На правах рукописи - Научно-исследовательскому институту
advertisement
На правах рукописи ГОДОВАЛОВА Ольга Сергеевна МОРФОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ГЛИО- И НЕЙРОБЛАСТОВ ПРИ ГИРИФИКАЦИИ НЕОКОРТЕКСА В ОНТОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА Специальность: 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Савельев Сергей Вячеславович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, руководитель лаборатории функциональной морфохимии ФГБУ «НЦ неврологии» РАМН Худоерков Рудольф Михайлович доктор биологических наук, доцент, руководитель группы функциональной морфологии стресса ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН Кондашевская Марина Владиславовна Ведущая организация: Российский университет дружбы народов Защита диссертации состоится «25» октября 2012 г. в 12.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.004.01. ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, 3. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН Автореферат разослан «___» сентября 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Л.П. Михайлова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Морфогенез борозд и извилин коры головного мозга – один из важнейших и недостаточно изученных аспектов пренатального онтогенеза человека. Существует ряд основополагающих работ, касающихся хронологии закладки борозд в онтогенезе человека и приматов (Gratiolet, 1854, цит. по: Huxley T.H., 1874; Bischoff, 1868, цит. по: Бец В.А., 1883; His, 1904, цит. по: Пинесу, 1949; Бут Н.И., 1956; Астахова А.Т., 1958; Савельев С.В., 1989), и более новые исследования (Савельев С.В., 2005; Ruiz A. et. al., 2006; Sawada K. et. al., 2012). Данные работы содержат много интересных, отчасти противоречащих друг другу фактов об особенностях формирования борозд. Мало изучено и практически не описано появление зачатков борозд в фетальном периоде. В отдельных случаях эти зачатки (первичные борозды) полностью повторяют положение постоянных борозд (Савельев С.В., 1989; Савельев С.В., 1993) и могут кратковременно сглаживаться в процессе развития (Астахова А.Т., 1958; Савельев С.В., 1989). Существует множество гипотез формирования гирифицированного (от лат. gyrus — извилина) мозга. Достаточно популярно представление о том, что быстрорастущий мозг формирует складки из-за того, что упирается в череп изнутри. В экспериментальной работе Р.S. Goldman-Rakic (1980) описано повышение гирификации поверхности мозга в результате повреждения. Повреждения также вызывают цитоархитектоническую реорганизацию первичной зрительной коры. Другая концепция предполагает, что борозды и извилины формируются за счет дифференцированного роста отдельных радиальных структур (Armstrong E. et al., 1991; Toro R, Burnod Y., 2005). Согласно другой гипотезе о механических натяжениях, образование извилин неокортекса происходит вследствие натяженности аксонов между тесно связанными областями коры, в то время как борозды образуются между областями коры, практически не имеющими взаимных связей (Van Essen D.C., 1997). Многое известно о формировании корковой пластинки. Детально изучены особенности формирования, миграции и дифференцировки нейро- и глиобластов в коре млекопитающих, прежде всего у крыс (Smart, I. H., McSherry, G. M., 1982; 3 Bayer, S. A., Altman, J., 1991; Takahashi, T. et. al., 1995), а также у приматов (Rakic P., 1972; Schmechel D.E., Rakic P., 1979; Letinic K. et. al., 2002). За последнее десятилетие на мышах и крысах были проведены генетические исследования, в которых были выявлены порядка 60 генов, специфично экспрессирующихся в постмитотических нейробластах различных слоев (Molyneaux B.J. et al., 2007). Несмотря на активный интерес к проблеме формирования коры головного мозга, в современной нейробиологии практически не обсуждаются особенности образования коры гирифицированного мозга. Более того, ряд исследователей опровергает наличие гетерогенности развития цитоархитектонических полей, приоритет формирования первичных полей над вторичными (Rakic P. et. al., 1986; Zacevic N., 1998; Letinic K., Kostovic I., 1998), хотя ускоренное созревание первичных полей ранее считалось неоспоримым фактом (Преображенская Н.С., 1965; Huttenlocher P.R., de Courten C, 1987). Таким образом, несмотря на активно ведущиеся работы по исследованию развития коры головного мозга млекопитающих и человека, многие аспекты формирования мозга недостаточно изучены. Прежде всего не решен вопрос о существовании первичных борозд в процессе развития, которые в дальнейшем элиминируются. Неясно, существуют ли подобные механизмы формирования для других борозд. Неизвестны факторы, под воздействием которых борозды могут сглаживаться, и почему эти факторы воздействуют на отдельные борозды неодновременно. Не описаны события, происходящие в стенке полушария на микроскопическом уровне. Неясно, влияет ли гетерогенность формирования борозд на дальнейшее созревание и формирование цитоархитектоники неокортекса. Цели и задачи. Целью исследования являлось изучение особенностей морфогенеза первичных и вторичных борозд затылочной доли медиальной поверхности головного мозга человека. В задачи исследования входило: 1. Установить гистологические и иммуногистохимические особенности миграции нейробластов в зонах формирования первичных и вторичных борозд неокортекса зрительной области с использованием комплекса маркеров (антител к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), нейрон4 специфическому β-III тубулину, фактору нейрональной миграции – рилину, переносчику фактора миграции (ретинола) - CRBP-I). 2. Установить особенности глиальной и нейрональной дифференцировки в зонах формирования первичных и вторичных борозд неокортекса зрительной области с использованием комплекса маркеров (антител к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), нейрон-специфическому β-III тубулину, нейральному ядерному белку (NeuN), маркерам синаптической активности: глутаматдекарбоксилазе (GAD), переносчику ГАМК (GAT-1), возбуждающему рецептору (NMDAR1)). 3. Определить наличие морфохимической гетерогенности в формировании первичного и вторичного зрительных полей с использованием маркеров (антител к Са2+-связывающему белку (S-100), основному белку миелина (MBP), нейральному ядерному белку (NeuN), глутаматдекарбоксилазе (GAD), переносчику ГАМК (GAT-1), рецептору (NMDAR1)). 4. Составить макроморфологическую периодизацию нормального развития мозга плодов. Определить иммуногистохимические компоненты механизма формирования первичных и вторичных борозд неокортекса. Научная новизна. В работе впервые детально исследована хронология возникновения как первичных, так и вторичных борозд полушарий головного мозга в фетальном периоде. Описаны первые временные борозды на медиальной поверхности полушария, последовательно исчезающие в ростро-каудальном направлении. Первичная теменно-затылочная борозда исчезает на период 18–21 нед; после этого возраста она формируется как постоянная борозда. Первичная шпорная борозда кратковременно исчезает в 23–25 нед. В работе применен комплекс иммуногистохимических методов, направленных на выявление миграции и дифференцировки нейробластов и глиобластов одновременно с выявлением синаптической активности головного мозга. Выявлены тенденции к тангенциальной миграции нейробластов в прижелудочковой области под бороздами. Дифференцировка астроцитов и формирование цитоархитектоники в зрительной коре запускается после 23-й нед – сразу после стадии сглаженной шпорной борозды. 5 Впервые оценены темпы развития и созревания неокортекса в бороздах, в губах борозд и в свободной коре. Участки неокортекса в губах борозд развиваются раньше других, на втором месте по скорости созревания свободная кора, позже других протекает созревание нейробластов в неокортексе внутри борозд. Выявлен приоритет развития первичного зрительного поля 17 над вторичным полем 18. Научно-практическая значимость. Понимание нормального развития головного мозга важно для диагностики пороков развития ЦНС. Традиционная ультразвуковая диагностика (УЗИ), совместно с магнитно-резонансной томографией (МРТ) в пренатальном периоде выявляют большое количество аномалий развития внутрненних органов, в том числе ЦНС. Тем не менее, существующие подходы и диагностические шкалы не всегда дают достаточно информации для прогнозирования возможных аномалий развития ЦНС. Борозды полушарий головного мозга хорошо различимы при УЗИ и МРТ. Знание нормальной хронологии формирования борозд, возраст появления и исчезновения первичных борозд должны способствовать более ранней и точной диагностике аномалий развития головного мозга. Полученные в работе данные о морфогенезе борозд больших полушарий на микроскопическом уровне расширят возможности морфологической диагностики патологии ЦНС. Основные положения, выносимые на защиту: В процессе становления гирификации выделяют этап формирования первичных борозд, которые в дальнейшем элиминируются, а на их месте формируются постоянные борозды. Шпорная борозда также претерпевает временное сглаживание подобно другим первичным бороздам медиальной поверхности головного мозга. Первичные борозды сглаживаются не одновременно, для каждой борозды существуют свои временные рамки, которые взаимосвязаны между собой. Выявлена гетерогенность в созревании нейробластов в бороздах и извилинах зрительной коры (поля 17 и 18) мозга человека на всех этапах пре- и постнатального развития. С 19-й по 28-ю нед пренатального онтогенеза дифференцировка нейробластов в слоях V-VI внутри борозд опережает таковую в свободной коре, что подтвержается усилением их NeuN-иммунореактивности. С 28-й нед пренатального развития и до периода детства раньше созревают нейробласты в губах борозд, что 6 подтверждается распределением Са2+-связывающего белка S-100 (до 40-й нед пренатального периода), нейрального маркера NeuN (до 10-го месяца постнатального периода), маркеров синаптической активности GAD и GAT-1 (до 4-х лет). Показано, что кратковременное сглаживание шпорной борозды в 23–25 нед совпадает с врастанием β-III-тубулин-иммунопозитивных афферентных таламических волокон, которые индуцируют экспрессию NeuN в IV слое неокортекса до начала выявления характерной цитоархитектоники II-VI слоев зрительной коры. После этого в 26 нед начинается специфическая временная экспрессия рилина и S-100 в нейробластах IV-VI слоев неокортекса в центре первичного зрительного поля 17. С 34-х нед экспрессия S-100 в нейробластах распространяется на вторичное зрительное поле 18. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: VIII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, 2006), Всероссийской конференции «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммуногистохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2007), научной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2008), Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» (Тюмень, 2008), III съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009), научной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2010), X конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), научной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2012), межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (июнь, 2012). Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в центральных журналах, рекомендованных ВАК РФ. 7 Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов), выводов, списка цитируемой литературы и двух приложений, изложена на 197 страницах, содержит 10 таблиц, 32 рисунка и 5 диаграмм. Список литературы содержит 194 источника, из них 31 на русском языке. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа выполнена на аутопсийном материале головного мозга человека (плоды, новорожденные, дети, взрослые), собранном в 2006–2010 гг. в больницах Москвы: ГКБ №36, ГКБ №72, МОНИИАГ, а также из коллекций лаборатории развития нервной системы ФГБУ «НИИМЧ» РАМН, кафедры антропологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Всего в работе исследованно 63 случая, из них 46 плодов человека на разных сроках развития, 10 недоношенных новорожденных детей, проживших от нескольких часов до нескольких суток, 2 доношенных новорождённых, 3 детей (3,5 мес, 10 мес, 4 г.), 2 взрослых лиц (48 лет, 70 лет). При сборе образцов головного мозга плодов человека учитывали пол, гестационный возраст, клинический диагноз матери и плода, причины прерывания беременности и причины смерти плода. При отсутствии клинических данных, определение возраста плодов проводили по теменно-копчиковой длине, согласно морфометрическим таблицам (Петтен Б.М., 1959), по массе тела, по Е. Бойду (цит. по: Петтен Б.М., 1959), по анатомическим характеристикам мозга (Савельев С.В., 2005). Изучали степень гирификации полушарий головного мозга. Выраженность борозд оценивали по разработанному нами методу в баллах по пятибалльной шкале. Материал фиксировали в 10%-м кислом формалине, нейтральном формалине (4% параформальдегид на 0,1М фосфатном буфере, рН 7,5) или жидкости Буэна. Проводили гистологическое исследование (окрашивание по методу Ниссля) участков медиальной стенки полушария, содержащих шпорную и теменнозатылочную борозды. Проводили иммуногистохимическое исследование. В работе использовали первичные антитела к некоторым антигенам нервной системы: нейрон-специфическому β-III тубулину, нейрональному ядерному гистоновому 8 белку (NeuN), глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), Са2+- связывающему нейроглиальному белку (S-100), основному белку миелина (MBP). Использовали антитела к факторам, влияющим на рост и развитие нервных клеток, и к их переносчикам: рилину, переносчику ретинола (CRBP-I). Использовали антитела к маркерным белкам, связанным с синаптической функцией: глутаматдекарбоксилазе (GAD65/67), пресинаптическому переносчику ГАМК (GAT-1), постсинаптическому возбуждающему рецептору NMDAR1. Негативным контролем служили реакции с заменой первичных антител раствором для разведения антител “Dako diluent” (“Dako”) или PBS рН=7,2–7,4 (0,01М). Во всех случаях в негативном контроле неспецифическая реакция отсутствовала. Позитивным контролем, в основном, служили реакции на образцах головного мозга детей и взрослых людей. Исключение составлял белок рилин, для которого позитивный контроль проводился на головном мозге плодов раннего возраста (Alcantara S. et. al., 1998). Для антител к переносчику ретинола (CRBP-I), для моноклональных антител к изоформе глутаматдекарбоксилазы молекулярной массой 67 кДа, к постсинаптическому рецептору NMDAR1 не удалось получить позитивного контроля ни у плодов, ни у взрослых людей. Все полученные препараты оценивали визуально с помощью микроскопа Leica DM2500. Видеозахват осуществляли с помощью камеры Lomo TCA-9.0C и программы Микро-View. С помощью программы Image J измеряли толщину каждой из зон стенки полушария, глубину борозд. Для каждого исследуемого участка проводили по 12 измерений. Данные вносили в таблицу в программе Microsoft Exel и вычисляли среднее значение для каждого измерения. Для оценки выраженности иммуногистохимической реакции использовали коэффициент интенсивности иммунореактивности, высчитываемый в программе Image J. Похожие методы оценки иммунореактивности представлены в других исследованиях (Leuba G. et. al., 1998; Cruz D.A. et. al., 2003; Cruz D.A. et. al., 2009). Микрофотографии с исследуемыми областями переводили в двухцветное состояние по стандартизированной методике. Далее в программе Image J вычисляли коэффициент интенсивности иммунореактивности, равный отношению суммы 9 иммунопозитивных (темных) пикселей к общему количеству пикселей в выделенной области: Ки= Σиммунопозитивн.пиклел/Σобщ. кол-во пикселей. Для каждого образца в каждой исследуемой области (кора борозды, кора губы борозды, свободная кора, вентрикулярная зона, краевая зона и др.) получали по 12 значений коэффициента интенсивности иммунореактивности. После этого в программе Microsoft Exel высчитывали уровень значимости различий (р), согласно F-распределению Фишера, высчитывали средние значения коэффициента интенсивности иммунореактивости в исследуемых областях. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В работе проведено исследование больших полушарий плодов человека. Изучено формирование борозд на их поверхности, микроструктура стенки полушария шпорной и теменно-затылочной борозд, а также свободной коры, окружающей эти борозды, у плодов человека от 10-й нед развития до рождения, у детей до 4-х лет. Формирование борозд у плодов человека. Согласно полученным данным, формирование борозд больших полушарий начинается с первичных непостоянных борозд и их зачатков, которые служат разметкой для постоянных борозд. На дорсолатеральной поверхности ранее всего появляются сильвиева, центральная борозды и бороздка макулы; их развитие в первой половине плодного периода наиболее интенсивно. Остальные борозды этой поверхности могут появляться в виде зачатков. В первой половине плодного периода наиболее характерно проявление зачатков верхней лобной и верхней височной борозд; гораздо реже встречаются зачатки других борозд. После 26-й нед наблюдается интенсивное развитие практически всех борозд этой поверхности; исключение составляют средняя и нижняя височные борозды. Частота встречаемости нижней височной борозды составляет 19%, средняя височная борозда до 28-й нед не встречается. В 28–33 нед на препаратах, помимо бороздки макулы, встречается поперечная затылочная борозда. Следует отметить, что к рождению наблюдается исчезновение макулярной и поперечной затылочной борозд. 10 На медиальной поверхности развитие борозд начинается раньше. В период с 12й по 17-ю нед для этой поверхности характерно наличие вдавления на месте будущей борозды мозолистого тела, от которого радиально расходятся первичные маргинальные, теменно-затылочная и шпорная борозды. Первичные маргинальные борозды исчезают по мере утолщения стенки полушария. В первой половине фетального периода для этой поверхности наиболее постоянными являются обонятельная, шпорная и теменно-затылочная борозды. Наблюдается кратковременное исчезновение теменно-затылочной борозды в период с 18-й до 21й нед и шпорной борозды в период 23–25 нед. Зачаток поясной борозды появляется рано, его наличие достаточно постоянно, но активное развитие поясной борозды начинается после 30-й нед. Развитие вторичных борозд связано, в основном, с двумя последними месяцами плодного периода. При сравнении полученных данных с исследованиями Н.И. Бута, проведенными на 236 плодах человека, для дорсолатеральной поверхности были получены сходные данные о сроках закладки центральной, предцентральной, верхней лобной, зацентральной, верхней и нижней височных борозд, начиная с 6-7 мес пренатальнго развития (Бут Н.И., 1956). На более ранних сроках развития наши данные на 4-6 нед опережают данные Н.И. Бута. Для медиальной поверхности сходные данные обнаруживаются для закладок теменно-затылочной, обонятельной и глазных борозд, начиная с 4-х мес. Для других борозд данные о сроках появления различаются. Полагаем, что разногласия в сроках закладки борозд на ранних стадиях связаны с существованием временных борозд. Первичные лобные, височные, межтеменная борозды кратковременно формируются в начале 5-го мес, далее сглаживаются, а постоянные борозды формируются только спустя месяц. Обнаружены отличия в сроках развития поперечных затылочных борозд и борозды макулы на 8-ом мес пренатального периода. Согласно нашим данным, их максимальная выраженность наблюдается в 6–7 мес, а к рождению они исчезают совсем, что согласуется с исследованиями Т. Бишофа (Bischoff Т., 1868, цит. по Бец В.А.,1883), З.А. Потёмкиной (1957) (цит по: Шевченко Ю.Г., 1972), С.В. Савельева (2005) и др. По Н.И. Буту, элиминации этих борозд к рождению практически не наблюдается. 11 Согласно полученным данным, закладка поясной борозды на 5–6 мес реализуется в виде двух-трех отдельных закладок, которые на 8-ом мес могут сливаться в сплошную поясную борозду или развиваться в виде отдельных фрагментов. По Д.Н. Зернову (1877), прерывистое строение поясной борозды встречается достаточно часто, хотя в классических схемах её рисуют всегда сплошной. Следует подробнее остановиться на особенности формирования шпорной и теменно-затылочной борозд. Кратковременное исчезновение теменно-затылочной борозды, выявленное в данной работе, описано ранее в других исследованиях (Астахова А.Т., 1958; Савельев С.В., 1989; Савельев С.В., 2005). Шпорная борозда, согласно большинству данных, формируется как постоянная борозда ближе к 4-му мес развития и не претерпевает временных сглаживаний (Бут Н.И, 1956; Савельев С.В., 1989; Савельев С.В., 2005). Действительно, когда на медиальной поверхности полушарий наблюдается сглаживание всех борозд (поясной борозды и её маргинальных ветвей, теменно-затылочной и прямой борозд), только шпорная борозда не исчезает на 4–5 мес. Зато на 6-ом мес в некоторых случаях наблюдается укорочение длины, уменьшение глубины и даже полное сглаживание шпорной борозды. Согласно нашим данным, в 6 мес шпорная борозда представлена в 55% (11 случаев), в 7 мес – в 94 % (8 случаев). Согласно А.Т. Астаховой и соавт. (1958), шпорная борозда также иногда отсутствовала на обоих полушариях у 4 из 8 плодов с 5-го до 6-го месяцев. Таким образом, в процессе становления гирификации выделяют этап формирования первичных борозд, которые в дальнейшем элиминируются, а на их месте формируются постоянные борозды. Шпорная борозда также претерпевает временное сглаживание подобно другим первичным бороздам медиальной поверхности. Первичные борозды сглаживаются не одновременно: для каждой борозды существуют свои временные рамки, которые взаимосвязаны между собой. Миграции полушариях нейробластов головного в мозга процессе формирования млекопитающих известны неокортекса. В радиальные и тангенциальные миграции. Выделяют два типа радиальной миграции: транслокация и локомоция. Путем транслокации передвигаются первые мигрирующие в кору клетки, причем как нейроны, так и клетки радиальной глии (Kubo K., Nakajima K., 12 2003; Hatanaka Y. et al., 2004). После формирования радиальных глиальных направляющих для нейробласта становится характерна локомоция вдоль волокна радиальной глии (Rakic Р., 1972; Hatanaka Y. et al., 2004). С помощью иммуногистохимической реакции на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и на нейрон-специфичный β-III-тубулин с 16-й нед выявляется GFAP-иммунопозитивная радиальна глия, вдоль которой происходят миграции вытянутых биполярных нейронов, цитоплазма которых иммунопозитивна к β-III-тубулину. На стадии 14 нед радиальные волокна GFAP-иммунонегативны. На гистологических препаратах, окрашенных по Нисслю, на этой стадии уже хорошо различимы радиальные отростки клеток, тела которых располагаются в вентрикулярной зоне, а отростки заканчиваются в краевой зоне. Согласно работе N. Zecevic (2004), экспрессия GFAP клетками радиальной глии выявляется с 5,5 нед (клон 6F2), а B.H. Choi и L.W. Lapham (1978) обнаруживают GFAP-экспрессию с 10й нед (клон не указан). Мы полгагаем, что начало экспресии отдельных изоформ белка может различаться. В своей работе мы использовали моноклональные антитела, клон GA-5. Появление данной изоформы белка с 16-й нед может быть связано с изменениями в темпах миграции в стенке полушария. С помощью иммуногистохимической реакции на рилин на границе субвентрикулярной и интермедиальной зон было выявлено достаточное количество тангенциально направленных рилин-иммунопозитивных волокон и тел клеток. В этой же области наблюдаются тангенциально вытянутые тела клеток, хорошо различимые на гистологических препаратах. С помощью иммуногистохимической реакции на β-III-тубулин было показано, что большинство этих клеток являются нейробластами. Недавние исследования на мутантных мышах reeler также выявляют рилин-зависимую тангенциальную миграцию нейробластов из вентрикулярной зоны (Britanova O. et al,. 2006). Вопрос о различиях в миграционных процессах под бороздами и извилинами в литературе практически не освещен. Согласно нашему исследованию, существуют принципиальные различия в характере миграции под бороздами и под прямыми участками коры. В области дна борозд для вентрукулярной\субвентрикулярной зон характерно уменьшение их ширины. Наблюдается большее количество 13 тангенциально вытянутых тел клеток в субвентрикулярной зоне под бороздами. Наблюдается более высокий уровень рилин-иммунореактивности на границе интермедиальной и субвентрикулярной зон под бороздами. Таким образом, нейробласты в этих областях в большем количестве вступают в рилин-зависимую тангенциальную миграцию. Морфогенез радиальной глии. Радиальная глия представляет собой клетки, простирающиеся радиально сквозь стенку полушария от прижелудочковой до краевой зоны. Для этих клеток характерен комплекс гистохимических маркеров: RC1, RC2, GFAP или vimentin, Rat 401, Ran-2 (Rakic P., 2003). В недавнем исследовании культур астроцитарных клеток и аутопсийных образцов методом конфокальной микроскопии была показана одновременная экспрессия GFAP и β-IIIтубулина в клетках вентрикулярной\субвентрикулярной зон стенки полушария головного мозга плодов 16–20 нед (Dráberová E. et. al., 2008). В нашей работе с помощью иммуногистохимической реакции на GFAP и на нейрон-специфичный βIII-тубулин, с использованием метода сопоставления соседних серийных срезов, было выявлено, что в 14 нед отростки радиальной глии β-III-тубулиниммунопозитивны. Но на более поздних сроках заметно, что эти волокна выглядят как полые трубки, стенки которых содержат β-III-тубулин. В связи с этим можно предположить, что это отростки нейробластов создают маркированную оболочку вокруг волокна, вдоль которого перемещаются. В пользу последнего предположения служит тот факт, что вентрикулярный слой, где располагаются тела радиальной глии, преимущественно не содержит β-III-тубулин. При сопоставлении одних и тех же участков на препаратах после иммуногистохимической реакции на GFAP и β-IIIтубулин, явно видно, что большинство клеток радиальной глии β-III-тубулиниммунонегативны уже с 16-й нед пренатального развития. С 23-й нед пренатального развития β-III-тубулин не встречается в клетках радиальной глии и астроцитах. Таким образом, мы не исключаем возможности коэкспрессии GFAP и β-III-тубулина в клетках радиальной глии на ранних этапах онтогенеза, до 16 нед. После 16-й нед основной пролиферирующий пул клеток вентрикулярной зоны (лишенные отростков клетки) либо GFAP- и β-III-тубулин-иммунонегативен, либо слабо β-IIIтубулин-иммунопозитивен. 14 C 23-й нед единичные морфологически зрелые GFAP- и S-100-позитивные астроциты начинают выявляться в интермедиальной зоне. Возможность GFAP и S100 коэкспрессии в астроцитах отмечается в ряде исследований (Liu H.M. et. al,. 1989; Stagaard M,. Mollghrd K., 1989). С 26-й нед астроциты также появляются в краевой зоне. С 23-й нед в вентрикулярной\субвентрикулярной зонах выявляется значительная ГАМК-ергическая пресинаптическая активность (GAT-1- иммунопозитивные волокна), сохраняющаяся до 30-й нед. Постсинаптические ГАМКА-рецепторы вентрикулярной зоны описаны в литературе ранее (LoTurco J.J. et al., 1995; Owens D.F. et al., 1996), авторы предполагают, что назначение этих рецепторов связано возможностью регулировать пролиферативные свойства этих клеток. Таким образом, в результате иннервации GAT-1-иммунореактивными волокнами клеток-предшественников в вентрикулярной\субвентрикулярной зонах с 23-й нед по 30-ю завершается пролиферация и запускается дифференцировка глиобластов. Дифференцировка нейробластов неокортекса. Согласно проведенному нами гистологическому исследованию, в неокортексе человека с 12-й до 16-й нед выявляется предварительная дифференцировка. В корковой пластинке начинается разделение на два этажа: верхний, более плотный и узкий; нижний, более широкий и рыхлый. Наиболее рано закладывается более глубокая зона поперечника коры – слой VI, позднее – V слой. Далее над ними формируется верхний слой, из которого будут развиваться слои IV, III, II. С 23-й нед в зрительной коре уже можно морфологически различить первичное поле 17 и общую закладку 18 и 19 полей. I слой над этой закладкой состоит из нескольких рядов клеток, в то время как над полем 17 в I слое наблюдается диффузное расположение клеток. В нижних II-VI слоях ещё не наблюдается сформированной цитоархитектоники. Разделение II, III и IV слоев в 17 поле происходит к 30-й нед. А с 32-й нед в IV слое уже можно различить 3 подслоя. С этого же момента становятся хорошо различимы все слои 18 поля, но III слой ещё представлен общей закладкой. Дальнейшая дифференцировка неокортекса проявляется в увеличении толщины коры за счет разрежения клеточных элементов, в увеличении объема клеток, в приобретении ими характерной морфологии. 15 Полученные данные, в основном, согласуются с фундаментальными знаниями о хронологии развития зрительной коры, представленными в работах Г.И. Полякова (1937) и Н.С. Преображенской (1965). В отличие от других работ, отмечен ряд новых особенностей формирования неокортекса. Детальный анализ морфологии нейронов в коре борозд и извилин выявил, что созревание слоев коры протекает неравномерно в бороздах и извилинах. Большая гетерогенность обнаруживается в IIV слоях, меньшая – в VI слое неокортекса. Так, у новорождённого в 18 поле подслои выявляются только в области ростральной губы, в борозде разделение III слоя не обнаруживается. В других исследованных возрастах периодов младенчества и детства в свободной коре наблюдались более крупные, лучше сформированные пирамиды III слоя 17 и 18 полей. Для VI слоя уже в 10 мес характерно зрелое строение, сопоставимое с корой взрослого человека. Все клетки этого слоя плотно заполнены веществом Ниссля, которое также частично заходит в отростки. Таким образом, самый нижний VI слой коры созревает быстрее. Другие слои неокортекса сохраняют незрелый характер строения по крайней мере до 4-х лет, особенно заметный внутри борозд. С помощью иммуногистохимической реакции на нейрон-специфичный белок NeuN была выявлена неоднородность распределения маркера внутри борозд и в свободной коре. Слой VI коры в бороздах, особенно внутри шпорной борозды, окрашивался более интенсивно в течение пренатального периода (рис. 1). После рождения наблюдалось равномерное маркирование нейронов VI слоя в бороздах и вне борозд. Отметим, что после осуществления цитоархитектонической разметки будущих первичных и вторичных зрительных полей происходит значительное замедление созревания вторичного поля 18, особенно внутри теменно-затылочной борозды. После 30-й нед развития внутри теменно-затылочной борозды нейробласты, как правило, NeuN-иммунонегативны. Внутри шпорной борозды также выявляется ослабление маркирования верхнего этажа коры, нижний этаж коры проявляет, напротив, повышение иммунореактивности к NeuN. Таким образом, выявляются ускоренные темпы созревания губ борозд и извилин (свободной коры). В 10 мес после рождения кора извилин поля 17 и 18 хорошо сформирована, сопоставима с корой взрослого человека. Кора внутри борозд 16 значительно запаздывает в созревании, выявляется много NeuN-иммунонегативных нейробластов. Мы предполагаем, что подобная морофологическая гетерохрония созревания борозд и извилин сохраняется по крайней мере до 4-х лет. Интенсивность иммунореактивности 100% 80% VI св 60% VI po VI ca 40% 20% н 25 е д ,5 н 26 ед ,5 не 28 д не 30 д не 33 д не 32 д не 34 д не 35 д не 40 д не 40 д н 3, е д 5 м е 10 с м е 48 с ле 70 т ле т не д 26 23 19 не д 0% Возраст Рис. 1. Интенсивность NeuN-иммунореактивности VI слоя коры в различных областях: в шпорной борозде (са), в теменно-затылочной борозде (ро), в свободной коре (св). Гетерогенность дифференцировки неокортекса внутри борозд и в свободной коре была подтверждена иммуногистохимической реакцией на глутаматдекарбоксилазу (GAD). В периоде новорожденности была обнаружена строгая региональная локализация GAD-иммунопозитивных нейронов в области извилин, которая практически отсутствовала внутри борозд. Плотность GAD-позитивных нейронов была максимальна в зонах перегиба корковой пластинки внутрь борозд. По мере удаления от зоны перегиба в коре, не скрытой в бороздах, количество дифференцированных нейронов плавно уменьшалось. Таким образом, у новорожденных наблюдается асинхроннное начало функционирования фермента глутаматдекарбоксилазы. C помощью иммуногистохимической реакции на пресинаптический переносчик ГАМК (GAT-1) у плодов с 26-й нед наблюдалось усиленное маркирование волокон неокортекса в губах борозд (рис. 2). Следующими по интенсивности маркирования являлись области коры внутри борозд; минимальная иммунореактивность выявлялась в свободной коре. С 30-й нед интенсивность маркирования областей свободной коры была сопоставима с таковой коры внутри борозд, а к рождению иммунореактивность свободной коры значительно превышала таковую коры внутри борозд. В постнатальном онтогенезе сохранялась тенденция максимальной 17 иммунореактивности в губах и свободной коре. С возрастом различия в GAT-1иммунореактивности коры внутри и вне борозд становились менее выраженными. Таким образом, антитела к ГАМК-транспортеру GAT-1 выявляют асинхронное созревание неокортекса внутри борозд, в губах борозд, а также в свободных участках коры в рамках общего морфофункционального цитоархитектонического поля. vz 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% I po губа 100% II-VI po губа 80% II-VI ca губа 60% II-VI св 40% II-VI po 20% II-VI ca I ca губа I св I po I ca 14-21 н 23 н. 24-27 н 28-33 н 34-35 н 0-4 г. 48-70 л. 0% Возраст 14-21 н 23 н. 24-27 н 28-33 н 34-35 н 0-4 г. 48-70 л. Возраст А Б Рис. 2. Интенсивность GAT-1-иммунореактивности в различных областях коры: внутри шпорной (са) и теменно-затылочной (ро) борозд, в губах борозд, в свободной коре (св), А – I слой неокортекса и вентрикулярная зона (вз); Б – II-VI слои неокортекса. Структурно-функциональные нейронные объединения. Согласно нашему исследованию, объединения у новорожденных второго порядка детей при выявляются морфофункциональные иммуногистохимическом выявлении глутаматдекарбоксилазы. В свободной коре извилины (17 поле) выявляются GADиммунопозитивные тела нейронов в VI, V, IVc слоях; в верхних подслоях IVa и IVb выявляются группы маркированных нейронов. Подобные группы GAD- иммунопозитивных нейронов отчетливо выявляются на уровне IV слоя также в 18, 19 полях неокортекса. Ширина этих объединений на уровне IV слоя составляет в среднем 180 мкм. В неокортексе взрослого человека GAD-маркирование не выявляло структурно-функциональных литературным данным, визуализация объединений «бочонков» неокортекса. Хотя, по (морфофункциональных объединений) при иммуногистохимическом маркировании GAD у крыс сохраняется у взрослых особей (Kiser P.J. et. al., 1998). С помощью иммуногистохимической реакции на NeuN у ребенка 10 мес после рождения были визуализированы нейронные объединения, напоминающие 18 «бочонки». Локализация этих нейронных объединений связана с неокортексом внутри борозд. Иммунореактивность внутри бочонков выявляется прежде всего во II и частично в III слоях неокортекса, а также в V и VI слоях. Ширина бочонков на уровне II слоя составляет в среднем 250 мкм, а на уровне VI слоя – 210 мкм. Данные согласуются с представлениями о форме бочонков в виде усеченного конуса, большее основание которого приходится на II слой (Антонова А.М., 1975). Локализация маркированных нейронов и размеры бочонков в 17 и 18 полях принципиально не различались. Отметим, что в извилинах не выявляется бочонковой организации коры. В нейронах и нейробластах извилин выявляется равномерная NeuN-иммунореактивность. Таким образом, созревание коры протекает кластерами – функциональными нейронными объединениями второго порядка. Раньше протекает созревание свободной коры, что видно при изучении GAD-иммунореактивности в периоде новорожденности. К 10-му мес уровень зрелости свободной коры сопоставим с корой взрослого человека, поэтому иммуногистохимическая реакция на NeuN не дает возможности визуализировать нейронные объединения в извилинах. Позже протекает созревание коры внутри борозд, где у ребенка периода младенчества (10 мес) ещё сохраняется возможность визуализации нейронных объединений иммуногистохимической реакцией на NeuN. Гетерохрония формирования 17 и 18 зрительных полей. В проведенном нами иммуногистохимическом исследовании рилин обнаруживается в клетках КахалаРециуса краевой зоны с самых ранних исследованных сроков – с 14-й нед после оплодотворения. Матрикс I слоя, окружающий клетки Кахала-Рециуса, тоже проявляет рилин-иммунореактивность. Известно, что в процессе развития рилин синтезируется в коре головного мозга и гиппокампе клетками Кахала-Ретциуса. Рилин-производящие клетки в пренатальном и раннем постнатальном периоде преимущественно размещаются в маргинальной зоне коры. Рилин выделяется клетками во внеклеточное пространсто, служа ориентриром для клеток радиальной глии и мигрирующих нейробластов (Schiffinann, S.N. et. al., 1997; Meyer G., Goffinet A.M., 1998). Согласно полученным нами данным, по характеру распределения данного маркера в исследуемых бороздах можно судить о более раннем 19 формировании шпорной борозды, что ранее в литературе не описывалось. Интенсивность маркирования матрикса I слоя, окружающего рилин-позитивные клетки Кахала-Рециуса, раньше возрастает в шпорной борозде; её максимальное значение связано с 16-й нед развития. К 26-й нед маркирование матрикса краевой зоны достигает уровня взрослого человека, хотя сами клетки сохраняют высокую иммунореактивность к рилину, вплоть до рождения (рис. 3). В краевом слое теменно-затылочной борозды процесс снижения интенсивности маркирования запаздывает, достигая уровня взрослого человека к 30-й нед. Таким образом, область шпорной борозды, содержащая первичное зрительное поле 17, созревает раньше, процессы миграции в нём идут интенсивнее, чем в области теменно- Интенсивность иммунореактивности затылочной борозды, содержащей общую закладку 18 и 19 полей. 20 шпорная б (ca) теменно-затылочная б.(po) 15 10 5 0 14 нед 19 нед 22 нед 25,5 нед 26,5 нед 30 нед 33 нед 34 нед 40 нед 40 нед 3,5 мес 48 лет Возраст Рис. 3. Интенсивность рилин-иммунореактивности внеклеточного матрикса краевой зоны шпорной (са) и теменно-затылочной (ро) борозд. При иммуногистохимическом маркировании основного белка миелина (MBP) первая слабая иммунореактивность в исследуемой области выявляется у новорожденных. В первую очередь миелинизации подвергаются проекционные афферентные пути, входящие в первичное зрительное поле. Развитие миелинизации 18 поля несколько отстает от 17 поля. Миелинизация ассоциативных путей формируется позже, в 10 мес и 4 года она незачительно представлена, но ещё не достигает уровня взрослого человека. Полученные результаты соответствуют ранее проведенным исследованиям становления миелинизации у детей (Дзугаева С.Б., 20 1965). Таким образом, наблюдается гетерохрония миелинизации первичных и вторичных цитоархитектонических полей в процессе созревания зрительной коры человека. Гетерохрония дифференцировки таламическими афферентами. зрительной Согласно коры, нашим индуцируемая данным, ранняя иммуногистохимическая разметка первичного зрительного поля 17 происходит при помощи ядерного нейрального маркера NeuN в 23 нед пренатального развития. Вторичное зрительное поле 18 в этом возрасте лишено подобной NeuNиммунореактивности. В 17 поле маркируется преимущественно IV, слабее V, VI слои коры. В 26,5 нед, исключительно в центре первичного зрительного поля, обнаруживается рилин-иммунореактивность отдельных нейробластов IV, V и VI слоя коры. Аналогичным образом Са2+-связывающий белок S-100 в 26,5 нед маркирует нейробласты в центре первичного зрительного поля. Иммунореактивные клетки располагаются в VI, V и строго в IVс слоях. Возможность локализации белка S-100 в нейронах отмечена рядом исследователей (Sviridov S.M. et. al., 1972; Hansson H.-A. et. al., 1975; Haglid K.G. et. al., 1976; Isobe T. et. al., 1984; Donato R., 1986). Отметим, что в указанные сроки, в соседних областях вторичного зрительного поля нейробласты лишены иммунореактивности к NeuN, S-100 и рилину. Аналогичное появление интенсивного маркирования нейробластов IV слоя первичного зрительного поля 17 обнаружено при обработке антителами в кальбиндину (Са2+-связывающий белок ГАМК-ергических нейронов) у плодов человека в 26 гестационных нед (т.е. 24 нед после оплодотворения) (Yan X.X. et. al., 1997). Также в этом возрасте (26 гестационных нед) выявляется иммунореактивность к другому Са2+-связывающему белку парвальбумину, но только в V, VI слоях. В IVc подслое этот белок выявляется только с 30-й гестационной нед (Cao Q.L. et. al., 1996). Интересно, что кальбиндин, как правило, не встречается в IVc подслое в коре взрослых лиц (Yoshioka T., Hendry S.H., 1995; Letinic K., Kostovic I., 1998; Bu J., Sathyendra V., 2003). Парвальбумин, напротив, характерен для IVc подслоя 17 поля зрелого неокортекса (Letinic K., Kostovic I., 1998). 21 Известно, что данный возраст (23–25 нед) характеризуется врастанием афферентных таламических волокон в первичное зрительное поле (Преображенская Н.С., 1965). Значимая роль таламических афферентов в регуляции цитоархитектонической дифференцировки у человека и животных отмечается рядом исследований (Stanfield B.B, O’Leary D.D., 1985; O’Leary D.D., Stanfield B.L., 1989; Rakic P., 1991; Schlaggar B.L., O’Leary D.D., 1991). Проведенная нами иммуногистохимическая реакция на β-III-тубулин подтверждает наличие радиально направленных пучков волокон под первичным зрительным полем в 23–26 нед. Отметим, что именно в этом возрасте наблюдается кратковременное сглаживание шпорной борозды. Таким образом, функциональная дифференцировка первичного зрительного поля начинается в период врастания таламических афферентов, что одновременно сопровождается сглаживанием шпорной борозды. Дальнейшее исследование указанных маркеров также выявляет гетерогенность их распределения нейробластов в 17, наиболее 18 полях. Временная показательно выявляет S-100-иммунореактивность центробежный характер цитоархитектонической дифференцировки. В 28 нед, кроме центральной области первичного зрительного поля, также подвержена иммунореактивности периферийная область 17 поля и граница 17, 18 полей в области губы шпорной борозды. В 34 нед исчезает S-100-иммунореактивность нейробластов в центре первичного поля. Для этого возраста характерно маркирование границ 17, 18 полей и 18 поля. Губа теменно-затылочной борозды, наиболее удаленная от 17 поля, проявляет меньшую иммунореактивность, меченые нейробласты локализуются преимущественно в VI, V слоях. В статье K. Letinic и I. Kostovic (1998), тем не менее, подчеркивается синхронность экспрессии Сa2+-связывающих белков в 17 и 18 полях коры в постнатальном онтогенезе человека. Также в других электронномикроскопических исследованиях выявляется синхронное развитие первичных и вторичных полей приматов и человека (Rakic P. et. al., 1986; Zacevic N., 1998). В пользу гетерогенности развития первичных и вторичных полей свидетельствуют работы по изучению синаптической плотности (Huttenlocher P.R., de Courten C, 1987; Huttenlocher P.R., Dabholkar A.S., 1997), синаптической активности (Trepel C. et. al., 1998) и электрофизиологические исследования (Фабер 22 Д.А., 1969; Zhang B. et. al., 2005). Таким образом, в своём исследовании мы подтверждаем гетерогенность развития первичного 17 и вторичного 18 полей. ВЫВОДЫ: 1. Составлена периодизация формирования борозд полушарий головного мозга у плодов человека с 9-й по 40-ю неделю развития. Установлены точные сроки появления и исчезновения первичных борозд медиальной и дорсолатеральной поверхностей полушария, сроки формирования постоянных борозд, степень выраженности борозд на каждой стадии пренатального онтогенеза. 2. Методами иммуногистохимии показана гетерогенность формирования и созревания полей 17 и 18 зрительной области коры головного мозга человека в пре- и постнатальном онтогенезе. В структурах поля 17 иммунореактивность к рилину и ГАМК-транспортеру (GAT-1) определяется с 14-й недели, к Са2+связывающему белку S-100 – с 26-й недели, а к основному белку миелина нервных волокон – с 40-й недели пренатального развития. В структурах поля 18 иммунореактивность к рилину и ГАМК-транспортеру (GAT-1) определяется после 16-й недели; к Са2+-связывающему белку S-100 – с 34-й недели пренатального развития, а к основному белку миелина нервных волокон – с 3,5 месяцев постнатального развития. 3. Обнаружена гетерогенность рилин-зависимых тангенциальных миграций β-IIIтубулин-иммунопозитивных нейробластов под бороздами и извилинами в перивентрикулярной области с 14-й по 26-ю неделю пренатального развития. Тангенциальные миграции в большей степени выражены под первичными и вторичными бороздами, чем под прямыми участками коры. 4. Показаны различия в созревании нейробластов в бороздах и извилинах зрительной коры (поля 17 и 18) мозга человека на всех этапах пре- и постнатального развития. С 19-й по 28-ю неделю пренатального онтогенеза дифференцировка нейробластов в слоях V-VI внутри борозд опережает таковую в свободной коре, что подтвержается усилением их NeuN-иммунореактивности. С 28-й недели пренатального развития и до периода детства раньше созревают нейробласты в губах борозд, что подтверждается распределением Са2+23 связывающего белка S-100 (до 40-й недели пренатального периода), нейрального маркера NeuN (до 10-го мес), маркеров синаптической активности GAD и GAT-1 (до 4-х лет). 5. Созревание коры протекает кластерами – функциональными нейронными объединениями, которые визуализируются с помощью иммуногистохимической реакции на глутаматдекарбоксилазу (GAD) с 40-й недели пренатального развития и нейрон-специфичный маркер NeuN – с 10-го месяца постнатального развития. 6. Установлено, что кратковременное сглаживание шпорной борозды с 23-й по 25ю неделю совпадает с врастанием β-III-тубулин-иммунопозитивных афферентных таламических волокон, которые индуцируют появление экспрессии NeuN в IV слое 17 поля неокортекса, до начала выявления характерной цитоархитектоники II-VI слоев этого поля. После экспрессии NeuN начинается специфическая временная экспрессия рилина и S-100 в нейробластах IV–VI слоев неокортекса у плодов возраста 26 недель в центре первичного зрительного поля 17. C 34-й недели экспрессия S-100 в нейробластах распространяется на вторичное зрительное поле 18. 7. Выявлено, что активная дифференцировка S-100- и GFAP-иммунопозитивных астроцитов в зрительной области коры запускается после стадии сглаживания шпорной борозды. В это время в тонких нервных волокнах перивентрикулярной области стенки полушария переднего мозга накапливается значительное количество переносчика ГАМК (GAT-1), что кардинально изменяет тип дифференцировки клеток-предшественников. 24 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Годовалова О.С. Савельев С.В. Формирование борозд и извилин коры больших полушарий большого мозга в плодном периоде онтогенеза человека // Морфология. – 2006. – Т.129. – №4. – С. 38. 2. Годовалова О.С., Савельев С.В., Негашева М.А. Закономерности формирования борозд и извилин в плодном периоде онтогенеза человека // Научный альманах кафедры антропологии. – Москва: Изд. МГУ им. М.В. Ломоносова, 2006. – №5. – С. 122-144. 3. Годовалова О.С., Савельев С.В., Барабанов В.М. Особенности формирования борозд коры больших полушарий в плодном периоде онтогенеза человека // сб. ГУ НЦН РАМН «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга». – Москва, 2007. – С. 186-190. 4. Годовалова О.С., Савельев С.В., Барабанов В.М. Сравнительная характеристика нейрональной дифференцировки борозд затылочной области в плодном онтогенезе человека // Морфология. – 2008. – Т.133. – №2.- С. 33-34. 5. Годовалова О.С., Савельев С.В., Барабанов В.М. Распределение белка S-100 в стенке полушария развивающейся затылочной доли человека // Морфология. – 2008. – Т.133. – №3. – С. 33-34. 6. Годовалова О.С., Савельев С.В., Бесова Н.В. Определение возраста плодов человека по анатомическим характеристикам головного мозга // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2008. – Т.4. – С. 52-58. 7. Годовалова О.С., Савельев С.В. Сравнительное гистологическое исследование коры головного мозга у плодов человека в норме и при сахарном диабете у матери, сб. «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». – Москва, 2008. – С. 29-31. 8. Годовалова О.С., Барабанов В.М., Савельев С.В. Распределение глутаматдекарбоксилазы (GAD) в период созревания зрительной коры головного мозга человека // сб. «Актуальные вопросы патологической анатомии». – Самара, 2009. – Т.2. – С. 101-102. 25 9. Годовалова О.С. Экспрессия ядерного белка нервной ткани и глиального фибриллярного кислого белка в морфогенезе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. – вып. 5. – С. 589-594. 10. Годовалова О.С., Савельев С.В. Распределение ядерного белка нервной ткани (NeuN) и нейроспецифического маркера (β-III-tubulin) в неокортексе человека в период морфогенетической перестройки борозд // сб. «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». – Москва, 2010. – С. 36-39. 11. Годовалова О.С. Иммуногистохимическое сравнение шпорной и теменно- затылочной борозд неокортекса человека в период их морфогенетической перестройки // Морфология. – 2010. – Т.137. – №4. – С. 57. 12. Годовалова О.С., Савельев С.В. Экспрессия ГАМК транспортера (GAT-1) и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в созревающем неокортексе человека // Росс. Медико-биологич. Вестник им. И.П. Павлова. – 2012. – № 2. – С. 132-137. 13. Годовалова О.С., Савельев С.В. Характеристика асинхронного созревания неокортекса борозд и извилин на примере экспрессии белков S-100 и рилин // сб. «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». – Москва, 2012. – С. 2629. Соискатель ________________О.С. Годовалова 26
