varnalina-gemostaz-pri-pankreatite

На правах рукописи
ВАРНАЛИНА
Надежда Владимировна
НАРУШЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО
КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПАНКРЕАТИТЕ И ИХ КОРРЕКЦИЯ
14.03.03 – патологическая физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
МОСКВА, 2010
1
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Мордовский государственный университет
им. Н.П. Огарева»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Алексей Петрович Власов
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАМН
доктор медицинских наук, профессор
Геннадий Васильевич Порядин;
доктор медицинских наук, профессор
Галина Александровна Дроздова
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»
Защита диссертации состоится 24 января 2011 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по
адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, г.Москва, ул. Островитянова,1.
Автореферат разослан
«16» декабря 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат медицинских наук доцент
1
Т.Е. Кузнецова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. За последние годы острый панкреатит (ОП) в ряде регионов Российской Федерации вышел на первое место в структуре ургентных заболеваний органов брюшной полости. Летальность при ОП колеблется в
пределах 3–6 %, но при деструктивной форме достигает 85 % (Вашетко Р. В. и др., 2000; Багненко С. Ф. и др., 2009).
Прогрессирование патологического процесса с формированием панкреонекроза сопровождается развитием эндотоксикоза, который может приводить к
полиорганной недостаточности (Толстой А. Д. и др., 1999; Вашетко Р. В. и др.,
2000; Гринев М. В. и др., 2001). Очевидно, что быстрота развития эндотоксикоза зависит от степени повреждения тканей в очаге воспаления, активного участия лимфо- и кровообращения в распространении токсинов в организме и воздействия эндотоксинов на органы-мишени (печень, кишечник, легкие, почки и
др.), превращающиеся в дополнительный источник интоксикации (Савельев B.C. и др., 1999; Ерюхин И. А. и др., 2001). Развивающаяся при деструктивных формах ОП функциональная недостаточность печени значительно усугубляет тяжесть течения заболевания и в 40–90 % наблюдений заканчивается
гибелью больных как результат срыва компенсаторных механизмов органа
(Мумладзе Р. Б. и др., 1997; Лещанкина Н.Ю. и др., 2009). Именно развитие печеночной недостаточности на фоне острого панкреатита замыкает порочный
круг синдрома эндогенной интоксикации (Кузнецов Н. Н. и др., 1996; Беляевский А. Д. и др., 1998; Machiedo G. W. et al., 1989; Di Filippo A. et al., 1994).
Под влиянием эндо- и экзогенных факторов, активизации процессов перекисного окисления липидов увеличивается прокоагулянтная и угнетается антикоагулянтная активность крови, в периферической крови появляется активный тканевой, эритроцитарный и тромбоцитарный тромбопластин, необходимый для превращения фибриногена в фибрин и возникновения необратимой агрегации эритроцитов и тромбоцитов (Бышевский А.Ш. и др., 1999;
2
Баркаган З.С. Момот А.П., 2001; Bauer K.A. et al., 1990). Расстройство микроциркуляции и нарастающая гипоксия также способствуют накоплению вазоактивных веществ, под влиянием которых расширяются прекапилляры, замедляется кровоток и развивается стаз в системе кровообращения, повышается вязкость крови, что совместно с циркулирующим в ней тромбопластином создает
условия для тромбинемии и первичного тромбообразования (Лычев В.Г., 1993;
Скипетров В.П., 1999; Vinazzer H., 1989). При прогрессировании патологического процесса данные изменения ведут к развитию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (Мачабели М.С., 1981; Скипетров В.П. и др., 1999; Егорова Н.В., 2009).
Безусловно, одним из патогенетически значимых способов коррекции гемокоагуляционных нарушений при патологии является восстановление функционального статуса печени–главного органа, регулирующего состояние системы гемостаза. С этой целью используется большой арсенал патофизиологически обоснованных медикаментозных и немедикаментозных схем терапии.
Однако в доступной литературе мы не нашли сведений по влиянию L-орнитинL-аспартата на указанные процессы при остром панкреатите.
Цель исследования. Изучить состояние клеточного и гуморального компонентов системы гемостаза при экспериментальном панкреатите; дать патофизиологическое обоснование применения орнитин-аспартата для коррекции расстройств в системе гемостаза.
Основные задачи.
1.
В эксперименте при остром панкреатите в динамике патологического
процесса изучить состояние клеточного и гуморального компонентов системы
гемостаза.
2.
Определить характер функционально-метаболических нарушений пе-
чени при остром панкреатите, а также выраженность эндогенной интоксикации.
3.
На основе корреляционного анализа установить зависимость измене-
ний клеточного и гуморального компонентов системы гемостаза от функционально-метаболического состояния печени при остром панкреатите.
3
4.
Изучить влияние орнитин-аспартата на состояние клеточного и гумо-
рального компонентов системы гемостаза, на состав фосфолипидного бислоя
мембран тромбоцитов, а также на интенсивность перекисного окисления их
мембранных липидов и активность фосфолипазы А2.
5.
Исследовать
действие
орнитин-аспартата
на
функционально-
метаболическое состояние печени и выраженность эндогенной интоксикации
при остром панкреатите.
Научная новизна.
Установлено, что при остром экспериментальном панкреатите нарушение
клеточного и гуморального компонентов системы гемостаза сопряжено с изменением функционально-метаболического состояния печени, развитием эндогенной интоксикации.
Показано, что одним из важнейших механизмов, лежащих в основе нарушений функционального статуса системы гемостаза при остром панкреатите,
выступают мембранодестабилизирующие явления в клеточных структурах печени и тромбоцитах.
Выявлено, что орнитин-аспартат препятствует прогрессированию нарушений со стороны клеточного и гуморального компонентов системы гемостаза,
способствует восстановлению функциональной активности печени.
Установлено, что одним из значимых эффектов препарата в коррекции
коагуляционно-литических нарушений крови при остром панкреатите является
его способность модулировать состояние мембранодестабилизирующих процессов.
Доказано, что на фоне применения орнитин-аспартата наблюдается более
быстрое, по сравнению с контролем, восстановление состава фосфолипидного
бислоя мембран тромбоцитов, а также клеточных структур печени.
Выявлено, что в уменьшении выраженности расстройств в системе гемостаза при остром панкреатите при использовании орнитин-аспартата определенную роль играет снижение уровня эндогенной интоксикации.
4
Практическая ценность работы. В работе дана экспериментальная
оценка патофизиологической активности орнитин-аспартата в коррекции коагуляционно-литического состояния крови, функционально-метаболического состояния печени при остром панкреатите. Полученный положительный эффект
препарата в коррекции нарушений системы гемостаза и функционального статуса печени при остром панкреатите является веским основанием для рекомендации орнитин-аспартата к более широкому применению в клинике.
Положения, выносимые на защиту.
1. Нарушение коагуляционно-литического состояния крови при остром панкреатите сопряжено с мембранодестабилизирующими явлениями в тромбоцитах и клеточных структурах печени, а также интоксикационным процессом.
2. Орнитин-аспартат препятствует прогрессированию нарушений со стороны клеточного и гуморального компонентов системы гемостаза, способствует
восстановлению функциональной активности печени.
3. Коррекция коагуляционно-литического состояния крови при остром панкреатите происходит за счет способности препарата уменьшать выраженность
мембранодестабилизирующих процессов и эндогенной интоксикации.
Внедрение в практику. В работе дана экспериментальная оценка патофизиологической активности орнитин-аспартата в коррекции коагуляционнолитического состояния крови, функционально-метаболического состояния печени при остром панкреатите. Полученный положительный эффект препарата в
коррекции нарушений системы гемостаза и функционального статуса печени
при остром панкреатите является веским основанием для рекомендации орнитин-аспартата к более широкому применению в клинике.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на Огаревских чтениях – научно-практических конференциях Мордовского
государственного университета (Саранск, 2006–2010), VII Международной
конференции «Биоантиоксидант» (М., 2006), X Международном конгрессе
«Здоровье и образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии
и медицине» (Москва, 2009), межвузовской научной конференции «Актуальные
5
вопросы фармакологии и фармации» (Курск, 2009), XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), научных конференциях молодых ученых Мордовского государственного университета (Саранск,
2009, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, 1 из
них в журнале, рекомендованном ВАК.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 156 страницах
компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), материалов и методов исследования (2-я глава), результатов собственных исследований (3, 4, и 5-я главы), обсуждения, выводов и списка литературы, который
включает 277 отечественных и иностранных источников. Работа содержит 21
таблицу и 32 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. В основу работы положены материалы экспериментального исследования на 40 взрослых беспородных половозрелых собаках обоего пола массой от 4,6 до 9,5 кг, разделенных на две группы.
В контрольной группе (К) 20 животным моделировали острый билиарный
панкреатит, после чего проводили инфузионную терапию. В динамике заболевания исследовали выраженность эндогенной интоксикации, нарушение функционального состояния печени, некоторые показатели функционального состояния тромбоцитов, в тканевых структурах печени и тромбоцитах изучали активность процессов перекисного окисления липидов, фосфолипазы А2, каталазы и супероксиддисмутазы, а также фракционный состав липидов.
В основной группе (I) острый билиарный панкреатит моделировали 20
животным, которым, помимо инфузионной терапии, ежедневно внутривенно
капельно вводили орнитин-аспартат на 200 мл изотонического раствора хлори-
6
да натрия из расчета 1 г/кг. Изучали влияние орнитин-аспартата на вышеперечисленные показатели.
В контрольные сроки (1-е, 3-и, 5-е сутки) животным под наркозом проводили релапаротомию, осуществляли забор венозной крови и биопсию печени.
Острый билиарный панкреатит моделировали по способу В. М. Буянова с
соавт. (1989) следующим образом. Взрослым беспородным собакам выполняли
срединную лапаротомию, пунктировали желчный пузырь, забирали желчь с последующим лигированием места пункции. Затем желчь вводили в паренхиму
вертикальной части поджелудочной железы по 0,5 мл в 5 точек. Таким образом
воспроизводили медленно прогрессирующую форму острого экспериментального панкреатита. Все экспериментальные исследования проводились под
внутривенным наркозом с использованием тиопентал-натрия из расчета 0,04 г
на 1 кг массы животного. Из эксперимента они выводились путем внутривенного введения летальной дозы тиопентал-натрия.
Исследования проведены в соответствии с этическими требованиями к
работе с экспериментальными животными («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от
12.08.1987 г.) и Федеральный закон «О защите животных от жесткого обращения» от 01.01.1997 г.) и одобрены локальным этическим комитетом.
В работе применялись следующие методы исследования:
– для оценки состояния гемостаза применялись методики, позволяющие
оценить как общую коагуляционную способность крови, так и отдельные звенья свертывающей системы крови. Определяли следующие показатели: время
спонтанного свертывания крови по Lee R.J. и White P.D. (1913), время рекальцификации обычной плазмы по Bergerhof и Roka (1954), толерантность плазмы
к гепарину по Poller в модификации В.П. Балуды (1954), каолиновое время
свертывания плазмы богатой тромбоцитами по P.G.J. Hattersley (1966), протромбиновое время плазмы по Quick A.J. (1966), тромбиновое время по
R.M.Biggs и R.G.Macfarlane (1962), антитромбин III по Hensen A., Loeliger E.A.
(модификация К.М. Бишевского (1963), фибринолитическую активность крови
7
по H. Kowarzyk, L. Buluck (1954), естественный лизис кровяного сгустка по
М.А. Котовщиковой и Б.И. Кузнику (1962), продукты деградации фибриногена
и фибрина (ПДФ) в плазме по N. Guest;
– содержание билирубина в сыворотке крови определяли по взаимодействию прямого билирубина с диазофенилсульфоновой кислотой;
– концентрацию мочевины определяли по взаимодействию ее с диацетилмонооксимом, образующим в присутствии тиосемикарбазида окрашенное
соединение;
– уровень креатинина в сыворотке крови определяли методом Яффе с
предварительным осаждением белков трихлоруксусной кислотой. В основе
определения лежит образование в щелочной среде окрашенного комплекса креатинина с пикриновой кислотой;
– активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз в сыворотке
крови определяли по методу Райтмана–Френкеля;
– уровень эндотоксемии оценивали по содержанию в сыворотке крови
молекул средней массы (МСМ) (Пикуза О.И., Шакирова Л.З., 1994) и физикохимическим свойствам альбумина, которые определяли по его эффективной
(ЭКА) и общей (ОКА) концентраций в сыворотке крови флуоресцентным методом на специализированном анализаторе АКЛ-01 «Зонд» (Грызунов Ю.А.,
Добрецов Г.Е., 1994). Далее рассчитывали резерв связывания альбумина (РСА)
по формуле: РСА=ЭКА/ОКА; индекс токсичности плазмы (ИТ) по формуле
ИТ=ОКА/ЭКА-1 (Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., 1994);
– определяли диеновые коньюгаты (ДК) спектрофотометрическим методом при длине волны 232-233 нм;
– содержание ТБК-активных продуктов изучали по накоплению малонового диальдегида в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК);
– активность фосфолипазы оценивали титрометрическим методом с помощью нейтрализации 0,02 ммоль NaOH карбоксильных групп свободных
жирных кислот;
– активность каталазы определяли фотометрическим методом;
8
– активность супероксиддисмутазы определяли в реакции с нитросиним
тетразолием.
Полученные цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия t Стьюдента. В каждой серии определяли
достоверность различия по отношению к исходному или контрольному значению (Р), корреляционные связи между различными показателями по коэффициенту корреляции r. Вычисления производили на CPU 1600 MHz “Intel PentiumIV” с помощью пакета программ Microsoft Office XP. Динамика показателей
отражена на графиках, построенных с использованием программы электронных
таблиц Microsoft Excel 2003.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты показали, что избранная модель панкреатита оказалась адекватной
для реализации цели и решения поставленных задач. Во всех случаях в поджелудочной железе возникали выраженные морфологические изменения. Лабораторным подтверждением моделированной патологии явилось резкое повышение в плазме крови активности альфа-амилазы и развитие выраженной эндогенной интоксикации, о чем свидетельствовало увеличение уровня гидрофильных и гидрофобных токсических продуктов, особенно на третьи сутки. Оказалось, что общая концентрация альбумина у экспериментальных животных была
ниже нормы на 12,76–18,03 % (p<0,05), эффективная концентрация альбумина –
на 31,72–50,78 % (p<0,05), резерв связывающей способности альбумина – на
19,23–26,92 % (p<0,05), индекс токсичности плазмы увеличивался на 110,71–
307,14 % (p<0,05). Выявлено повышение уровня токсических продуктов и гидрофильной природы. Так, содержание молекул средней массы (λ=254 нм и 280
нм) в плазме крови было повышено на 53,03–77,88 (p<0,05) и на 58,50–90,78 %
(p<0,05) соответственно.
При остром панкреатите нарушались показатели гемостазиограммы. Так,
время свертывания крови укорачивалось на 6,58–12,37 % (p<0,05), время ре9
кальцификации плазмы – на 17,42–27,11 % (p<0,05), протромбиновое время –
на 16,16–32,62 % (p<0,05), тромбиновое время – на 29,48 % (p<0,05) (на третьи
сутки); на пятые сутки достоверно была снижена (на 12,53 %) толерантность
плазмы к гепарину (рис. 1). Снижался антикоагулянтный потенциал крови. Содержание антитромбина III в контрольной группе было снижено на
16,39–19,20 % (p<0,05). Развитие острого панкреатита вызывало угнетение
фибринолитической активности крови. Зафиксировано выраженное угнетение
спонтанного фибринолиза на 30,52–43,09 % (p<0,05). Эуглобулиновый фибринолиз на третьи сутки был снижен на 14,62 % (p<0,05). В течение всего периода
наблюдения за животными в контрольной группе было увеличено содержание
продуктов деградации фибриногена и фибрина на 59,15–92,65 % (p<0,05).
Норма
1 сутки
3 сутки
5 сутки
120
100
80
%60
40
20
0
ВС
ВР
ТПГ
ПВ
ТВ
АТ III
Р и с. 1. Состояние системы свертывания крови при остром панкреатите, на фоне инфузионной терапии ((Здесь и далее: значения нормы приняты за 100 %; – достоверность отличия от нормы при p<0,05 ВС–время свертывания; ВР–время рекальцификации плазмы,
ТПГ–толерантность плазмы к гепарину, ПВ - протромбиновое время, ТВ–тромбиновое время; АТ III–антитромбин III)
При моделировании острого панкреатита функциональная активность
тромбоцитов подвергается значительным модификациям, что, вероятно, связано с поступлением в кровоток большого количества тромбогенных субстанций
из очага воспаления (Баркаган З. С., 1988; Дмитриев В. В., 1991). Возрастание
агрегационной способности тромбоцитов отмечалось в виде увеличения, по
сравнению с нормой, скорости и степени их агрегации на 158,40–378,40 %
10
(р<0,05) и на 32,94–70,65 % (р<0,05) соответственно, а также укорочения времени агрегации кровяных пластинок на 31,17–39,54 % (р<0,05) (рис. 2).
Норма
1-е сутки
3-и сутки
5-е сутки
600
500
400
300
200
100
0
степень агрегации
скорость агрегации
Рис. 2. Функциональная активность тромбоцитов при остром панкреатите
Детальный анализ липидограмм показал, что при остром панкреатите в
фосфолипидном бислое мембран тромбоцитов возникали существенные модификации, проявляющиеся в изменении уровня основных мембранообразующих
липидов, а также резкое повышение уровня липидов, обладающих детергентным действием. Так, содержание суммарных фосфолипидов в тромбоцитах достоверно падало на третьи и пятые сутки динамического наблюдения на 14,95 и
22,56 % (р<0,05) соответственно, свидетельствуя о прогрессировании мембранодестабилизирующих процессов. Показатель фосфатидилэтаноламина в
динамике периода наблюдения превосходил норму на 16,97–17,29 % (р<0,05), а
содержание
фосфатидилинозита
и
фосфатидилсерина
снижалось
на
22,27–31,32 и 26,71–39,55 % (р<0,05) соответственно, что, вероятно, обусловлено наличием в организме взаимопревращений отдельных фосфолипидов (Климов А. Н., Никульчева Н. Г., 1999). На фоне острого панкреатита в тромбоцитах
увеличивалась концентрация эфиров холестерола на 22,67–36,59 % (p<0,05).
Нами выявлен значительный рост фракций липидов, обладающих детергентным действием. Так, удельный вес свободных жирных кислот превосходил
норму на 55,88–77,21 % (р<0,05). Их накопление способствовало превращению
11
мембранных фосфолипидов в лизофосфолипиды, количество которых в динамике патологии увеличилось на 301,01–426,26 % (р<0,05).
В изменении структурной организации биомембран тромбоцитов важная
роль отводится гиперлипопероксидации (Алмазов В.А. и др., 1992; Трофимов
В.А., 1999). В нашем исследовании это подтверждается наличием достоверной
корреляционной связи между нарушениями функциональной активности тромбоцитов, дислипидными изменениями их биомембран и интенсификацией процессов перекисного окисления липидов. Так, уровень первичных и вторичных
продуктов процессов перекисного окисления заметно возрастал на протяжении
всего периода наблюдения: содержание диеновых конъюгатов превышало нормальные показатели на 65,22–113,04 % (р<0,05); уровень малонового диальдегида – на 63,07–119,89 % (р<0,05). В ходе данной серии экспериментов было
выявлено существенное повышение при остром панкреатите активности в
тромбоцитах фосфолипазы А2, когда значение данного показателя превосходило норму на 120,82–202,09 % (р<0,05). На фоне интенсификации свободнорадикальных процессов активность каталазы снижалась по отношению к норме на
41,18–58,82 % (р<0,05).
Как известно, состояние системы гемостаза во многом зависит от функционального состояния печени. Опыты показали, что при остром экспериментальном панкреатите происходит выраженное нарушение функции печени,
подтверждением чего, в частности, является повышение активности аминотрансфераз, содержания мочевины, креатинина и билирубина. Так, в динамике
заболевания выявлено повышение в крови активности аспарагиновой и аланиновой аминотрансфераз на 52,43–63,11 и 49,38–61,73 % (р<0,05) соответственно, увеличение содержания мочевины на 14,48–15,44 % (р<0,05), креатинина –
на 29,67–68,83 % (р<0,05), общего билирубина – на 35,83–65,31 % (р<0,05).
Экспериментально установлено, что нарушения в системе гемостаза тесно коррелировали с патологическими изменениями функционального состояния печени и выраженностью эндогенной интоксикации, что доказывает значи-
12
мость мембранодеструктивных процессов в печени, которые при данной патологии как раз и вызывают нарушения ее функций (табл. 1).
Таблица 1
Корреляционная зависимость между нарушениями в системе гемостаза и функциональной
активностью печени, выраженностью эндогенной интоксикации
Степень
Скорость
Время
агрегации
агрегации
агрегации
АСТ
0,91#
0,90#
-0,84#
-0,83#
-0,93#
-0,99#
0,98#
0,80#
Мочевина
0,98#
0,91#
-0,95#
-0,66
-0,99#
-0,97#
0,99#
0,95#
Креатинин
0,92#
0,97#
-0,97#
-0,48
-0,98#
-0,84#
0,90#
0,81#
Билирубин
0,99#
0,98#
-0,96#
-0,61
-0,99#
-0,93#
0,97#
0,91#
МСМ(λ=254нм),
0,79#
0,77#
-0,71#
-0,88#
-0,81#
-0,97#
0,93#
0,92#
ЭКА
-0,73#
-0,78#
0,73#
0,82#
0,81#
0,97#
-0,93#
-0,95#
ИТ
-0,94#
-0,79#
0,71#
0,85#
0,83#
0,96#
-0,94#
-0,96#
РСА
-0,77#
-0,76#
0,68
0,91#
0,80#
0,96#
-0,91#
-0,89#
Показатели
ВС
ПВ
СФ
ПДФ
ВК
Примечание: #–достоверная корреляционная связь
Исследования показали, что в основе нарушения функционального статуса печени при остром экспериментальном панкреатите лежат мембранодестабилизирующие явления, что проявлялось в существенном изменении фосфолипидного состава клеточных структур органа. Так, содержание суммарных фосфолипидов в тканях печени достоверно падало на третьи и пятые сутки динамического наблюдения на 14,69 и 22,09 % (р<0,05) соответственно, свидетельствуя о прогрессировании мембранодестабилизирующих процессов. Уровень
фосфатидилэтаноламина превосходил норму на 16,43–44,28 % (р<0,05), эфиров
холестерола – на 19,49–67,30 %, а содержание фосфатидилинозита и фосфатидилсерина снижалось на 23,44–45,22 и 39,36–90,35 % (р<0,05) соответственно.
В тканевых структурах печени при остром панкреатите существенно повышалось содержание
липидов, обладающих хаотропным действием. Так,
удельное содержание свободных жирных кислот превосходило норму на
22,10–106,20 % (р<0,05), а лизофосфолипидов – на 767,31–1194,23 % (р<0,05).
При исследовании выявлено нарастание в тканевых структурах печени
скорости протекания процессов перекисного окисления липидов и фосфоли13
пазной активности. Уровень первичных и вторичных продуктов процессов перекисного окисления был существенно повышен на протяжении всего эксперимента. Так, содержание диеновых конъюгатов превосходило норму на 106,45–
193,55 % (р<0,05), малонового диальдегида на 36,20–104,89 % (р<0,05). Активность супероксиддисмутазы уменьшалась на 21,49–36,83 % (р<0,05). Было выявлено значительное повышение активности фосфолипазы А2 в тканях печени
на 97,56–143,09 % (р<0,05).
Таким образом, полученные результаты показывают важную роль нарушений липидного метаболизма в патогенезе гемокоагуляционных расстройств
при остром панкреатите. Так, при повреждении клеточных мембран тромбоцитов высокотоксичными продуктами перекисного окисления липидов и избыточной активизации фосфолипазных систем обнажаются слои фосфолипидов,
которые являются матрицей для запуска каскада ферментативных реакций процесса свертывания. Данные патологические процессы протекают на фоне выраженных нарушений функций печени, что усугубляет патологию в системе
гемостаза. Отметим, что центральным патогенетическим звеном, приводящим к
угнетению ее функционального статуса, также являются мембранодестабилизирующие явления.
Выявленная закономерность свидетельствует о необходимости включения в терапию острого панкреатита препаратов, способных корригировать
нарушения липидного гомеостаза, тем самым определяя возможность восстановления функционального статуса клеточных структур печени и тромбоцитов.
В опытной группе с целью коррекции возникших нарушений был использован орнитин-аспартат. На фоне его ежедневного внутривенного введения
при остром экспериментальном панкреатите в опытной группе животных выявлено снижение выраженности эндогенной интоксикации, что проявлялось в
уменьшении содержания в плазме крови токсичных продуктов гидрофильной и
гидрофобной природы. Так, в плазме крови концентрация молекул средней
массы (λ=254 нм и λ=280 нм) хотя и было выше нормы на 34,24–54,55 и 32,85–
66,86 % (р<0,05) соответственно, однако наблюдалось достоверное ее снижение
14
по сравнению с группой контроля на 12,28–15,50 и 14,80–16,18 % (р<0,05) соответственно.
Общая и эффективная концентрация альбумина в плазме крови экспериментальных животных была ниже нормы на 9,95–14,16 и 13,18–37,06 %
(p<0,05) соответственно. При этом содержание общего альбумина не имело достоверного отличия от данных контрольной группы, а уровень эффективной
концентрации альбумина был выше на третьи и пятые сутки на 27,17 и 27,88 %
(p<0,05) соответственно. Резерв связывающей способности альбумина на первые и третьи сутки исследования был ниже нормы на 16,67–30,77 % (p<0,05) и
выше данных контроля на конечном этапе исследования на 27,17 % (p<0,05),
когда уже не имел достоверного отличия от нормального значения. Индекс токсичности
был
выше
нормы
на
протяжении
всего
исследования
на
21,43–167,86 % (p<0,05) и ниже данных контроля на 23,19–42,34 % (p<0,05).
Время свертывания крови на фоне ежедневного внутривенного применения орнитина-аспартата, по сравнению с контрольной группой, удлинялось на
6,18–10,69 % (p<0,05), время рекальцификации плазмы – на 24,11 % (p<0,05) на
третьи сутки терапии, толерантность плазмы к гепарину – на 13,89 % (p<0,05)
на конечном этапе наблюдения, протромбиновое время – на 14,30–37,45 %
(p<0,05), тромбиновое время – на 25,99 % (p<0,05) на третьи сутки (рис. 3).
Норма
1 сутки
3 сутки
5 сутки
250
200
150
%
100
50
0
ПДФ К
ПДФ I
СФ К
СФ I
ВК К
ВК I
Р и с. 3. Состояние системы свертывания крови при остром экспериментальном панкреатите на фоне применения орнитина-аспартата
15
На фоне применения орнитина-аспартата восстанавливался антикоагулянтный потенциал. Так, содержание антитромбина III в опытной группе было
выше контроля на 17,87–21,07 % (p<0,05). Отметим, что при использовании орнитин-аспартата происходила активизация фибринолитической активности
крови. Так, спонтанный фибринолиз повышался, по сравнению с контролем, на
22,80–32,69 % (p<0,05), эуглобулиновый фибринолиз на третьи сутки применения данного препарата был выше на 11,06 % (p<0,05); выявлено существенное
уменьшение в плазме крови продуктов деградации фибриногена и фибрина – на
14,37–22,10 % (p<0,05).
Экспериментально установлено, что применение орнитина-аспартата в
терапии острого панкреатита способствовало снижению коагуляционного потенциала крови за счет уменьшения агрегационной способности тромбоцитов
(рис. 4).
Норма
1-е сутки
3-и сутки
5-е сутки
600
500
400
300
200
100
0
степень агрегации (К) степень агрегации (I)
скорость агрегации скорость агрегации (I)
(K)
Рис. 4. Функциональная активность тромбоцитов при остром панкреатите на фоне
применения орнитина-аспартата
Так, степень их агрегации снижалась на 20,77 % (р<0,05), по сравнению с
контролем, на конечном этапе динамического исследования, но была выше
нормы на 33,59–44,71 % (р<0,05) на всех этапах. Скорость агрегации падала, по
сравнению с контролем, на 26,76–36,22 % (р<0,05), превосходя норму на
118,40–250,40 % (р<0,05). Время агрегации удлинялось, превышая контроль на
19,66–37,42 % (р<0,05), но по-прежнему было меньше нормы на 16,92–17,64 %
16
(р<0,05). Положительный эффект орнитина-аспартата отмечался уже с третьих
суток его применения.
Нами установлено, что в тромбоцитах при остром панкреатите на фоне
применения орнитина-аспартата, так же как и в контрольной группе, происходит рост активности процессов перекисного окисления липидов, однако эти изменения носят менее выраженный характер (рис. 5).
Норма
1-е сутки
3-и сутки
5-е сутки
400
350
300
%
250
200
150
100
50
0
ДК К
ДК I
МДА К
МДА I
Ф ЛА2 К
Ф ЛА2 I
Р и с. 5. Показатели перекисного окисления липидов тромбоцитов при остром экспериментальном панкреатите на фоне применения орнитина-аспартата
Так, содержание диеновых конъюгатов было выше нормы на 52,17–
113,04 % (р<0,05), малонового диальдегида – на 62,50–78,41 % (р<0,05). При
этом активность фосфолипазы А2 была повышена по сравнению с нормой на
78,16–150,85 % (р<0,05). По сравнению с данными контрольной группы происходило уменьшение уровня диеновых конъюгатов на 16,67–26,53 % (р<0,05),
малонового диальдегида – на 18,86–19,44 % (р<0,05). По сравнению с контролем активность фосфолипазы А2 в тромбоцитах снижалась на 15,28–19,32 %
(р<0,05), каталазы – повышалась на 20,00–128,57 % (р<0,05).
Оказалось, что на фоне применения орнитина-аспартата в опытной группе животных происходила коррекция фосфолипидного состава бислоя мембран
тромбоцитов. Выявленный факт раскрывает патофизиологический механизм
действия препарата, который выражается в его мембраностабилизирующей
способности. Так, содержание суммарных фосфолипидов было ниже нормы
17
лишь на первые и третьи сутки эксперимента на 16,02 и 17,93 % (р<0,05), а на
конечном этапе не имело достоверного отличия от нормы. Уровень свободных
жирных кислот сохранялся повышенным на всех сроках исследования на 19,97–
33,33 % (р<0,05), а холестерола – на третьи и пятые сутки – на 19,97 и 33,33 %
(р<0,05), концентрация эстерифицированного холестерола была выше нормы
лишь на первые сутки на 16,44 % (р<0,05). Относительно данных группы контроля в опытной группе наблюдалось значительное снижение уровня эстерифицированного холестерола на 11,94–11,95 % (р<0,05), свободных жирных
кислот – на 19,41–26,97 % (р<0,05), а к концу исследования выявлено повышение уровня суммарных фосфолипидов на 20,54 % (р<0,05).
Отмечено, что применение орнитина-аспартата способствует восстановлению качественного состава фосфолипидов (рис. 6).
Норма
1-е сутки
3-и сутки
5-е сутки
140
120
100
%
80
60
40
20
0
ФЭА К
ФЭА I
ФС К
ФС I
ФИ К
ФИ I
Р и с. 6. Содержание некоторых фосфолипидов в биомембранах тромбоцитов при
остром экспериментальном панкреатите на фоне применения орнитина-аспартата
Так, на его фоне не имело существенного отличия от нормы на протяжении всего исследования содержание фосфатидилэтаноламина, фосфафатидилхолина. Однако даже при применении данного препарата была снижена концентрация фосфатидилинозита на 16,38–20,55 % (р<0,05), фосфатидилсерина –
18
на 13,56–29,97 % (р<0,05) и повышен уровень лизофосфатидилхолина на
216,16–247,47 (р<0,05). По отношению к данным контроля выявлено снижение
количества фосфатидилэтаноламина на 13,01–13,97 % (р<0,05), лизофосфолипидов – на 13,35–39,92 % (p<0,05); увеличение уровня фосфатидилсерина на
15,85–26,83 % (p<0,05), фосфатидилинозита на конечном этапе наблюдения –
на 21,76 % (р<0,05). Концентрация же сфингомиелина, фосфатидилхолина при
остром панкреатите на протяжении всего эксперимента не имела достоверных
отличий от данных контрольной группы.
Другим механизмом влияния препарата на состояние системы гемостаза
явилась его способность корригировать функционально-метаболическое состояние печени. В частности, при его применении наблюдались снижение в плазме
крови активности аминотрансфераз, уменьшение уровня билирубина, мочевины
и креатинина. Так, на фоне применения орнитина-аспартата относительно контрольной группы зафиксировано снижение активности АСТ на 11,52–16,07 %
(p<0,05), АЛТ – на 18,25–25,19 % (p<0,05), содержания в плазме крови мочевины – на 10,26–11,72 % (p<0,05), креатинина – на 13,17–15,90 % (p<0,05), общего
билирубина – на 16,67–22,33 % (p<0,05).
Нами установлено, что при использовании исследуемого препарата при
остром панкреатите в тканевых структурах печени модифицировался липидный
метаболизм. Так, содержание диеновых конъюгатов в них было ниже данных
группы контроля на 15,29–42,86 % (p<0,05), концентрация малонового диальдегида – на 17,29–26,06 % (p<0,05), активность супероксиддисмутазы на конечном этапе исследования выше контрольного значения на 42,39 % (p<0,05). При
этом активность фосфолипазы А2 снижалась на 17,91–31,44 % (p<0,05).
Благодаря положительному влиянию препарата наблюдалось ускорение
восстановления липидного состава тканевых структур органа. Так, количество
свободных жирных кислот в них снижалось на 19,08–31,10 % (p<0,05), лизофосфолипидов – на 12,93–22,95 % (p<0,05), фосфатидилсерина – на 11,69–33,07
% (p<0,05), фосфатидилинозита – на 11,61–26,52 % (р<0,05), фосфатидилэтано-
19
ламина – на 13,21–19,92 % (р<0,05); содержание диацилглицеролов увеличивалось на 26,26–77,06 % (p<0,05) (рис. 7).
Норма
1-е сутки
3-и сутки
5-е сутки
250
200
%
150
100
50
0
Ф ЭА К
Ф ЭА I
ФС К
ФС I
ФИ К
ФИ I
Р и с. 7. Уровень некоторых фосфолипидов клеточных структур печени при остром
экспериментальном панкреатите на фоне применения орнитина-аспартата
При этом к концу наблюдения уровень основных мембранообразующих
липидов вплотную приближался к показателю начала эксперимента. Выявленный эффект обусловил достаточно быстрое восстановление функционального
статуса печени, а вместе с тем и ее способность корригировать состояние системы гемостаза.
Таким образом, включение орнитина-аспартата в терапию острого панкреатита способствует коррекции состояния как гуморального, так и клеточного компонентов системы гемостаза. Важнейшее патофизиологическое действие
препарата проявляется в его способности регулировать липидный метаболизм
как в печени, так и в крови, что нами показано на примере тромбоцитов. Мембраностабилизирующее действие орнитин-аспартата проявляется в уменьшении
чрезмерной интенсивности процессов перекисного окисления липидов и фосфолипазной активности в тканевых структурах печени и форменных элементах
крови. Воздействие на различные звенья одного патогенетического механизма,
проявляющееся в достаточно быстром восстановлении функциональнометаболического состояния печени и тромбоцитов, обусловливало коррекцию
состояния системы гемостаза в целом. С другой стороны, положительный эф20
фект терапии орнитин-аспартатом подтверждает важную патофизиологическую
значимость мембранодестабилизирующих процессов в патологии системы гемостаза при остром панкреатите.
Мы далеки от мысли, что полученные данные по механизмам влияния исследованного препарата при остром панкреатите являются исчерпывающими.
Тем не менее полагаем, что они могут быть полезными не только с теоретической, но и с практической точки зрения.
ВЫВОДЫ
1. При остром экспериментальном панкреатите нарушение клеточного
(агрегационная активность тромбоцитов повышается на 32,9–70,6 %) и гуморального (коагуляционный потенциал возрастает на 6,6–27,1 %, фибринолитическая способность падает на 14,6–43,1 %) компонентов системы гемостаза сопряжено с изменением функционально-метаболического состояния печени
(нарушение детоксицирующей, альбуминсинтезирующей, пигмент- и липидрегулирующей функций).
2. Одним из важнейших механизмов, лежащих в основе нарушений функционального статуса системы гемостаза при остром панкреатите, выступают
мембранодестабилизирующие явления в клеточных структурах печени и тромбоцитах, что выражается в существенном нарушении состава основных мембранообразующих фракций липидного бислоя их мембран, а также повышении
уровня липидов, обладающих хаотропным действием.
3. Применение орнитин-аспартата при остром панкреатите препятствует
прогрессированию нарушений со стороны клеточного и гуморального компонентов системы гемостаза: агрегационная активность тромбоцитов по сравнению с контролем падает на 19,7–36,2 %, коагуляционный потенциал снижается
на 6,2–10,7 %, фибринолитическая способность повышается на 11,1–22,8 %.
4. В коррекции коагуляционно-литических нарушений при остром панкреатите важное значение имеет способность орнитин-аспартата улучшать
функциональную активность печени, что проявляется в восстановлении деток21
сицирующей, альбуминсинтезирующей, пигмент- и липидрегулирующей функций.
5. Одним из значимых эффектов орнитин-аспартата в коррекции коагуляционно-литических нарушений крови при остром панкреатите является его
способность уменьшать выраженность мембранодестабилизирующих процессов в клеточных структурах печени и тромбоцитах. Указанный эффект сопровождается снижением в их мембранных липидах активности перекисного окисления и фосфолипазы А2.
6. В уменьшении выраженности расстройств в системе гемостаза при
остром панкреатите при использовании орнитин-аспартата определенную роль
играет снижение эндогенной интоксикации (уровень гидрофильных токсичных
продуктов снижается на 12,3–16,2 %, гидрофобных – на 23,2–42,4 %).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
При
остром
панкреатите
с
целью
улучшения
функционально-
метаболического состояния печени и снижения выраженности нарушений в системе гемостаза патогенетически обоснованным является включение в комплексную терапию орнитина-аспартата, что способствует уменьшению мембранодестабилизирующих проявлений указанной патологии.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Варналина Н.В. Модификация липидного матрикса и функциональной
активности тромбоцитов при остром панкреатите // Актуальные вопросы фундаментальной и прикладной медицины. Сборник научных работ. – Саранск,
2007. – С.71-75.
2. Кирпичников А.А., Нынь Е.И., Варналина Н.В., Якушкина О.М.,
Кормишкин А.Е. Коррекция гемостатических расстройств при эндотоксикозе//
Сборник Научных трудов X международного конгресса «Здоровье и образова22
ние в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине». – М.,
2009. – С.1112-1113.
3. Крылов В.Г., Бунятян В.А., Варналина Н.В., Бардина И.В., Саксин
А.А.Фармакодинамические эффекты орнитина в терапии острого панкреатита//
Сборник Научных трудов X международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине». – М.,
2009. – С.1109-1110.
4. Крылов В.Г., Бунятян В.А., Гасанова З.М., Варналина Н.В. Гепатопротекторный эффект l-орнитин- l-аспартата при остром панкреатите// Технические и естественные науки: проблемы, теория, практика: межвуз. сб. науч. тр.
Вып. X. – Саранск, 2009. – С. 43-46.
5. Кирпичников А.А., Саксин А.А., Нынь Е.И., Варналина Н.В., Якушкина О.М. Гемостатические нарушения при эндотоксикозе и их коррекция//
Технические и естественные науки: проблемы, теория, практика: межвуз. сб.
науч. тр. Вып. X. – Саранск, 2009. – С. 46-48.
6. Крылов В.Г., Бунятян В.А., Гасанова З.М., Варналина Н.В., Тингаев
М.В. Метаболическая терапия токсического поражения печени при остром панкреатите //Материалы межвузовской научной конференции «Актуальные вопросы фармакологии и фармации». – Курск, 2009. – С. 225-227.
7. Григорьева Т.И., Логинова О.В., Кирпичников А.А., Нынь Е.И., Варналина Н.В., Якушкина О.М. Фармакокоррекция нарушений клеточного и гуморального компонентов системы гемостаза при синдроме эндогенной интоксикации// Материалы межвузовской научной конференции «Актуальные вопросы фармакологии и фармации». – Курск, 2009. – С. 122-123.
8. Крылов В.Г., Кукес В.Г., Бунятян В.А., Лещанкина Н.Ю., Власова
В.П., Тингаев М.В., Варналина Н.В. Мембраностабилизирующий компонент эффективности орнитина при остром панкреатите / Клиническая
фармакология и терапия. -2010. -№ 1. – С. 24-27.
9. Власов А.П., Лещанкина Н.Ю., Начкина Э.И., Щукин С.А., Варналина
Н.В., Нынь Е.И. Фармакокоррекция метаболических нарушений печени при
23
токсическом поражении// Материалы XVII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". – М., 2010. – С. 168.
10.
Варналина Н.В., Висаитов Д.А., Шибитов В.А., Тимошкин Д.С.,
Кузнецова О.М. Новые схемы коррекции эндогенной интоксикации// Технические и естественные науки: проблемы, теория, практика: межвуз. сб. науч. тр.
Вып. XII. – Саранск, 2010. – С. 139-141.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПОЛ – перекисное окисление липидов;
МДА – малоновый диальдегид;
ФЛА2 – фосфолипаза А2;
ДК – диеновые коньюгаты;
ТК – триеновые коньюгаты;
СОД – супероксиддисмутаза;
ВС – время свертывания;
ВР – время рекальцификации плазмы;
ТПГ – толерантность плазмы к гепарину;
ПВ – протромбиновое время;
ТВ – тромбиновое время;
АТ III – антитромбин III;
ЭФ – эуглобулиновый фибринолиз;
СФ – спонтанный фибринолиз;
ПДФ – продукты деградации фибриногена;
ВК – вязкость крови;
МСМ – молекулы средней массы;
ОКА – общая концентрация альбумина;
ЭКА – эффективная концентрация альбумина;
РСА – резерв связывания альбумина;
ИТ – индекс токсичности;
ЭХ – эстерифицированный холестерол;
СФ – суммарные фосфолипиды;
СЖК – свбодные жирные кислоты;
ХЛ – холестерол;
ФЭА – фосфатидилэтаноламин;
ФС – фосфатидилсерин;
ФИ – фосфатидилинозит.
24