epithelium cells; thinning of the basal membrane
and outer circular muscle layer; focus of algal encapsulation with hemocytes;
deformation of circulatory and longitudinal muscle layers.
Kidney
Hemocytic and algal infiltration in the intertubular renal space; hyperplasia,
vacuolization of the excretory epithelium; increase in the number of
concretions; changes in the shape (rounding) and size (minimization) of cells;
degeneration of renal tubular epithelium occasionally; dilatation of basal
membrane.
Digestive
gland
Denudation and dilatation of the basal membrane of digestive tubules;
and hemocytic and algal infiltration in the connective tissue between the digestive
intestine
and intestinal tubules; deformation of the intestine epithelium.
Gonad
Hemocytic and algal infiltration in the connective tissue between the follicles;
neither the alga-containing hemocytes nor the free algae were observed inside
the gonadal follicles.
Мантия
здоровых
особей
модиолусов
(рис.
8
a-c)
была
представлена
эпителиальными клетками и мышечными волокнами, уложенными в несколько слоев.
Между мышцами и эпителием, содержащим слизистые и цилиндрические ресничные
клетки (40 – 42 мкм высотой) находилась базальная мембрана с прилежащими клетками
базального слоя, которая при участии outer circular layer мышечным слоем (10 – 13 мкм
толщиной) образовывала микроворсинки мантии. В отличие от здоровых животных у
зараженных модиолусов (рис. 8 d-f) слои мышечных волокон не имели такого типичного
строя и были сильно инфильтрированы водорослями и гемоцитами, с некротическими
зонами (рис. 8 f), что указывает на острую воспалительную реакцию. Цилиарный
наружный мышечный слой (5 – 7 мкм толщиной) и базальная мембрана были значительно
деформированы и утончены, микроворсинки практически отсутствовали (рис. 8 e). Также
деформировался
слой
эпителиальных
клеток,
которые
становились
более
вакуолизированными у основания, узкими и вытянутыми (45 – 52 мкм высотой) с
преобладаем среди них слизистых клеток, секрет которых покрывал весь эпителий (рис. 8
e), что хорошо согласуется с данными макроскопического исследования.
Fig. 8. Histological sections of healthy (a-c) and infested (d-f) M. kurilensis mantles. Semithin
sections of mantle showing the presence of C. parasitica cell aggregations and necrotic areas
(arrows), encapsulation of the algal aggregation by host cells (star), deformation of the edge of
the mantle. Designations: outer epithelium cells (OEC); outer circular muscle layer (COL);
median longitudinal muscle layer (LML); radial muscle fibers (RF); ciliated columnar epithelium
(CEC); mucous cells (MC); basal membrane (Bm); basal cells (BC); hemocytes (Hc); groove
(G); 1 – increasee of the mucous cells number ; 2, 3 – narrowing of the epithelium cells; 4 – Bm
and COL thinned; 5 – foci of the hemocytic encapsulation around algae; 6 – deformation of the
circulatory and longitudinal filaments. Scale bar 20 µm.
Анализ полутонких срезов почек (рис. 9) также показал значительные отклонения в
строении этих органов у зараженных особей по сравнению со здоровыми. Так, у
моллюсков происходило утолщение (в некоторых участках в десятки раз) базальной
мембраны (рис. 9 d) и значительное увеличение числа (гиперплазия) эпителиальных
экскреторных клеток (рис. 9 c, d), которые, как правило, имели более округлую и
сплющенную форму и меньшие (20 – 30 мкм) размеры по сравнению со здоровыми (30 –
50 мкм), а также содержали большее число конкреций (рис. 9 c). Просвет почечных
канальцев зараженных моллюсков был зачастую сильно расширен, поскольку был
заполнен массой, состоящей из водорослей и фагоцитирующих гемоцитов (рис. 9 c, d).
Иногда наблюдалась дегенерация трубчатого эпителия.
Fig. 9. Histological sections of healthy (a, b) and infested (c, d) M. kurilensis kidneys. Semithin
sections of the kidneys showing the C. parasitica cell aggregations (arrows) and phagocytic
hemocyte (asterisk). Designations: hemocytes (Hc); renal tubule lumen (Lu); basal membrane
(BM); epithelium cells (EC); microvilli (Mv); vacuole (V); nucleus (Nu); excretory concretions
(ExC); 1 – excrescence of the basal membrane and intertubular connective tissue; 2 – an increase
of the concretions number ; 3 – hyperplasia and vacuolization of the excretory epithelium; the
size and shape of cells changed (rounding and minimization); severe tubular epithelium
degeneration occasionally; 4 – hemocytic and algal infiltration in the intertubular renal space.
Scale bar 40 µm.
При анализе пищеварительных желез моллюсков обеих групп (рис. 10) были
обнаружены ацинусы на разных стадиях пищеварительного цикла, содержащие
пищеварительные и базофильные клетки (рис. 10 a). Однако у зараженных животных
просветы между intestinal and digestive tubules были значительно расширены и заполнены
большим числом водорослей и гемоцитов, а сами ацинусы имели более утолщенную
базальную мембрану (3 – 10 мкм) по сравнению с таковой у здоровых животных (2 – 4
мкм) (рис. 10 c, d). Также в некоторых случаях было выявлено оголение базальной
мембраны intestinal and digestive tubules (рис. 10 c), между которыми наблюдалась
гемоцитарная и водорослевая инфильтрация.
Fig. 10. Histological sections of healthy (a, b) and infested (c, d) M. kurilensis digestive glands
and intestine. Semithin sections of the digestive (a, c) and intestinal (b, d) tubules showing the C.
parasitica cell aggregations (arrows) in the intertubular connective tissue. Designations:
hemocytes (Hc); lumen (Lu); basal membrane (BM); digestive cells (DC); mucous cells (MC);
columnar ciliated epithelium (CCE); basophile cells (BC); 1 – denudation and dilatation of
tubule basal membrane; 2 – hemocytic infiltration in the connective tissue between tubules; 3, 4
– deformation of intestine epithelium. Scale bar 50 µm.
Гонады зараженных и здоровых моллюсков практически не отличалась и содержали
созревающие ооциты (рис. 11), за исключением того, что просветы между ацинусами у
зараженных животных были значительно инфильтрованы клетками водорослей и
гемолимфы (рис. 11 b).
Fig. 11. Histological sections of healthy (a) and infested (b) M. kurilensis female gonads.
Semithin sections showing hemocytic and algal infiltration in the space between follicles
(asterisk). Designations: oocyte (Oc); hemocytes (Hc). Scale bar 40 µm.
В жабрах зараженных модиолусов клетки водорослей отсутствовали (рис. 12), но,
несмотря на это они были значительно инфильтрированы гемоцитами (рис. 12 c, d). В
некоторых наблюдалось уменьшение числа слизистых клеток среди цилиарных клеток
abfrontal zone и дегенерация columnar epithelial cells with microvilli intermedial zone жабр
(рис. 12 d).
Fig. 12. Histological sections of healthy (a, b) and infested (c, d) M. kurilensis gill filaments.
Semithin sections showing of the algal cells absence. Designations: columnar epithelial cells
with cilia (CC); columnar epithelial cells with microvilli (MvC); epithelium cells (EC); basal
membrane (BM); hemocytes (Hc); muscle cell (MuC); mucous cells (MC); frontal zone (FZ);
lateral zone (LZ); abfrontal zone (AZ); intermedial zone (ImZ); branchial sinus (BS); 1 –
hemocytic infiltration; 2 – decrease of the mucous cells number; 3 – degeneration of the medial
epithelium. Scale bar: a, c = 40 µm, b, d = 20 µm.
Сравнительный
анализ
здоровых
и
инфицированных
особей
доказывает
паразитический статус C. parasitica, поскольку влияние (impact) данной микроводоросли
обеспечивает
существенные
свидетельствующие
дегенерацией тканей.
о
(crucial)
выраженной
гистоморфологические
воспалительной
реакции,
перестройки,
сопровождающейся
Обсуждение
Симбиотические
одноклеточные
водоросли
были
описаны
у
различных
беспозвоночных (Taylor 1973, Trench 1993). Наиболее раннее сообщение о нахождении
одноклеточных зеленых водорослей у двустворчатых моллюсков было сделано Wiborg
K.F. в 1946 г. Однако кроме того, что сифон и мантию Modiolus modiolus населяют
маленькие глобулярные зеленые одноклеточные водоросли размером 12 мкм со жгутиком,
никакой информации больше не сообщалось. Позже, в 1967 г. Rowell T.W. описал у этого
же моллюска, но уже меньшего размера (4,6 мкм) овальные с микрофлагеллой водоросли,
населяющие мантию и жабры. Naidu K.S. и South G.R. обнаружив в 1970 г.зеленую
окраску мантии, гонады и мускула-аддуктора у Placopecten magellanicus, учитывая
морфологическую
характеристику
водоросли,
данную
двумя
вышеупомянутыми
авторами, пришли к выводу, что гребешков инфицирует водоросль отличная от таковой у
модиолусов и описали ее как endozoic alga, т.е. живущую внутри животного и отнесли ее к
симбиотическим зоохлореллам. В последующей работе разоблачения феномена заселения
гребешка Stevenson R.N. и South G.R. (1972) уже признали за водорослью паразитический
статус, но точное систематическое положение не установили. Спустя три года Stevenson
R.N. и South G.R. (1974) в своей статье описывают паразита в качестве нового члена
семейства Coccomyxaceae под названием Coccomyxa parasitica, а в 1979 г. Boraso A.L. и
Zaixso H.E. сообщают о первой находке зеленой инвазии в Mytilus edulis, вызванной, как
они полагают, также C. parasitica. Последующие работы (Meixner 1984, Bala 1995, Gray
1999, Mortensen 2005), описывающие обнаружение коккомиксы у M. edulis из разных
районов Атлантического океана и подтвержденные генетическим анализом в работе
Rodriguez F. (2008) показали, что водоросль, выделенная Stevenson R.N. и South G.R. и
хранящаяся в Culture Collection of Algae and Protozoa [CCAP] strain 216/18 не является C.
parasitica. Генетический анализ выявил, что все водоросли, выделенные из мидий разных
районов, кроме культуры CCAP strain 216/18 входят в Coccomyxa clade. The CCAP strain
216/18 was a sister sequence to Nannochloris algae, far from the Coccomyxa clade. These results
suggest a misidentification or outgrowth of the original CCAP strain 216/18 by a different.
Филогенетический анализ выделенной нами водоросли из Modiolus kurilensis, благодаря
более удачно сконструированным двум праймерам и более полному сиквенсу (1728 bp),
чем в работе Syasina I.G. 2012, исследовавшей этот же феномен, позволил точно
установить, что модиолуса из Японского моря тоже инвазирует C. parasitica very similar
with C. parasitica from Flensburg fjord 2 (EU127471) and Flensburg fjord 1 (EU127470) (99%
identity).
В 2009 г. Crespo C. сообщает о нахождении коккомиксы у Mytilus galloprovincialis,
а через год Vazquez N. (2010) находит ее в Panopea abbreviate и Ensis macha (единичный
случай заражения). В 2012 г. в своей работе Syasina I.G. описывает заражение
коккомиксой Modiolus modiolus from Vityaz Bay (Peter the Great Bay, the Sea of Japan),
однако из литературных источников (Лутаенко 2012) известно, что в водах Японского
моря обитает лишь вид Modiolus kurilensis (Bernard 1983), исследуемый в данной работе.
Инвазия зелеными водорослями также была описана для Clinocardium nuttalli (Hartman
1976 и Jones 1992), однако никаких достоверных данных о принадлежности водоросли к
Coccomyxa clade нет, за исключением морфологического описания обнаруженной
зоохлореллы.
Согласно литературным и полученными нами данным C. parasitica является
эукариотическим одноклеточным организмом без флагеллы с одним или двумя
хлоропластами, овальной или круглой формы, размером 2 – 10 мкм, при этом чаще
встречаются водоросли от 3 до 5 мкм (Gray 1999, Vazquez 2010, Crespo 2009, Syasina 2012,
Meixner 1984). Размножаются водоросли чаще 2- и 4-спорами размером 2 – 8 мкм, реже в
литературе встречается упоминание об образовании 8- и 16-спор (Stevenson 1974, Hartman
1976) и то только в культуре. Однако нами в культуре не было обнаружено 8- и 16спорангиев – в культуре преобладали диспоры, что также было отмечено Stevenson R.N.
(1972). Полученная и описанная Stevenson R.N. культура отличалась и формой клеток (от
круглой до каплевидной с различными выростами цитоплазмы), что еще больше
доказывает отличие водорослей, наводняющих ткани гребешка от всех выше упомянутых
(C. parasitica).
Важным критерием получения эндозоических водорослей является эффективная
методика выделения и поддержания этих симбионтов в постоянной культуре. Stevenson
R.N. (1971), Hartman M.C. (1976) и Rodriguez F. (2008) предпринимали попытки выделения
микроводорослей из тканей моллюсков, но несмотря на сложные процедуры выделения
водорослей (оригинальные методики), полученные культуры, как правило, содержали
бактерии, что в итоге приводило к ее загрязнению и гибели. Разработанный нами метод
позволяет эффективно получать постоянную культуру паразитических микроводорослей,
которая лучше развивается в узком, но несколько более высоком температурном режиме
(20 – 22 0C), чем указывают в своих работах Stevenson R.N. и Hartman M.C. (15 – 16 0C),
что вероятно связано с более холодными климатическими условиями районов вылова
hosts. Нами также как и Stevenson R.N. было отмечено, что при недостаточном количестве
водорослей культура не растет, а Hartman M.C. обнаружил, что культура гораздо быстрее
растет на среде, приготовленной с добавлением ten percent mantle fluid filtrate, при этом
лаг фаза сокращается с двух месяцев до 10 дней. В нашем случае оптимальной средой для
культуры C. parasitica стала среда, рецептура которой прописана на сайте CCAP (f/2).
Однако попытки Rodriguez F. to isolate C. parasitica from mussels using f/2 and K media were
unsuccessful, и на основе этого им было дано заключение, что данные среды являются не
подходящими для C. parasitica, поскольку не содержат нужного количества питательных
веществ. Однако в работе Carlos A.A. (2000) также описан удачный опыт культивирования
зооксантелл, выделенных из различных видов моллюсков именно на K media. Помимо
этого в работах Stevenson R.N. и Hartman M.C. представлен широкий перечень сред,
апробированных и подходящих для выращивания эндозоических водорослей, схожих по
составу с выше упомянутыми. Оптимальным циклом чередования света и темноты (без
прямого воздействия света) для выращивания водорослей в культуре стал фотопериод
18/6 ч, что также было указано в работах Stevenson R.N. и Hartman M.C. В таких
оптимальных условиях культура проходила все стадии жизненного цикла стандартно
описанными для культур микроводорослей с видимыми метаморфозами клеток
водорослей. Так, нами и Stevenson R.N. было обнаружено, что молодая культура содержит
в основном маленькие клетки с компактной укладкой всех органелл. Затем наступает фаза
размножения, в результате которой в культуре появляются хорошо различимые споры
водорослей. По мере развития и запасания питательных веществ, клетки увеличиваются в
размерах, а на стадии отмирания старые клетки уже содержат более диффузный по
сравнению с молодыми хлоропласт, который не имеет такого ярко красного свечения во
флуоресцентном свете. Таким образом, несмотря на различия выделенных нами и
Stevenson R.N. (1971), Hartman M.C. (1976) и Rodriguez F. (2008) водорослей для
выращивания паразитических водорослей необходимы хоть и специфические, но схожие
условия выращивания культур в лаборатории.
Изучая в 1983 – 1984 гг. распространение кокомиксы у четырёх видов митилид
Aulacomya atraatra, Brachidontes rodriguezi, Mytilus edulis platensis, Perumytilus purpuratus
зал. Сан-Хосе Bala L. (1995) установил, что этот паразит встречается здесь только у
аргентинской мидии, а Vazquez N. (2010) обнаружил подобную особенность для особей
Panopea abbreviate, которые оказались единственно зараженными среди других массово
выловленных видов моллюсков (Ostrea puelchana, Pododesmus rudis, Aequipecten
tehuelchus). Выше описанные случаи и не обнаруженные нами в смешанной друзе
моллюсков зараженных особей кроме как M. kurilensis дает основание предположить, что
C. parasitica обладает высокой степенью специфичности по отношению к своему хозяину.
Заражению подвергаются представители семейства Mytilidae, за исключением единичного
случая заражения гуидака. Моллюски, инфицированные водорослями, как правило,
обитают на глубине 30 – 70 см (Jones 1992, Gray 1999, Mortensen 2005), 2 – 5 м (Syasina
2012 и исследованные нами моллюски) и 15 м (Vazquez 2010) с илистым и реже песчаным
дном. Naidu (1970) и Gray (1999) отмечено, что с увеличением глубины степень заражения
уменьшается, в связи с тем, что для развития водорослевой инвазии необходим свет. При
этом, как отмечают все авторы, поражаются животные старше двух лет. Нами такой
тенденции не было выявлено, поскольку друзы содержали исключительно уже взрослых
особей моллюсков. В ряде работ (Naidu 1970, Zykov 2014) также показано, что с
увеличением возраста увеличивается частота и степень заражения моллюсков, но до
определенных пределов: не встречаются очень старые особи, что вероятно связано с
ранней смертностью зараженных моллюсков. При этом пораженные ткани органов, среди
которых чаще всего авторами отмечаются мантия и мускул приобретают зеленую окраску.
Нами, так же как и другими авторами была выявлена зеленая окраска жабр, гонады (Naidu
1970, Stevenson 1974), задней кишки ближе к анусу и сифона (Hartman 1976, Mortensen
2005). В работе Syasina I.G. (2012) и Zykov M. (2014) также описана зеленая окраска
пищеварительной железы. Для мидий чаще описывают диффузную окраску пораженных
органов в виде пустул (Rodriguez 2008, Crespo 2009), что вероятно связано с видовыми
особенностями поражаемого host. У P. abbreviate сифон был описан, как единственный
орган, зараженный C. parasitica (Vazquez 2010). Таким образом, нами было выявлено, что
сначала
у зараженных животных без видимых поражений органов водоросли
наблюдаются лишь в гемолимфе, далее зеленую окраску приобретает задняя кишка
(ближе к анусу) и уже позже exhalent сифон, мантия, мускул-аддуктор, жабры и гонада, а в
связи с аномальным развитием тканей деформируется в последствии и раковина
моллюсков. Подобную точку зрения на очередность поражения органов можно найти и в
работах Jones D.S. (1992) и Mortensen S. (2005), однако не во всех работах (Jones 1992,
Syasina 2012) сообщается о деформации раковины моллюсков. Истончение раковины
моллюсков, как предполагает Zykov M. (2014) также способствует проникновению света.
Первая теория о пути и причине проникновения паразитической водоросли в
организм моллюсков была выдвинута Naidu K.S. в 1970 г., согласно которой водоросли
проникают в организм в результате повреждения внешних эпителиальных покровов и
раковины моллюсков. Однако в 1972 г. Stevenson R.N. в своей работе опровергает Naidu
K.S., поскольку не все особи с обнаруженной им инвазией имели видимые повреждения в
столь раннем возрасте (2 года). В этой же работе Stevenson R.N. представил результаты,
проведенных опытов экспериментального заражения моллюсков, и, несмотря на то, что
наиболее удачным оказался опыт с инъекцией клеток водорослей в краевую складку
мантии, автор склоняется к теории о проникновении водорослей все же через
пищеварительную систему. Это было связано с тем, что в желудке моллюсков
наблюдались гемоциты с фагоцитированными водорослями, а как предполагают
большинство авторов именно гемоциты, поглощая водоросли, но не всегда способные
переварить их клеточную стенку способствуют их распространению по всему организму.
В некоторых случаях замечено даже размножение водорослей внутри гемоцитов
(Stevenson 1975). Предпринятые нами попытки (данные не представлены в работе)
окраски клеток водорослей I2-KI-H2SO4, chlor-zinc-iodide tests for cellulose и Lugol's
solution for starch gave negative results. A similar negative result was encountered by Naidu
K.S. (1970), Stevenson R.N. (1974) and Jones D.S. (1992). В работе Stevenson R.N. (1974)
также показано, что the cell wall is highly resistant to chemical penetration, cells remaining
intact for as long as 10 min in 75% H2SO4. Все указанные данные подтверждают возможную
высокую устойчивость клеток эндозоических водорослей к воздействию лизосомальных
ферментов гемоцитов.
Активная реакция гемоцитов на присутствие Coccomyxa является показателем
патогенности водоросли по отношению к морским организмам. В работе Cheung P.J.
(1990) и Diamant A. (2007) выявлено, что представители рода коккомикса могут являться
даже причиной массовой гибели рыб. В данной работе было обнаружено повсеместное
распространение водорослей у инфицированных моллюсков, за исключением жабр и
мускула-аддуктора. Однако значительная инфильтрация гемоцитами, не содержащими
водоросли, наблюдалась в тканях всех исследуемых органов модиолуса (мантия, жабры,
гонада,
почки,
пищеварительная
железа).
При
этом
неоднократно
встречалась
инкапсуляция водорослей с образованием крупных очагов фиброза и areas with amorphic,
presumably necrotic material, что было также отмечено в работах Gray A.P. (1999),
Rodriguez F. (2008), Crespo C. (2009), Mortensen S. (2005) и Vazquez N. (2010), и работах,
посвященных исследованию влияния различных паразитов на физиологическое состояние
моллюсков (Auffret 1988, Neff 1986, Villalba 1997, Kim 1998 и da Silva 2008). Нами не
было обнаружено отклонений в строении мускула-аддуктора, однако, описанные
признаки нарушения тканей сифона гуидака в работе Vazquez N. (2010): distorting the
orientation of the muscle and connective fibers, cellular debris, and infiltration by hemocytes,
which were encapsulating the alga cells, были выявлены в мантии модиолуса. В мантии и
почках модиолуса были выявлены значительные морфофункциональные отклонения
различных клеточных типов, ведущих к дисфункции исследуемых органов.
В ряде работ было указано, что заселение водорослей приводит к деформации
тканей, ослаблению и атрофии мускула-аддуктора (Gray 1999), эродированию раковины
(Zykov 2014), нарушению репродуктивного цикла связанного с недоразвитием половых
желез, росту соединительной ткани (Vaschenko et al. 2013, Gray 1999). Выявленные
гистопатологии, как правило, приводят в дальнейшем к нарушению нормальной
фильтрационной способности моллюсков, а также к отставанию в развитии и дегенерации
поражённых органов (Gray 1999, Humphrey 2005), что также может способствовать
проникновению других паразитов.
Несмотря ярко выраженную защитную реакцию моллюсков против водорослевой
инфекции и ее патогенные эффекты некоторые авторы высказывают точку зрения о том,
что характер взаимоотношений зелёных водорослей с моллюсками все же может
варьировать от паразитизма (Stevenson 1974, Meixner 1984, Hartman 1974, Vazquez 2010,
Gray 1999) до типичного мутуализма (Naidu 1970).
В результате проведенной нами работе, можно заключить, что C. parasitica,
инвазирующая двустворчатых моллюсков, в зависимости от доступности света, и
способная независимо от хозяина, размножаться в культуре, является факультативным
паразитом, вызывающим значительные деформации и дисфункции пораженных тканей и
органов с ранним смертельным исходом пораженных особей.