Методические указания к Большому практикуму

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М. БЕРБЕКОВА
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА DROSOPHILA MELANOGASTER
Методические указания
к практическим занятиям
по большому практикуму
Для специальности 020201 – Генетика
НАЛЬЧИК 2009
УДК
ББК
Рецензент:
Составители: Боготова З.И., Биттуева М.М., Керефова М.К.
Генетический анализ на Drosophila melanogaster: Методические
указания к практическим занятиям по большому практикуму. –
Нальчик: Каб. -Балк. ун-т, 2009. – 54 c
Методические указания к практическим занятиям по Большому
практикуму составлены с учетом программы соответствующего курса,
проводимого для студентов, специализирующихся по кафедре общей
генетики, селекции и семеноводства КБГУ.
Цель издания - ознакомление с особенностями биологии, морфологи,
генетики дрозофилы, обучение методике постановки генетических опытов и
анализа результатов скрещиваний по изучению наследования признаков,
используя линии дрозофилы коллекции кафедры общей генетики КБГУ.
Предназначено для студентов-биологов IV курса, бакалавров III курса
биологического факультета, а также учителей биологии, аспирантов и
учащихся.
Рекомендовано РИС университета
УДК
ББК
Введение
Глубокое и прочное усвоение основ генетики может быть достигнуто в
результате серьезного знакомства с генетикой дрозофилы. Этот элемент
учебной работы дает возможность не только закрепить полученные в
теоретическом курсе знания, но и приобрести первые серьезные навыки в
постановке самостоятельных опытов, являющихся своего рода введением в
научно-исследовательскую или практическую деятельность. Ряд разделов
генетики хромосомная теория наследственности, генетической теории
определения пола и половой баланс, множественный аллелизм, мутагенез и
другие разработаны на дрозофиле (плодовой, или уксусной, мухе). Дрозофила
удобный объект генетических исследований. Она легко размножается в
лабораторных условиях, имеет короткий цикл развития, исключительно
плодовита, обладает четко выраженными морфологическими признаками.
Благодаря большому числу спонтанных и индуцированных мутантных рас,
часто характеризующихся четким проявлением измененных признаков,
небольшому числу хромосом она может служить модельным объектом при
проведении ряда практических работ со студентами.
На кафедре генетики, селекции и семеноводства для постановки опытов
имеется ряд мутантных линий Dr. melanogaster, поддерживаемых в культуре.
Студенты знакомятся с биологией, морфологией, генетикой и генетической
номенклатурой дрозофилы; а также учатся готовить питательные среды.
Студенты познают на занятиях основные правила работы с дрозофилой при
постановке мух на скрещивание и анализе потомства в F1, F2, Fb. Обучаясь на
опыте, студенты должны убедиться, что генетика основывается на строгих
законах, позволяющих предвидеть те или иные явления и точно рассчитать
их количественные закономерности.
Практикум рассчитан на 10-11 занятий по 6 часов каждое. В конце
каждого занятия студенты решают задачи по теме.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №1
Тема. Биология, морфология и разведение дрозофилы.
Цель занятия: познакомить студентов с внешним строением дрозофилы,
особенностями ее разведения, длительностью различных стадий жизненного
цикла.
Материалы и оборудование: 1. пробирки с мухами дрозофилами
(Drosophila melanogaster). 2. набор для работы с дрозофилой: капельница с
эфиром, морилки (пробирки с ватными пробками), доска для работы с мухами,
голубиное маховое перо.
Дрозофила является очень удобным объектом для генетических
исследований и чисто учебных целей. Четыре наиболее важные особенности:
1) небольшой срок развития от яйца до взрослой мухи; 2) исключительно
высокая плодовитость; 3) богатство наследственных рас или мутаций; 4)
малое число хромосом.
Дрозофила впервые была использована в лабораторных опытах
Карпентером для разработки некоторых биологических вопросов в самом
начале прошлого столетия. В 1910 г. Т.Х. Морганом была обнаружена первая
мутационно возникшая наследственная раса (мутант) дрозофилы, а именно
белоглазая (white). Начиная с этого времени дрозофилу, усиленно начали
изучать
при
проведении
генетического
и
цитологического
анализов
ближайшие сотрудники Моргана (Стэртевант, Мёллер и Бриджес).
Ряд теоретических вопросов генетики искусственное получение
мутации и природа гена, определение пола и локализация половых факторов
в хромосомах, проблемы экспрессии гена, генетика популяции, механизм
расо- и видообразования и многие другие проблемы интенсивно изучаются
на дрозофиле. Эти и другие исследования имеют важное значение не только
в генетике, но и в решении вопросов общей биологии и эволюции видов.
Drosophila
melanogaster,
иначе
плодовая,
или
уксусная
муха,
принадлежит к семейству Drosophicidae из отряда Diptera. Это очень мелкая
мушка, величиной около 2 .1 мм, с ярко-красными глазами и серым телом.
Родиной Dr. melanogaster считается Индо-малайская область. В
настоящее время она почти космополит и населяет Северную и Южную
Америку, Африку, Австралию, Японию и Южную Европу (до Северной
Франции). В пределах России Dr. melanogaster обычна на Кавказе. На севере
этот вид встречается до 60° северной широты, куда он проникает в летнее
время вместе с потоком фруктов и овощей.
Питается
дрозофила
ферментируемыми
фруктами,
овощами,
древесным соком. В лабораториях мух разводят на питательной среде,
составляемой по разным рецептам.
Краткое описание: дрозофила относится к той её расе или форме,
которая обитает в природе и поэтому носит название дикой (wild type), или
нормальной (Normal).
В лабораторных условиях нормальной температурой для дрозофилы
надо считать 24-25 ºС. При температуре несколько превышающей 31 ºС она
становится бесплодной полностью или частично.
При нормальной температуре цикл развития дрозофилы от яйца до
взрослой мухи длится приблизительно 10 суток. Развитие яйца составляет 20
часов, а развитие личинки и куколки 8 суток, то есть по 4 суток
соответственно. Таким образом, имеется возможность получать
в год 40
поколений дрозофил.
С понижением температуры развитие сильно замедляется. Так, при 10
ºС личиночный период растягивается до 57 дней, а куколочный - до 13-14
дней: при 20°С сроки соответственно равны 8 и 6,3 дня.
Продолжительность жизни взрослой мухи, то есть с момента
вылупления её из куколки, в лабораторных условиях равна 3 - 4 неделям и в
значительной мере зависит от условий содержания (температуры, влажности,
пищи, плотности населения, наличия в питательной среде бактерий). В
специальных опытах дрозофилы жили до 152 дней. Жизнеспособность
мутантов в большинстве случаев понижена по сравнению с диким типом,
хотя известны мутационные расы, обладающие повышенной по сравнению с
нормальными мухами жизнеспособностью.
Самки и самцы дрозофилы несколько отличаются по величине и по ряду
других морфологических признаков.
Рис.1. Дрозофила: 1 - самка: 2 - самец.
Самки несколько крупнее самцов (рис. 1). Брюшко у самки более
округлое с заострённым концом; у самца оно боле цилиндрическое с
притуплённым концом и сильно пигментированными (чёрными) несколькими
последними тергитами. Тергитами у насекомых называют скелетные
хитиновые пластинки брюшка со спинной стороны. У самки имеется 8 хорошо
развитых тергитов, у самца - 6, причём шестой и седьмой тергиты слиты, а
восьмой вошел в состав полового аппарата. Стернитами называют такие же
хитиновые пластинки с брюшной стороны. У самки их 4, у самца - 3.
К числу вторичнополовых признаков относятся половые гребешки
самца, представляющие собой ряд крепких хитиновых щетинок на правом
членике лапки передних ног. У самки половые гребешки отсутствуют.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №2
Тема. Питательная среда и ее приготовление. Правила работы с
дрозофилой, подготовка и постановка опытов.
Цель занятия: познакомить студентов с различными по составу
питательными средами; приготовление студентами питательной среды для
постановки скрещиваний
Материалы и оборудование: 1. ингредиенты для приготовления
питательной среды. 2. оборудование для приготовления питательной среды
(кастрюля, стакан, весы, разновесы).
Главными составными частями среды, на которой разводят дрозофилу
в лабораториях, является сахар и дрожжи. Сахар вносят в среду в виде
сахарозы, изюма, патоки или сусла. Он является тем субстратом, на котором
развиваются дрожжи, которые, в свою очередь, служат основной пищей
дрозофилы. Кроме того, дрожжи предохраняют среду от поражения плесенью.
В качестве составного компонента в питательную среду входит также
агар-агар, который придаёт среде желеобразную консистенцию.
На дрожжевой среде мухи развиваются значительно быстрее, очень
крупные, с прекрасным проявлением всех признаков. Однако, благодаря
обилию мух и наличию в среде неблагоприятно действующих на дрозофилу
бактерий и грибов, развившиеся на такой среде, мухи живут сравнительно
недолго. Поэтому дрожжевую среду рекомендуют применять во всех случаях,
за исключением поддержания основных линий.
Приготовленная питательная среда не может сохраняться дольше 3-4
дней, особенно когда она уже разлита в стаканчики, пробирки или
флакончики, так как начинает развиваться плесень.
Для предупреждения развития в культурах плесени добавляют
пропионовую кислоту или 10% спиртовой раствор нипагина (этилбензойная
кислота).
Готовую среду можно хранить в холодильнике, где она может
оставаться месяц и больше. При отсутствии прессованных дрожжей для
варки среды можно пользоваться сухими дрожжами, произведя перерасчет на
прессованные – пекарские дрожжи, содержащие 75% воды.
Рецепты наиболее распространенных питательных сред (в г)
1. Вода - 100 мл
Бананы - 100
Агар-агар - 2
2. Вода - 100 мл
Изюм - 50
Агар-агар - 2
3. Вода - 2000мл
Патока - 200
Кукурузная мука - 150
Агар-агар - 15
4. Вода - 350мл
Агар-агар - 4,5
Дрожжи - 40
Манная крупа - 15
Сахароза - 13
5. Вода - 700 мл
Агар-агар - 9
Дрожжи пекарские - 75
Сахарный песок - 25
Манная крупа - 25
Рецепт №3 рекомендуется для поддержания основных линий
дрозофилы с интервалом между пересадками до 2 месяцев. На кафедре для
приготовления питательной среды используют рецепт №5.
Приготовление питательной среды.
Ниже приводится способ приготовления питательной среды, по
рецепту №5 на 100 пробирок.
1. Растворяют 9 г агар-агара в 700 мл холодной воды и доводят до
кипения.
2. Добавляют 75 г прессованных дрожжей (или 9 г сухих дрожжей) в
кипящий агар-агар и варят на медленном огне 40 мин.
3. Добавляют 25 г манной крупы и 25 г сахарного песка и варят
помешивая еще 15 минут.
4.
Для предохранения приготовленного корма в дальнейшем от
заплесневения необходимо добавить 1 мл пропионовой кислоты в корм,
остудив его предварительно до 60° и разлить в пробирки примерно на 1 - 1,5
см их высоты. Пробирки закрывают пробкой из натуральной чистой ваты.
Разливать среду следует так, чтобы она не попадала на стенки
пробирки, тонкий слой её скоро подсыхает, и отложенные на нём яйца
погибают. Во избежание этого рекомендуется разливать среду при помощи
воронки, укреплённой на штативе. На горлышко воронки разливают мягкую
резиновую трубку с моровским зажимом.
Через 30-40 минут среда застывает в виде довольно плотного желе.
После этого её поверхность засевают дрожжами, добавляют 1-2 капли
дрожжевого молочка (2-3г обычных дрожжей разводят в 50 мл воды), и среда
готова к потреблению.
Правила работы с дрозофилой. Все манипуляции с мухами выполняют
под наркозом. В качестве наркотизирующего вещества употребляют серный
эфир рrо narcosi. Наркоз мух проводят морилкой (эфиризатором), который
представляет собой пробирку с корковой пробкой. Внутри помещается
ватный тампончик, смоченный эфиром. Осторожным встряхиванием или
постукиванием пальцами о стенки пробирки следует перегнать мух подальше
от пробки, затем быстро открыть её (можно накрыть марлей или сеткой) и
столь же быстро приставить к отверстию морилки. Как только мухи
перестанут двигаться, их нужно тотчас вытряхнуть на чистый лист бумаги.
От большей дозы наркоза мухи погибают через 3-5 мин. Характерный
признак погибших от эфира мух растопыренные кверху и в сторону крылья и
безжизненно вытянутые лапки.
Знакомство с морфологическими особенностями мух удобнее всего
производить под слабым увеличением бинокуляра, лупы с увеличением х 4,
располагая мух на молочно-белом стекле. Мух можно передвигать при
помощи препаровальной иглы тонкой кисточки или перышка. Брать
усыпленных мух можно глазным пинцетом за крылышки или ножки (если
особи бескрылые).
Если во время просмотра мухи начинают просыпаться от наркоза, их
следует накрыть часовым стеклом или половинкой чашки Петри, под которые
положен кусочек ваты, смоченный эфиром (1-2 капли).
Подготовка мух и постановка опытов. Для скрещивания необходимо
брать заведомо девственных самок не старше 10-12 часов после вылупления.
Для этой цели из тех культур, из которых надлежит взять девственных самок,
за несколько часов до начала массового вылета мух, следует удалить
родительских мух. После этого культуру просматривают через 8-10 часовые
интервалы. Вылупляющихся девственных самок изолируют от самцов и
используют для соответствующих скрещиваний.
В каждый флакончик с емкостью 20 мл с 5-6 мл питательной среды
следует сажать 2-3 самки и 2-3 самцов. Превышение указанной нормы может
привести к перенаселению в культуре (crowding effect), что влечет за собой
значительное измельчение мух и сокращение продолжительности их жизни.
Первые 1,5-2 сутки после вылупления самка дрозофилы не откладывает
яиц. В среднем одна самка откладывает 200-300 яиц. Кладка яиц лучше всего
происходит на среду, на которой достаточно хорошо проросли дрожжи. Этот
оптимум откладки яиц лежит между 24-36 часов, после того как питательная
среда была засеяна дрожжами. По мере старения культуры и усиления
брожения питательной среды интенсивность откладки яиц падает. Работы с
дрозофилой должны фиксироваться в дневнике или книге протоколов опытов
(табл. 1).
Таблица 1
Примерная форма дневника практической работы
Дата
10.x
Порядковый номер
культуры
15
22.x
24
22.x
25
Краткое описание скрещиваний
Результат
Normal ♀♀ ×♂♂ b (из
основных культур)
♀♀ из №15×♂♂ b (из
основных культур)
♀♀ ×♂♂ из №15 и т. д.
150 мух Normal
(♀♀ и ♂♂)
89 Normal и 76 black
195 Normal и 57 black
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№3
Тема. Сравнительная характеристика мутантов
Цель занятия: знакомство студентов с основными учебными линиями
дрозофил, имеющихся для работы на кафедре.
Материалы и оборудование: 1. пробирки с линиями мух дрозофил
(Drosophila melanogaster). 2. набор для работы с дрозофилой.
К числу органов дрозофилы, чаще подвергающихся мутационным
изменениям, относятся глаза, крылья и щетинки.
Глаза нормальной мухи устроены по обычному типу сложных
фасеточных глаз насекомых. Сложный глаз состоит из многих простых
глазков-фасеток или омматидий (рис. 2). Число их у самок 780, у самцов
около740. Мутации, затрагивающие различные особенности глаз весьма
разнообразны. Наиболее многочисленны те, которые изменяют свойственную
диким мухам пигментацию глаза, усиливая её до цвета бордо или сепии или
ослабляя до бесцветного, белого. Между ними имеются всевозможные
переходы, такие как: эозиновый, вишнёвый, абрикосовый, розовый,
коралловый, карминовый, багряный, винно-красный и др.
Большое число мутаций затрагивают форму глаза, строение и
расположение фасеток. У нормальной мухи фасетки расположены наподобие
ячеек пчелиных сот (рис. 2,1). У мутантов нарушена правильность
расположения фасеток.
Рис 2 . Форма и расположение глазных фасеток и волосков. 1 – нормальная муха, 2
– мутант Star (звёздчатые глаза)
Рис. 3. Форма и размеры глаз. 1- нормальная самка; 2 - гомозиготная
самка Bar; 3- самец Ваr; 4 -гетерозиготная самка Ваr.
Мутационные изменения, приводящие к частичной или полной
редукции
глазных
фасеток,
вследствие
представляется ровной и гладкой. Это
чего,
поверхность
глаза
такие как: мутации Ваг
(полосковидные глаза), Lobe - лопастные, eyeless - безглазый и др. У
мутантной самки Ваг число фасеток в глазе не превышает 70, у Lobe или
eyeless и вовсе могут отсутствовать (рис.3). В связи с этим общие размеры
головы мух резко уменьшены по сравнению с головой нормальной мухи.
Мутационные изменения, затрагивающие крыло, условно можно
разделить на 3 группы (рис.4 -9).
I группа. Мутанты, модифицирующие общую конфигурацию крыла.
Рис.4. Мутант curled (загнутые крылья) Вид спереди и сбоку.
Рис. 5. Мутант Delta (дельтообразные Рис. 6 . Мутант Notch (вырезки на
расширения
продольных
жилок дистальном конце крыла, III и IV
утолщения на дистальном конце крыла)
продольных жилок)
Рис.7. Аллельные мутанты серии cut. Отличаются по степени
зазубренности крыльев
Рис.8. Аллельные мутанты серии Vestigial. 1 - vestigial (зачаточные
крылья); 2 - antlered (оленерогий); 3 - strap (полосковидные крылья).
Рис.9. Мутант apterous (бескрылый)
В отличие от крыла нормальной мухи, являющегося плоским, прямым,
у различных мутантов оно может быть изогнуто в виде арки (мутант arc),
лыжи (ski), закручено кверху (Curly, curled), книзу (curved) или своим
положением во время полета напоминать крыло самолета, по сходству с
которым один из таких мутантов получил свое название (aeroplane) и т.д.
II группа. Мутанты, вызывающие изменения в жилковании крыла. Эти
изменения выражаются в частичном или полном исчезновении одной или
нескольких жилок (например, crossveinless), в развитии одной или
нескольких добавочных жилок (например, plexus, Delta).
III группа. Многочисленный класс мутантов, уменьшающих крыло в
той или иной степени: cut, dumpy - вырезанный, small wing - маленькие
крылья, rudimentary - зачаточные крылья, apterous - бескрылый (рис.7-9).
Генетическая номенклатура Dr. melanogaster.
У дрозофилы отмечено около тысячи генных мутаций, имеющих
морфологическое, физиологическое, биохимическое, летальное проявление;
множество хромосомных мутаций; получены все жизнеспособные типы
анеуплоидов, а также триплоидные самки. Возникла необходимость создания
специальной генетической номенклатуры, определённого генетического
«языка», обозначений и символов. Первой сводкой по генетической
номенклатуре был справочник К.Б. Бриджеса и К. Бреме, опубликованный в
1914 году. Второй справочник, в котором учтён прогресс генетики
дрозофилы, опубликован Д.Л. Линдсли и Е. Греллом в 1968г. На основе
данных этого справочника М.Д. Голубовским был проведён анализ
организации генома и фенотипического проявления мутации у дрозофилы.
По
степени
изученности,
чёткости
проявления
и
лёгкости
классификации мутанты дрозофилы Бриджесом выделены на 5 категорий
(обозначены арабскими цифрами 1-5 в конце характеристики каждого
мутанта).
1. Мутанты, наиболее изученные и интенсивно используемые, с чёткой
классификацией, хорошей жизнеспособностью и точной локализацией.
2. Мутанты,
аналогичные
мутантам
первой
категории,
но
используемые менее интенсивно. Локализованы недостаточно точно.
3. Немногочисленные мутанты с чётким проявлением признаков, но
локализованы недостаточно точно.
4. Мутанты
менее
удобные,
но
интенсивно
используемые
в
специальных исследованиях. Локализованы не вполне точно.
5. Мутанты,
обнаруживающие
трансгрессию
с
диким
типом.
Локализация недостаточно точная.
Буква
А
при
категории
обозначает
ненормальный
перекрест,
обязанный данной абберации.
Генные мутации
Фенотип и генотип дикого типа считаются нормальными. Наследуемые
отклонения от этого стандарта называются мутациями. Каждой мутации
даётся название, отражающее основные, самые яркие мутантные признаки.
Название мутации - обычно короткое и простое прилагательное (например,
black) или существительное (например, Ваг), чаше английское или латинское.
Для удобства каждой мутации соответствует свой символ это
сокращение названия, однозначно определяющее данную мутацию. Он
всегда начинается с той же буквы, что и название мутации, пишется всегда
курсивом и никогда не содержит греческих букв, подстрочных подписей и
промежутков между буквами. Название и символ рецессивной мутации
пишутся со строчной буквы, например black, b и dumpy, dp. Если мутант
признак распознаётся в гетерозиготе, то мутация "классифицируется как
доминантная, и её название и символ пишутся с заглавной буквы, например
Ваг, В и Notch, N.
Аллели одного локуса имеют одно и то же название и символ и
отличаются друг от друга соответствующими индексами (дата открытия;
инициалы
исследователя,
сокращение
названия
мутации,
которое
использовалось до того, как был установлен аллелизм, номер эксперимента, в
котором была обнаружена мутация).
Мутации разных локусов, имеющие одинаковое фенотипическое
проявление, могут иметь каждая своё название; например, мутации vermilion,
cinnabar, scarlet, karmosin, cardinal обуславливают ярко-красный цвет глаз.
Мутации
летали,
со
сходным
фенотипическим
проявлением
обозначаются как 1, например 1 (1)7 деталь №7 в первой хромосоме; 1(3)с
деталь в третьей хромосоме, возникшая в линии ebony.
Мутации, подавляющие проявление другой мутации, обозначаются su
или Su (supressor), а усиливающие е или Е (enchancer), далее в скобках
указывают символ мутации, действие которой модифицируется, например su
(w") или К (S).
Нормальные аллели обозначаются либо знаком +, либо с индексом
плюс:b +. Знаком «–» обозначают отсутствие какого-либо локуса, например bb.
Данные о локализации мутации приводятся в таком виде: номер
хромосомы, затем через чёрточку место в хромосоме. Например, для white,
локализованной на 1,5 единиц карты в I хромосоме, написано I, 1,5. У
дрозофилы первая группа сцепления соответствует X хромосоме, вторая и
третья двум большим аутосомам и четвёртая маленькой аутосоме. Номера
хромосом пишутся арабскими или римскими цифрами (в ранних работах
номера хромосом обозначались римскими цифрами).
Мутации на генетической карте локализуются с точностью до десятых
долей. Так, локализация 3,0 единиц карты является более точной, чем 3
единицы карты. При неточной локализации пользуются знаком ±.
При описании линий, имеющих несколько мутаций в одной хромосоме,
символы мутация записывают в порядке их расположения на генетической
карте и разделяют промежутками, например у w f В. Символы мутаций,
находящихся в гомологичных хромосомах, разделяют наклонной линией,
например, у w f/B, Cy/Pm.
При описании линий, содержащих мутации в негомологичных хромосомах,
символы - мутаций, принадлежащих к негомологичным хромосомам, разделяют
точкой с запятой и промежутком. Например, у we sn; b sp.
Список мутантных линий Drosophila melanogaster, используемых на
практических занятиях большого практикума на кафедре общей генетике,
селекции и семеноводства КБГУ.
Д-32. Дикий тип.
Canton S, K-c. Дикий тип
Bar, B, I, 57,0. Полосковидные глаза. Гомозиготы жизнеспособны.
Дупликация (1).
black, b, II, 48,5. Чёрный. Тело, ножки, жилки очень тёмные (1).
brown, bw, II, 104,5. Коричневоглазый. Цвет глаз от коричневого до
гранатового (1).
cinnabar, сn, II, 57,5. Киноварноглазый. Цвет глаз яркий, шарлаховый,
глазки бесцветные (1).
cut, ct, I, 20,0. Обрезанный край крыла (1).
dumpy, dp, II, 13,0. Короткокрылый. На груди воронкообразные
углубления (1).
ebony, e, III, 70,7. Чёрный цвет тела (1).
scarlet, III, 44,0. Шарлаховый, багряно-красный цвет глаз, глазки
бесцветные. (1).
vestigial, vg, II, 67,0. Зачаточнокрылый. Крылья и жужжальца зачаточные
(1).
white, w. I, 1,5. Белоглазый. Глаза белые, глазки, мальпигиевые сосуды
и семенники бесцветные (1).
yellow, у. I, 00. Жёлтый цвет тела; ротовой аппарат личинки
коричневый (1).
vermilion, v, I, 33,0. Киноварный цвет глаз, глазки бесцветны (1).
white apricot, w a, I, 1,5. Абрикосовые глаза. Аллеломорф white.
cut vermilion, ctv, I, 20,0-33,0. Обрезанный край крыла, киноварные
глаза.
white cut, wct, I, 1,5-20,0. Белоглазый, обрезанный край крыла.
scarlet spineless, stss, III, 44,0-58,5. Шарлаховый, багряно-красный цвет
глаз, бeсщетинковый.
meller-5 (w aB), m-5, I, 1,5-57,0. Полосковидные абрикосовые глаза.
black
cinnabar
vestigial,
bcnvg,
II,
48,5-57,5-67,0.
Черный,
киноварноглазый, зачаточнокрылый.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №4
Тема. Моногибридное скрещивание у дрозофилы
Цель занятия: освоение методики постановки опытов по скрещиванию
дрозофил; закрепление знаний по основным закономерностям наследования
при моногибридном скрещивании.
Материалы и оборудование: 1. пробирки или стаканчики со средой по
2 на каждого студента для получения F1 и по 4-6 для получения F2. 2.
соответствующие мутанты и мухи дикого типа. 3. набор для работы с
дрозофилой.
Задание. 1. Отобрать виргинных самок. 2. Поставить скрещивание в
соответствии с разработанным заданием. 3. Получить F1 и проанализировать его.
4. Поставить на скрещивание мух F1. 5. Получить F2 и проанализировать его.
Пояснения к заданию. Отбор виргинных самок. Для постановки опытов
по скрещиванию необходимо в качестве материнских форм брать заведомо
девственных (виргинных) самок не старше 10 - 12 ч после вылупления. С
этой целью в пробирках, где идет размножение соответствующих линий мух,
удаляют родительские особи и вылупившихся из куколок мух. Через 6 - 8 ч
пробирки или стаканчики просматривают, и если появились молодые мухи, их
усыпляют, отделяют самцов от самок, помещают в отдельные пробирки с
питательной средой. Там они могут находиться в течение 2 - 4 суток. По мере
надобности их используют для скрещивания.
Эту работу удобно организовать следующим образом. За 4 - 8 ч до
начала занятий из пробирки удаляют всех мух. Пробирку с куколками ставят
в термостат с температурой 24-26°С на 4 - 8 ч. Мух, вылупившихся из
куколок за этот период, используют для скрещивания.
Желательно в каждом случае ставить реципрокные (прямые и
обратные) скрещивания. Гибриды F1, как и обычные линии, размножаются
внутри себя без отбора виргинных самок, поэтому после анализа гибридов F1,
самцов и самок помещают в пробирки со свежей средой для получения F2. На
протяжении всего опыта, а он от момента постановки скрещивания и до
получения F2 продолжается 20 - 24 дня, следует внимательно следить за
состоянием мух и обеспечить все условия для их нормального развития.
При проведении моногибридного скрещивания учащиеся должны
ознакомиться с первым и вторым законами Менделя, усвоить понятия о
генотипе, фенотипе, доминантных и рецессивных признаках, о реципрокных,
возвратных и анализирующих скрещиваниях. Для постановки опыта в
качестве одной из родительских форм следует взять линию дикого типа
(Normal), а в качестве второй родительской формы можно взять одного из
мутантов, vestigial, cinnabar, ebony, brown, black, curved и др.
Весьма удобно провести следующие прямые и обратные (реципрокные)
скрещивания,
позволяющие
изучить
наследование
доминантных
и
рецессивных признаков:
Canton S (Д-32) x black – black x Canton S (Д-32)
Canton S (Д-32) x brown – brown x Canton S (Д-32)
Canton S (Д-32) x ebony – ebony x Canton S (Д-32)
Canton S (Д-32) x vestigial – vestigial x Canton S (Д-32)
Выполнение задания. 1. Вначале следует составить схему и определить
теоретически ожидаемое наследование признаков в F1 и F2 (табл.2).
2. В соответствии с подобранной комбинацией скрещивания 2 – 3
виргинные самки поместить вместе с 3 - 5 самцами в пробирку со свежей
средой.
3. Через 10 - 12 дней после постановки опыта, когда в пробирке будет
массовое вылупление мух F1, их следует усыпить и проанализировать. Все они
как в прямом, так и в обратном скрещивании будут одинаковыми по признаку
од того из родителей.
4. В каждой комбинации для получения F2 следует провести
скрещивание внутри себя. С этой целью среди анализируемых мух отобрать
2 - 3 самки и 3 - 5 самцов и поместить в пробирки со свежей средой. В
каждой комбинации для получения F2. поставить по 2 - 3 и более пробирки.
Таблица 2
Схема моногибридного скрещивания
black х Canton S (Д-32)
Гаметы F1
♂
b
+
b/b
b/+
b/+
+/+
+
vg
+/+
+/vg
+/vg
vg/vg
♀
b
+
vestigial x Canton S (Д-32)
Гаметы F1
♂
♀
+
vg
5. Через 10 - 12 дней в пробирках начнется массовое вылупление мух
F2. Их следует усыпить в эфиризаторе и проанализировать на матово-белом
стекле. При внимательном просмотре отделить и подсчитать мух с чёрным
телом (black). В соответствии со схемой опыта (табл. 2) их будет примерно
1/4 от общего числа. Затем отделить и подсчитать мух с нормальным цветом
тела. Их будет примерно 3/4 от общего числа. Результаты подсчета занести в
таблицу (табл.3).
6. Одновременно можно провести опыт по возвратному скрещиванию.
Для этого в F1 брать виргинные самки и поместить их по одной в пробирки
вместе с самцами одной из родительских форм (доминантной или
рецессивной).
Таблица 3
Результаты гибридологического анализа при моногибридном и
возвратном скрещивании дрозофил black x Canton S (Д-32)
Проанализировано
Линия
Расщепление
особей
или
в В том числе
гибрид
сего
black
Теоретичес фактически
Canton S ки
(Д-32)
полученное
ожидаемое
♀ Canton S (Д-32)
♂ black
F1 Canton S (Д-32) x black
F2
Беккроссы F1 x black
F1 x Canton S (Д-32)
7. При постановке этого опыта предварительно разработать его
схему (по типу табл. 2).
8. Через 10 - 12 дней в пробирках начнется массовое вылупление мух.
Их поместить в эфиризатор, усыпить и проанализировать по признаку цвета
тела.
Анализ
мух
от
возвратною
скрещивания
F1
с
доминантной
родительской формой показывает, что все они имеют нормальный цвет тела.
В скрещивании F1, с рецессивной родительской формой (анализирующее
скрещивание) 1/2 часть мух имеет чёрный цвет тела, а 1/2 нормальный. Такой
результат скрещивания свидетельствует о том, что мухи F1 гетерозиготны.
Таким
же
образом
могут
быть
проведены
скрещивания
и
проанализированы гибриды Canton S (Д-32) с любым мутантом, у которого
соответствующий ген локализован во II, III или IV хромосомах.
Статистическая обработка полученных результатов
Полученное в опыте в F2 и F|b, соотношение серых и черных мух
отличается от теоретически ожидаемого 3:1 или 1 : 1 . Решение вопроса о
том, случайно ли это различие или расщепление не соответствует
теоретически ожидаемому, возможно только с помощью статистических
методов. Очень прост и удобен метод χ2 (хи-квадрат), Применение этого
метода сводится к расчету величины χ2 и ее оценке. Расчет осуществляется по
формуле:
X - ∑d2/q , где ∑- знак суммы, q - теоретически ожидаемое число особей
с определенным признаком; d - отклонение фактически полученных данных
от теоретически ожидаемых для каждого класса (р - q).
В процессе расчетов сначала составляют таблицу 4 по классам
расщепления на основании опытных числовых данных (р). Затем из суммы
частот всех классов, составляющей объем выборки, вычисляют теоретически
ожидаемые величины (q) для каждого класса соответственно предполагаемой
формуле расщепления (3:1, 1:1 и т.п.). Далее определяют отклонение (d)
полученных данных от теоретически ожидаемых для каждого класса.
Каждое отклонение d возводят в квадрат (d2), делят его на теоретически
ожидаемое число (q) для данного класса: d2/q. Затем все частные суммируют
и получают величину χ2 согласно приведенной формуле.
Оценка величины χ2 производится по таблице Фишера (табл. 5). В
таблице обозначены вероятности (Р). Что они означают?
При рассмотрении формулы χ2 видно, что при полном соответствии
опытных и теоретических данных χ2 равен нулю. Если χ2 не равен нулю, то
всегда при
применении
этого
метода
предполагают,
что
различия
сравниваемых величин случайны (эта гипотеза называется нулевой).
Вероятность, указанная в таблице, и есть не что иное, как вероятность этой
нулевой гипотезы. Вероятность 0,05 говорит о том, что если сравниваемые
величины отличаются случайно, то значение χ2, указанное в таблице, может
появиться только в 5 выборках из 100 подобных. В статистике же принято
считать, что события, имеющие вероятность 0,05 и меньше, практически не
встречаются. Значит, указанное в таблице значение χ2 в колонке 0,05 говорит
о том, что различия между сравниваемыми величинами нельзя считать
случайными, т. е. нулевую гипотезу необходимо отвергнуть. Вероятность
0,01 говорит о том же, только появление значения χ2, указанного в таблице,
возможно лишь один раз на 100, если различия случайны, т. е. еще более
редко. Вот почему при значении χ2 равном или большем, чем указано в таблице,
нулевая гипотеза отвергается, т.е. считают различия сравниваемых величин не
случайными, а закономерными. В остальных случаях (когда χ2 меньше
табличного) принимают нулевую гипотезу, т. с. считают различия
случайными. И, наконец, что значит число степеней свободы, которое
определяет строку в таблице? Число степеней свободы это число независимо
рассчитанных теоретически ожидаемых величин. В рассматриваемом
примере рассчитаны две теоретически ожидаемые величины (число серых и
черных мух). Однако если рассчитать число серых мух, то число черных
можно определить уже автоматически, оно зависит от суммы и числа серых
мух. Следовательно, число независимо рассчитанных величин здесь равно
единице. Это и есть степень свободы. В общем виде число степеней свободы
при анализе расщепления всегда равно числу различных классов особей
минус 1.
Критерий χ2 дает надежные результаты, если объем выборки более 50, а
теоретически ожидаемые частоты в классах не менее 5.
Таблица 4
Результаты количественного анализа наследования окраски тела у
дрозофилы (моногибридное скрещивание).
Серых
Материнская линия……................................................................... 0
Отцовская линия………………….................................................... Все
F1
Все
F2
Фактическое расщепление–данные, полученные студентом (р) 78
Ожидаемое отношение …………………………............................. 3
Теоретически ожидаемое расщепление (q)..……………... 72
Отклонение (d)……………………………………………... + 6
d2…………………........................................ 36
2
2
χ =∑d /q= 0,50 + 1,50 = 2,00:
n'=1; P>0,05
F2
Фактическое расщепление - суммарные данные, полученные
всеми студентами группы (р)……………………………………… 1199
Ожидаемое отношение…………………………………….. 3
Теоретически ожидаемое расщепление (q)………………. 1188
Отклонение (d)……………………………………………...
d2 ……………………………………………..
χ2=∑d2/q = 0,10 + 0,31 = 0,41;
n'=1; P»0,05
Fb
Данные, полученные студентом…………..………………………
Фактическое расщепление - суммарные данные, полученные
всеми студентами группы (р)………………………………………
Ожидаемое отношение …………………………………………….
Теоретически ожидаемое расщепление (q)……………………….
Отклонение (d) ……………………………………………..
d2 …………………………………………......
χ2=∑d2/q = 0,16 + 0,16 = 0,32;
n=1; Р » 0,05
Число мух
Черных Всего
Все
0
0
18
1
24
-6
36
96
4
96
385
1
396
1584
4
1584
+11
121
-11
121
66
58
124
504
1
495
+9
81
486
1
495
-9
81
990
2
990
Проведите статистическую обработку результатов расщепления F2, но
собственным
данным
(самостоятельно)
и
по
суммарным
данным,
полученным всеми студентами группы, исходя из ожидаемого отношения
3:1, докажите, что полученное расщепление соответствует теоретически
ожидаемому отношению. В рассматриваемом примере 1 степень свободы и
χ2=2,00 и 0,41, что меньше, чем указанные в первой строке значения χ2=3,84 и
6,63 (табл. 5). Это значит, что различия между полученными в опыте и
теоретически
ожидаемыми
величинами
случайны.
Убедитесь,
что
расщепление соответствует ожидаемому 3:1 тем точнее, чем большее
количество мух проанализировано. Суммарные данные, полученные всеми
студентами группы, дают лучшее совпадение с ожидаемым отношением
(Р»0,05), чем данные одного студента (Р>0,05).
Аналогичным
образом
проведите
статистическую
обработку
расщепления в Fb по суммарным данным, полученным всеми студентами
группы. Докажите, что оно соответствует ожидаемому отношению 1:1.
Таблица 5
Таблица значений χ2 при разных степенях свободы
Число
степеней
свободы
(df)
1
2
3
4
5
Вероятность (Р)
0,99 0,95 0,90 0,75 0,50 0,25 0,10 0,05
0,025
0,01
0,02 0,10
0,02 0,10 0,21 0,58
0,11 0,35 0,58 1,21
0,30 0,71 1,06 1,92
0,55 1,15 1,61 2.67
5,02
7,38
9,35
11,14
12,83
6,63
9,21
11,34
13,28
15,09
0,45
1,39
2,37
3,36
4,35
1,32 2,71 3,84
2,77 4,61 5,99
4,11 6,25 7,81
5,39 7,78 9,49
6,63 9,24 11,07
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №5
Тема. Дигибридное скрещивание у дрозофилы
Цель занятия: постановка скрещиваний; закрепление знаний по
основным закономерностям наследования при дигибридном скрещивании.
Материалы и оборудование 1. пробирки со свежеприготовленной
средой. 2. мутанты ebony и vestigial, cinnabar, black, scarlet, brown. 3. набор
для работы с дрозофилой.
Задание. 1. Подобрать мутанты для скрещивания. 2. Отобрать
виргинные самки. 3. Произвести скрещивание. 4. Проанализировать гибриды
F|1. 5. Поставить на скрещивание гибриды F1, для получения F2. 6.
Проанализировать F2.
Пояснение
к
заданию.
Непременное
условие
свободной
перекомбинации генов в F2 при дигибридном скрещивании локализация их в
разных хромосомах. Для этого скрещивания, например, удобно взять
рецессивный мутант с зачаточными крыльями vestigial (ген vg локализован во
II хромосоме). Окраска тела у этого мутанта серая (Canton S (Д-32)). Вторым
компонентом скрещивания можно взять мутант с темной окраской тела и
нормальными крыльями - ebony. Ген е, определяющий темную окраску тела,
локализован в III паре хромосом. Кроме того, можно для дигибридных
скрещиваний рекомендовать и другие комбинации:
ebony х vestigial
brown x ebony
cinnabar x ebony
scarlet х vestigial
black x scarlet
Схему скрещивания мутантов записывают следующим образом:
Выполнение задания. 1. Составить схему по типу табл. 2 и определить
теоретически ожидаемое расщепление. 2. Отобрать 2 - 3 виргинные самки
ebony и поместить в пробирку со свежей средой с 3 - 5 самцами vestigial. 3.
Через 10 - 12 суток после постановки скрещивания, когда в пробирке
начнется
массовое
вылупление
мух
F1,
их
следует
усыпить
и
проанализировать. Все они как при прямом, так и при обратном скрещивании
будут иметь нормальную серую окраску тела и нормально развитые крылья.
Результаты подсчета следует записать в таблицу (табл. 6). 4. В каждой
комбинации F1, следует отобрать по 2 - 3 женские особи и по 5 6 мужских и
поместить их в чистые пробирки с питательной средой для получения F2.
Желательно для получения F2 в каждой комбинации поставить по 3 - 5
пробирок на каждого студента. 5. Через 10 - 12 дней в пробирках начнется
массовое вылупление мух F2. Их следует усыпить в эфиризаторе и
анализировать на матово-белом стекле. При внимательном просмотре
отделить и подсчитать мух с нормальными крыльями и серым телом, затем
мух с нормальными крыльями и чёрным телом, с недоразвитыми крыльями и
серым телом и с недоразвитыми крыльями и чёрным телом. Результаты
занести в таблицу (табл. 6).
Анализ F1 по фенотипу показывает, что все мухи имеют серое тело и
нормальные крылья. Следовательно, признаки черной окраски тела и
недоразвитых крыльев рецессивны. По генотипу они гетерозиготны (рис. 10).
В F2 наблюдается расщепление, которое соответствует теоретически
ожидаемому: 9/16 Canton S (Д-32), 3/16 ebony, 3/16 vestigial и 1/16 ebony;
vestigial.
Таблица 6
Результаты гибридологического анализа при дигибридном
скрещивании ebony х vestigial
всего
Линии и гибриды
Получено мух
В том числе
Canton S
ebony
vesti ebony;
(Д-32)
gial
vestigial
Расщепление
теоретич фактиче
ески
ски
ожидаем получен
ое
ное
♀ebony
♂vestigial
F1 ebony x vestigial
F2 ebony x vestigial
Пример статистической обработки при дигибридном скрещивании
показан в таблице 7.
♀
×
♂
F1
♀
F2
×
♂
Рис. 10. Дигибридное скрещивание ♀ebony x ♂vestigial
Таблица 7
Пример статистической обработки при дигибридном скрещивании
Норм.
крылья
Зачат.
крылья
Всего
Отклонение (d)
d2
χ2=∑d2/q=169/954+49/318+25/318+1/100=0,418
n'=3; P»0,05
Зачат.
крылья
Фактическое расщепление - суммарные данные,
полученные всеми студентами группы р)………
Ожидаемое отношение…………………………...
Теоретически ожидаемое расщепление (q)…….
Черное тело
Норм.
крылья
Серое тело
F2
941
9
954
325
3
318
323
3
318
107
1
106
1696
16
1696
-13
169
+7
49
+5
25
+1
1
Вывод: так как значение χ2 фактически меньше табличного (7,81), то
фактическое расщепление соответствует ожидаемому отношению 9:3:3:1.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №6
Тема. Взаимодействие неаллельных генов
Цель занятия: постановка скрещиваний на взаимодействие генов.
Материалы и оборудование: 1. Пробирки со свежеприготовленной
средой. 2. Мутанты ebony, black. 3.набор для работы с дрозофилой.
Задание. 1. Подобрать мутанты дрозофилы для скрещивания. 2.
Составить схему скрещивания и определить теоретически ожидаемое
расщепление в F2. 3. Отобрать виргииные самки и провести скрещивание. 4.
Проанализировать
F1,
и
подобрать
пары
для
получения
F2.
5.
Проанализировать F2.
Пояснение к заданию. У дрозофилы в наследовании ряда признаков
довольно четко проявляется комплементарный тип взаимодействия генов,
когда
одновременно
наличие
двух
неаллельных
генов
в
генотипе
обусловливает развитие нового признака.
Для изучения этого явления удобнее всего взять для скрещивания 2
мутантов с черной окраской тела. Черная окраска тела у дрозофилы может
быть обусловлена различными генами: либо геном ebony, локализованным в
III хромосоме, либо геном black, локализованным во II хромосоме. Каждый из
этих
генов
рецессивен
по
отношению
к
гену
Canton
S
(Д-32),,
обусловливающему серую окраску тела. При скрещивании мутантов ebony x
black, имеющих черную окраску тела, все особи F1 имеют серую окраску тела,
что может быть обусловлено только одновременным присутствием двух этих
генов; в F2; наблюдается расщепление в отношении 9/16 серых, 7/16 - черных.
Для
изучения
взаимодействия
генов
могут
быть
проведены
скрещивания также между мутантами brown x scarlet.
Мутант brown имеет коричневую окраску глаз, scarlet - ярко-красную.
В результате скрещивания brown x scarlet в F1, все мухи будут иметь окраску
глаз, свойственную дикому типу, а в F2 будет 4 фенотипа мух: красноглазые
(Canton S (Д-32)), типа brown, типа scarlet и белоглазые (white).
Выполнение задания. 1.
Подобрать мутантные линии. 2. Составить
схему расщепления и определить теоретически ожидаемое расщепление. 3. В
соответствии с подобранной комбинацией подобрать 2 – 3 виргинные
самки ebony и поместить в стаканчик со свежей средой с 3 - 5 самцами black.
4. Через 10 - 12 суток после постановки скрещивания, когда в стаканчике
будет наблюдаться массовое вылупление мух F1, их следует усыпить и
проанализировать. Все они как в прямом, так и в обратном скрещивании
будут иметь нормальную серую окраску тела. Результаты скрещивания
следует записать в табл. 5. В каждой комбинации F1, следует отобрать по 2 3 женские особи и 5 - 6 мужских и поместить в чистые пробирки со свежей
питательной средой для получения F2. 5. Через 10 - 12 дней в пробирках
начнется массовое вылупление мух F2. Их усыпить в эфиризаторе и
проанализировать на матово-белом стекле. При внимательном просмотре
отделить и подсчитать мух с серой и отдельно с черной окраской тела.
Результаты занести в табл. 8.
Таблица 8
Результаты гибридологического анализа F2 от скрещивания
ebony x black
Линия или
гибриды
всего
Проанализировано
особей
В том числе
серых чёрных
Расщепление
теоретически
ожидаемое
фактически
полученное
♀ebony
♂ black
F1 ebony x black
F2 ebony x black
В F2 в соответствии со схемой расщепления теоретически ожидаемого
должно быть: 9Normal: 3 ebony: 3 black: 1 ebony-black. Фенотипически все
особи ebony, black, ebony-black, имеющие черную окраску тела, неотличимы,
поэтому по фенотипу расщепление будет 9/16 серых: 7/16 черных.
Пример количественного анализа наследования окраски глаз у
дрозофилы (комплементарность) приводится в таблице 9, окраски тела – в
таблице 10.
Таблица 9
Пример количественного анализа наследования окраски глаз у дрозофилы
с красными
глазами
с коричневыми
глазами
всего
с красными
глазами
с коричневыми
глазами
с ярко-красными
глазами
с белыми глазами
всего
F1
все
0
Данные,
64
20
полученные
студентом
Факт.
174
74
расщепление –
данные,
полученные
всеми студентами
группы (p)
Ожидаемое
3
1
отношение
Теоретически
186
62
ожидаемое
расщепление (q)
Отклонение (d)
-12
+12
2
d
144
144
χ2=∑d2/q = 0,77+2,32=3,09;
n=1; Р » 0,05
Скрещивание
второе
третье
♀Красные
♀Коричневые глаза ×♂Яркоглаза×♂Коричневые красные глаза
глаза
Число мух F1 и F2
всего
с ярко-красными
глазами
с красными
глазами
первое
♀Красные глаза ×
♂Ярко-красные
84
все
+42
0
18
60
все
62
0
24
0
21
0
5
112
248
148
36
184
199
70
51
16
336
4
3
1
4
9
3
3
1
16
248
138
46
184
189
63
63
21
336
+10
-10
100
100
χ2=∑d2/q=0,72+2,17=2
,89; n=1; Р » 0,05
+10
+7
-12
-5
100
49
144
25
χ2=∑d2/q=0,53+0,78+2,29+1,19=4,7
9; n=1; Р » 0,05
Таблица 10
Пример количественного анализа наследования окраски тела у дрозофилы в F2
Окраска тела в F2
Фактическое расщепление - суммарные данные,
полученные всеми студентами группы (р)…………..
Ожидаемое отношение………..………………………
Теоретически ожидаемое расщепление (q)………….
Отклонение (d)
d2
χ2=∑d2/q=169/270+169/210=1,42
серая
черная
283
9
270
197
7
210
13
169
-13
169
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №7
Тема. Наследование пола и признаков, сцепленных с полом
Цель занятия: постановка скрещиваний; закрепление знаний по
основным закономерностям наследования признаков, сцепленных с полом:
различия реципрокных скрещиваний в F1 и F2, крисс-кросс.
Материалы и оборудование: 1. Пробирки со свежеприготовленной
средой. 2. Мухи Canton S (Д-32), мутантные линии white или yellow.
Задание. 1. Познакомиться с половыми хромосомами и определением
пола у дрозофилы. 2. Провести скрещивание ♀ Canton S (Д-32) x ♂white, ♀
white x ♂ Canton S (Д-32). 3. Составить схему теоретически ожидаемого
расщепления. 4. Проанализировать F1 и поставить их на скрещивание для
получения F2. 5. Получить мух F2 и проанализировать их.
Объяснение к заданию. Самки дрозофилы гомогаметны: они содержат 2
одинаковые хромосомы, составляющие первую пару и называемые Ххромосомами. Самцы гетерогаметны, они содержат 2 хорошо различимых по
строению хромосом (рис. 11). Одна из них идентична женской половой
хромосоме (Х-хромосома), а другая Y-хромосома.Y - хромосома доминантна
в определении пола. Наследование пола у дрозофилы осуществляется по
следующей схеме:
РР ♀ XX
Яйца
♂XY
х
X
F1
♀♀ XX
Сперматозоиды
X,Y
Зиготы
♂♂XY
Гомогаметные по половым хромосомам самки образуют только один
тип гамет Х, а гетерогаметные самцы образуют 2 типа гамет X и Y. В
результате оплодотворения образуются самки с генотипом XX и самцы с
генотипом XY. Такой механизм наследования пола обеспечивает наличие в
популяции одинакового числа женских и мужских особей.
Y-хромосома генетически инертна. В X-хромосоме локализован ряд
генов - white, yellow, Bar и другие, которые, следовательно, наследуются
сцеплено с полом. Учитывая, что у самцов Y - хромосома генов не содержит,
всякий
ген,
локализованный
в
Х-хромосоме,
независимо
от
того,
доминантный он или рецессивный, проявляется так, как будто он находится в
гомозиготном
состоянии.
Подобное
состояние
генов
называется
гемизиготным. Например, все самцы, у которых в X-хромосоме локализован
рецессивный ген white, будут белоглазыми.
Для
изучения
наследования
признаков,
сцепленных
с
полом,
рекомендуется взять мух с генотипом Canton S (Д-32) и скрещивать либо с
рецессивным мутантом white или yellow, либо с доминантным мутантом Bar
и др.
Рис. 11. Наследование сцепленного с полом гена white
Ниже приводится схема наследования пола и сцепленного с полом
признака, как при прямых, так и при обратных скрещиваниях (табл. 6).
Из этой схемы следует, что в F1, и в F2 как при прямом, так и при
обратном скрещивании отношение мужских и женских особей будет
одинаково - 1:1. Наследование окраски глаз зависит от генотипов
материнской и отцовской особей. При прямом скрещивании, когда
материнская особь Canton S (Д-32), а отцовская white, все мухи F1 имеют
красные глаза, присущие материнским особям. В F2 no окраске глаз
наблюдается расщепление 3:1. Причем, все самки имеют красные глаза, а у
самцов 50% особей красноглазых и 50% - белоглазых.
При обратном скрещивании белоглазых самок с красноглазыми
самцами в F1 все самки имеют красные глаза, а самцы белые (рис. 11). В F2 по
окраске глаз наблюдается расщепление 1:1. Причем, как у самок, так и у
самцов 50% особей имеет красные, 50% - белые глаза.
Выполнение задания. Задание выполняется в том же порядке, что и при
обычном моногибридном скрещивании. Только при анализе F1, и F2 сначала
отделяют самцов от самок, а затем подсчитывают число белоглазых и
красноглазых особей в каждой группе. Результаты анализа записывают в
таблицу (табл.11).
Таблица 11
Результаты гибридологического анализа при наследовании пола и
признаков, сцепленных с полом
Линии и гибриды
Проанализировано мух
всего
Расщепление
по окраске глаз
В том числе
Теорети
Факти
чески
чески
♀сам ♂сам Canton S white
ожида
полу
ок
цов
(Д-32)
емое
ченное
Прямое скрещивание
♀ Canton S (Д-32)
♂ white
F1 Canton S (Д-32) х white:
самки
самцы
F2 Canton S (Д-32) х white:
самки
самцы
Обратное скрещивание
♀ white
♂ Canton S (Д-32)
F1 white х Canton S (Д-32):
самки
самцы
F2 white х Canton S (Д-32):
самки
самцы
Анализ мух первого и второго поколений показывает, что фактически
полученные результаты полностью соответствуют теоретически ожидаемым.
Таблица 12
Пример количественного анализа наследования окраски глаз у
дрозофилы (наследование признаков сцепленных с полом)
самцов
всего
самок
самцов
самок
самцов
всего
Отклонение (d)
d2
самок
F2
Данные, полученные студентом
Фактическое расщепление данные, полученные всеми
студентами группы (р)…………
Ожидаемое отношение …..……
Теоретически ожидаемое
расщепление (q)………………..
самцов
F1
Данные, полученные студентом
Фактическое расщепление данные, полученные всеми
студентами группы (р)..……......
Ожидаемое отношение …..……
Теоретически ожидаемое
расщепление (q)………………...
Отклонение (d)
d2
самок
Прямое скрещивание Обратное скрещивание ♀
♀ красноглазая ×
белоглазая× ♂ красноглазый
♂белоглазый
Число мух в F1 и F2
красно
белоглазых
красно
белоглазых
глазых
глазых
48
44
0
0
92
55
0
0
47
102
256
1
226
1
0
0
0
0
482
2
215
1
0
0
0
0
183
1
398
2
241 241
0
0
482
+15 -15
225 225
χ2=∑d2/q = 0,93 + 0,93 = 1,86
n=1; Р » 0,05
199
+16
256
0
0
56
28
31
28
29
24
112
312
2
163
1
302
+10
100
104
199 398
-16
256
1,29+1,29=2,58
n=1; Р » 0,05
0
20
0
129 604
1
4
130
1
151
1
160
1
127
1
568
4
151
151 604
142
142
142
142
568
+12
144
-22
484
-12
144
+9
81
+18
324
-15
225
χ2=∑d2/q=0,33+0,95+3,21=4,49
n=2; Р » 0,05
1,05+0,57+2,28+1,58=5,54
n=3; Р » 0,05
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №8.
Сцепленное наследование и кроссинговер
Цель занятия: постановка скрещивания на сцепленное наследование.
Материалы и оборудование: пробирки со свежеприготовленной
средой. 2. Мухи Canton S (Д-32) и black-cinnabar-vestigial. 3. набор для
работы с дрозофилой.
Задание. 1. Провести скрещивание Canton S (Д-32) x black-cinnabarvestigial. 2. Отобрать виргинных самок гибридов первого поколения,
проанализировать их и скрестить с рецессивным родителем black-cinnabarvestigial. 3. Составить схему скрещивания и определить теоретически
ожидаемое расщепление. 4. Проанализировать мух Fb и определить
соответствие
теоретически
ожидаемого
расщепления
фактически
полученному.
Пояснение к заданию. Т. Морган сформулировал закон сцепления,
согласно которому гены, локализованные в одной хромосоме, наследуются
совместно, так как в мейозе они обязательно попадают в одну гамету. Число
групп сцепления соответствует гаплоидному числу хромосом данного вида.
У дрозофилы изучено более 500 генов. Все они локализованы в 4 парах
хромосом.
Сцепленное наследование генов, находящихся в одной хромосоме
нарушается вследствие конъюгации гомологичных хромосом и обмена
участками
между
ними
(кроссинговера)
в
мейозе с
последующим
соединением их в местах разрыва. В результате кроссинговера происходит
перегруппировка исходных комбинаций признаков. Так, у мух гены,
определяющие черную окраску тела (black), киноварную окраску глаз
(cinnabar)и недоразвитые крылья (vestigial), находятся во II хромосоме и
наследуются совместно. Но среди гибридных особей могут появиться мухи с
черным телом и нормальными крыльями и мухи с серым телом и
недоразвитыми крыльями (рис.12), что свидетельствует о наличии перекреста
хромосом.
Рис. 12. Неполное сцепление признаков как результат перекреста
хромосом.
Гаметы, зиготы и взрослые особи, возникшие в результате перекреста
хромосом,
называются
кроссоверными
или
кроссоверами.
Число
кроссоверных особей свидетельствует о величине расстояния между данными
генами в хромосоме: чем больше кроссоверных особей, тем дальше гены
расположены в хромосоме один от другого.
Наличие перекреста между генами принято обозначать вертикальной
линией. Например, кроссинговер между генами b и vg обозначают как b/vg
Величину перекреста вычисляют в процентах к общему числу
потомков в данной комбинации. Мерой расстояния между генами является
отрезок хромосомы, в пределах которого наблюдается 1 % кроссинговера.
Это расстояние называют единицей перекреста, или морганидой.
Т. Морган предположил, что гены расположены в хромосомах линейно,
а частота кроссинговера отражает относительное расстояние между ними.
Чем дальше находятся гены друг от друга, тем чаще между ними происходит
кроссинговер. Гены, находящиеся в одной хромосоме и наследующиеся
сцеплено, образуют группу сцепления, число которых должно быть равно
гаплоидному набору хромосом. В схеме относительного расположения генов
в группе сцепления, или генетической карте, каждый ген занимает
определенное место – локус. Группы сцепления обычно нумеруются. На рис.
13 приведена генетическая карта Drosophila melanogaster.
Рис. 13. Генетические карты (группы сцепления) дрозофилы.
Выполнение задания. Для изучения кроссинговера в половой хромосоме
(I группа сцепления), можно взять виргинную самку с белыми глазами
(white), с вырезанным краем крыла (cut), и глазами киноварного цвета
(vermilion) и скрещивать ее с нормальным самцом (Canton S (Д-32)). В этом
скрещивании не нужно отбирать девственных самок из F1.
Для изучения кроссинговера во II хромосоме можно взять комбинацию
у ♀ Canton S (Д-32) x ♂ black-cinnabar-vestigial. Мухи одной линии имеют
красную окраску глаз (cn+), серое тело (b+), нормальные крылья (vg+), у мух
другой линии – киноварные глаза (cn), темное тело (b), зачаточные крылья
(vg). Проанализировать гибриды F1; все мухи должны иметь красные глаза,
серое тело и нормальные крылья в силу доминирования соответствующих
аллелей. Далее скрещивать тригетерозиготную виргинную самку из F1 с
рецессивным по всем трем генам самцом, т.е. провести анализирующее
скрещивание. Тригетерозиготная самка образует 8 сортов гамет, что и
определяет 8 генотипических и фенотипических классов в Fb. В Fb
появляются мухи, имеющие сочетания генов, подобные исходным линиям
(cn+b+vg+ и cnbvg), а также и все возможные комбинации между ними - всего
таких новых комбинаций 6 (таб. 14).
Провести анализ гибридов от анализирующего скрещивания. Для этого
разбить мух на 8 фенотипических классов в соответствии с теоретически
ожидаемым (таб. 13). Для легкости сначала развит мух на 2 класса – с
красными и киноварными глазами, затем каждый класс на два – с серым и
темным телом, далее каждый из четырех классов на два – с нормальными и
зачаточными крыльями. Полученные данные записать в таблицу 14.
Необходимо обратить внимание, что чаще всего встречаются два
класса мух с родительскими сочетаниями признаков: красные глаза, серое
тело, нормальные крылья и киноварные глаза, черное тело, зачаточные
крылья.
Следует также помнить, что не у всех студентов будет наблюдаться
появление восьми ожидаемых классов; их может быть семь или даже шесть.
Таблица 13
Наследование окраски глаз, окраски тела и формы крыльев у
дрозофилы (тригибридное скрещивание)
Таблицу 14.
Пример анализа мух разных фенотипических классов в тригибридном
скрещивании дрозофилы при сцепленном наследовании.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №9
Тема. Генетический анализ кроссинговера. Построение генетической карты
Цель занятия: научить студентов проводить анализ сцепления генов,
определять расстояние между генами, строить участка генетической карты для
этих генов.
Материалы
и
оборудование:
результаты
количественного
учета
расщепления в анализирующем скрещивании, проведенном на предыдущем
занятии (табл. 14).
Задание: доказательство сцепления трех генов, определение процента
кроссинговера между ними. Построение участка генетической карты для этих трех
генов.
Объяснение
к
заданию:
прежде
чем
приступить
к
анализу
кроссинговера в тригибридном скрещивании, с которым знакомились на
занятии № 8, нужно проверить, сцеплены ли между собой все анализируемые
гены, для чего проводится проверка на свободное и независимое наследование
каждых двух пар признаков (теоретически ожидаемое отношение 1:1:1:1).
Например, в анализируемом скрещивании проверяются следующие пары
признаков:
Окраска глаз – Окраска тела. Окраска глаз - Форма крыльев. Окраска
тела - Форма крыльев
При анализе первых двух пар признаков следует учесть, что у исходных
линий они комбинировались следующим образом: красная окраска глаз и
серая окраска тела, киноварная окраска глаз и черная окраска тела.
Поэтому в Fb в случае сцепленного наследования должны преобладать
именно эти сочетания признаков, а недоставать должно рекомбинантов:
красные глаза и черное тело, киноварные глаза и серое тело. Аналогично
ведется и анализ следующих двух пар признаков: окраски глаз и формы
крыльев. В Fb в случае сцепления этих признаков должны преобладать (по
сравнению с теоретически ожидаемым отношением 1: 1: 1: 1) родительские
комбинации: красные глаза и нормальные крылья, киноварные глаза и
зачаточные крылья, а должно не хватать рекомбинантов - мух, имеющих
красные глаза и зачаточные крылья, а также киноварные глаза и нормальные
крылья. И, наконец, для последних двух пар признаков (окраска тела - форма
крыльев) в случае их сцепленного наследования в Fb должны преобладать
родительские комбинации: серое тело и нормальные крылья, черное тело и
зачаточные крылья, рекомбинанты же - мухи с серым телом и зачаточными
крыльями, а также с черным телом и нормальными крыльями должны
встречаться реже ожидаемого.
Только после того как получено доказательство сцепления всех трех пар
признаков, можно переходить к одновременному анализу их наследования.
В том случае, если известно, что гены сцеплены, написание формулы
генотипа принято видоизменять. Например, генотип дигетерозиготы с
несцепленными генами пишется АаВb, со сцепленными - ABab.
Следует помнить, что для анализирующего скрещивания можно брать
только самок Fb, так как у самцов дрозофилы кроссинговер не идет. Поскольку
кроссинговер происходит реципрокно, т. е. между отцовской и материнской
хромосомами, и у гибридной самки F1 происходит взаимный обмен участками
гомологичных хромосом, расположим гаметы, образуемые этой самкой, парами.
Каждая такая пара комплементарных гамет образовалась или при отсутствии
кроссинговера (первая пара классов), или в результате процесса кроссинговера в
том или ином участке гомологичных хромосом (вторая - четвертая пары
классов). Гаметы, которые имеют хромосомы, не претерпевшие кроссинговера,
- некроссоверные, а те, которые образовались в результате кроссинговера кроссоверные.
Соответственно организмы, возникшие от объединения в процессе
оплодотворения кроссоверных гамет гибрида с гаметами линии анализатора,
называют кроссоверными (кроссоверами) или рекомбинантами (на рис. 15 это
вторая - четвертая пары классов). Организмы, образовавшиеся от сочетания
некроссоверных гамет гибрида с гаметами анализатора, называют некроссоверными или нерекомбинантньми (на рис. 14 - первая пара классов).
Поскольку, как уже говорилось, рекомбинация происходит реципрокно,
необходимо рассматривать комплементарные пары классов как результат одного
события.
Расположив гаметы самки F, и гибриды Fb так, как это сделано на рисунке,
и выразив частоту встречаемости комплементарных классов мух в процентах,
можно приступить к определению расстояния между генами. Определим
расстояние между генами сп - b. Так как у исходных форм были сцеплены аллели
сп+b+ и сп b, то о наличии кроссинговера между этими генами будет говорить
появление мух сп+ b (красные глаза, черное тело) и сп b+ (киноварные глаза,
серое тело). Это вторая и четвертая пары классов. Следовательно, кроссинговер
между генами сп и b составляет 0,2+8,2=8,4%.
Аналогично определяем расстояние между генами b и vg. Поскольку у
исходных линий сочетания аллелей были следующие: b+vg+ и bvg, о наличии
кроссинговера между ними будет свидетельствовать появление мух b+vg (серое
тело, зачаточные крылья) и b vg+ (черное тело, нормальные крылья). Это мухи
третьей и четвертой пар классов. Тогда расстояние между генами b и vg составит
11,4+8,2=19,6%.
Найдем расстояние между генами сп и vg. У исходных линий сочетались
аллели cn+vg+ и сп vg. Значит, в результате кроссинговера между этими генами
появятся мухи cn+vg (красные глаза, зачаточные крылья) и сп vg+ (киноварные
глаза, нормальные крылья). Такие мухи соответствуют второй и третьей парам
классов. Отсюда расстояние между генами сп и vg составляет 0,2+11,4=11,6%.
Теперь, зная расстояние между генами каждой из трех пар, можно
построить участок генетической карты для генов сп, b, vg.
Далее всех расположены гены b и vg -19,6%. Очевидно, между ними
должен быть помещен ген, который находится от гена b на расстоянии 8,4% и от
гена vg - 11,6%, Тогда участок карты будет выглядеть следующим образом:
Из карты следует, что в схеме скрещивания порядок генов не
соответствовал тому, который установлен в результате анализа.
Если гены расположены линейно в установленном порядке, то сумма
расстояний между генами b -сп и сп -vg должна быть равна расстоянию между
крайними генами b -vg. Однако сумма двух отрезков составляет
8,4+11,6=20%, а расстояние между крайними генами равно 19,6%, т. е. на 0,4%
меньше суммы. В чем причина этого расхождения? В наших подсчетах не учтен
двойной кроссинговер.
На рис. 15 представлены все возможные случаи рекомбинации. Четвертый
случай и представляет собой двойной кроссинговер, в результате которого
крайние гены b+vg+ и bvg остаются на своих местах, сцепление между ними не
нарушается, а расположенные посередине аллели сп+ и сп меняются местами.
Следствием двойного кроссинговера должно быть появление мух b+сп vg+
(серое тело, киноварные глаза, нормальные крылья) и b cn+ vg (черное тело,
красные глаза, зачаточные крылья). Такие мухи в нашем скрещивании появились
(вторая пара классов), однако, не зная истинного порядка генов, невозможно
было рассматривать эти классы как кроссоверные в отношении генов b и vg.
Следовательно,
для
учета
двойного
кроссинговера
необходимо
иметь
дополнительный маркер, т. е. ген, находящийся между двумя изучаемыми
генами. В нашем примере это ген сп.
Итак, к расстоянию между генами b–vg, составляющему 19,6%, нужно
добавить частоту двойного кроссинговера. Но так как каждый двойной
кроссинговер происходит благодаря двум одинарным разрывам в двух участках
хромосомы, а не одному разрыву в одном участке, как в случае одинарного
кроссинговера, то частоту двойного кроссинговера следует удвоить. Тогда
расстояние
между
генами
b-vg
составит
19,6+0,2x2=20%,
что
точно
соответствует сумме расстояний между генами b-сп и сп-vg. Теперь участок
карты для трех изученных генов можно представить следующим образом:
Рис. 14 Наследование трех сцепленных признаков при анализирующем
скрещивании у дрозофилы. Обозначения генов: 1) окраски глаз сп+ – красная,
сп – киноварная, 2) окраски тела: b+ – серая, b – черная; 3) крылья vg+ –
нормальные, vg – зачаточные. В Fb показаны только самцы. Самки имеют те
же генотипы и фенотипы.
Рис. 15. Рекомбинация сцепленных генов b cn и vg у дрозофилы
1 – некроссоверные хромосомы; 2 – одинарный кроссинговер между
генами b–cn; 3 – cn – vg; 4 – двойной кроссинговер между генами b – cn и cn – vg.
Сравним полученные цифры с локусами этих трех генов, которые
расположены во второй группе сцепления. Локус гена b - 48,5; сп -57,5; vg -67,0.
Следовательно, кроссинговер между генами b -сп должен в среднем составлять
9% (у нас получилось 8,4%); между генами сп -vg должно быть около 9 -10% (в
нашем скрещивании 11,6%); и, наконец, расстояние между генами b-vg
составляет 18,5 (у нас -20%).
Таким образом, результаты нашего опыта хорошо совпали с теоретически
ожидаемыми. Незначительные расхождения можно объяснить различными
случайными
причинами:
избирательной
гибелью
мух
некоторых
фенотипических классов, запоздалым вылуплением - других и т. п.
Выполнение работы: Анализ наследования каждых двух пар признаков.
Эту часть работы студенты выполняют тремя подгруппами, используя
результаты количественного учета расщепления, проведенного на предыдущем
занятии (табл. 14).
Студенты первой подгруппы анализируют наследование следующих двух
пар признаков: окраска глаз и окраска тела. Для этого необходимо подсчитать
число мух (по данным всех студентов группы) с родительскими сочетаниями
признаков (красные глаза и серое тело, киноварные глаза и черное тело) и
рекомбинантов (красные глаза и черное тело, киноварные глаза и серое тело).
Обратите внимание на преобладание мух родительских комбинаций.
Впишите результаты в таблицу (табл. 15) и проведите статистическую
обработку данных методом χ2, исходя из ожидаемого отношения 1:1:1:1. Далее
нужно
доказать
достоверное
преобладание
родительских
классов
над
рекомбинантами, т. е. установить сцепленное наследование окраски глаз и окраски
тела.
Вписать в таблицу результаты, полученные студентами второй и
третьей подгрупп, и убедиться в сцепленном наследовании окраски глаз и
формы крыльев, а также окраски тела и формы крыльев.
Студенты второй подгруппы анализируют наследование окраски глаз и
формы крыльев. Для этого нужно подсчитать число мух (по данным всех
студентов группы) с родительскими сочетаниями признаков (красные глаза,
нормальные крылья и киноварные глаза, зачаточные крылья) и рекомбинантов
(красные глаза, зачаточные крылья и киноварные глаза, нормальные крылья).
Обратите внимание на преобладание мух с родительскими комбинациями
признаков и впишите результаты в таблицу.
Проведите статистическую обработку данных методом χ2, исходя из
ожидаемого отношения 1:1:1:1, и докажите достоверное преобладание мух
родительских классов над рекомбинантами, т. е. установите сцепление
признаков окраски глаз и формы крыльев.
Затем впишите в таблицу результаты, полученные студентами второй и
третьей подгрупп, и убедитесь в сцепленном наследовании окраски глаз и
окраски тела, а также окраски тела и формы крыльев.
Студенты третьей подгруппы анализируют наследование окраски тела и
формы крыльев, для чего нужно подсчитать число мух (по суммарным данным
всех студентов группы) с родительскими сочетаниями признаков (серое тело,
нормальные крылья и черное тело, зачаточные крылья) и рекомбинантов (серое
тело, зачаточные крылья и черное тело, нормальные крылья). Обратите
внимание на преобладание мух с родительскими сочетаниями признаков над
рекомбинантами.
Впишите результаты в табл. 15 и проведите статистическую обработку
данных методом χ2, исходя из ожидаемого отношения 1:1:1:1. Докажите
достоверное преобладание родительских классов над рекомбинантами, т. е.
установите сцепленное наследование окраски тела и формы крыльев.
Впишите в таблицу данные, полученные студентами первой и второй
подгрупп, и убедитесь в сцепленном наследовании окраски глаз и окраски
тела, а также окраски глаз и формы крыльев.
Составление
общей
схемы
скрещивания.
Доказав
сцепленное
наследование всех трех пар признаков, нужно составить схему скрещивания
аналогично приведенной на рис. 14.
Написать генотипы мух исходных линий и гибридов F1 с учетом
хромосом, в которых находятся гены сп, b, vg.
Выписать гаметы гибридной самки
Fb, систематизировав их в
комплементарные пары классов: 1) некроссоверные; 2) кроссоверные за счет
перекреста между генами сп и b; 3) кроссоверные за счет перекреста между
генами b и vg; 4) кроссоверные за счет перекреста между генами сп и b, b и vg.
Проставить номера пар классов; в целях экономии времени генотипы и
фенотипы мух F2 можно не выписывать, так как гаметы самки являются
фенотипическими радикалами мух Fb.
Учет частоты кроссинговера между генами сп, b и vg. Вначале следует в
схему скрещивания записать число мух каждого класса, взяв его из таблицы 14,
после чего подсчитать общее число мух в каждой комплементарной паре
классов и выразить их частоту в процентах.
Рассчитать процент кроссинговера между генами сп и b. Для этого
суммировать частоты кроссоверных по этой паре генов мух - вторая и
четвертая пары классов.
Рассчитать процент кроссинговера между генами сп и vg. Для этого
суммировать частоты кроссоверных по этой паре генов мух - вторая и третья
пары классов.
Рассчитать процент кроссинговера между генами b и vg. Для этой цели
суммировать частоты кроссоверных по этой паре генов мух - третья и четвертая
пары классов.
Построение генетической карты для генов сп, vg и b. Найти гены с
наибольшим процентом кроссинговера между ними (гены b и vg); это крайние
гены на карте.
Приблизительно посередине между генами b и vg поместить ген сп, который
находится примерно на одинаковых расстояниях от крайних генов b и vg.
Подсчитать сумму двух отрезков на карте: между генами b –сп и сп -vg.
Убедиться, что она превышает расстояние между генами b-vg.
К расстоянию между генами b-vg прибавить удвоенный процент
двойного кроссинговера (вторая пара классов). Убедиться, что теперь
расстояние между крайними генами точно соответствует сумме двух расстояний
между генами b-сп и сп–vg.
Сравнить полученные расстояния между генами b-cn-vg с локусами этих
генов на генетической карте (на рисунке локус гена b - 48,5, сп - 57,5, vg - 67,0).
Убедиться, что последовательность генов установлена правильно и что
расстояния между ними близки к ожидаемым.
Таблица 15
Пример количественного анализа наследования окраски глаз, окраски
тела и формы крыльев у дрозофилы. (Проверка на независимое наследование
каждых двух пар признаков на тригибридном анализирующем скрещивании)
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №10
Тема. Множественный аллелизм.
Цель занятия: постановка скрещиваний.
Материал и оборудование. 1. Пробирки или стаканчики со средой по 34 на каждого студента для получения F1 2. Мутанты w, wa, cn и мухи дикого
типа. 3. Оборудование, необходимое для работы с дрозофилой.
Задание. 1. Подобрать мутанты для скрещивания. 2. Отобрать
виргинных самок. 3. Поставить скрещивание в соответствии с разработанным
заданием. 4. Получить F1 и проанализировать его
Пояснение к заданию: Различное состояние одного и того же гена
называется аллелями. Переход гена одного аллельного состояния в другое
обусловливается мутацией. Ряд состояний одного и того же гена называют
серией
множественных
аллелизмов.
Знакомство
с
функциональным
критерием аллелизма будет осуществляться в связи с решением вопроса о
том, являются ли мутации, обусловливающие белую, абрикосовую и
киноварного цвета окраску глаз у дрозофилы, серией множественных
аллелей. Для решения этого вопроса проводят следующие скрещивания с
разными окрасками глаз:
Абрикосовые глаза × Белые глаза
Киноварные глаза × Абрикосовые глаза
Киноварные глаза × Белые глаза
Выполнение задания. 1. В соответствии со схемами скрещиваний
подобрать мутанты. 2. Поставить скрещивания, отобрав 2-3 виргинные
самки, и поместить в пробирку со свежей средой с 3-5 самцами по каждому
типу скрещивания. 3. Через 10 - 12 суток после постановки скрещивания,
когда в пробирке начнется массовое вылупление мух F1, их следует усыпить
и проанализировать. 4. Для знакомства с результатами скрещивания
необходимо каждому студенту описать окраску глаз у исходных и гибридных
мух в каждом типе скрещивания.
Результаты записать в виде схем.
Р
♀ абрикосовые глаза × ♂ белые глаза
↓
F1
Р
♀
абрикосовые глаза
киноварные глаза × ♂ абрикосовые глаза
↓
F1
Р
красные глаза (дикий тип)
♀ киноварные глаза
× ♂ белые глаза
↓
F1
красные глаза (дикий тип)
Исходя из полученных результатов, можно заключить, что мутации,
определяющие белую и абрикосовую окраски глаз, аллельны, т. е. произошли
в одном гене, так как при скрещивании не появилась окраска дикого типа, а
появилась окраска одной из скрещиваемых форм. Киноварные глаза
определяются мутацией другого гена, неаллельного гену, определяющему
белую и абрикосовую окраски, так как при скрещивании появляется новый
признак — красная окраска — дикого типа, т. е. имеет место взаимодействие
доминантных, неаллельных генов. Те же схемы скрещивания теперь можно
переписать, используя символы генов и хромосом (рис. 16).
Рис. 16. Схемы скрещиваний, приведенных для определения
аллельности мутаций. Обозначения генов окраски глаз: w - белая, wa абрикосовая, cn - киноварная, cn+ - красная.
В первом типе скрещивания аллели гена w (white) локализованы в Ххромосоме, обозначаются они w для белой окраски и w а — для абрикосовой.
Это признаки, сцепленные с полом, поэтому самки имеют две аллели, самцы
— одну. Мухи F1 имеют абрикосовую окраску глаз, т. е. такую же, как
скрещиваемая самка, значит, эти мутации — аллельны. Во втором типе
скрещивания киноварные глаза определяет ген сп во II хромосоме. У мухи с
киноварной окраской глаз этот ген в гомозиготном состоянии. В Ххромосоме они имеют аллель дикого типа гена w, она обозначается w+; мухи
же с абрикосовыми глазами (ген w
а
в Х-хромосоме) во II хромосоме
обязательно имеют аллель дикого типа гена сп, которая обозначается сп+.
Это же имело место и в первом типе скрещивания. У мух с белыми и
абрикосовыми глазами (гены w и wa в Х-хромосоме) во II хромосоме также
были аллели сп+. Эти аллели, одинаковые у двух скрещиваемых форм, не
отражались на результатах скрещивания. Поэтому не были обозначены. Во
втором типе скрещивания обозначение их необходимо. Появление мух с
красными глазами, т.е. признака дикого типа, в F1 говорит о неаллельности
мутаций, определяющих абрикосовую и киноварную окраску глаз у мух.
Само появление признака дикого типа можно объяснить так: аллель w+ и сп+
взаимодействуют между собой по типу комплементарности и определяют
красную окраску глаз (дикого типа).
Если мутации wa и cn неаллельны, а wa и w аллельны, то в третьем типе
скрещивания можно ожидать появление мух с красными глазами, что
действительно и имело место.
Литература.
1. Абрамова З.В., Карлинский О.А. Практикум по генетике. 2-е издание
переработанное и дополненное - Л.: Колос, 1974. - 208 с.
2. Асланян М.М., Глотов Н.В. и др. Большой практикум по генетике
животных и растений. - М: МГУ, 1977. - 136 с.
3. Ватти К.В., Тихомирова М.М. Руководство к практическим занятиям
по генетике. - М.: Просвещение, 1979. - 189 с., ил., 4 л. ил.
4. Медведев Н.Н. Практическая генетика. М.: Наука, 1968 г. - 294 с.
5. Орлова М.М. Генетический анализ: Учебное пособие. М.; Изд-во
МГУ, 1991. - 318 с.: ил.
6. Ситникова
А.Д.,
Ситников
М.Н.,
Керефова
М.К.
Генетика.
Лабораторный практикум. - Нальчик: КБГУ. – 2002. – 116 с.
7. Валиев Р.Р. Практические занятия по изучению наследования
признаков на дрозофиле (Drosophila melanogaster). Методические указания. –
Уфа – РИО БашГУ. – 2002. – 38 с.
УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ
Боготова Залина Ихсановна
Биттуева Мадина Мухаматовна
Керефова Майя Камбулатовна
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА DROSOPHILA MELANOGASTER
Методические указания
к практическим занятиям
по большому практикуму