Отчет 1 этап по ГК №П716 от 12.08.09 - Кабардино
advertisement
Федеральное агентство по образованию УДК 650.014.2 ГРНТИ 76.03.31 Инв. № ПРИНЯТО: УТВЕРЖДЕНО: Приемочная комиссия Государственного заказчика Государственный заказчик Федеральное агентство по образованию От имени Приемочной комиссии От имени Государственного заказчика _____________________/Е.И. Лапин/ ____________________/ Е.Я. Бутко/ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П 716 от 12 августа 2009 г. Исполнитель: Государственное профессионального образования университет им. Х.М. Бербекова». образовательное учреждение высшего «Кабардино-Балкарский государственный Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.2 «Проведение научных исследований научными группами под руководством кандидатов наук» Проект: «Разработка технологий создания лекарственных средств на базе синтетических гетероциклических соединений в качестве геномных и постгеномных модуляторов клеточной и опухолевой пролиферации» «Экспериментальные исследования, синтез новых химических веществ» Руководитель организации: ______________________Б.С. Карамурзов м.п. Руководитель проекта: ________________________ А.А. Шевченко Согласовано: Управление научных исследований и инновационных программ От имени Заказчика _______________________/Кошкин В.И./ Нальчик 2009 Список исполнителей Научный руководитель, Шевченко А.А. С.н.с. УНИИД КБГУ, к.б.н. (Реферат, введение, 20.10.2009 г. главы 1-3, заключение) Исполнители Г.н.с., УНИИД КБГУ, академиРАМН, профессор, д.м.н. Березов Т.Т. (Главы 20.10.2009 г. С.н.с., УНИИД КБГУ, к.х.н., доцент 1-3) Левов А.Н. 20.10.2009 г. Н.с., УНИИД КБГУ, к.б.н. (Главы 1-3) Голомазова К. А. 20.10.2009 г. (Главы 1-3) Заведующая, Кафедра микробиологии, вирусологии и Хараева З.Ф. 20.10.2009г. иммунологии КБГУ, д.м.н., (Главы 1-3) профессор. Аспирант КБГУ Аспирант КБГУ Студент КБГУ Студент КБГУ Анзорова З.З. (Главы 20.10.2009 г. 1-3) Сакиева Д.Н. 20.10.2009 г. (Главы 1-3) Борисова А. А. 20.10.2009 г. (Главы 1-3) Андриянова Е.В. 20.10.2009 г. Патентовед КБГУ (Главы 1-3) Искакова Г.А. 20.10.2009 г. 2 (Приложение 1) Нормоконтролер, начальник ОСМО 20.10.2009 г. 3 Кольченко Е.А. Реферат Отчет 320 с., 1 ч., 36 рис., 12 табл., 275 источника. ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ ТРАНСГЛУТАМИНАЗА, СОЕДИНЕНИЯ, РЕГУЛЯЦИЯ ПОЛИАМИНЫ, КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ, ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ Аналоги ПА способны замещать эндогенные ПА в клетке в участках связывания. Это приводит к нарушению функций внутриклеточных ПА [234]. Исследования ограничились аналогами ПА алифатической структуры [270]. Однако предварительные результаты показали, что онкопротекторной активностью могут обладать также гетероциклические соединения, в частности, бис-уридильные [266], азафлуореновые и бензимидазольные [29] производные, а также алкалоиды [207]. Выбор данных веществ был обусловлен тем, что в их структуре можно выделить полиаминовые фрагменты. Изучение характера и степени влияния названных веществ на ключевые ферменты обмена ПА позволит сделать предположение об их возможном канцерогенном или противоопухолевом действии. Целью исследования было изучение биологических (антипролиферативных и антиопухолевых) и биохимических свойств структурных аналогов ПА из числа гетероциклических соединений оригинального синтеза. Проведено сравнительное исследование влияния ряда гетероциклических соединений оригинального синтеза на метаболизм ПА в бесклеточных тестсистемах. Определены гетероциклических группы соединений, веществ из числа которые позволяют исследованных прогнозировать перспективные направления дальнейшего синтеза соединений с повышенным терапевтическим эффектом действия. 4 Содержание Введение ........................................................................................................................... 8 Глава 1 Обзор литературы ........................................................................................... 10 1.1 Химическое строение и распространение полиаминов ...................................... 10 1.2 Метаболизм полиаминов ........................................................................................ 12 1.3 Пути синтеза полиаминов и роль орнитиндекарбоксилазы .............................. 13 1.3.1 Орнитиндекарбоксилаза ..................................................................................... 15 1.3.2 S-аденозил-L-метиониндекарбоксилаза ........................................................... 20 1.3.3 Спермидин- и сперминсинтазы .......................................................................... 22 1.4 Пути распада полиаминов и роль аминоксидаз .................................................. 22 1.4.1 Диаминоксидаза .................................................................................................. 22 1.4.2 Полиаминоксидазы .............................................................................................. 24 1.5 Роль трансглутаминазы в обмене полиаминов ................................................... 27 1.6 Пролиферация клеток ............................................................................................. 30 1.7 Влияние полиаминов на деление и рост клеток.................................................. 30 1.7.1 Полиамины в нормальных пролиферирующих клетках ................................. 31 1.7.2 Полиамины в регенерирующей и эмбриональной ткани животных ............. 32 1.7.3 Полиамины и опухолевый рост ......................................................................... 34 1.8 Неоплазии................................................................................................................ 37 1.8.1 Меланома ............................................................................................................. 38 1.8.2 Меланин ................................................................................................................ 40 1.8.3 Меланиногенез .................................................................................................... 42 1.9 Дифференциация клеток......................................................................................... 43 1.10 Действие аналогов полиаминов и метиленовых производных ксантина на метаболизм полиаминов ............................................................................................... 46 Глава 2 Материалы и методы ...................................................................................... 49 2.1 Характеристика гетероциклических соединений оригинального синтеза ....... 49 2.2 Количественный анализ основных показателей обмена полиаминов в бесклеточных тест-системах ........................................................................................ 57 5 2.2.1 Регенерирующая печень здоровых крыс ........................................................... 58 2.2.2 Пролиферирующая ткань гепатомы крыс Г27 .................................................. 59 2.3 Определение активности ДАО и ПАО .................................................................. 61 2.4 Определение активности ОДК и уровней полиаминов ....................................... 63 2.5 Количественное определение белка в бесклеточных тест-структурах ............ 68 Глава 3 Исследование биохимических свойств гетероциклических веществ оригинального синтеза на бесклеточном уровне ....................................................... 70 3.1. Тест-система из регенерирующей печени крыс .................................................. 70 3.2 Тест-система из гепатомы Г-27 крыс .................................................................... 74 3.3 Модификация метода разделения и количественного определения ПА методом ВЭЖХ ............................................................................................................................. 76 Заключение .................................................................................................................... 81 Список использованных источников .......................................................................... 83 Приложение 1 Отчет о патентных исследованиях .................................................. 109 6 Список сокращений, принятых в работе ПА – полиамины См – спермин Сд – спермидин Пут – путресцин АМ – S –аденозилметионин АМДК – аденозилметиониндекарбоксилаза (КФ 4.1.1.50) АРА – 1-аминоокси-3-аминопропан ГТФ – гуанозин – 5’-трифосфат ДАО – диаимноксидаза (КФ 1.4.3.6) ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДФМО – D, L-α-дифторметилорнитин Км – константа Михаэлиса МАР – (2R, 5R)-6-гептин – 2,5-диамин МГБГ – метилглиоксаль-бис (гуанилгидразон) мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота ОДК – орнитиндекарбоксилаза (КФ 4.1.4.17) РНК – рибонуклеиновая кислота ПАО – полиаминоксидаза ССАТ – спермидин/спермин-N1-ацетилтрансфераза ТГ – трансглутаминаза цАМФ – циклический аденозинмонофосфат 7 Введение В процессе новообразований химиотерапии совершенствования человека выдвигается на первый разработка методов план и лечения в злокачественных проблеме направленный современной синтез новых высокоэффективных противоопухолевых агентов. В последнее время арсенал применяемых в клинике противоопухолевых средств значительно расширился, однако большинство из них остаются малоэффективными и высокотоксичными. В настоящее время стало очевидным, что методология подходов разработки новых действия перспективных с заранее химиотерапевтических заданными свойствами соединений должна направленного базироваться на фундаментальных исследованиях особенностей метаболизма опухолевой клетки. В этом отношении обмен полиаминов (ПА), являющихся эссенциальными факторами процессов клеточного роста и дифференцировки [143, 255], с учетом активности трансглутаминазы (ТГ) [193] может служить удобной и надежной мишенью для поиска и конструирования противоопухолевых агентов, в частности, в качестве специфических ингибиторов ТГ и регуляторов активности ключевых ферментов обмена ПА. Была высказана гипотеза о том, что аналоги ПА способны замещать эндогенные ПА в клетке в участках связывания. Это приводит к нарушению функций внутриклеточных ПА [234]. Исследования ограничились аналогами ПА алифатической структуры [270]. Однако предварительные результаты показали, что онкопротекторной активностью могут обладать также гетероциклические соединения, в частности, бис-уридильные [266], азафлуореновые и бензимидазольные [29] производные, а также алкалоиды [207]. Выбор данных веществ был обусловлен тем, что в их структуре можно выделить полиаминовые фрагменты. Изучение характера и степени влияния названных веществ на ключевые ферменты обмена ПА позволит сделать предположение об их возможном канцерогенном или противоопухолевом действии. Цель исследования: изучение биологических (антипролиферативных и 8 антиопухолевых) и биохимических свойств структурных аналогов ПА из числа гетероциклических соединений оригинального синтеза. 9 Глава 1 Обзор литературы 1.1 Химическое строение и распространение полиаминов К полиаминам традиционно относятся спермин и спермидин; путресцин и кадаверин являются диаминами, но и их также причисляют к ПА [9]. Ниже представлена структура «основных» ПА: H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (спермин) H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (спермидин) H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (кадаверин) H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (путресцин) Рисунок 1 - Химические структуры основных ПА [68]. Как видно, спермин и спермидин являются органическими поликатионами (рисунок 1) и имеют 4 и 3 основные группы, соответственно. Путресцин и кадаверин содержат по 2 аминогруппы. ПА обнаружены во всех живых организмах (у животных, в растениях, водорослях и грибах, бактериях и вирусах) 10 [1, 9]. В тканях и биологических жидкостях животных присутствуют спермин, спермидин, путресцин и кадаверин. Ткани эукариотов содержат спермин и спермидин в миллимолярных концентрациях, тогда как путресцина в них в количественном отношении значительно меньше (наномоли). У прокариотов концентрация путресцина более высокая, чем спермидина. Кроме того, у большинства из них, за исключением лишь некоторых видов бактерий, отсутствует спермин. К настоящему времени обнаружены и другие ПА, которые являются производными спермина, спермидина и путресцина. Ниже приведены структуры некоторых из них: H2N-CH2-CHOH-CH2-CH2-NH2 (2-гидроксипутресцин) H2N-CH2CHOH-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (2-гидроксиспермидин) H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (калдин) H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (гомоспермидин) HOOC-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-COOH (сперминовая кислота) H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH2 (норспермин, или термин) H2N-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 (термоспермин). Многие из этих ПА были обнаружены и у эукариотов, но их биологическое значение еще не выяснено [1]. Суммируя литературные данные, можно сказать, что ПА распределены в клетке неравномерно – имеются определенные градиенты их концентрации. Уровень ПА в тканях зависит от скорости роста и типа тканей, возраста животного и других биологических особенностей. В экспериментах на крысах обнаружено наиболее высокое содержание ПА в органах, где происходит интенсивный синтез белков, в частности, в поджелудочной железе, тимусе и других железах, а также в печени. Например,в растущих тканях у крысят содержание спермидина в печени значительно выше, чем у взрослых животных, в то время как содержание спермина с возрастом, напротив, возрастает. Как 11 следствие этого, соотношение спермидин/спермин с возрастом снижается, что иллюстрирует таблица 1 [1]. Таблица 1 - Содержание спермидина и спермина в ткани печени нормальных крыс различных возрастных групп. Спермидин Возраст, мес. Спермин нмоль/г нмоль/мг нмоль/г нмоль/мг влажной РНК влажной ткани РНК Спермидин/спермин ткани 1 1438±73 237±11 826±21 136±4 1,7±0,09 2-2,5 951±51 139±12 876±53 142±19 1,0±0,05 6-12 610±49 100±16 1106±82 154±26 0,56±0,05 Таким образом, ткани с различными уровнями митотической активности характеризуются разным содержанием ПА. Содержание ПА в различных органеллах клетки также неодинаково. Имеются сообщения о том, что наибольшее количество ПА содержится в микросомах (55-60 %) – структурах,где происходит биосинтез белка [135]. Суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что уровень ПА в значительной степени связан с ростом и делением клеток, в частности, с синтезом белка. Наивысшее их количество обнаруживается, когда происходит интенсивный рост органов и тканей, в частности, при регенерации или опухолевом росте. 1.2 Метаболизм полиаминов Повсеместное распространение ПА в биологическом материале: микроорганизмах, растениях и животных – указывает на то, что эти соединения, вероятно, выполняют существенные функции в обмене веществ у живых организмов. Следует отметить, что метаболизм ПА тесно связан со многими 12 обменными процессами, и, прежде всего, с обменом аминокислот. Все три полиамина сунтезируются в организме из L-аргинина и L-метионина. Путресцин образуется путем декарбоксилирования орнитина под действием фермента орнитиндекарбоксилазы (ОДК). Путресцин присоединяет аминопропильные группы, образованные декарбоксилированием S-аденозил-метионина, последовательно образуя сначала спермидин, а потом спермин. Спермидин- и спермин-синтазы катализируют эти реакции синтеза спермидина и спермина, соответственно. Существует также процесс обратного превращения – интерконверсия. Спермин расщеплялся до спермидина, а последний до путресцина. Механизм реакции проходит в 2 стадии: 1. В реакции ацетилирования спермина и спермидина с участием ацетилтрансферазы образуются ацетилпроизводные полиаминов, которые обычно секретизируются клеткой [269]. В опухолевых клетках, наоборот, уровни ацетилполиаминов остаются высокими. Это подтверждает факт корреляционной зависимости между полиаминами и опухолевыми процессами [143, 54, 194]. 2. Ацетил-производные представляют собой субстрат для активации полиаминоксидазы (ПАО), под действием которого они окисляются до спермидина и путресцина [72, 73]. Окислению полиаминов сопутствует образование пероксида водорода и аминоальдегидов в больших количествах. Они оказываюттоксическое воздействие на клетку, которое может привести к ее гибели. 1.3 Пути синтеза полиаминов и роль орнитиндекарбоксилазы ПА образуются в результате декарбоксилирования аминокислот, и их метаболизм тесно связан со многими важными метаболическими превращениями последних. В тканях животных путресцин образуется при декарбоксилировании L-oрнитина L-орнитиндекарбоксилазой (ОДК; КФ 4.1.1.17). Как видно из рисунка 2, путресцин служит исходным материалом для биосинтеза спермидина и 13 спермина. При этом также необходимы метионин и аденозинтрифосфат (АТФ). Метионин, прежде чем он используется для биосинтеза спермидина и спермина, взаимодействует с АТФ с образованием S-аденозил-L-метионина (S-AM). Декарбоксилирование S-АМ катализируется ферментом S-аденозил-L- метиониндекарбоксилазой (S-АМДК; КФ 4.1.1.50). Декарбоксилированный S-АМ снабжает аминопропиловыми группами ферментативный биосинтез полиаминов, осуществляемый двумя синтазами: спермидинсинтазой и сперминсинтазой. Рисунок 2 - Схема обмена полиаминов в клетках млекопитающих. Спермидинсинтаза катализирует образование спермидина путем присоединения к путресцину одной аминопропиловой группы. Сперминсинтаза добавляет другую такую же группу к спермидину. В результате этого образуется спермин. Протекание этих аминопропилтрансферазных реакций регулируется запасом их субстратов. S-АМ является донором метильных групп при метилтрансферазной реакции. Нормальное содержание в клетке декарбоксилированного S-АМ очень низкое (в печени приблизительно 1,5 нмоль/г влажной ткани) и составляет 1-5 % содержания S-АМ. Но оно увеличивается в 300-500 раз, если содержание путресцина и спермидина в клетке снижается. Во 14 всех тканях животных активность спермидин- и сперминсинтаз во много раз выше активностей обеих декарбоксилаз. Поэтому синтез полиаминов лимитируется активностями ОДК и S-АМДК [19, 26, 27]. 1.3.1 Орнитиндекарбоксилаза Ключевую роль в биосинтезе полиаминов играет ОДК. Как и другие декарбоксилазы, ОДК является пиридоксальсодержащим ферментом, требующим для проявления своей активности наличия тиоловых групп. Фермент локализуется в цитозоле и в ядрах клеток и декарбоксилирует L-орнитин, но не Д-орнитин. Км для L-орнитина 0,1-0,2 мМ. ОДК – один из самых быстрообменивающихся ферментов животных. Период ее полужизни (t1/2) в нормальных тканях составляет 10-30 минут. Замечательным свойством ОДК является ее высокая индуцибельность, впервые описанная при развитии куриного эмбриона, регенерации печени и при действии на печень гормона роста [167, 168, 253]. Быстрое и значительное (от 10 до 200 раз) увеличение активности ОДК установлено в опытах in vivo на изо лированных органах и клетках при различных физиологических и фармакологических стимулирующих воздействиях [1, 168]. Индукция ОДК – одно из самых ранних молекулярных проявлений активированного метаболизма клетки, готовящейся к дифференцировке, росту и делению или активному выполнению специализированной функции. Особенно показательна в этом отношении гормональная регуляция активности ОДК в клетках органов-мишеней. Так, при гипофизэктомии у крыс резко снижается содержание спермидина в печени, а при введении гормона роста уровень его нормализуется [1, 19]. Гормон роста активирует ОДК, при этом в печени накапливается путресцин. Это ведет к активизации биосинтеза спермидина. Стимулятором активности ОДК печени, почек и надпочечников является адренокортикотропный гормон (АКТГ). Активацию ОДК почек крыс вызывают также глюкокортикоиды. Одним из доказательств участия гонадотропного гормона в регуляции метаболизма полиаминов служит его зависимость от 15 эстральных циклов. Активность ОДК матки молодых крыс возрастает в несколько раз при введении эстрогенов. Молекулярная масса ОДК печени крыс 105 000 Да. При ПАГ-электрофорезе додецилсульфат натрия, в денатурирующей фермент системе, представлен одной содержащей субъединицей с молекулярной массой 55000 Да (ОДК печени крыс) и 53 000 Да (ОДК почек мышей). Описаны различные молекулярные формы ОДК, обнаруживаемые в регенерирующей печени, в печени крыс, получающих канцерогенные вещества, в различных клетках, растущих в культуре, у низших эукариотов и бактерий. Так, например, в культивируемых фибробластах при экспоненциальной фазе роста обнаружены две формы ОДК, отличающиеся по чувствительности к пиридоксаль51-фосфату, но без заметных различий в Км для L-орнитина и одинаковым периодом полужизни. В ткани сердца крыс после введения изопротеренола наблюдали появление формы фермента с увеличенным сродством к субстрату. Падение активности ОДК в сердце крыс сопровождалось исчезновением этой молекулярной формы фермента. Сравнительное кинетическое изучение активности ОДК мозга и печени крыс показало, что ОДК мозга имеет более высокую чувствительность к субстрату, чем ОДК печени. Взаимоотношения различных молекулярных форм ОДК с повышенным сродством к субстрату или к коферменту не ясны. В настоящее время нет убедительных данных, являются ли множественные транскрипции молекулярные (т.е. формы изоэнзимами) или ОДК они различными появляются продуктами в результате посттрансляционных превращений фермента [1, 19]. «Драматическое» увеличение активности ОДК наблюдается в печени животных впервые часы регенерации. Эффективными стимулами, вызывающими подъем ОДК, являются ростовые факторы (эпидермальный фактор роста), активация лимфоцитов, трансформация клеток онкогенными вирусами, добавление свежей содержащей сыворотку среды к покоящимся клеткам, изменение ионного состава среды, введение канцерогенных веществ и промоторов опухолевого роста (форболовых эфиров) и др. [19]. Содержание ОДК в нестимулированных тканях животных очень низкое (исключением является предстательная железа). Поэтому выделение фермента из 16 различных органов производят обычно после индукции в них ОДК. Для этой цели чаще всего используют почки мышей, которым вводили андрогены, в сотни раз увеличивающие содержание ОДК в этом органе. Но даже в этом случае ОДК составляет лишь 0,01% почечного белка. В печени крыс ОДК можно индуцировать тиоацетамидом и α-гидразин-β-аминовалериановой кислотой. После индукции тиоацетамидом ОДК составляет 0,0003% общего белка печени крыс, и для получения гомогенного препарата требуется очистка в 350 000 раз. Из этих органов ОДК выделена и очищена до гомогенного состояния [1]. Механизмы, которые регулируют уровень активности ОДК в клетке, полностью не расшифрованы. Предполагается несколько возможностей. Это может быть изменение скорости синтеза фермента, включая механизм амплификации генов ОДК, изменение скорости ее деградации, образование макромолекулярных ингибиторов и активаторов, а также посттрансляционная модификация [47]. В большинстве исследованных биологических систем индукция активности ОДК является результатом синтеза новых молекул фермента, а не активации предсуществующих молекул. Это заключение сделано на основании данных о том, что индукция ОДК не происходит или значительно ослабляется при применении ингибиторов синтеза белка и РНК. Прямое доказательство увеличения количества ОДК при ее индукции получено в опытах с использованием специфических антител. Однако в ряде случаев индукция ОДК резистентна к действию актиномицина Д, что свидетельствует о том, что образование новых мРНК для ОДК регулируется раздельно на транскрипционном и трансляционном воздействиях уровнях. увеличивается Количество также фермента благодаря при стимулирующих стабилизации ОДК (t1/2 увеличивается в 4-10 раз) [1, 19]. Из внутриклеточных контролирующих механизмов в настоящее время большое внимание уделяется изучению ингибиторов ОДК. Обнаружено, что добавление путресцина к клеточным культурам или инъекции его частично гепатэктомированным крысам, индуцирует образование в клетках или печени ингибитора ОДК, который был назван «ОДК антизимом» [1, 19]. Ингибитор – это 17 белок, чувствительный к протеазам, но не к РНКазам. Его индукция подавляется циклогексимидом, но не актиномицином Д. Это свидетельствует в пользу существования в клетках стабильных мРНК для синтеза этого белка. Антизим ОДК обнаружен в клетках печени животных, которым и не вводили путресцин. В печени крыс (без индукции путресцином) ингибитор локализуется, в осноном, в ядре клеток, но небольшие его количества обнаружены в гладком и гранулярном эндоплазматическом ретикулуме. После индукции путресцином содержание антизима ОДК в цитозоле клеток печени резко увеличивается. Антизим ОДК был получен из цитозольной фракции печени крыс и очищен в 600 000 раз до гомогенного состояния. Были изучены его физико-химические свойства. Очищенный антизим давал одну полосу с молекулярной массой 19 000 Да при электрофорезе в полиакриламидном геле в системе, содержащей додецилсульфат натрия, а молекулярная масса его, определенная методом гельфильтрации на сефадексе G-200, близка к этой величине – 22000 Да [1]. Эти данные показывают, что антизим представляет собой одну полипептидную цепь. Механизм действия ингибитора заключается в образовании комплекса с ОДК, в результате чего теряется ферментативная активность ОДК, и исчезает свободный ингибитор. Взаимодействие ОДК с антизимом in vitro протекает при температуре 0ºС очень быстро, достигая максимума в течение 1 мин. При 37ºС реакция замедляется. Антизим очень лабилен, но стабилизируется твином-80 и 2-меркаптоэтанолом. Связь ОДК с антизимом нековалентная, поэтому комплекс ОДК – антизим может быть разрушен в среде с высоким содержанием солей и выходом активного фермента. Антизим ОДК выделен также из ткани молочных желез и других тканей животных, в частности, культур клеток животных. Физиологическое его значение заключается в быстром изменении активности ОДК. Возможно, антизим играет роль в деградации ОДК. Кроме антизима, из печени крыс выделен белок «активатор ОДК» – антиантизим. Он имеет высокое сходство к антизиму и высвобождает ОДК из комплекса в активной форме. По-видимому, существуют и другие механизмы посттрансляционной модификации ОДК. Так, обнаружено полное исчезновение 18 активности ОДК после 4 часов выращивания S. cerevisiae в среде, содержащей спермидин и спермин. Количество ферментного белка, определенного методом иммунопреципитации, при этом не уменьшалось, не изменялась его молекулярная масса. В то же время не было получено доказательств ковалентного связывания ОДК с антизимом или полиаминами. Возможно, в инактивации ОДК определенную роль играют специфические протеинкиназы, вызывающие ее фосфорилирование. Изучению регуляции активности ОДК полиаминами в тканях животных посвящено большое число работ, результаты которых обобщены в обзорах. Синтетические диамины, не содержащиеся в организме в нормальных условиях, могут вызывать снижение активности ОДК в различных тканях крыс in vivo или в культивируемых клетках. Высокие концентрации неорганических катионов (Na+, K+, Mg2+) ингибируют активность ОДК. Механизмы подавления ОДК полиаминами не ясны. Предполагается, что активность ОДК может регулироваться состоянием чувствительных к полиаминам участков клеточной мембраны. Имеются данные о том, что циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) может быть важным фактором в синтезе полиаминов. Это подтверждается тем, что увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ в фазе G1 сопровождается увеличением активности ОДК. Активность ОДК индуцируется цАМФ и фармакологическими препаратами, которые вызывают увеличение содержания цАМФ в клетках. Например, производные метилксантина, вызывающие рост содержания цАМФ посредством торможения фосфодиэстеразы, увеличивают и активность ОДК. Охлаждение поджелудочной железы крыс, вызывающее повышение уровня цАМФ, также сопровождается увеличением активности ОДК. Все это свидетельствует о важной роли цАМФ в биосинтезе полиаминов. В настоящее время известно, что биохимические и физиологические воздействия цАМФ опосредуются цАМФ–зависимыми протеинкиназами. Увеличение внутриклеточного содержания цАМФ не является обязательным условием для 19 активации цАМФ–зависимой протеинкиназы, так нормальный уровень содержания цАМФ в клетке, по мнению многих исследователей, вполне достаточен для активации всего пула цАМФ–зависимых протеинкиназ. Так, было показано, что введение гормона роста крысам, не увеличивая содержания цАМФ в печени или в органах-мишенях, активирует цАМФ–зависимую протеинкиназу. При гипертрофии печени, вызванной 3-метилхолантреном и фенобарбиталом, также без увеличения содержания цАМФ, возрастает активность цАМФ-зависимой протеинкиназы [274]. Предполагают, что ОДК выполняет двойную функцию: образует необходимый для синтеза ПА путресцин и активирует РНК-полимеразу. Таким образом, внутриклеточная регуляция биосинтеза белка обеспечивается ранней координацией процессов синтеза полиаминов и рибосомных РНК. Так как не во всех случаях индукция ОДК сопровождается последующей активацией РНКполимеразы-I, по-видимому, имеющаяся взаимосвязь ОДК и метаболизма РНК не всегда реализуется [19]. ОДК занимает центральное место в контроле биосинтеза полиаминов, поэтому изучению этого фермента в последние годы уделяется большое внимание. 1.3.2 S-аденозил-L-метиониндекарбоксилаза Быстрое и значительное увеличение активности ОДК, наблюдаемое в различных тканях в ответ на различные воздействия, стимулирующие рост и дифференциацию клеток (регенерирующая печень, действие анаболических гормонов и т.д.), сопровождается, как правило, увеличением активности SАМДК. Повышение активности S-АМДК после стимулирующих воздействий не такое значительное, как ОДК, и не всегда пропорционально последней. Активность S-АМДК определяет содержание в клетке декарбоксилированного SАМ – поставщика аминопропильных групп для синтеза спермидина и спермина. S-АМДК выделена и очищена до гомогенного состояния из E.coli, дрожжей, 20 печени и молочных желез мышей, печени и мышц крысы, печени теленка, лимфоцитов быка. Имеются сообщения о выделении и клонировании гена SАМДК лимфоцитов быка [19]. S-АМДК в виде двух субъединиц присутствует в ядре и цитозоле клеток, молекулярная масса фермента, выделенного из печени и мышц крысодинакова – 68 000 Да. Несмотря на структурное сходство, ферменты, выделенные из двух источников, значительно различаются по чувствительности к субстрату и к ингибиторам, что свидетельствует в пользу существования разных форм S-АМДК в различных тканях. Обнаружены существенные отличия в свойствах S-АМДК прокариотов и эукариотов. Фермент, выделенный из высших организмов и дрожжей, стимулируется путресцином, а из бактерий – не чувствителен к путресцину. Это, по-видимому, эволюционная особенность, связанная с отсутствием синтеза спермина у прокариотов. Кроме того, S-АМДК эукариотов (но не прокариотов), in vitro ингибируется продуктом реакции – декарбоксилированным S-АМ. Ингибиторы ОДК увеличивают активность S-АМДК в клетках, которая значительно снижается при добавлении экзогенного спермидина. Важное значение спермидина в регуляции количества S-АМДК доказано в опытах с использованием ингибитора спермидинсинтазы S-аденозил-I, 8-диаминотиооктана. Это вещество вызывает снижение содержания спермидина в клетках с одновременным увеличением содержания путресцина и спермина. Экстракты, полученные спермидинсинтазы, имеют из клеток, повышенную обработанных активность ингибитором S-АМДК. Введение спермидина крысам или добавление его к культивируемым клеткам вызывает уменьшение содержания фермента. Одним из наиболее известных ингибиторов SАМДК является метилглиоксальбис (гуанилгидразон) – МГБГ. Это вещество – неспецифический ингиботор S-АМДК, которое ингибирует также полиаминоксидазу. Следует отметить, что S-АМДК, наряду с ОДК, является ферментом, лимитирующим скорость синтеза ПА. 21 1.3.3 Спермидин- и сперминсинтазы Спермидинсинтаза-S-метиладенозилгомоцистеамин: путресцинаминопропил-трансфераза аминопропила от (КФ 2.5.1.16) декарбоксилированного S-АМ катализирует к транспорт путресцину, образуя спермидинтиометиладенозин и один протон. Значения Км для природного и синтетического S-АМ близки и составляют 4 мкМ. Фермент заметно ингибируется in vitro S-АМ, его природными и синтетическими производными. Сперминсинтаза катализирует синтез спермина, используя декарбоксилированный S-АМ в качестве донора аминопропильной группы и спермидин как акцептор. Другие продукты этой реакции: 5-метилтиоаденозин и один протон. В отличие от декарбоксилаз активность спермидин- и сперминсинтазы в нестимулированных клетках высокая, и эти ферменты не лимитируют скорость биосинтеза полиаминов. Оба энзима имеют длительный период полужизни. Спермидин и сперминсинтаза получены в гомогенном виде и охарактеризованы [1]. 1.4 Пути распада полиаминов и роль аминоксидаз Основным путем распада полиаминов является окислительное дезаминирование. Ферменты, катализирующие окислительное дезаминирование путресцина и ПА, обнаружены повсеместно в живой природе: микроорганизмах, растениях и животных. Основными ферментами, катализирующими эти реакции, являются диаминоксидаза (ДАО) и полиаминоксидаза (ПАО) [172]. 1.4.1 Диаминоксидаза ДАО окисляет путресцин с образованием перекиси водорода, аммиака и иминоальдегида, который спонтанно превращается в пирролин [268]. Необходимость в ионах меди и пиридоксальфосфате [104] обусловливает 22 ингибирующее действие на ДАО медькомплексирующих [55] и карбонильных реагентов [98]. Для очищенного фермента установлены субстратное ингибирование [63], способность действовать только на первичные аминогруппы и широкий, резкощелочной оптимум рН [161]. Это принципиально отличает ДАО от моноаминоксидазы.ДАО, в основном, локализована в микросомальной фракции, поддерживает оптимальные для ростовых процессов концентрации ПА, и тем самым, вероятно, служит одним из факторов регуляции клеточного деления и роста [46]. Так, известно о резком увеличении активности ДАО в матке и плазме крови беременных женщин [1]. Такое же увеличение ДАО обнаружили в плазме крови животных, у которых наивысшая активность фермента наблюдалась на 13-15 день беременности [181]. Аналогичные изменения активности этого фермента в мозге куриного эмбриона коррелировали с содержанием ПА [85]. Максимальной она была на 14-16 дни инкубации, а затем резко падала. Регуляторные свойства ДАО подтверждаются также ее индуцибельностью, которую наблюдали у ряда микроорганизмов [268], а также под действием гепарина в опытах на животных [140] и в перфузированной плаценте человека [263]. Одновременно с регуляторной функцией ДАО, вероятно, выполняет и защитную, устраняя избыток ПА, которые в больших концентрациях проявляют не активирующее, а токсическое действие [51]. Однако наиболее изученным и важным аспектом физиологии этого фермента следует признать ингибирующее действие на клеточный рост продуктов окисления полиаминов. Взаимодействие окисленных полиаминов с ДНК ведет к ингибированию процессов транскрипции in vivo [219] и in vitro [50] и репликации ДНК [179]. В отличие от свободных ПА, которые образуют электростатические связи с ДНК, окисленные продукты этих соединений связываются специфически, необратимо, ковалентно через карбонильную группу со свободными аминогруппами оснований в молекуле ДНК [52]. О возможности регуляторного действия на уровни ПА со стороны аминоксидазы, осуществляющей их распад, говорит и то, что ингибирование ДАО ипрониазидом приводило к аккумулированию ПА и нуклеиновых кислот с одновременным снижением концентрации свободных нуклеотидов [83]. 23 С помощью ингибиторов ДАО показана важная роль окислительного дезаминирования в регуляции обмена ПА. Аминооксидазная активность ферментов крови, расщепляющая ПА, индуцируется у женщин при нормально протекающей беременности как защитная система, ликвидирующая избыток синтезируемых плодом ПА. Максимум активности ДАО приходится на поздние сроки беременности [1]. 1.4.2 Полиаминоксидазы Спермидин- и сперминсинтазные реакции необратимы. Однако возможны внутриклеточные взаимопревращения спермина в спермидин и спермидина в путресцин. Так, парентеральное введение спермина животным приводит к увеличению содержания спермидина в печени и к экскреции его с мочой, а введение спермидина – к возрастанию уровней путресцина в печени. Процесс интерконверсии спермидина, спермина и путресцина обеспечивают ацетил-КоА: полиамин-N1-ацетилтрансфераза (N1=ПАТ, КФ 2.3.1) и полиаминоксидаза (ПАО, КФ 1.5.3.). Фермент имеет очень высокую обмениваемость, лишь немногим меньшую, чем ОДК, что свидетельствует о ее важном физиологическом значении. Ацетилазно/оксидазная система, вероятно, выполняет регуляторную функцию, снижая повышенные внутриклеточные уровни ПА [227, 228]. Данная трансфераза по скорости обмениваемости немногим уступает лишь ОДК. Поэтому ацелирование лимитирует скорость взаимопревращения ПА. Содержание этого фермента в нормальных клетках очень низкое и только в условиях усиления катаболизма ПА, при действии токсических веществ (четыреххлористый углерод, тиоацетамид), при голодании, а также при введении некоторых гормонов (гормон роста, глюкагон) и эндогенного спермидина содержание его быстро и многократно увеличивается [226]. Из печени крыс выделен и охарактеризован единственный флавин – содержащий фермент – полиаминоксидаза (ПАО). N1 – ацетилспермин, N1-ацетилспермидин, N1-, N12-диацетилспермидин 24 являются хорошими субстратами для ПАО, которая расщепляет их в положении вторичной аминогруппы с образованием N-ацетилпропиональдегида и путресцина или спермидина в зависимости от субстрата. ПАО может окислять in vitro и неацетилированные полиамины, но для этого требуются нефизиологические концентрации активаторов. Ацетилированные полиамины быстро окисляются ПАО при физиологических условиях. По-видимому, естественными субстратами ПАО in vivo являются не сами полиамины, а их ацетилированные производные [26]. Второй фермент, участвующий во взаимопревращениях полиаминов – ПАО, не является лимитирующим. В большинстве тканей животных обнаружена высокая активность ПАО, которая обеспечивает быстрое расщепление ацетилированных полиаминов. Поэтому даже в условиях индукции N1-ПАТ, содержание ацетилированных производных полиаминов в тканях низкое. Накопление ацетилированных полиаминов в тканях животных наблюдали при применении ингибиторов ПАО. Инактивация ПАО ингибитором приводит к накоплению в тканях животных N1-ацетилспермидина и N1-ацетилспермина и к снижению концентрации путресцина и спермидина. Поскольку ингибиторы ПАО не влияют на активность других ферментов катаболизма и синтеза полиаминов и не обладают побочным действием, описанные эффекты являются экспериментальной демонстрацией физиологической роли ПАО: окисление N1-ацетилспермина и N1-ацетилспермидина и образование из них спермидина и путресцина соответственно [26]. Другой важный путь катаболизма полиаминов начинается с окислительного дезаминирования их концевых групп – СН2NН2. Многочисленное семейство ферментов – аминооксидазы, обнаруженные в тканях и жидкостях организма животных, в котором выделяют две большие группы: мoноаминооксидазы (МАО – амино: кислород-оксиредуктазы (дезаминирующие) флавин-содержащие, КФ 1.4.3.4), действующие на первичные, вторичные и четвертичные амины, и ДАО. Аминоксидазы, окисляющие путресцин, спермидин и спермин, содержатся в различных тканях: в почках и слизистой оболочке кишечника, в сыворотке 25 крови жвачных и нежвачных животных в период беременности, в сперме, амниотической жидкости, плаценте и т.д. Их выделение и свойства широко известны. Эти ферменты имеют различную субстратную чувствительность. Так, классическая диаминоксидаза почек собак легче всего окисляет путресцин и кадаверин, хуже – спермидин и с трудом – спермин. Из сыворотки крови быка выделен высокоочищенный препарат фермента, названный сперминоксидазой, который катализировал окисление как первичных аминов (бензиламина, бутиламина и др.), так и спермина и спермидина. При окислительном дезаминировании полиаминов образуются лабильные альдегиды – иминоальдегид из спермидина и иминодиальдегид из спермина. Иминоальдегиды, образующиеся при внеклеточном окислении спермина и спермидина, являются биологически активными веществами. В очень малых концентрациях они полностью подавляют рост и размножение бактерий и вирусов, проявляют сильно выраженное антипролиферативное действие по отношению к нормальным и злокачественным клеткам человека и животных. Установлено полиаминоксидазой ростингибирующее бычьей действие сывороткой полиаминов, крови, на окисленных нормальные и трансформированные фибробласты, клетки асцитного рака Эрлиха, гепатомы Зайдела, лейкоза Швеца и человеческие лейкемические клетки К-562. Авторадиографически показано, что альдегиды полиаминов связываются с плазматическими мембранами клеток [1, 19] продукты окисления полиаминов крайне нестабильны и подвергаются спонтанному распаду. Диокисленный спермин превращается в моноокисленный спермин и акролеин, а моноокисленный спермин – в путресцин и акролеин. Катаболизм путресцина в организме животных и человека осуществляется несколькими путями. Основным для большинства тканей является окислительное дезаминирование путресцина под влиянием диаминоксидазы. Предполагается существование и другого пути катаболизма путресцина, при котором происходит его конверсия в Δ'-пирролин и превращения в 2- пирролидон и 5-гидрокси-2-пирролидон. Этот путь выявлен в печени, селезенке и легких и не обнаружен в мозге, сердце и почках. Кадаверин в 26 тканях животных окисляется ДАО до Δ'-пиперидина с образованием аммония и перекиси водорода [19, 26]. Таким образом, к настоящему времени обмен полиаминов в организме животных изучен довольно полно, выделены, очищены до гомогенного состояния и охарактеризованы три ключевых регуляторных фермента внутриклеточного синтеза и катаболизма полиаминов: ОДК, S-АМДК, ПАТ. Эти ферменты содержатся в клетках в очень маленьких количествах. Так, количество ОДК в печени после индукции составляет 22 000 молекул на клетку, а N1-ПАТ – приблизительно 60 000 молекул. До индукции одна клетка содержит 100-200 молекул ОДК и около 1000 молекул ацетилазы. Регуляторные ферменты имеют высокую скорость деградации по сравнению с другими белками. Период полужизни этих ферментов исчисляется минутами, тогда как период полужизни аминопропилтрансферазы и полиаминоксидазы более 20 час. Быстрый «оборот» этих ферментов обеспечивает быстрое изменение количества ферментного белка и уровня полиаминов в клетке [19, 26]. 1.5 Роль трансглутаминазы в обмене полиаминов У позвоночных существуют 9 генов, связанных между собой с точки зрения эволюции, которые кодируют один ряд ферментов, обозначенных как трансглутаминазы (ТГ). ТГ у эукариотов выполняют множественные функции [134]. Общая структура всех ТГ включает в себя отрезок цистеина, заключенный в активном сайте. Происходит Ca2+-зависимая реакция между группой γ-карбоксиамидными отрезками пептидил-глутамина (которые выступают в качества ацильного донора) и группой ε-аминных отрезков пептидил-лизина. В результате формируются резистентные к действию протеаз связи, и образуется комплекс ε-(γ-глутамил)-лизин. При этом высвобождается одна молекула аммиака (рисунок 3). Итак, полиамины, обладая первичными аминогруппами, могут взаимодействовать с ТГ. Предполагают две схемы такой реакции (рисунок 4), в 27 первом случае они связываются только с помощью одной из двух аминогрупп, образуя таким образом моно-производные (N-моно-(γ-глутамил) полиамины) (рисунок 5). Во втором случае образуются более сложные комплексы с участием двух свободных аминогрупп молекулы полиамина. В результате этого строятся прочные мостики между протеинами, которые формируют беспроизводные (бис (γ-глутамил) полиамины [65, 192]. Рисунок 3 - Реакции, катализируемые трансглутаминазами. 28 Рисунок 4 - Схема метаболизма полиаминов с участием ТГ. Рисунок 5 - Структуры моно- и бисглутамил производных ПА. 29 1.6 Пролиферация клеток Пролиферация (proliferatio; лат. proles потомство + ferre носить, приносить)новообразование клеток эндоплазматической сети, и внутриклеточных рибосом и др.). структур Лежит в (митохондрий, основе роста и дифференцировки тканей, обеспечивает непрерывное обновление структур организма. Пролиферация различных клеток иммунокомпетентной системы является основой иммуногенеза. С помощью этого процесса ликвидируется образовавшийся при повреждении тканей дефект и нормализуется нарушенная функция. Пролиферация также может возникать и вследствие нарушения гормональных влияний, приводя к уродливому увеличению органа, например при акромегалии. Пролиферация клеток, утративших способность дифференцироваться в клетки того или иного органа, ведет к возникновению опухолей. Одни органы и ткани обладают очень высокой способностью к пролиферации клеток (соединительная, кроветворная, костная ткань, печень, эпидермис, эпителий слизистых оболочек), другие – более умеренной (скелетные мышцы, поджелудочная железа, слюнные железы и др.), третьи – совсем или почти лишены этой способности (ц.н.с., миокард) [10]. 1.7 Влияние полиаминов на деление и рост клеток Нормальный клеточный рост регулируется наличием специфичных белков, в основном циклинами и некоторыми циклин зависимыми протеинкиназами [233]. В последние годы также изучено изменение уровней полиаминов во время клеточного цикла. Так в фазах G1 и G2 клеточного цикла замечено увеличение количества этих полиаминов. До сих пор еще не доказано, какие именно реакции связывают полиамины с циклинами, но, вполне возможно, полиамины выступают в роли инициаторов механизмов дегидратации циклинов. Полиамины участвуют также и в процессах деления клеток, а именно: 30 1. В эмбриональном росте: вследствие экспериментов на икре морского ежа [187] замечено, что игибирование активности орнитиндекарбоксилазы прекращало деление клеток. 2. В клеточной пролиферации: эта функция основана на том, что полиамины контролируют экспрессию генов, не только посредством связывания с ДНК, но также регулируя взаимодействия между ДНК и белками. Первое открытие по этому поводу было то, что полиамины выступают в качестве стабилизаторов линейной конформации ДНК [267]. Это делает молекулу ДНКменее чувствительной к деградации от термического воздействия. В тканях млекопитающих можно обнаружить полиамины, связанные с клеточными белками ковалентно, либо с нуклеокислотами и фосфолипидами нековалентными связями. Полиамины могут быть включены в белки благодаря формированию амидных леганд между первичными аминными группами полиаминов и некоторыми γ-карбоксиамидными составляющими пептидил-глутаминных отрезков белков. Описанная реакция катализирется трансглутаминазами (ТГ) [65] и протекает по приведенной выше схеме (рисунок 4),образуя моно- и биспроизводные. 1.7.1 Полиамины в нормальных пролиферирующих клетках В клетках млекопитающих концентрация ПА изменяется в зависимости от фазы клеточного цикла. Соотношение спермидин/спермин увеличивается во время фазы G1 с максимумом в период фазы S и уменьшением в фазах G2 и М клеточного цикла. Это подтверждает существование корреляции максимума отношения спермидин/спермин с максимальным ростом и делением клеток. Аналогичные данные получены для позвоночных, растений и бактерий. Обнаружено также значительное увеличение содержания спермидина и гистамина в период роста нервных клеток [267, 268]. Путресцин и родственные ему амины стимулировали рост и клеточное деление в культуре тканей млекопитающих и фибробластов человека. Усиление пролиферации при добавлении ПА обнаружено 31 в растительных клетках и в тканях животных. В высоких концентрациях путресцин, спермидин и спермин, вследствие образования их активных метаболитов – альдегидов ПА, ингибируют пролиферацию человеческих фибробластов в культуре [94, 200, 239, 268]. В 1952 году впервые было показано ингибирование спермином роста бацилл туберкулеза. Оно осуществлялось лишь в присутствии бычьей сыворотки и связано с наличием в ней сперминоксидазы. Вскоре искусственно синтезированные аналоги иминоальдегидов ПА окончательно подтвердили это предположение [155, 267]. Чувствительными к токсическому действию иминольдегидов оказались сперматозоиды млекопитающих и тканевые культуры клеток млекопитающих и кур. Токсическое действие продукты окисления ПА оказывали на митотическую активность тканей, а не на поглощение глюкозы из среды [105, 160]. Синхронное увеличение наблюдалось активности под ОДК действием и скорости самых синтеза разнообразных нуклеиновых кислот ростстимулирующих факторов. Так же синхронно концентрации ПА и цитоплазматической РНК снижались при замедлении скорости ростовых процессов с возрастом и при голодании. При введении ПА в физиологических концентрациях в окружающую среду клеточной системы они выступают промоторами роста. В высоких концентрациях они подавляют пролиферацию [116]. Таким образом, в физиологических концентрациях ПА служат стимуляторами роста, тогда как при значительном повышении их концентрации становятся ингибиторами этого процесса. Наиболее ярко роль ПА как активаторов роста проявляется в процессе эмбриогенеза, регенерации тканей, гипертрофии, а также при воздействии гормонов роста. 1.7.2 Полиамины в регенерирующей и эмбриональной ткани животных Для эмбрионов птиц, амфибий и млекопитающих установлено резкое увеличение содержания ПА перед быстрыми фазами роста. При регенерации, в частности, быстрому росту предшествует увеличение активности ОДК и 32 повышение уровней ПА в ткани [94, 170, 245, 268]. В самых различных клетках и тканях начало быстрого роста сопровождается резким увеличением активности ОДК, а скорость синтеза ПА находится в соответствии со скоростью клеточной пролиферации [49]. Первые исследования этого аспекта физиологии ПА проводились на куриных эмбрионах, которые служили удобной моделью для изучения особенностей механизма клеточного роста и дифференцировки. Было обнаружено совпадение пика концентрации ПА с пиком синтеза нуклеиновых кислот [200]. Увеличению уровня путресцина предшествовало многократное возрастание активности ОДК в течение 5-ти дней инкубации [245]. Закономерным в этот же период времени было увеличение активности АМДК, катализирующей декарбоксилирование аденозилметионина и обеспечивающей образование субстратов для синтеза спермидина и спермина. Пики количества спермидина и спермина появлялись дважды – на 4 и 14 дни. Рибосомная и ядерная РНК, а также ДНК ядерной фракции достигали максимальных уровней в эти же дни, в то время как концентрации митохондриальных РНК и ДНК возрастали во время инкубации постоянно и не коррелировали с уровнями ПА. Инъекция ПА в оплодотворенное яйцо усиливала включение меченного 3Н-формиата во фракции РНК и ДНК и приводило к образованию РНК, связанной с полирибосомами и самих полирибосом. Это, вероятно, стимулировало синтез макромолекул и рост в целом [86]. Аналогичную тесную корреляцию между содержанием РНК и концентрациями ПА, с одной стороны, и увеличением ОДК, с другой стороны, обнаружили в гепатектомированной печени крыс и мышей, эмбрионе амфибий, в молочной лактирующей железе крыс, развивающемся морском еже и Drosophila melanogaster, в центральной нервной системе, в головном мозге и в печени обезьяны в ходе развития [108, 245, 259]. Объяснить строго параллельное увеличение уровней РНК и ПА в быстрорастущих тканях, вероятно, можно тем, что ПА в зависимости от своей концентрации могут быть и активаторами, и ингибиторами синтеза РНК. Синхронность колебаний уровней нуклеиновых кислот и ПА нужно рассматривать 33 как результат строгой временной последовательности событий, происходящих в обмене этих соединений с момента воздействия ростстимулирующих факторов до момента усиления клеточной пролиферации. Блокирование развития на стадии гаструляции эмбрионов полихет Ophryotrocha labronica L-метилорнитином, ингибирующим синтез путресцина, можно считать прямым подтверждением наличия связи между обменом ПА и усилением клеточной пролиферации [1, 273]. 1.7.3 Полиамины и опухолевый рост В 1853 году было опубликовано первое сообщение о высоком содержании спермина в легких лейкемических больных. Позднее высокие уровни ПА обнаружили в крови больных с различными видами лейкозов и у мышей с лимфомой. Это позволило легко объяснить возрастание уровней ПА у больных с лимфомами увеличением числа лейкоцитов [268]. Тем не менее, в костном мозге у детей с лейкозом и другими злокачественными новообразованиями, было обнаружено резкое возрастание уровня ПА (особенно путресцина), которое было настолько существенным, что позволило предположить, что анализ содержания ПА в костном мозге может служить диагностическим тестом при лейкозах. Более того, дальнейшие наблюдения за онкологическими больными с солидными опухолями показали настолько резкое возрастание содержания ПА в крови, что оно, очевидно, послужило причиной многократного увеличения количества ПА, экскретируемых с мочой [1, 216]. Такие отклонения от нормы в обмене ПА оказались специфичными для онкологических больных по сравнению с практически здоровыми людьми и больными другими заболеваниями [211, 244]. Это позволило предложить определение ПА в качестве биохимических маркеров в сыворотке [216], плазме [245] и моче [1] онкологических больных. Однако следует отметить, что полиаминовый тест является низкоспецифичным. Повышенное содержание ПА в злокачественных тканях отмечалось также и многими другими исследователями. Однако только экспериментальные данные позволили считать растущую опухоль причиной увеличения концентраций ПА в 34 биологических жидкостях. Было установлено, что у крыс с индуцированными диметилбензантраценом (ДМБА) опухолями молочных желез, метилхолантреном саркомами бедра и у крыс с перевивной карциномой Герена экскреция ПА значительно увеличена. Обнаружена корреляция между степенью увеличения ПА и величиной опухоли у животных. Увеличение экскреции ПА наблюдали уже на ранней стадии заболевания, предшествующей развитию пальпаторно определяемых опухолей. Удаление аденокарцином у крыс оперативным путем приводило к снижению уровней ПА в моче. Аналогично этому эффективное лечение больных (оперативное удаление опухоли, химио- или лучевая терапия) вызывало снижение экскреции ПА [34, 52, 70, 244]. Эксперименты по опухолевой регрессии в ответ на гормональную депривацию с гормонзависимой карциномой и на химиотерапию с еще большей убедительностью продемонстрировали существование связи между опухолевым ростом и ПА. Результаты показывают, что уровни внеклеточного спермидина, возрастающие во время опухолевого роста, снижаются в результате выведения повышенных количеств ПА из организма животного с мочой. Путресцин и ПА стимулировали рост и клеточное деление менингиомы (опухоль человека). В гепатомах повышение активности ОДК приводило к увеличению уровней путресцина и спермидина. Содержание спермина при этом изменялось в меньшей степени. Это позволило рассматривать молярное отношение спермидин/спермин как показатель скорости роста опухоли и дифференцировать медленно и быстрорастущие гепатомы, поскольку данное отношение было более высокое у последних и не зависило от изменения концентрации путресцина [245]. Аналогичная связь молярного отношения спермидин/спермин со скоростью опухолевого роста была обнаружена в перевивных и индуцированных опухолях крыс [1]. Помимо увеличения синтеза ПА наблюдали значительные количества путресцина. Это указывает на существование прямой зависимости между уровнем путресцина и спермидина в клетках опухоли и скоростью ее 35 роста. У медленнорастущих и высокодифференцированных опухолях оценка этой взаимосвязи более сложная [244] и требует дополнительной информации о скорости биосинтеза ПА. Клетки асцитной опухоли Эрлиха, лимфолейкозов L1210 и Р1534, а также других перевиваемых опухолей оказались чувствительными к токсическому действию иминоальдегидов, образующихся при окислении ПА [53,166, 242]. В связи с этим интерес представляют причины увеличения уровней ПА при неопластической трансформации клеток. Асцитная карцинома Эрлиха, характеризующаяся быстрой начальной фазой с последующим снижением скорости роста, оказалась наиболее удобным объектом для таких исследований. Именно для этой опухоли обмен ПА был изучен наиболее подробно. Было показано, что путресцин синтезируется из орнитина, вовлекается в синтез спермидина, из которого, в свою очередь, образуется спермин. Эти эксперименты, проведенные in vivo и с клетками асцита Эрлиха, позволяют предположить, что путресцин служит предшественником для ПА в этих клетках. У мышей к 10 дню после перевивки показано увеличение и последующее снижение содержания ПА. Эти изменения коррелировали с колебаниями концентраций РНК и ДНК. Такую же высокую степень положительной корреляции со скоростью клеточной пролифферации показали оба фермента, участвующих в синтезе ПА. Увеличение и снижение активности ОДК и АМДК предшествовали и были синхронны изменениям в содержании ПА, нуклеиновых кислот и скорости клеточной пролиферации. При этом активность АМДК была увеличена только в быстрорастущих гепатомах. Высокая активность ОДК была также установлена для STAT-1, STAT-III и NRF-TFF сарком и гепатомы крыс. Была показана также высокая положительная зависимость между скоростью синтеза ПА, содержанием спермидина и скоростью пролиферации клеток опухоли мозга крыс in vivo и in vitro [44, 45, 244]. Таким образом, приведенные данные об изменении скорости биосинтеза и концентраций ПА в различных опухолях животных показывают, что для пролиферирующих опухолевых клеток характерна высокая активность ключевых ферментов синтеза ПА и высокое содержание путресцина и спермидина. Это 36 позволяет предположить, что активность ОДК, содержание спермидина и петресцина, величина отношения спермидин/спермин отражает пролиферативную активность опухоли. Так, рост и пролиферация обеспечиваются высоким уровнем ПА, а переход клеток от пролиферации к дифференциации сопровождается снижением активности ОДК и внутриклеточной концентрации ПА. Более того, снижение уровней ПА индуцировало дифференцировку клеток эмбриональной карциномы мышей. Детали механизма участия ПА в процессах усиленной пролиферации и дифференцировки клеток на сегодняшний день остаются до конца не выясненными. Тем не менее, очевидно, что индукция биосинтеза ПАпринципиально необходимый этап в реализации процесса клеточного роста, а не следствие его. Так, полная утрата ОДК клетками-мутантами культуры яичка китайского хомячка делает невозможной пролиферацию без добавления в среду экзогенных ПА или без трансфекции функционального гена ОДК и этой клетки. 1.8 Неоплазии Неоплазиями называется необратимый процесс неконтролируемого роста аномальных клеток и их распространение во всем организме, являясь тем самым помехой для нормального функционирования организма и приводя в конечном итоге к его гибели. Опухоль развивается, начиная с определенного очага в теле человека (первичная опухоль) и, если ее удается обнаружить на ранних стадиях, когда она еще вся локализована в месте образования, может быть излечена химиотерапией, удалена хирургическим путем или уничтожена вследствии радиотерапии [173]. Если же опухоль уже начала распространяться по системе кровообращения и лимфатической системе, образуя так называемые матастазы в других органах, даже в тех, которые достаточно удалены от места первоначального формирования опухоли, то прогнозы излечения такого пациента чаще всего негативные. 37 Отсюда можно определить неоплазию как нарушение клеточного порядка, которое отображается изменениями в следующих процессах: 1. Клеточная пролиферация. 2. Клеточная дифференциация. 1.8.1 Меланома Кожная меланома составляет 5% от всех раков кожи. Она очень распространена среди белых людей, в особенности встречается у тех, кто живет в условиях жаркого климата [173]. Частота возникновения меланомы у представителей белой расы увеличилась за последние 50-летие, занимая самое высокое место среди всех типов опухолей. Этот тип неоплазии носит название меланома, потому что он развивается, начиная со специфических клеток – меланоцитов, которые мигрируют во внешний слой кожи – эпидермис (рисунки 6, 7). Рисунок 6 - Внешний вид меланомы. Рисунок 7 - Структура меланомы. 38 Кожная меланома приводит к летальному исходу в очень высоких процентах случаев, в отличие от других раков кожи. Меланома – это злокачественное образование меланоцитов. Она может расти как снаружи кожных покровов, так и изнутри. Ее клетки могут в определенный момент оторваться от места образования и через лимфоток добраться до лимфотических узлов (в основном это подмышечные, паховые и шейные лимфоузлы). Через систему кровообращения они могут перемещаться в любой орган (чаще всего в печень, легкие, кости и мозг) и там расти, формируя новую опухолевую массу. Рисунок 8 - Различия в меланомных образованиях. 39 Риск того, что меланома может распространиться и дать метастазы, очень высок, когда она начинает утолщаться. Выступ над уровнем кожи более 1 мм уже считается этим риском [144]. Края злокачественного образования неровные и его пигментация неоднородная, по сравнению с обычной родинкой. Наиболее часто встречающиеся типы меланомы: − меланома внешних покровов; − узелковая меланома; − акральная меланома пигментного родимого пятна; − злокачественная меланома пигментного родимого пятна. Также существуют более редкие формы меланомы: − бледная саркома клеток; − меланома мускулов; − меланома склеры. 1.8.2 Меланин Разнообразный цвет кожи человека определяется относительным содержанием в ней меланина, оксигемоглобина, восстановленного гемоглобина и каротина. Однако именно меланин является основным пигментом, от которого зависит цвет кожи, волос и глаз. Он выполняет также функции фильтра, уменьшающего опасное воздействие на кожу ультрафиолетовых лучей и таким образом предотвращающего острую реакцию на солнечные ожоги и хроническое воздействие лучистой энергии, в том числе рак кожи. Цвет кожи представляющих определяется собой содержанием меланина клетки-рецепторы в кератиноцитах, меланинсодержащих органелл,формируемых меланоцитами и названных меланосомами [122, 123]. На рисунке 9 изображены места дермы, соприкасающейся с герминативный слоем эпидермиса, состоящего из клеток – кератиноцитов. Каждый меланоцит, с помощью своих удлинений проникает между кератиноцитами (рисунок 10), образуя так называемые мелано-эпидермические группировки [235, 236, 237] 40 животных организмов и людей гранулы меланина придают окраску коже, волосам, шерсти и перьям. В результате синтеза меланина (меланогенеза) образуются два класса пигментов: − эумеланин: пигмент черно-коричневого цвета; − феомеланин: пигмент желто-красного цвета. Рисунок 9 - Герминативный слой эпидермиса. Рисунок 10 - Мелано-эпидермическиегруппировки. 41 1.8.3 Меланиногенез Биогенез меланина был хорошоописан моделью Мэсона и Рэпера [203, 237], в которой они указали всепоследовательные реакции формирования пигмента, начиная с молекулы тирозина (рисунок 11, 12): 1. К тирозину присоединяется гидроксигруппа в результате реакции, катализируемой тирозиназой, и образуется 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА). 2. Далее также под действием тирозиназы ДОФА окисляется до дофахинона (фенилаланин – 3, 4-хинон). 3. Дофахинон трансформируется в дофахром, который служит субстратом для дофахромтаутомеразы при синтезе 5,6-дигидроксииндоло-2-карбоксильной кислоты и 5,6-дигидроксииндола. Эти кислоты формируют эумеланин. 4. Дофахинон вступает в реакцию с цистеином с образованием 5-S-цистеин-ДОФА и 2-S- цистеинил-ДОФА. Из них формируется феомеланин Показано, что очень редко можно получить меланин из животных тканей, который состоял бы только из эумеланина и феомеланина. Количество и соотношение выработки этих двух типов пигмента зависит от наличия в организме молекул-предшественников, из которых они синтезируются [190]. Рисунок 11 - Схематическое изображение меланогенеза в коже человека при световом и электронномикроскопическом исследовании. 42 Рисунок 12 - Модель биогенеза меланина Рэпера и Мэсона [237]. 1.9 Дифференциация клеток Клеточная дифференциация – это процесс, в результате которого потомки одной клетки достигают определенной специализации структуры и функций и сохраняют их. Когда клетки приобретают способность к дифференцировке, они в итоге теряют склонность к бесконтрольному росту и размножению. Дифференцированные клетки в норме практически не делятся. Последние годы в онкологии актуально противоопухолевых направление в химиотерапевтических изучении и препаратов, разработке новых направленных на активацию процессов дифференциации раковых клеток. В связи с этим, в науке неожиданно появился интерес к рассмотрению возможности добиваться регрессии опухоли, используя вещества, вызывающие дифференциацию клеток. Последнее эспериментальное направление в лечении онкологических больных, названное «дифференциальная терапия», использует именно эти агенты, 43 способные модифицировать опухолевый рост, вызывая дифференциацию [272]. В природе существует много субстанций, обладающих антиопухолевым эффектом, которые индуцируют процессы дифференциации и апоптоза. Из них наиболее известны β-каротин и витамины, а также флафоноиды (кверцетин) и полифенолы [195, 264]. В процессе дифференциации наблюдаются морфологические и функциональные изменения в клетке. Морфологическая модификация клеток меланомы после активации процесса дифференциации, вызвать который способны некоторые синтетические и природные агенты [79, 222, 191, 271], характеризуется появлением дендрических отростков. Меланоциты – это клетки эпидермы, берущие начало в нейроэктодерме. Во время эмбрионального развития предшественники меланоцитов мигрируют в базальный слой эпидермиса, где дифференцируются и приобретают возможность синтезировать пигменты меланина [122, 188]. Процесс дифференциации характеризуется стимулированием появления выростов в клетке меланоцита, которые служат для поставки меланина в верхние слои кожи. В частности, дифференциативный эффект клеток меланомы вызывался действием ретиноидной кислоты (рисунок 13), а также флавоноида цианидин-3-O-β-глюкопиранозида который присутствует во многихфруктах, таких, как сливы, виноград, ежевика, черника, красные апельсины, а также в некоторых сортах баклажанов [258]. Рисунок 13 - Химическое строение флавоноида цианидин-3-O-β-глюкопиранозида. 44 Были изучены спровоцированные модификации экспрессией клеток специфических человеческой маркеров меланомы, дифференциации меланоцитов – тирозиназы и MelanA/MART-1 (рисунок 14). Новейшие тенденции в научных исследованиях в области дифференциальной терапии опухолей экспериментально доказывают роль активности трансглутаминазы в процессах дифференциации. Как показывают результаты оценки действия ретиноидной кислоты на клетки человеческой и мышиной меланомы, она способствует повышению активности трансглутаминазы и уровней циклического аденозин 3,5-монофосфата (цАМФ), индуцируя при этом дифференциацию (рисунок 15) [193]. Рисунок 14 - Эффект действия флавоноида цианидин-3-O-β-глюкопиранозида (C-3-G) и ретиноидной кислоты (RA) на экспрессию тирозиназы и антигена Melan-A/MART1. 45 Рисунок 15 - Активность ТГ клеток меланомы линии B16-F10 с высокой метастатической активностью и клеток меланомы линии B16-F10 Lr6 с низкой метастатической активностью под действием ретинойдной кислоты в течение 48 часов. Следовательно, активность ТГ и уровни меланина являются маркерами дифференциации в клетках меланомы. 1.10 Действие аналогов полиаминов и метиленовых производных ксантина на метаболизм полиаминов Следует отметить, что среди веществ, исследованных ранее по их влиянию на активность ферментов обмена полиаминов, есть синтетические структурные аналоги природных полиаминов, в частности, полиамины, модифицированные урацилом (рисунок 16). В частности, в отношении аналогов полиаминов, модифицированных урацилом, доказано их влияние на активность ОДК и ПАО в регенерирующей печени. 46 Рисунок 16 - Формулы аналогов полиаминов, модифицированных урацилом [32]. Как видно из диаграммы (рисунок 17), некоторые из указанных аналогов поллиаминов, модифицированных урацилом, повышают активность полиаминоксидзы, одновременно снижая активность орнитиндекарбоксилазы. Следовательно, эти вещества усиливают распад полиаминов, одновременно подавляя их синтез. За счет этого возможно снижение концентрации полиаминов в клетке. Это может привести к снижению синтеза белка и замедлению роста клеток. Это обстоятельство позволяет предположить у веществ VII, VIII и IX наличие канцеростатических (антипролиферативных) свойств. Вещества, обозначенные на диаграмме как IV и VI, напротив, снижают активность полиаминоксидазы и повышают активность орнитиндекарбоксилазы. Это может привести к повышению уровня полиаминов, а, следовательно, и к усилению роста и деления клеток. Это позволяет предположить, что у веществ IV и VI возможно наличие канцерогенных свойств. 47 Рисунок 17 - Влияние структурных аналогов полиаминов, модифицированных азотистыми основаниями, на активность ОДК и ПАО [32]. Таким образом, при опухолевом росте повышение уровня полиаминов происходит за счет резкого снижения или практически полного отсутствия активности ПАО при незначительном изменении активности ОДК [1, 19, 25]. В связи с этим вещества, которые влияют на обмен внутриклеточных полиаминов подобным образом, можно предположительно отнести в группу соединений с потенциальными канцерогенными свойствами. И напротив, если вещество подавляет активность ОДК и одновременно повышает активность аминоксидаз, то онохарактеризуется, как потенциальный канцеростатик. При нормальной регенерации повышение уровня полиаминов происходит за счет повышения активности ОДК, при этом скорость окислительного дезаминирования остается постоянной [1, 19, 25]. Поэтому вещества, которые имеют такую же направленность действия, нами были признаны в качестве соединений, усиливающими пролиферацию, а действующие в противоположном направлении – потенциальными антипролиферативными веществами. Следует отметить, что подобная классификация исследуемых веществ, является предварительной и требует дальнейшего изучения, не входившего в рамки поставленных задач в данном исследовании. 48 Глава 2 Материалы и методы 2.1 Характеристика гетероциклических соединений оригинального синтеза В ходе эксперимента проводились исследования биологических свойств метиленовых производных ксантина (таблица 2) и соединений оригинального синтеза - структурных аналогов полиаминов, условно разделенных на группы: А - производные бензимидазола и азафлуорена (таблица 3); Б - производные анилина (таблица 4); В - производные диоксаборенинопири-дина (таблица 5); Г - производные пиперидона (таблица 6); Д - производные азафлуорена (выборочная группа), (таблица 7). Таблица 2 - Структурные формулы пуриновых алкалоидов - метилированных производных ксантина. 49 Таблица 3 - Структурные формулы веществ оригинального синтеза -производных бензимидазола и азафлуорена (группа А). 50 Все вещества из группы производных метилксантина растворялись в воде, вещества оригинального синтеза - в диметилсульфоксиде (ДМСО) с добавлением кислот или щелочей (в зависимости от растворимости и устойчивости веществ), а в случаях труднорастворимости веществ использовалась ультразвуковая машина. Выбор именно этих соединений обусловлен сходством их структур со структурами соединений, противоопухолевая активность которых доказана [19, 32, 61, 80, 82]. 51 Таблица 4 - Структурные формулы веществ оригинального синтеза производных анилина (группа Б). 52 53 Таблица 5 - Структурные формулы группы веществ оригинального синтеза – производных диоксаборенинопиридина (группа В). 54 55 Таблица 6 - Структурные формулы веществ оригинального синтеза производных пиперидона (группа Г). 56 Таблица 7 - Структурные формулы веществ оригинального синтеза -производных азафлуорена (группа Д - выборочная). 2.2 Количественный анализ основных показателей обмена полиаминов в бесклеточных тест-системах В экспериментах были использованы белые беспородные крысы – самцов массой 100-130 г, содержащихся на стандартном рационе вивария РУДН со свободным доступом к воде. Для анализов были выбраны две модельные бесклеточные тест системы из тканей с сохраненной и утраченной системой контроля за скоростью клеточной пролиферации. Использованные тест-системы позволяют исследовать влияние аналогов полиаминов как на регенерирующую, так и на опухолевую ткань [37]. В качестве тканей с повышенным митотическим индексом использовалась регенерирующая печень здоровых крыс и солидная гепатома крыс Г-27. Ткань печени обладает высокой скоростью регенерации. 57 Моделью патологической регенерации была ткань гепатомы крыс Г-27 – этосолидная опухоль печени, первично индуцированная у нелинейных белых крыс диэтилнитрозамином [19, 37]. 2.2.1 Регенерирующая печень здоровых крыс Для получения бесклеточной тест-системы выполнялась стандартная парциальная гепатэктомия по методике Higgins, Anderson (1931) [154]: 1. Под эфирным наркозом крысам проводилась лапаротомия, у основания левой боковой и центральной долей печени накладывалась лигатура, доли удалялись. Такая операция приводила к хорошо выраженной регенерации оставшейся части печени в течение последующих 18-20 часов. В эти сроки животных умерщвляли декапитацией и извлекали малые участки регенерирующей печени для исследования (рисунок 18) . 2. Эти участки обескровливали на льду физиологическим раствором с температурой 2-4ºС для исключения погрешностей определения активности ферментов и уровня полиаминов за счет примеси гемоблобина, затем взвешивались. 3. Обескровленные участки печени взвешивались и гомогенизировалина холоде с буфером. 4. Гомогенат ткани ультрацентрифугировали при 20 000 g в течение 15 минут при 2-4ºС. 5. Супернатант полученного 33% гомогената использовался для определения активности ОДК и уровня полиаминов или по определению активности полиаминоксидаз. 58 Рисунок 18 - Удаление центральной и боковой долей печени. 2.2.2 Пролиферирующая ткань гепатомы крыс Г27 Штамм гепатомы Г-27 был получен из банка опухолевых штаммов ГУ Российского онкологического научного Центра РАМН им. Н.Н. Блохина. Ампулы с биологическим материалом транспортировались к месту перевивки в жидком азоте. Штамм гепатомы пассировался на крысах, как было описано ранее И. Н. Швембергером (1970 г.) [37]. Перевивалась гепатома крысам подкожно по 50 мг взвеси опухолевой ткани в 0,5 мл питательной среды. Пассировалась опухоль 2-3 раза на белых беспородных крысах-самцах в течение 2-3 недель. Затем крысы усыплялись декапитацией и выделялась опухоль. В опытах использовали 2-3 пассажи in vivo. Образцы опухолевой ткани для исследования готовились следующим образом. Ткань опухоли, освобожденную от некротических масс, суспендировали со стерильным физиологическим раствором на холоде в стерильных условиях. Перевивалась полученная суспензия крысам подкожно по 50 мг взвеси на крысу. В полученных образцах определялась активность ОДК и уровень полиаминов. Остаток опухолевого материала использовался для последующих перевивок. Ткань гомогенизировали с охлажденным 50 мМ 59 фосфатным буфером рН 6,6 содержащим дитиотриэтол 0,1 мМ и пиридоксальфосфат 0,4 мМ. Измельчение ткани проводилось в металлическом охлажденном прессе. Полученная масса взвешивалась. Затем проводилась гомогенизация в лабораторном стеклянном гомогенизаторе с предварительно охлажденным тефлоновым пестиком. Смесь центрифугировалась в ультрацентрифуге с ускорением 20000 об/мин при t = 4 0C в течение 15 минут. Полученные таким образом бесклеточные тестсистемы по составу химических компонентов были максимально приближены к внутриклеточной среде и содержали необходимые компоненты для определения ктивности ОДК, ДАО, ПАО и уровня полиаминов (рисунок 19) и, кроме того, содержали минимум компонентов, способных помешать определению. Рисунок 19 - Метаболизм полиаминов,цитировано по Basu H.S. и др. [62] ODC, ornithine decarboxylase – ОДК, орнитиндекарбоксилаза; Spd, spermidine – Спд, спермидин; AdoMetDC, S-adenosylmethionine decarboxylase – АМДК, S-аденозилметиониндекарбоксилаза; dcAdoMet, decarboxylated AdoMet – дкАМ, декарбоксилированный аденозилметионин; Spm, spermine – Спм, спермин; SSAT, spermidine/spermine N1-acetyltransferase – ССАТ, спермидин/спермин N1-ацетилтрансфераза; PAO, polyamine oxidase – ПАО, полиаминоксидаза; SMO, spermine oxidase – СМО, сперминоксидаза; eIF5A, eukaryotic initiation factor 5A – eIF5A, эукариотический фактор инициации 5А. 60 2.3 Определение активности ДАО и ПАО Диаминоксидаза – диамин: кислород – оксидоредуктаза (дезаминирующая, пиридоксальфосфатсодержащая, КФ 1.4.3.6.) – окисляет субстраты с поглощением кислорода и образованием аммиака, перекиси водорода и соответствующего альдегида: H2N(CH2)4NH2 + H2O + O2 → H2N(CH2)3CHO + H2O2 + NH3 Путресцин ДАО При окислительном дезаминировании ПА также образуются лабильные иминоальдегиды, аммиак и перекись водорода: H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2 + 2O2 + 2H2O → OHC(CH2)2NH(CH2)3CHO Спермидин ПАО Иминоальдегид +2H2O2 + 2NH3 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 + 2O2 + 2H2O2 → Спермин ПАО OHC(CH2)2NH(CH2)4NH(CH2)2CHO + 2H2O2 + 2NH3 Иминоальдегид Известные методы, основанные на прямом определении поглощения кислорода и освобождения аммиака, микротитровании перекиси водорода, определении убыли субстрата в процессе реакции, требуют большого количества биоматериала, длительного периода инкубации и показывают относительно низкую чувствительность. Для определения скорости окислительного дезаминирования ди- и полиаминов из большого числа различных методов в качестве прототипа выбрали спектрофотометрический метод измерения активности гистидазы в плазме крови кролика в модификации Gordon и Peters (1967) [9]. В основе метода лежит измерение окрашенного продукта, который образуется при окислении одианизидина перекисью водорода, образующейся в аминоксидазной реакции. 61 Катализатором о-дианизидиновой реакции служила пероксидаза. Провели замену о-дианизидиного основания на его гидрохлоридное производное. Это позволило использовать данный краситель не в спиртовом, а в водном растворе: Существенное преимущество данного метода перед уже известными, заключалось в удалении из реакционной среды перекиси водорода и аммиака – сильных, Нижняя неконкурентных граница ингибиторов чувствительности окислительного метода составила дезаминирования. ± 0,1 нмоль и воспроизводимости ± 0,1 нмоль. В качестве источника фермента использовался супернатант гомогената, полученный центрифугированием при 15000 об/мин в течение 20 мин (L7-55 “Beckman”). Ultracentrifuge Активность ДАО (амин: кислородоксидоредукта-за, дезаминирующая, пиридоксальсодержащая, КФ 1.4.3.6) и ПАО определялась спектрофотометрическим микрометодом [9] (таблица 8). В качестве субстрата использовался путресцин-2НС1, спермидин3HCI и спермин-4HCI,полученные нами из свободных ПА фирмы «Fluka» (Швейцария). 62 За единицу активности принимали преобразование 1 нмоля субстрата, окисленного за 1 ч при 37°С. Удельную активность фермента выражали в единицах активности на 1 мг белка. Таблица 8 - Общая схема определения аминооксидазной активности 2.4 Определение активности ОДК и уровней полиаминов Совместное определение активности ключевого фермента синтеза полиаминов – ОДК и уровней полиаминов проводилось методом ВЭЖХ. Предварительный этап анализа по данным показателям заключался в следующем. Реакционная среда в 0,5 мл конечного объема содержала орнитин («Реахим»,Россия) в концентрации 80 мМ, пиридоксальфосфат («Реанал», Венгрия) –4 мМ, дитиотриэтол (“Serva”, ФРГ) 20 мМ в 50 мМ фосфатном буфере рН 6,6. В реакционную среду добавлялись тестируемые вещества до конечной концентрации 0,1 мМ и 0,3 мл супернатанта 33% гомогената гепатомы Г-27 или регенерирующей печени. Инкубация с веществами длилась 1 час при температуре 37 0С. Затем реакция останавливалась добавлением 0,1 мл 0,2 М раствора хлорной кислоты. Осадок отделяли центрифугированием при 6000 об./мин. в течение 5 минут. Для дальнейшего исследования использовалась надосадочная 63 жидкость. Полученные таким образом пробы, хранились при температуре около 0 0С. Дальнейшие операции были связаны с подготовкой проб к определению концентрации полиаминов и активности ОДК методом ВЭЖХ. Для этого сначала проводилось бензоилирование проб. Бензоилирующим агентом был бензоилхлорид. Реакцию можно представить в виде следующей схемы: NH2-R-NH2 + C6H5COCl C6H5CONH-R-NHCOC6H5 + 2HCl Полиамин Бензоилхлорид R= CH2 CH2 CH2 CH2 путресцин CH2 CH2 CH2NH CH2 CH2 CH2 CH2 спермидин CH2 CH2 CH2NH CH2 CH2 CH2 CH2 NH CH2 CH2 CH2 спермин В полученные ранее пробы добавлялся 2N раствор NaOH, смесь интенсивно перемешивали в течение 1 минуты. Затем добавляли бензоилхлорид и вновь активно перемешивали в течение 2 минут. Полученную смесь выдерживали в условиях комнатной температуры в течение 1-2 часов. Реакция прекращалась добавлением NaCl. Образовавшиеся бензоильные производные полиаминов экстрагировали шестью порциями этилового эфира по 30 мл.Эфирные экстракты объединяли, эфир выпаривали досуха. Бензоильные производные полиаминов помещали в полиэтиленовые эппендорфы. Далее проводилось определение концентрации бензоилированных производных полиаминов методом ВЭЖХ на приборе «Милихром 5-3». Исходный метод определения количественного содержания полиаминов в биологических тканях с применением в качестве элюента для градиентного элюирования смеси метанол – вода был модифицирован Сяткиным С.П. и Голомазовой К.А. [7]. В отличие от исходного метода ВЭЖХ, где в качестве элюента использовался токсичный метанол, в данной модификации использовалась система ацетонитрил-вода. Это позволило снизить токсичность метода. Определение проводилось в режиме градиентного элюирования, при этом содержание ацетонитрила менялось от 10% до 100%, всего было 4 ступеней (0-10% ацетонитрила, 10-50% ацетонитрила, 50-80% ацетонитрила и 80-100% ацетонитрила). При определении использовалась колонка с обращенной фазой С18. Длина волны составляла 254 нм. Скорость 64 потока 80 мкл/мин. Общее время анализа 1 пробы составляло около 17 минут. В таблице 10 представлен режим градиентного элюирования смесью ацетонитрила и воды. Все режимы элюирования и объемные отношения смеси были подобраны нами заново. Таблица 9 - Режим градиетного элюирования смесью ацетонитрила и воды. Концентрация Время ацетонитрила в воде Объем ступени, мкл 0-1 мин. 10 % 100 1-4 мин. 10-50 % 240 4-9 мин 50-80% 400 9-17 мин 80-100 % 640 Примечание - объемы ступеней указаны без объема регенерации и объемов буферов 1 и 2. Объем регенерации колонки составлял 300 мкл, что учитывалось при составлении программы элюирования (закладывалось в программу при задании объма последней по порядку набора ступени элюирования), объем буфера 1 и буфера 2-0,5 мкл, объем вводимой пробы – 0,2 мкл. Расчет концентраций бензоильных производных полиаминов производился исходя из концентрации стандартных растворов бензоильных производных полиаминов. Стандартные бензоильные производные полиаминов получали самостоятельно, проводя реакцию бензоилирования стандартных субстанций полиаминов по указанной выше методике. Контроль качества полученных веществ (по показателям состав и количественный выход) проводился с помощью метода хромато-масс- спектрометрии. На рисунке 20, приведен хромато-масс-спектр стандартных производных полиаминов (время бензоилирования 2 часа). 65 Рисунок 20 - Хромато-масс-спектр бензоильных производных полиаминов (стандарт) Далее проводилась ВЭЖХ стандартных производных полиаминов, при этом отмечались их времена удерживания и концентрации исходя из площадей их пиков. Определение проводилось при длине волны 254 нм. Рисунок 21 - Хроматограмма, полученная методом ВЭЖХ на приборе «Милихром 5-3», стандартных производных полиаминов. 66 Рисунок 22 - Хроматограмма стандартных бензоильных производных полиаминов, полученная методом ВЭЖХ. Рисунок 23 - Указаны времена выхода бензоильных производных полиаминов в минутах. Пики 1, 2 и 3 – это, соответственно, пики производных путресцина, спермидина и спермина. Затем проводилась ВЭЖХ анализируемых образцов и рассчитывались их концентрации в пробе. По концентрациям производных полиаминов расчитывалась удельная активность ОДК в анализируемых образцах. 67 2.5 Количественное определение белка в бесклеточных тест-структурах Для расчета удельных активностей ОДК и аминоксидаз, выраженных в нанокаталах на миллиграмм белка, проводилось определение концентрации белка в каждой пробе ткани как гепатомы Г-27, так и регенерирующей печени. Определение проводилось по методу Lowry (1951) [197] в модификации С. П.Сяткина [22]. Порядок проведения определения белка представлен в таблице 10. Таблица 10 - Порядок проведения определения концентрации белка в биологических пробах. Инкубационная смесь Опыт Контроль буфер 0,1 - NaOH (1N) 0,8 0,8 ДОХ (1%) 0,1 0,1 р-в С 4 4 проба 0,1 - Встряхнуть до просветления р-в D 0,5 0,5 Перемешать Термостатирование при 370ºС 30 мин. Спектрофотометрирование λ=750 нм В связи с высоким содержанием липо- и гликопротеинов в ткани метод пределения белка по Лоури модифицировали следующим образом. Применили дезоксихолат. Это сократило время анализа и исключило потерю белка, входящего в состав липо- и гликопротеинов. Для более полного растворения белка концентрацию NaOH увеличили с 0,1 М до 1 М. Заменили тартрат нацитрат натрия. Стабильность реактива С повышали тем, что реактив А готовили на воде, 68 а не на 0.1 М NaOH. Оптимальным соотношение концентраций детергента и белка в пробе было 1:100. Калибровочная зависимость сохраняла линейный характер до концентрации 250 мкг/мл белка в пробе. Полученная оптическая плотность растворов сравнивалась с таковой для стандартных растворов с известной концентрацией белка и по калибровочной кривой (рисунок 24) рассчитывалась концентрация белка в анализируемой пробе. Рисунок 24 - Калибровочная кривая для расчета концентрации белка. По оси абсцисс – концентрация белка в растворе (в мкг/мл); по оси ординат – оптическая плотность раствора, измеряемая при 750 нм. 69 Глава 3 Исследование биохимических свойств гетероциклических веществ оригинального синтеза на бесклеточном уровне 3.1. Тест-система из регенерирующей печени крыс Количественная оценка влияния синтетических аналогов ПА из исследуемых групп на обмен ПА в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс определялась по характеру и величине их действия на активность аминоксидаз – ПАО и ДАО. Полученные экспериментальные данные представлены на рисунках 25-26. Рисунок 25 - Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на скорость окислительного дезаминирования Пут, Сд и См в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс (результаты представлены в виде M±m для 9 измерений). 70 Рисунок 26 - Влияние производных анилина (группа Б) на скорость окислительного дезаминирования Пут, Сд и См в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс (результаты представлены в виде M± m для 9 измерений). Рисунок 27 - Влияние производных диоксаборенинопиридина (группа В) на скорость окислительного дезаминирования Пут, Сд и См в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс (результаты представлены в виде M± m для 9 проб). 71 Полученные результаты (рисунок 27) свидетельствуют о том, что все исследованные вещества группы А, кроме 1А, существенно увеличивают распад См. Окисление Пут ускоряют соединения 3А, 10А и 12А, а Сд – 4А, 7А, 9А и 10А. Как видно из диаграммы (рисунок 28), все протестированные соединения группы Б вызывали окислительного статистически дезаминирования достоверные ПА. изменения Вещество 9Б в скорости ингибировало дезаминирование Сд, а вещество 11Б – Пут и См. Это позволяет прогнозировать у них канцерогенные канцеростатические свойства. свойства, Все остальные активируя вещества процесс проявили окислительного дезаминирования. Довольно резкая активация См наблюдалась при действии вещества 5Б. Наибольшее активирующее действие на окислительный распад всех трех ПА оказало вещество 3Б. Все тестируемые вещества группы В также вызывали статистически достоверные изменения активностей ДАО и ПАО (рисунок 27). Процесс окислительного дезаминирования Пут значительно ингибировался всеми тестируемыми веществами этой группы. Скорость окислительного дезаминирования Сд уменьшалась в 2 раза, См – уменьшалась незначительно или оставался неизменным предположить наличие (при у действии всех СоА2 исследуемых и СоА3). веществ Это позволило данной группы канцерогенных свойств. Влияние тестируемых веществ из группы А на обмен ПА в ткани регенерирующей печени оценивалось по характеру и силе их действия на скорость синтеза ПА. Результаты этой серии опытов представлены в таблице 5 и рисунок 28. Следует отметить, что все исследованные вещества проявили ингибирующее действие на активность ОДК. Самыми активными оказались вещества 1А, 3А, 8А и 10А. Уровни ПА рассматривали как интегральные показатели изменения баланса скорости распада и синтеза ПА под влиянием тестируемых веществ. Результаты представлены на рисунке 29. 72 Таблица 11 - Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на активность ОДК в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс. Вещество Активность ОДК, нкат/мг Ингибирование, % белка Контроль 12,96±0,07 0 1А 6,32± 0,05 51,23 2А 7,25±0,08* 44,06 67,13 3А 4,26±0,06* 67,13 4А 8,33±0,07* 35,73 5А 9,23±0,05* 28,78 6А 10,98±0,07* 15,28 7А 8,00±0,06* 38,27 8А 3,61±0,08* 72,14 9А 5,02±0,06* 61,26 10А 2,18±0,06* 83,18 11А 10,00 ±0,08* 22,84 12А 7,56±0,06* 41,67 Примечание - Результаты представлены в виде M± m для 9 проб. *Статистически достоверные отличия от контроля, P<0,05. Рисунок 28 - Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на активность ОДК в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс. 73 Рисунок 29 - Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на уровни ПА в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс (результаты представлены в виде M± m для 9 проб). Все исследованные соединения вызывали снижение уровней Пут и ПА. Наиболее эффективными оказались 3А, 8А и 10А. 3.2 Тест-система из гепатомы Г-27 крыс Количественная оценка влияния тестируемых соединений на скорость синтеза ПА в бесклеточной тест-системе из гепатомы Г-27 крыс проводилась аналогичным образом. Результаты этой серии опытов представлены в таблице 12 и на рисунке 30. Полученные данные указывают на то, что все исследованные вещества проявили ингибирующее действия на активность ОДК. Наиболее эффективными ингибиторами оказались вещества 3А, 8А, 9А и 10А. 74 Таблица 12 - Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на активность ОДК в бесклеточной тест-системе. Вещество Активность ОДК, нкат/мг Ингибирование, % белка Контроль 15,96±0,07 0 1А 7,32± 0,05 53,39 2А 8,25±0,08* 45,28 3А 5,26±0,06* 66,13 4А 9,33±0,07* 41,73 5А 10,23±0,05* 33,78 6А 12,98±0,07* 21,28 7А 9,00±0,06* 41,27 8А 4,61±0,08* 69,14 9А 6,02±0,06* 59,26 10А 3,18±0,06* 74,18 11А 12,00 ±0,08* 23,84 12А 8,56±0,06* 46,67 Примечание - Результаты представлены в виде M± m для 9 проб. *Статистически достоверные отличия от контроля, P<0,05. Рисунок 30 - Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на активность ОДК в бесклеточной тест-системе из гепатомы Г-27 крыс (результаты представлены в виде M± m для 9 проб). 75 Все протестированные вещества группы А так же, как и в серии опытов с регенерирующей печенью, вызывали понижение уровней ПА (риснок 31). Соединения 3А, 8А, 9А и 10А были наиболее активными. Рисунок 31 - Влияние производных бензимидазола и азафлуорена (группа А) на уровни ПА в бесклеточной тест-системе из гепатомы Г-27 крыс (результаты представлены в виде M± m для 9 проб). 3.3 Модификация метода разделения и количественного определения ПА методом ВЭЖХ Хроматографический метод модифицировали специально для определения уровней ПА в лизате клеточной культуры мышиной меланомы линии B16-F10. Перед хроматографическим разделением свободные полиамины переводили в соответствующие производные путем химической модификации офтальальдегидом (1:1), o-фтальальдегидный реагент приготавливали путем растрворения 4 мг порошка о-фтальальдегида в 1 мл метанола, добавляя 76 4,740 млборатного буфера (1M, pH 9,5) и 10 μл раствора μ-меркаптоэтанола. 100 μл смеси впрыскивали в хроматограф. Депротеинезацию клеточного лизата осуществляли, добавляя раствор перхлорной кислоты, с последующим центрифугированием (14 000 оборотов/мин в течение 15 мин) и фильтрованием супернатанта. Определение было выполнено на аппарате AKTABASIC 10HPLC (Amersham Pharmacia Biotech.,Milan, Италия). Обратнофазовые разделения проводились при комнатнойтемпературе в колонках LC-18 Supelcosyl column (150 mm x 4,6 mm, 3 μm) (Supelco, Milan, Италия). Производные были разделены на 2 подвижные фазы: фазу A (95% 350 mM раствора цитрата натрия, pH 4,0; 5% тетрагидрофурана) и фазу B (45% 350 mM раствора цитрата натрия, pH 4,0; 40% ацетонитрила; 15 % тетрагидрофурана). Процедура <Џ_Dy–_Dт_элюирования начиналась с изменением линейного градиента буфера B от 50% до 100% в течение 5 мин, а затем переходило в стадию изократического элюирования со скоростью 0,9 мл/мин, длящееся 15 мин. Детектирования регистрировались спектрофлуориметром (Jasco). Флуоресцентный детектор был настроен на длины волн λex 330 нм и λem 445 нм. Распознавание полиаминов проводилось по средним стандартным значениям. Соотношение между площадями пиков всех трех ПА (рисунки 33-35) и их концентрацией определялось по калибровочным предварительнопостроенным для ПА и диаминоктана (рисунок 36). 77 графикам, Рисунок 32 - Хроматограф AKTABASIC 10 HPLC, на котором проводилось определение уровня полиаминов в лизате клеток в ходе нашего эксперимента FP-1520, Easton, MD). Рисунок 33 - Хроматограмма контрольной смеси ПА. 78 Рисунок 34 - Хроматограмма уровней ПА после 48 часов воздействия вещества на клетки. Рисунок 35 - Хроматограмма уровней ПА после 72 часов воздействия вещества на клетки. 79 Рисунок 36 - Калибровочные графики уровней полиаминов и диамиоктана. R2 (коэффициент линейной регрессии). 80 Заключение Анализ литературы, посвященной роли полиаминов и ферментов их обмена в процессах клеточной пролиферации и дифференцировки показывает, что эта тема является актуальной и требует дальнейшей экспериментальной разработки. Уникальность ПА, как факторов роста, заключается в том, что они одновременно могут выполнять в живом организме диаметрально противоположные функции: активировать (при оптимальной концентрации) и ингибировать (при высоких концентрациях) синтез нуклеиновых кислот и белка в нормальных и опухолевых тканях. Эти свойства лежат в основе регуляторной функции ПА и определяют их высокую метаболическую лабильность. Так, период полужизни путресцина в различных тканях животных равен двум часам и спермидина – нескольким суткам. Это возможно лишь благодаря непосредственной регуляции внутриклеточных уровней ПА основными ферментами их обмена (ОДК, ДАО и ПАО), которые, в свою очередь, также отличаются высокой метаболической подвижностью. ПА, в зависимости от активности ТГ, образуют прочные комплексы с белками (моно- и бис- производные), которые определенным образом влияют на пролиферацию, дифференциацию клеток, апоптоз и, в случае раковых клеток, имеют антиметастатическое действие. Следовательно, ПА и ТГ активность – маркеры клеточной пролиферации и дифференциации. Взаимосвязь процессов метаболизма полиаминов и биологических свойств полиаминсодержащих соединений лежит в основе прогноза их канцерогенных и антипролиферативных свойств. Выводы: 1. Производные диоксаборенинопиридина и бензимидазола снижаютскорость окислительного дезаминирования путресцина и полиаминов, проявляя тем самым канцерогенные свойства. 2. Производные анилина существенно ускоряют окислительный распад путресцина и ПА, проявляя тем самым потенциальные антипролиферативные свойства. 81 3. Производные азафлуорена на бесклеточном уровне (тест-системы из регенерирующей и опухолевой ткани) демонстрируют потенциальные онкопротекторные свойства, существенно снижая уровни и скорость синтеза путресцина и полиаминов, при этом существенно окислительного дезаминирования этих веществ. 82 повышая скорость Список использованных источников 1 Бердинских Н. К., Залеток С. П. Полиамины и опухолевый рост - Киев: Наук. думка, 1987 г. – С. 140 2 Березов Т.Т. Обмен аминокислот нормальных тканей и злокачественных опухолей. – М.: Медицина, 1969 г. – С. 224 3 Борбо Л.И., Яхимович Л.В., Черный В.А., Некрасов П.Я., Дорфман 4 В.М. Выявление биогенных аминов в опухолях с диагностической целью//Архив патологии. 1976. Т.38. -№ 9. – С. 33-38 5 Вартанян М.Е. Клинико-биологические и наследственные закономерности течения шизофрении: Автореф. докт. дис. – М., 1968 г. – С. 60 6 Гамалея Н.Б. Современные биохимические концепции патогенеза шизофрении. – М.: Медицина, 1978 г. – С. 303 7 Гельштейн В.И. Прогрессия трансплантируемых опухолей мышей // Цитология. – 1971 г. – Т. 13. – С. 3-14 8 Голомазова К.А. Антипролиферативные и антиопухолевые свойства синтетических аналогов полиаминов. Автореферат дисс. канд. биол. наук, РУДН, Москва (2006) 9 Горбунова В.А. Новая система предклинического скрининга новых противоопухолевых препаратов в США: Обзор // Вести. Всесоюз. Он-кол. Науч. Центра АМН СССР. – 1991. – № 2. – С. 45-46 10 Горкин В.З., Москвитина Т.А. Биохимические особенности течения шизофрении // Журн. Невропатологии и психиатрии. 1985 г. – Т. 87, № 7.-С. 10621064 11 Давыдовский И.В. Общая патология человека. – М., 1969 г. – С. 126-434 12 Дин Р. Процессы распада в клетке – М.: Мир, 1981 г. – С. 120 13 Закревский В.И. Определение активности орнитиндекарбоксилазы у микроорганизмов с помощью 2,4-динитро-1-фторбензола // Сборник научных работ Волгоградского медицинского института. Волгоград. 1973 г. – Т. 26. – С. 375-377 83 14 Лидак М.Ю. Нуклеозиды и рак // Целенаправленное изыскание физиологически активных веществ: Докл. VII Всесоюз. симпоз. 26-29 янв. 1987 г. – Рига: Зинатне, 1989. – С. 79-94 15 Лысенко А.В., Ускова Н.Н., Альперович Д.В. и др. // Нейрохимия–1998 г. – Т. 15, № 2. – С. 165-172 16 Москвитина Т.А., Камышанская Н.С., Смирнов А.В. и др./ Определение активности орнитиндекарбоксилазы в печени млекопитающих. Бюл. эксперим. Биол. Мед. – 1985 г. – Т. Х, № 6. – С. 147-165 17 Полищук И. А. Шизофрения – Киев: Здоров’я, 1976 г. – С. 263 18 Протопопов В. П. Избранные труды. – Киев: Здоров’я, 1961 г. – С. 560 19 Регенерация печени у млекопитающих/ Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М. – Л.: Медицина, 1966 г. – С. 23 20 Семенов С.Ф., Попова Н.Н. Нервно-психические заболевания в свете иммунопатологии мозга.– М.: Медицина, 1969 г. – С. 265 21 Сепетилев Д.М. Статистические методы в научных медицинских исследованиях. – М.: Медицина, 1968 г.- С. 419 22 Сяткин С.П. Микрометод флуорометрического определения полиаминов и путресцина тканей животных тонкослойной хроматографией на пластинках Силуфола УВ-254 // Вопр. мед. химии. – 1981 г. – Т. 27, № 6. - С. 848-851 23 Сяткин С.П. Модифицированный метод определения белка в пробах с повышенным содержанием липо- и гликопротеидов // Вопр. мед. химии. – 1981 г. – Т. 27, № 1. – С. 136-138 24 Сяткин С.П. Полиамины и лизосомы как система опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной пролиферации и опухолевого роста: Автореф. докт. дисс. – М., 1998 г. – С. 41 25 Сяткин С.П., Березов Т.Т. Окислительное дезаминирование полиаминов в гепатомах с различной скоростью роста // Вопр. мед. химии. – 1979 г. –Т. 25, № 5. – С. 611-617 84 26 Сяткин С.П., Березов Т.Т. Быстрый спектрофотометрический метод определения орнитиндекарбоксилазы с помощью 2,4-динитрофторбензола//Вопр. мед. химии. – 1980 г. Т. 26, № 4. – С. 561-564 27 Сяткин С.П., Березов Т.Т. Метаболизм полиаминов в опухолевых тканях // Вестник Академии медицинских наук СССР. – 1982 г. – Т.З. С.10-21 28 Сяткин С.П., Березов Т.Т. Обмен полиаминов в злокачественных опухолях // Вестник АМН СССР. – 1982 г. – № 3. – С. 10-21 29 Сяткин С.П., Березов Т.Т., Гридина Н.Я. и др. Полиамины как биохимические маркеры антипролиферативного действия ингибиторов ферментов биосинтеза полиаминов и путресцина в культуре L-клеток // Вопр. мед. химии. – 1991 г. – Т. 37, № 6. – С. 77-81 30 Сяткин С.П., Березов Т.Т., Фролов В.А., Голомазова К.А., Левов А.Н., Шевченко А.А., Федорончук Т.В. Прогноз канцерогенных и противоопухолевых свойств производных бензимидазола и азафлуорена // Вестник РУДН. – 2007 г. – № 6. – С. 70-73 31 Сяткин С.П., Галаев Ф.В. Окисление путнесцина, спермидина и спермина диаминоксидазой печени мышей // Биохимия.–1977 г. – Т.42. – С. 10101013 32 Хоменко А.К. Особенности систем ферментов, участвующих в обмене полиаминов при злокачественном ростею // Опухоль и организмю.–Киев, 1973 г. – С. 300-301 33 Хоменко А.К., Залеток С.Т., Суслик Д.Р. Повышение экскреции полиаминов при химическом канцерогенезе // Онкология. – Киев. – 1976 г.–№ 6. – С. 27-31 34 Хомутов P.M., Денисова Г.Ф., Хомутов А.Р., Белостоцкая К.М., Шлосман Р.Б., Артамонова Е.Ю. Аминооксипропиламин – эффективный ингибитор орнитиндекарбоксилазы in vitro и in vivo // Биоорганическая химия. – 1985 г. – Т. II. – С. 1574-1576 35 Хомутов А.Р., Хомутов P.M. Синтез аминооксианалогов путресцина и спермидина // Биоорг. химии. – 1989 г. – Т. 15, № 5. – С. 698-703 85 36 Шапот B.C. Биохимические аспекты опухолевого роста – М.: Медицина, 1975 г. – С. 304 37 Швембергер И.Н. Морфология и гистогенез опухолей, индуцированных у крыс нитрозоаминами. – Л.: Медицина, 1966 г. – С. 154 38 Швембергер И.Н. Перевиваемый штамм гепатомы крысы Г-27 // Цитология. – 1970 г. – Т. 12. – С. 1057-1059 39 Шизофрения и полиамины / Свинарев В.И., Залеток С.П., и др. – Киев, «ЕксОб», 1999 г. – С. 176 40 Экспериментальные опухоли печени / Быкорез А.И., Пинчук В.Г. – Киев: Наукова думка, 1976 г. – С. 280 41 Abraham A.J. Studies on DNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli. I. The mechanism of polyamine induced stimulation of enzyme activity // Eur. J. Biochem. – 1968. – V. 5 – P. 143-146 42 Agostinelli E., Riccio P., Mucigrosso J., Turini P., Mondovi B. Amine oxidases as biological regulators // Perspectives in polyamine research / Ed. A. Perin, G.Scalabrino, A.Sessa, M.E.Ferioli. Milano, Italy: Wichting Editore. –1988. – P. 11-14 43 Alhonen-Hongisto E., Eeinonen P., Eaine R., Janne J. Human myeloma cells acquire resistance to difluoromethylornithine without overproducing ornithine decarboxylase // Biochem. Biophys.Res.Commun. – 1987. – V. I (14). – P. 132-137 44 Anderson D. J., Crossland J., Shaw G. G. // Neuropharmacol. – 1975. – Vol. 14, № 2. – Р. 571-577 45 Anderson G., Heby O. Polyamine and nucleic acid concentration in Ehrlich ascites carcinoma cells and liver of tumor-bearing mice at various stages of tumor growth // J. Natl.Cancer Inst. – 1972. – V. 48. – P. 165-172 46 Andersson G., Osterberg S., Heby O. Accumulation of spermidine in Ehrlich ascites tumor cells during plateau phase growth. A function of an increased fraction of G 2 phase cells and polyploideels // Int. J. Biochem. – 1978. – V. 9. – P. 263-267 47 Argento-Ceru M.P., Sartori C., Autuori F. Association of diamine oxidase with microsomal membranes in rabbit liver // Life Sci. – 1974. – V. 15, № 11. – P. 1909-1915 86 48 Autelli R., Holm I., Heby O., Persson L. Feedback regulation of ornithine decarboxylase expression. Studies using a polysomal run-off system // FEBS Letters. – 1990. – V. 260. – P. 39-41 49 Aziz SM, Lipke DW, Olson JW, Gillespie MN. Role of ATP and sodium in polyamine transport in bovine pulmonary artery smooth cells.// J Cell Physiol. – 1993. – V. 155(2). – P. 399-407 50 Bachrach U. Metabolism and function of spermine and related polyammes // Ann.Rev.Microbiol. – 1970. – V.24. – P. 109-134. 51 Bachrach U. Antiviral Action of oxidized polyamines // Virus-cell interactions and viral antimetabolites // Ed. D.Shugar. New York: Acad.Press. –1972. – P. 149-162 52 Bachrach U. Function of naturally occurring polyamines. – New York: Acad. press, 1973. – P. 175 53 Bachrach U., Abzug S., Bekierkrust A. Cytotoxic effect of oxidized spermine on Erlich ascites cells // Biochim. Biophys.Acta. – 1967. – V.134. – P.174-181 54 Bachrach U., Ben-Joseph M. Studies on ornithine decarboxylase activity in normal and T2-infected Escherichia coli // FEBS Lett. – 1971. – V.15. – P.75-77 55 Bachrach U., Don S., Wiener H. Polyamines and tumor cells: effect of transformation of chick embryofibroblasts by Rons sarcoma virus on polyamine leves // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1973. – V. 55. – P. 1035-1041 56 Bachrach U., Don S., Wiener H. Polyamine in normal and in virustransformed chick embryo fibroblasts // Cancer Res. – 1974. – V. 34. – P. 15771580 57 Bachrach U., Persky S. Interaction of oxidized polyamines with DNA. V. Inhibitionof nucleic aid synthesis // Biochim. Biophys. Acta. – 1969. – V. 179. –P. 484493 58 Bardsley W.G., Childs R.E., Crabbe M. Inhibition of enzymes by emtalionchelating reagents. The action of copper-chelating reagents on diamine oxidase //J. Biochem. – 1974. – V. 137, № 1. – P. 61-66 87 59 Barros C., Giudice G. Effect of polyamines on ribosomal RNA synthesis during Sea Urchin development // Exp. Cell. Res. – 1968. – V. 50. – P. 671-674 60 Basil H.S., Feuerstein B.G., Deen D.F., Lubich W.P., Bergeron R.J., Samejima K., Marton L.J. Correlation betwen the effects of polyamine analogues on DNA conformation and cell growth // Cancer Res. – 1989. – V. 49. – P. 5591-5597 61 Basu H.S., Pellarin M., Feuerstein B.G., Deen D.F., Marton L.J. Effect of N',N14-bis(ethyl)homospermine on the growth of U87MG and SF-126 human brain tumor cells // Cancer Res. 1990. – V. 50. – P. 3137-3140 62 Basu H.S., Pellarin M., Feuerstein B.G., Shirahata A., Samejima K., Deen D.F., Marton L.J. Interaction of a polyamine analogue, l,19-bis-(ethylamino)- 5,10, 15triazanonadecane (BE-4-4-4-4), with DNA and effect on growth survival and polyamine levels in seven human brain tumor cell lines // Cancer Res. –1993. – V. 53. – P. 39483955 63 Basu H.S., Wnght W.D., Deen D.F., Roti-Roti J., Marton L.J. Treatment with a polyamine analog alters DNA-matrix association in HeLa cell nuclei. A modified halo assay // Biochemistry. – 1993. – V. 32. – P. 4073-4076 64 Beaven M.A., Shaff R.E. Study of the relationship of histaminase and diamine oxidase activities in various rat tissues and plasma by sensitive isotopic assay procedures // Biochem. Pharmacol. – 1975. – V. 24, № 9. – P.979-984 65 Becker F.F. Acute glycogenolysis: a major stimulus of autophagocytic activity in rat hepatocytes // Proc. Soc. Exper. Biol. Med. – 1972. – V. 140. - P.11701172 66 Beninati S, Folk JE. Covalent polyamine-protein conjugates: analysis and distribution // Adv Exp Biol. – 1988. – V. 250. – P. 411-422 67 Beninati S., Abbruzzese A. and Cardinali M. Differences in the posttraslatio of proteins by polyamines between weakly and higly metastatic B16 melanoma cells // Int. J. Cancer. – 1993. – V. 53. – P. 792-798 68 Beninati S, Nicolini L, Jakus J, Passeggio A and Abbruzzese A. Identification of substrate site for transglutaminase on human protein synthesis initiation factor 5 A // J. Biochem. 1995. – V. 305. – P. 325-328 88 69 Beninati S, Piacentini M, Cocuzzi ET, Autuori F, Folk JE. Covalent incorporation of polyamines as gamma-glutamyl derivatives into CHO cell protein //Biochim Biophys Acta. – 1988. – V. 952(3). – P. 325-338 70 Berdinskih N.K., Homenko A.K., Zaletok S.P. Diagnostic value of determination of polyamine excretion in patients with malignant tumours // Tenth international congress of biochemistry.: Abstracts. – 1976. – P. 599 71 Berdinskih N.K., Homenko A.K., Zaletok S.P. Study of excretion of polyamines in mammary carcinoma // Seventh international symposium on the biological characterisation of human tumours.: Abstracts. – 1977. – P. 141 72 Bergeron R.J., Hawthorine T.R., Vinson J.R.T., Beack D.E., Ingeno M.J. The role of the methylene back bone in the antiproliferative activity of po polyamine analogues // Cancer Res. – 1989. – V. 49. – P. 2959-2964 73 Bolkenius F.N., Bey P., Seiler N. Specific inhibition of polyamine oxidase in vivo is a method for the elucidation of its physiological role // Bio-chim. Et biophys. acta. – 1985. – V. 838, № 1. – P. 69-71 74 Bolkenius FN, Seiler N. Acetylderivatives as intermediates in polyamine catabolism // Int J. Biochem. – 1981. – V. 13(3). – P. 287-92 75 Boyle S.M., Cohen P.S. Putrescine-mediated degradation of ribonucleic acid in chloramphenicol-treated Escherichia coli // J. Bacteriol. – 1968. – V. 95. – P. 12661272 76 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein using the principle of protein dye building // Anal.Biochem. – 1976. – V. 72. – P. 246-254 77 Brewer E.N., Rusch H.P. Control of DNA replication: effect of spermine on DNA polymerase activity in nuclei isolated from Physarun Palycepha-lum // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1966 – V. 25. – P. 579-584 78 Briggs M.H. Vitamin and coenzyme conyeny of hepatomas induced by butter yellow // Nature. – 1960. – V. 187. – P. 249 79 Burton, R.B. Malignant melanoma in the year 2000 // CA Cancer J.Clin. – 2000. – V. 50. – P. 209-213 89 80 Buscà, R., Berlotto, C., Ortonne, J-P., and Ballotti, R. Inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway induces B16 melanoma cell differentiation //J. Biol. Chem. – 1996. – V. 271. – P. 31824-31830 81 Byers T.L., Bitonti A.J., McCann P.P. Bis(benzyl)polyamine analogues are substrates for a mammalian cell-transport system which is distinct from the polyamine transport system // J. Biochem. – 1990. – V. 269. – P. 39-40 82 Byers TL, Pegg AE. Regulation of polyamine transport in Chinese hamster ovary cells // J. Biol Chem. 2004 Jul 16. – V. 279(29). – P. 29921-29929 83 Byers TL, Wechter Sadenosylmethionine RS, Hu decarboxylase RH, Pegg inhibitor, AE. Effects of the 5'-([(Z)-4-amino-2- butenyl]methylamino)- 5'-deoxyadenosine, on cell growth and polyamine metabolism and trans134 port in Chinese hamster ovary cell cultures // J. Cell Physiol. – 1990 Jun. – V. 143(3). – P. 460-467 84 Caldarera C.M., Barbiroli В., Monizzi G. Polyamine and nucleic acid drug and development of the chick embryo // J. Biochem. – 1965 – V. 97. – P. 84-98 85 Caldarera C.M., Monizzi G. Polyamines and nucleic acid metabolism in the chick embryo //Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1970. – V. 171. – P. 709-722 86 Caldarera C.M., Monizzi G., Rossoni C., Barbiroli B. Polyamines and nucleic acid metabolism during development of chick embryo brain // J. Neurochem.– 1969. – V. 16. – P. 309-316 87 Casero R.A., Bergeron R.J., Porter C.W. Treatment with a- difluoromethylornithineplus a spermidine analog leads to spermine depletion and growthinhibition in cultured L1210 Leukemia cells // J. Cell. Physiol. – 1984. – V. 121. –P. 476-482 88 Casero R.A. Jr., Erwin S.J., Celano P., Baylm S.B., Bergeron R.J. Differential response to treatment with the bis(ethyl)polyamine analogues between human small cell lung carcinoma and undifferentiated large cell lung carcinoma in culture // Cancer Res. – 1989. – V. 46. – P. 639-643 89 Cavia E., Webb Т.Е. The polyamines and nucleic acid in growing rat hepatomas // J. Biochem. – 1972. – V. 129. – P. 223-224 90 90 Caunders N.A., Kett K.F., Minohin R.F. Uptake, efflux and metabolism of the polyamines and putrescine in rabbit lung slices // Biochim. Biophys. Acta.: Mol. Cell. Res. – 1987. – V. 927, № 2. – P. 170-176 91 Chen K.J., Presepe V., Parhen N., Lin A.J. Changes of ODC activity and polyamines content upon differentiation mouse NB-15 neuroblastoma cell // J. Cell. Physiol. – 1982. – V. 110. – P. 285-290 92 Chen Y.Q. Mechanism of cell damage by hematoporphyrin derivative (HPD) plus light. III. Effect of HPD plus light on lysosomes of liver and hepatoma cell // Chung Hua Chung Liu Tsa Chih. – 1989. – V. 11. – P. 22-24 93 Chung SI, Folk JE. Transglutaminase from hair follicle of guinea pig // Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash.) – 1972. – V. 69. – P. 303-307 94 Cohen S.S. The polyamine content of bacterial t-RNA // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1970. – V. 171. – P. 869-881 95 Cohen S.S. Introduction to the polyamines // New Jersey: Prentice Hall, Inc. – 1971. – Р. 179 96 Cohen S.S., O'Malley B.W., Stastny M. Estrogenic induction of or-nithine decarboxylase in vivo and in vitro // Science. – 1970. – V. 170. – P. 336-338 97 Cohen S.S., Raina A. Some interrelations of natural polyamines and nucleic acids in growing and virus-infected bacteria // Organizational Biosynthesis / Ed. H.J.Vogel, J.O. Eampen and V.Bryson. – New York: Acad. Press, 1967. – P. 157-184 98 Claverie N., Mamont P.S. Comparative antitumor properties in rodents of irreversible inhibitors of L-Ornithinedecarboxylase, used or as prodrugs // CancerRes. – 1989. – V. 49. – P. 4466-4471 99 Crabbe M., Childs R.E., Bardsley W.G. Time-independent inhibition of diamine oxidase by carbonyl-group reagents and urea // Eur. J. Biochem. – 1975. – V. 60, № 2. – P. 325-333 100 Cullis PM, Green RE, Merson-Davies L, Travis N. Probing the mechanism of transport and compartmentalisation of polyamines in mammalian cells // Biochem J. – 1994. – V. 303. – P. 89-96 91 101 Danzm C., Casara P., Claverie N., Metcalf B.W., Fung M.J. (2R,5R)-6heptyne-2,5-diamine and extremely potent inhibitor of mammalian ornithine decarboxylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1983. – V. 116. – P. 237-243 102 Darzynkiewier Z., Arnason B.G. Suppression of RNA synthesis in lymphocytes by inhibitors of proteolytic enzymes // Exp. Cell. Res. – 1974. – V. 85. – P. 95-104 103 Davidson N.E., Anderson N.G. Chromosome coiling: abnormaleties induced by polyamines // Exp. Cell. Res. – 1960. – V. 20. – P. 610-613 104 Davidson N.E., Mank A., Prestigiacomo L.J., Bergeron R.J., Casero R.A.Growth inhibition of hormoneresponsive and resistant human breast can cer cells in culture by N ,N -bis(ethyl)spermine // Cancer Res. – 1993. – V. 53. – P. 2071-2075 105 Davison A.N. Pyridoxal phosphate as coenzyme of diamine oxidase // J. Biochem. – 1956. – V.64. – P. 546-548 106 Dawson M., Dryden W.F. The toxicity of spermine and spermidine to cells in culture // Biochem. Pharmacol. – 1960. – V. 18. – P. 1307-1313 107 De Duve C., de Barsy Т., Pool B. e. a. Lysosomotropic agents // Biochem. Pharmacol. – 1974. – V. 23. – P. 2495-2531 108 Delcros J.-G., Sturkenboom M.C.M., Basu H.S., Feuerstein B.C., Stafer R.H., Marton L.J. Differential effects of spermine and its analogues on the structures of polynucleotides complexed with ethidium bromide // J. Biochem. – 1993. – V. 291. – Р. 269-274 109 Dion A.S., Herbst E.J. Polyamine changes during development of Drosophila Melanogaster // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1970. – V. 171. – P. 713-734 110 Don S., Bachrach U. Polyamine metabolism in normal and in virustransformed chick embryo fibroblasts // Cancer Res. – 1975. – V. 35. – P. 36183622 111 Don S., Wiener H., Bachrach U. Specific increase in polyamine levels in chick embryo cells transformed by Rous sarcoma vifus // Cancer Res. – 1975. – V. 35, № 1. – P. 194-198 92 112 Dubin D.T., Rosenthal S.M. Polyamine-glutathione conjugates in E.coli // Fed. Proc. – 1960. – V. 19. – P. 1 113 Duffy P.E., Defendini R., Kremzner L.T. Regulation of meningioma cell growth in vitro by polyamines // J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 1971. – V. 30. – P. 698713 114 Edwards M.L., Prakash N.J., Stemench D.M., Sunkara S.P., Bitonti A.J., Davis G.F., Dumont J.A., Bey P. Polyamine analogues with antitumor activity // J. Med. Chem. – 1990. – V. 33. – P. 1369-1375 115 Eichberg J., Zetusky W., Bell M.E., Cavanagn E. Effects of polyamines on calcium dependent rat brain phosphatidylinositol-phosphodiesterase // J. Neurochem. – 1981. – V. 36. – P. 1868-1871 116 Eloranta Т.О., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Hyrvonen T. Aminooxy analogs of spermidine as inhibitors of spermine synthase and substrates of hepatic polyamine acetylating activity // J. Biochem. 1990. – V.108. – P. 593-598 117 Eloranta Т.О., Maenpaa P.H., Raina A.M. Synthesis of hepatic polyamines. Ribonucleic acid and S-adenosylmethionine in normal and oestrogentncated chicks // J. Biochem. 1991. – V. 154. – P. 95-103 118 Ericsson J.L.E. Studies on induced cellular autophagy. I. Electron microscopy of cells will in vivo labelled lysosomes // Exper. Cell. Res. – 1969. – V. 55. – P. 95-106 119 Fesus L., Madi A., Balajthy Z. Transglutaminase induction by various cell death and apoptosis pathways // Experientia. – 1996. – V. 52. – P. 942-949 120 Feuerstein B.G., Williams L.D., Morton L.J. Implications and concepts of polyamine-nucleic acid interactions // J. Cell. Biochem. – 1991. – V. 46. –P. 37-47 121 Fidler I.J. Selection of successive tumor cell lines for metastasis // Nature (New Biol.) – 1973. – V. 245. – P. 148-149 122 Fidler I.J. and Cifone M.A. Properties of metastatic and nonmetastatic cloned subpopulations of an ultraviolet-light-induced murine fibrosarcoma of recent origin // Am. J. Pathol. – 1979. – V. 97. – P. 633-648 93 123 Fitzpatrick, T.D., Szabo, G., Seiji, M., and Quevedo, W.C. Biology of melanin pigmentary system. In: T.D. Fitzpatrick (ed), Dermatology in General Medicine. New York: Academy Press. – 1979. – P.131-163 124 Fitzspatrick F.A. Cyclooxygenase enzymes: regulation and function. Curr. Pharm Des. – 2004. – V. 10. – P. 577-88 125 Fogel W.A. Amine oxidases in mammalian gastrointestinal tract // Ital. J. Biochem. – 1992. – V. 41, № 1. – P. 61 A-62A 126 Fogel-Petrovic M., Shappell N.W., Bergeron R.J., Porter C.W. Polyamine and polyamine analog regulation of spermidine/spermine N1- acetyltransferase in MALME-3M human melanoma cells// J. Biol. Chem. –2002. – Vol. 277, Issue 42. – P. 39867-39872 127 Folk J.E., Park M.H., Chung S.I., Schrode J., Lester E.P., Cooper H.L. Polyamines as physiological substrates for transglutaminase // J.Biol.Chem – 1980.– V. 8. – P. 3695-3700 128 Francis G.E., Pinsky C.M. Growth and differentiation control // Cancer Chemother. Biol. Response. Modif. Annu // Amsterdam. – 1988. – P. 507-544 129 Fukuchi J., Hiipakka R.A., Kokontis J.M., Nishimura K., Igarashi K., Liao S. TATA-binding protein-associated factor 7 regulates polyamine transport activity and polyamine analog-induced apoptosis.//Biochem Pharmacol. – 1994. – V. 48(8). – P. 1611 130 Fuller O.J., Carper S.W., Clay L, Chen J.-R., Gerner E.W. Polyami-ne regulation of heat-shock-induced spermidine N -acetyltransferase activity // J. Biochem.– 1990. – V. 267. – P. 601-605 131 Gazdar A.F., Stull H.B., Kilton L.J., Bachrach U. Increased ornithine decarboxylase activity in murine sarcoma virus infected cells // Nature. – 1976. – V. 262. – P. 696-698 132 Ghoda L., Basu H.S., Porter C.W., Marton L.J., Coffino P. The role of ornithine decarboxylase suppressionand polyamine depletion in the antiproli-ferative activity of polyamine analogs // Mol. Pharmacol. – 1992. – V. 42. – P.302-306 94 133 Giorgi P.P. Polyamine and ammo acid incorporation in vitro into microsomes of rat cerebral cortex. // J. Biochem. – 1970. – P. 643-651 134 Goldstein J.The effect of spermine on the accumulation of nucleic acid and protein in mammalian cells // Exp. Cell. Res. – 1965. – V. 37. – P. 494-497 135 Grenard P, Bates MK and Aeschlimman D. Evolution of transglutaminase genes: identification of a transglutaminase gene cluster on human chromosome 15q15. Structure of gene encoding transglutaminase x and a novel gene family member, transglutaminase z // J. Biol.Chem. – 2001. – V. 276. – P. 33066-33078 136 Gumport R.I. Effects of spermidine on the RNA polymerase reaction //Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1970. – V. 171. – P. 915-938 137 Gray W.R., Hartley B.S. A fluorescent end-group reagent for proteins and peptides // J. Biochem. – 1963. – V. 89. – P. 59 138 Haddox M.K., Russell D.H. Nuclear transglutaminase activity and nuclear conjugation of polyamines exhibit parallel increases in regenerating rat liver // Eur. J. Cell. Biol. – 1980. – V. 22. – P. 12-117 139 Haddox M.K., Russell D.H. Increased nuclear conjugated polyamines and transglutaminase during liver regeneration // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Biol. Sci. – 1981. – V. 78. – P. 1712-1716 140 Halline A.G., Dudeja P.K., Brasitus T.A. 1,2-dimethylhydrasine induced alterations in N-acetylspermidine levels in rat distal colonic mucosa: effects of adifluoromethylornithme // Cancer Res. – 1989. – V. 49. – P. 633-638 141 Hansson R., Thysell H. Heparin-induced increase of diamine oxidase in lymph and blood plasma of rat, guinea-pig and rabbit // Acta Physiol. Scand. – 1971. – V. 81. – P. 208-214 142 Harada J.J., Porter C.W., Morris O.K. Induction of polyamine limitation in Chinese hamster cells by a-methylornithine // J. Cell. Physiol. – 1981. – V. 107. – P. 413-426 143 Harris J.W., Wong J.P., Kehe C.R. The role of adenosine triphos-phate, chalones and specific proteins in controlling tumor growth fraction // Cancer Res. – 1975. – V. 35. – P. 3181-3186 95 144 Heby, O. Role of polyamines in the control of cell proliferation and differentiation // Differentiation – 1981. – V.19 (1). – P. 1-20 145 Heby O., Agrell I. Observations on the affinity between polyamine and nucleic acids // Hoppe Seylers Z Physiol Chem. – 1971. – V. 352. – P. 29-38 146 Heby O., Janne J. Polyamine antimetabolites: biochemistry, specificity and biological effects of inhibitors of polyamine synthesis // Polyamine in biology and medicine / Ed. D.K. Morris, L.J. Marion, M. Dekker. New York, Basel: Acad. Press. – 1981. – P. 244-310 147 Heby O., Lewan L. Putrescine and polyamines in relation to nucleic acids in mouse liver after partial hepatectomy // Viuchows Arch. – 1971. – V. 8. –P. 58-66 148 Heby O., Marton L.J., Wilson C.B. Polyamine metabolism in a rat brain tumor cell line: its relationship to the growth rate // J. Cell. Physiol. – 1975. – V. 86. – P. 511-522 149 Heby O., Persson L. Molecular genetics of polyamine synthesis in eukaryotic cells // Trends Biochem. Sci. – 1990. – V. 172. – P. 153-158 150 Heby O., Russel D.M. Depression of polyamine synthesis in L1210 leukemic mice during treatment with apotent antileukemic agent 5-azacytidine // Cancer Res. – 1973. – V. 53. – P. 159-165 151 Heby O., Russel D.M. Effects of methylglyoxalbis(guanylhydrazone) on polyamine metabolism in spleens of mice with disseminated L1210 lymphoid leukemia // Cancer Res. – 1974. – V. 34. – P. 886-892 152 Herbst E.J., Bachrach U. Metabolism and biological functions of polyamines // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1970. – V. 171. – P. 691-1009 153 Hershko A., Amoz S., Mager J. Effect of polyamines and divalent metals on in vitro incorporation of amin acids into ribonucleoprotein particles // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1961. – V. 5. – P. 46-51 154 Hibasami H., Tsukada Т., Shirakawa S., Nanta Т., Inagaki M., Nakashima K. Dioxopiperazine derivative potentiaties antitumor effect of methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrasone) on human and mouse leukemia cells // Anticancer Res. – 1994. – V. 14. – P. 561-565 96 155 Higgins G.M., Anderson R.M. Experimantal pathology of liver: restoration of liver of white rat following partial surgical removal // Arch. Path. –1931. – V. 12. – P. 186-202 156 Hirsch J.G. The essential participation of an enzyme in the inhibition of growth of tubercle bacilli by spermine // J. Ep. Med. – 1953. – V.97. – P. 327-344 157 Hogan B.L.M. Effect of growth conditions on the ornithine decarboxylase activity of rat hepatoma cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1971. – V. 45. – P. 301-307 158 Hogan B.L.M., Murden S., Slachledge A. The effect of growth conditions on the synthesis and degradation of ornithine decarboxylase in cultured hepatoma cells // Polyamines in normal and neoplastic growth / Ed. D.H. Russell. New York: Raven Press. – 1973. – P. 239-248 159 Holm I., Persson Lo., Pegg A.E., Hebby O. Effects of S-adenosyl-l,8diamino-3-thio-octane and S-methyl-5'-methylthio adenosine on polyamine synthesis in Ehrlich ascites tumor cells // J. Biochem. – 1989. – V. 261. – P. 205-210 160 Holtta E.Oxidation of spermidine and spermine in rat liver: purification and properties of polyamine oxidase // Biochemistry. – 1977. – V. 16, № 1. – P. 91-100 161 Holtta E., Pulkkinen P., eleving K., Janne J. Oxidation of polyamines by diamine oxidase from human seminal plasma // J. Biochem. – 1975. – P. 373-378 162 Holtta E., Sinervirta R., Janne J. Synthesis and accumulation of polyamines in rat liver regenerating after treatment With carbon tetrachloride // Biochem and Biophys. Res. Communs. – 1973. – V. 54. – P. 350-357 163 Homewood C.A., Warhurst D.C., Peters W., Baggaley V.C. Lysoso-mes, pH and anti-malarial action of chloroquine // Nature. – 1975. – V. 235. – P. 50-52 164 Igarashi K., Tabeda Y. Polyamines and protein synthesis. VI. Role of spermine aminoacyl-t-RNA formation // Biochim. Biophys. Acta. – 1970. – V. 213, № 1. – P. 240-243 165 Inouye M, Pardee A.B. Reguirement of polyamines for bacterial division // J. Bacteriol. – 1970. – V. 101, № 3. – P.770-776 97 166 Israel M., Rosenfield J.S., Modest E.J. Analogs of spermine and spermidine. I. Synthesis of polymethylenepolyamines by reduction of cyanoc-thylated alphaomega-alkylene-diamines // J. Med. Chem. – 1964. – V. 7. – P. 710-716 167 Israel M., Zoll E.G., Muhammad N., Modest E.J. Synthesis and antitumor evaluation of the presumed cytotoxicmetabolites of spermine and N,N-bis(3aminopropyl)nonane-l,9-diamine // J. Med. Chem. – 1973. – V. 16. – P. l-5 168 Janne J. Studies on the biosynthetic pathway of polyamines in rat liver // Acta Physiol. Scand. – 1967. – V. 300. – P. 70-71 169 Janne J., Alhoneu-Hopgisto L., Kapyako K., Seppanen P. Experimental approaches to the systemic and topical use of polyamine antimetabolites as antiproliferative agents // Advances in polyamine research. – New York: Raven Press, 1983. – P. 17-32 170 Janne J., Poso H., Raina A. Polyamines in rapid growth and cancer // Biochim. Biophys. Acta. – 1978. – V. 473. – P. 241-293 171 Janne J., Raina A. On the stimulation of ornithine decarboxylase and RNA polymerase activity in rat liver after treatment with growth hormone // Biochim. Biophys. Acta. – 1969. – V. 174. – P. 769-772 172 Kalistratos G., Pfau A., Timmermann A. Untersuchungen uber malignolipin // Z Krabsforsch. – 1970. – V. 73. – P. 387-396 173 Kapeller-Adler R. Amine oxidases and methods for their study. –New York: Wiley-interscience. – 1970. – Р. 319 174 Kavekos M. Site specific therapy: an integrative approach to treating melanoma // Med Hypotheses. – 2005. – V. 64(6). – P. 1097-1105 175 Kee Kristin, Vujcic Slavoljub, Merali Salim, Diegelman Paula, Kisiel Nicholas, Powell C. Thomas, Kramer Debora L., Porter Carl W. Metabolic and Antiproliferative Consequences of Activated Polyamine Catabolism in LNCaP Prostate Carcinoma Cells // J. of The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. – 1997. – V. 272. – P. 18746-18751 98 176 Khan NA, Sezan A, Quemener V, Moulinoux JP. Polyamine transport regulation by calcium and calmodulin: role of Ca(2+)-ATPase // Chem Biol. – 1999. – V. 6(10). – P. 717-729 177 Khawhja J.A. Graduel release of spermine and RNA from rat-liver microsomes treated with EDTA // FEBS Lett. – 1972. – V. 21. – P. 49-52 178 Khawhja J.A., Raina A. Possible role of spermine and Mg2+ in the attachment of ribosomes to the endoplasmic reticulum membranes // 7-th Meeting FEBS: Abstracts. – 1971. – P. 153 179 Khomutov A.R., Eloranta Т.О., Persson L., Porter C.W., Dzavakhia V.G., Khonutov R.M. Chemical regulation of polyamine biosynthesis in cell cultures by polyfunctional O-substituted hydroxylamines // Enzymes dependent on pyridoxal phosphate and other carbonyl compounds as cofactors / Ed. T. Fukui, H. Kagamiyama, K. Soda, H. Wada. Osaca: Pergamon Press, 1990. – P. 567-572 180 Kimes B.W., Morris D.R. Inhibition of nucleic acid and protein synthesis in Escherichia coli by oxidized polyamines and acrolein // Biochim. Biophys. Acta. – 1971. – V. 288. – P. 235-244 181 Kramer DL, Miller JT, Bergeron RJ, Khomutov R, Khomutov A, Porter CW. Regulation of polyamine transport by polyamines and polyamine analogs // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279. – P. 27050-27058 182 Kobayashi Y. Plasma diamino oxidase titres of normal and pregnantrate // Nature. – 1964. – V.203. – P.146-147 183 Koenig H., Goldstone A.D., Lu C.Y. p-adrenergic stimulation of Ca2+fluxes, endocytosis, hexose transport and amino acid transport in mouse kidneycortex is mediated by polyamine synthesis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1983. – V. 80. – P. 7210-7215 184 Kojima Т., Tanaka Т., Kawamori Т., Нага A., Mori H. Chemopreventive effects of dietary D,L-a-difluoromethylornithine, an ornithine decarboxy-lase inhibitor, on initiation and postinitiation stage of diethylnitrosamine-indu-ced hepatocarcinogenesis // Cancer Res. – 1993. – V. 53. – P. 3903-3907 99 rat 185 Kostyo J.L. Changes in polyamine content of rat liver following hypophysectomy and treatment with growth hormons // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1966. – V. 23. – P. 150-155 186 Kramer D.E., Black J.D., Mett H., Bergeron R.J., Porter C.W. Lysosomal sequestration of polyamine analogues in Chinese hamster ovary cells resistant to the Sadenosylmethionine decarboxylase inhibitor, CGP-48664 // Cancer Res. – 1998. – V. 58, № 17. – P. 3883-3890 187 Kremzner L.T., Duffy P.E., Defendini R.F., Terrano M.J. Metabolism of polyamines in normal human and in tumors of the C.N.S. // Excerpta Med. – 1969. – V. 193. – P. 242 188 Kusunoki S, Yasumasu I. Inhibitory effect of alpha-hydrazinoornithine on egg cleavage in sea urchin eggs // Dev Biol. – 1978 Dec. – V. 67(2). – P. 336-345 189 Douarin La N. The neural crest. Cembridge: Cambridge University Press, 1982 190 Lala P.K., Patt H.M. Cytokinetic analysis to tumor growth // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1966. – V. 56. – P. 1735-1742 191 Land E.J., Ramsden C.A., Riley P.A. Quinone chemistry and melanogenesis // Methods Enzymol. – 2004. – V. 378. – P. 88-1109 192 Lee, K.W., Lee, H.J., Kag, K.S., and Lee, C.Y. Preventive effects of vitamin C on carcinogenesis // Lancet. – 2002. – V. 359. – P. 172 193 Lentini A, Abbruzzese A, Caraglia M, Marra M, Beninati S. Proteinpolyamine conjugation by transglutaminase in cancer cell differentiation: review article // Amino Acids. – 2004. – V. 26. – P. 331-337 194 Lentini A. and Beninati S. Differentiation therapy of cancer: transglutaminase as differentiative tool // Minerva Biotec. – 2002. – V.14 (2). – P. 159164 195 Libby P.R., Bergeron R.J., Porter C.W. Potent induction of spermidine/ spermine N'-acetyltransferase (SSAT) activity and its relationship to inhibition of cell growth // Cancer Res. – 1989. – V. 30. – P. 586-589 100 196 Lopez-Lazaro, M., and Akiyama, M. Flavonoids as anticancer agents: structure-activity relathionship study // Curr. Med. Chem. Anti-Canc. Agents, 2002. – V. 2. – P. 691-714 197 Lotan R. and Lotan D. Stimulation of melanogenesis in a human melanoma cell by retinoids // Cancer Res. – 1980. – V. 40. – P. 3345-3350 198 Lowry O.K., Rosebrough N.J., Fair A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 193. – P. 265-275 199 Luk G.D., Goodwin G., Marton L.J., Baylin S.B. Polyamines are needed for the survival of human small-cell lung carcinoma in culture // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. – 1981. – V. 78. – P. 2355-2358. 200 Mach M, White M.W., Neubawer M., Degen J.L., Morris D.R. Isolation of a cDNA clone encoding S-adenosylmethionine decarboxylase // J. Biol. Chem. – 1986. – V. 261. – P. 11697-11703 201 Mamont P.S., Bohlen P., Malann P.P., Bey Ph., Schuber F., Tardif Ch. Lmethyl ornithine, a potent competitive inhibition of ornithine decarboxy-lase. Blocks proliferation of rat hepatoma cells in culture // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –1976. – V. 73. – Р. 1626-1630 202 Mamont P.S., Ducherne M.-C., Grove J., Bey P. Antiproliferative properties of DL-a-difluoromethylornithine in cultured cells. A consequence of irreversible inhibition of ornithine decarboxylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1978. – V. 81. – P. 58-66 203 Mamont P.S., Siat M., Joder-Ohlenbusch A.-M., Bernhardt A., Casa-ra P. Effect of (2R, 5R)-6-heptyne-2,5-diamine, a potent inhibitor of L-ornithi-ne decarboxylase,on rat hepatoma cells cultured in vitro // Eur. J. Biochem. – 1984. – V. 142. – P. 457-463 204 Mason H.S. J.Biol. Chem. – 1948. – V. 172. – P. 83 205 Matsui J., Pegg A.E. Increase in acetylation of spermidine in rat liver extracts brought about by treatment with carbon tetrachloride // Biochem. Biophys. Res. Communs. – 1980. – V. 92. – P. 1009-1015 101 206 Matsushima M., Bryan G.T. Early induction on mouse urinary bladder ornithine decarboxylase activity by rodent vesical carcinogenes // Cancer Res. – 1980. – V. 40. – P. 1897-1901 207 Mimori K., Mori M., Shiraishi T., Tanaka S., Haraguchi M., Ueo H., Shitasaka C., Akiyoshi T. Expression of ornithine decarboxylase mRNA and cmyc mRNA in breast tumours // Int. J. Oncol. – 1998. – V. 12. – P. 597-601 208 Misawa M., Endo T. Antitumor compounds // Cell Culture and Somatic Cell Genetics Of Plants. – 1988. – V. 5. – P. 553-568 209 Miyamoto M., Teryama H., Ohnishi T. Effects of protease inhibitors on liver regeneration // Biochem. Biophys. Res. Comm. – 1973. – V. 55. – P. 84-90 210 Miyski K., Hayashi M., Chiba T., Nasu K. Effect of some polymethylenepolyamines on the growth of transplantable cancer // Chem. Pharm. Bull. –1960. – V. 8. – P. 933 211 Morioka K., Tanada K., Kezuke Y. Etal. Early changes in ornithine decarboxylase activity and polyamines during erythroid differentiation of friend leukemiaeels//Oncodevelop. Biol.Med. – 1983. – V. 4. – P. 231-237 212 Moulinoux J.-P., Quemener V., Khan N.A. Biological significance of circulatingpolyamines in oncology // Cell. Mol. Biol. – 1985 – V. 37. – P. 773-783 213 Naveen Babbar, Natalia A. Ignatenko, Robert A. Casero, Jr., and Eugene W. Gerner Cyclooxygenase-independent Induction of Apoptosis by SulindacSulfone Is Mediated by Polyamines in Colon Cancer // J. Biol. Chem. – 2003. –V. 278, Issue 48. – P. 47762-47775 214 Niiranen Kirsi, Pietilä Marko, Pirttilä Terhi J., Järvinen Aki, Halmekytö Maria, Korhonen Veli-Pekka, Keinänen Tuomo A., Alhonen Leena, Jänne Juhani Targeted Disruption of Spermidine/Spermine N1-Acetyltransferase Gene in Mouse Embryonic Stem Cells // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 277. – P. 25432-25438 215 Nishioka K. International Symposium on Polyamines in Cancer. Critical role of polyamines in cancer: basic mechanisms and clinical approaches // Cancer Res. – 1993. – V. 53. – P. 2689-2692 216 Nishioka K. Polyamines in cancer. – Houston, 1996. – P. 230 102 217 Nishioka K., Romsdahl M.M. Elevation of putrescine and spermidine in sera of patients with solid tumors // Clin. Chem. Acta. – 1974. – V. 57. – № 2. – P. 155161 218 O'Brien R.L., Olenick J.G., Hahn F.E. Reactions of quimine, ehloroquine and quinacrine with DNA and RNA polymerase reactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1966. – V. 55. – P. 1511-1517 219 Ochoa M.J., Weinstein I.B. Spermine inhibition of polypeptide synthesisin a subcellular system derived from the L1210 mouse ascites leukemia // Biochim. Biophys. Acts. – 1965. – V. 95. – P. 175-179 220 Oki T., Kawasaki H., Ogata K., Yamada H., Tomida I., Morino T., Fukami H. Biochemical studies on polyamine and its analogues. II. Mechanism of phage inactivation by enzymatically oxidized spermine // Afr. Biol. Chem. – 1969. – V. 33. – P. 994-1000 221 Olson J.W., Russell D.H. Prolonged induction of hepatic ornithine decarboxylase and its relation to cyclic adenosine 3':5'-monophosphate dependent protein kinase activation after a single administration of diethylnitrosamine // Cancer Res. – 1979. – V. 39. – P. 3074-3079 222 Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G, Schultz TM. Structural modifications in biosynthetic melanins induced by metal ions // Biochim Biophys Acta. – 1988 Feb 17. – V. 964(2). – P. 193-198 223 Pantazis, P., Chatterjee, D., Han, Z., and Wyche, J. Differentiation of human malignant malenoma cells that escape apoptosis after treatment with 9nitrocamptothecin in vitro // Neoplasia. – 1999 – P. 231-240 224 Parkin D., Bray F., Ferlay J. Global cancer statistics // CA Cancer J.Clin. – 2002. – V. 55(2). – P. 74-108 225 Pawelec G, Koch S, Griesemann H, Rehbein A, Hähnel K, Gouttefangeas C. Immunosenescence, suppression and tumour progression // Cancer Immunol Immunother. – 2006 Aug. – V. 55(8). – P. 981-986 226 Pegg A.E. The effects of diamine abd polyamines on enzymic methylationof nucleic acid // Biochim. Biophys. Acta. – 1971. – V. 232. – Р. 630-642 103 227 Pegg A.E. Recent advances in the biochemistry of polyamines in eukaryotes // J. Biochem. – 1986. – V. 234. – P. 249-262 228 Pegg A.E. Perspectives in cancer research. Polyamine metabolism and its importancein neoplastic growth and as a target for chemotherapy // Cancer Res. –1988. – V. 48. – P. 751-774 229 Pegg A.E., Coward J.K. Growth of mammalian cells in the absence of the accumumletion of spermine // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1985. – V. 113. – P. 82-89 230 Pegg A.E., Mc Cann P.P. Polyamine metabolism and function // Am. J. Physiol. – 1982. – 243, № 1. – P. 212-221 231 Pegg A.E., Williams-Ashman H.G. Biosynthesis of putrescine in the prostate gland of the rat // J. Biochem. – 1968. – V. 108. – P. 533-539 232 Petropoulos Alexandros D., Xaplanteri Maria A., Dinos George P., Wilson Daniel N., Kalpaxis Dimitrios L. Polyamines Affect Diversely the Antibiotic Potency // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 278, Issue 45. – P. 44826-44831 233 Pietilä Marko, Alhonen Leena, Halmekytö Maria, Kanter Peter, Jänne Juhani, Porter Carl W. Activation of Polyamine Catabolism Profoundly Alters Tissue Polyamine Pools and Affects Hair Growth and Female Fertility in Transgenic Mice Overexpressing Spermidine/Spermine N1-Acetyltransferase // Biol. Chem. – 1993. – V. 268. – P. 19118-19125 234 Pines J. The cell cycle kinases // Semin.Cancer Biol. – 1994. – V. 5. – P. 305-313 235 Porter CW, Bergeron RJ. Regulation of polyamine biosynthetic activity by spermidine and spermine analogs--a novel antiproliferative strategy // Adv Exp Med Biol. – 1988. – V. 250. – P. 677-690 236 Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites // Med Res Rev. – 1988. – V. 8(4). – P. 525-556 237 Prota G. Some new aspects of eumelanin chemistry // Prog Clin Biol Res. – 1988. – V. 256. – P. 101-124 104 238 Prota, G. The Chemistry of Melanins and Melanogenesis // Prog. Chem. Org. Nat. Prod. – 1995. – V. 64. – P. 93-148 239 Raina A., Janne J. Biosynthesis of putrescine: characterizationof ornithine decarboxylase from regenerating rat liver // Acta. Chem. Scand. – 1968. – V. 22. – P. 2375-2378 240 Raina A., Teloranta T. Association of polyamines and RNA in isolated subcellular particles from rat liver // Biochem. Biophys. Acta. – 1967. – V. 138. –P. 200-203 241 Ramesh M. Ray, Shirley A. McCormack, Claire Covington, Mary Jane Viar, Yi Zheng, and Leonard R. Johnson The Requirement for Polyamines for Intestinal Epithelial Cell Migration Is Mediated through Rac // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279. – P. 26518-26525 242 Räsänen Tiina-Liisa, Alhonen Leena, Sinervirta Riitta, Keinänen Tuomo, Herzig Karl-Heinz, Suppola Suvikki, Khomutov Alex R., Vepsäläinen Jouko , Jänne Juhani A Polyamine Analogue Prevents Acute Pancreatitis and Restores Early Liver Regeneration in Transgenic Rats with Activated Polyamine Catabolism// J. Biol. Chem. – 2005. – V. 235. – P. 36978-36982 243 Razin S., Rosansky R. Metabolism of antibacterial action of spermine // Arch. Biochem. And Biophys. – 1959. – V. 81. – P. 36-56 244 Russell D.H. Elevated polyamine synthesis in a mouse L1210 leukemia// Proc. Am. Cancer Res. – 1970. – V. 11. – P. 69 245 Russell D.H. Drug stimulation of putrescine and spermidine synthesis. Relationships to enhancement of ribonucleic acid synthesis // Biochem. Pharmacol. – 1971. – V. 20. – P. 3481-3491 246 Russell D.H. The rolles of the polyamines: putrescine, spermidine and spermine in normal and malignant tissue // Life Sci. – 1973. – V. 13. – P. 1635-1647 247 Russell D.H. Polyamines in growth-normal and neoplastic // Polyamines in normal and neoplastic growth. – New York: Raven Press, 1973. – P. l-13 248 Russell D.H. Clinical relevance of polyamines // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. – 1983. – V. 18. – P. 261-311 105 249 Russell D.H., Haddox M. K. Cyclic AMP-mediated induction of ornithine decarboxylase in normal and neoplastic growth // Adv. Enzyme Regul. – 1979. – V. 17. – P. 61-87 250 Russell D.H., Levy C.C. Polyamine accumulation and biosynthesis in a mouse L1210 Leukemia // Cancer Res. – 1971. – V. 31. – P. 248-261 251 Russell D.H., Levy C.C., Schimpft S.C. Urinary polyamines in cancerpatients // Cancer Res. – 1971. – V. 31. – P. 1555-1558 252 Russell D.H., McVicker T.A. Polyamine biogenesis in the rat mammary gland // Physiologist. – 1971. – V. 14. – P. 3 253 Russell D.H., Russell S.D. Relative usefulness of measuring polyamines in serum, plasma and urine as Biochemical Markers of cancer // Clin. Chem. – 1975. – V. 21, № 7. – P. 860-863 254 Russell D.H., Snyder S.H. Amine synthesis in rapidly growing rat liver, chick embryo and various tumors //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1968. – V. 60. – P. 420-427 255 Sarkar FH, Yiwei L. Using chemopreventive agents to enhance the efficacy of cancer therapy // Can. Res. – 2006. – V. 66 (7). – P. 3347-3350 256 Seiler N. Polyamine metabolism // Digestion 46 Suppl. – 1990. – V. 2. – P. 319-330 257 Seiler N. Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. Part 1. Selective enzyme inhibitors // Curr Drug Targets. – 2003. – V. 4(7). – P. 537-64 258 Seiler N. Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. Part 2. Structural analogues and derivatives // Curr Drug Targets. – 2003. – V. 4(7). – P. 565-85 259 Serafino A, Sinibaldi-Vallebona P, Lazzarino G, Tavazzi B, Rasi G, Pierimarchi P, Andreola F, Moroni G, Galvano G, Galvano F, Garaci E. Differentiation of human melanoma cells induced by cyanidin-3-O-beta-glucopyranoside // J. FASEB – 2004. – V. 18(15). – P. 1940-1942 106 260 Snyder S.H., Russell D.H. Polyamine synthesis in rapidly growing tissues // Fed. Proceedings. – 1970. – V. 29. – P. 1575-1582 261 Sonawane N. D., Francis C. Szoka, Jr., and A. S. Verkman Chloride Accumulation and Swelling in Endosomes Enhances DNA Transfer by PolyamineDNA Polyplexes // J. Biol. Chem. – 2002. – V. 277. – P. 25323-25328 262 Soulet D, Covassin L, Kaouass M, Charest-Gaudreault R, Audette M, Poulin R. Role of endocytosis in the internalization of spermidine-C(2)-BODIPY, a highly fluorescent probe of polyamine transport. // Cell Physiol. – 1993. – V. 157(3). – P. 493-501 263 Soulet Denis, Gagnon Bruno, Rivest Serge, Audette Marie, Richard Poulin A Fluorescent Probe of Polyamine Transport Accumulates into Intracellular Acidic Vesicles via a Two-step Mechanism // Biochem J. – 2002 – V. 367(Pt 2). – P. 347-357 264 Southren A.L., Calanog A.M., Mishr S., Weingold A.B. Effect ofcycloheximide on production of diamine oxidase by the human placenta // J. Appl.Physiol., 1970. – V. 29. – P. 684-686 265 Sovak, M. Grape Extract, Resveratrol, and Its Analogs: A Review // J.Med. Food. – 2001. – V. 4. – P. 93-105 266 Sturman J.A., Gaull G.E. Polyamine metabolism in the brain and liverof the developing monkey // J. Neurochem. – 1975. – V. 25. – P. 267-272 267 Syatkin S.P., Fedorontchuk T.V., Lidack M.Yu., Berezov T.T. Effect of synthetic polyamine analoge on polyamine metabolism in cell-free system of regenerating rat liver // Modern Enzymology: Problems and Trends. Ed. B.I. Kurganov, S.N.Kochetkov and V.I. Tishkov. – Nova Science Publishers, Inc. – N.Y., USA, 1994. – P. 747-751 268 Tabor C.W. The stabilizing effect of spermine and related amines on mitochondria and protoplasts // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1960. – V. 2. –P. 117-120 269 Tabor C.W., Tabor H. 1,4-diaminobutane (putrescine), spermidine and spermine // Ann. Rev. Biochem. – 1976. – V. 45. – P. 285-306 107 270 Wallace HM. Polyamine catabolism in mammalian cells: excretion and acetylation // Med.Sci.Res. – 1987. – V. 15. – P. 1437-1440 271 Wallace HM, Fraser AV. Polyamine analogues as anticancer drugs // Biochem Soc Trans. – 2003. – V. 31(2). – P. 393 272 Wang, H., Race, E.J., and Shrikhande, A.J. Characterization of anthocyanins in grape juices by ion trap liquid chromatographymass spectrometry // J. Agric. Food Chem., 2003. – V. 51. – P. 1839-1844 273 Waxman, S. Differentiation therapy in acute myelogenous leukaemia (nonAPL) // Leucemia. – 2000. – V. 14. – P. 491 274 Williams-Ashman H.G., Pegg A.E., Lockwood D.H. Mechanism and regulation of polyamine and putrescine biosynthesis in male genital glands and other tissues of mammals // Adv. Enzyme Reg. – 1969. – V. 7. – P. 291-323 275 Zarybnicky V., Horasek P. Influence of ionic strength on the staility ofphage T2rto osmotic shock // Folia Microbiol. – 1968. – V. 13. – P. 391-400 108 Приложение 1 Отчет о патентных исследования 109
