НТО на КЭ Регенерация

Приложение 1
Научно-техническое обоснование космического эксперимента «РЕГЕНЕРАЦИЯ-1»
1. Сущность исследуемой проблемы. Краткая история и состояние вопроса.
Выяснение значимости силы тяжести в различных жизненных процессах у земных
организмов – парадигма космической биологии. Одной из таких задач является изучение
восстановления органов и тканей после их повреждения либо полной утраты в условиях
воздействия факторов космического полета. Очевидно, данная проблема имеет непосредственное
отношение и к космоплаванию. Увеличение продолжительности пилотируемых полетов и объема
работ, усложнение операторских задач, несомненно, повышают риск несчастного случая и
получения различного рода травм, требующих хирургического вмешательства. По этой причине
информация по регенерации поврежденных органов и тканей в космическом полете, добытая в
модельных опытах на животных, окажется полезной в системе мер по медицинскому
обеспечению полетов.
Имеющиеся на сегодня экспериментальные данные о влиянии невесомости на
восстановительный морфогенез немногочисленны и противоречивы. Согласно [2, 3, 10]
экспозиция
в
невесомости
сопровождалась
ускорением
регенерации
ампутированных
конечностей, хвоста, сетчатки и хрусталика глаз у тритонов Pleurodeles waltlii. По данным [1],
напротив, регенерация удаленных конечностей у тритонов заметно отставало от наземного
контроля (регенерировавшие кости имели атипичную пластинчатую структуру). Следует особо
подчеркнуть, что в этих экспериментах, поставленных на автоматических космических аппаратах
«Бион» и «Фотон», продолжительность орбитальных полетов не превышала 16 суток. О характере
регенерации судили по прошествии достаточно длительного времени после возвращения
животных на Землю. Можно упомянуть еще об одном эксперименте. У двух крыс линии Вистар
14-суточное пребывание в невесомости привело к задержке посттравматической регенерации в
виде уменьшения размеров костной мозоли и снижения прочности консолидации костных
обломков диафиза малоберцовой кости, подвернутой оперативному перелому за 2 суток до
запуска биоспутника по сравнению с животными наземной контрольной группы [8].
Ранее нами на МКС были проведены исследования по изучению регенерации органа
зрения (глазных щупалец) на наземной легочной улитке Helix lucorum и целого организма из
отдельных фрагментов тела на пресноводной планарии Girardia tigrina. (Планария Girardia tigrina –
бесполая раса: при достижении животными определенных размеров задняя часть тела постепенно
отшнуровывается и затем полностью отрывается от ее передней части. В течение нескольких
суток из передней и задней частей тела регенерируют две планарии. Планарию размером всего 1012 мм можно расчленить на множество фрагментов и всего за одну неделю появляется такое же
2
число особей благодаря наличию в них популяций стволовых клеток [11, 13, 18-20]. Согласно
литературным данным у наземных гастропод после удаления глазных пузырьков в течение 2-3
мес имеет место структурно-функциональное восстановление вышеуказанной структуры. Правда,
регенерировавший глаз заметно уступает интактному глазу по своим размерам и содержит
меньшее число клеток в сетчатке [9, 12, 14-17]).
Результаты исследований показали сохранность высокой регенерационной способности в
орбитальном полете: из отдельных фрагментов планарий регенерировали полноценные особи. У
улиток в 20-70 % случаях взамен ампутированных глазных щупалец образовались новые глазные
щупальца с функционирующими глазами [4-6; см. также итоговый отчет по КЭ «Регенерация».
Регистр. № 0-3244. ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Москва, 2010]. Основной вывод из этой работы состоял
в том, что отсутствие силы тяжести не является лимитирующим фактором для реализации
механизмов регенерации. В ряде случаев регенерировавшие щупальца полетных улиток были
искривлены, имели характерные выросты, как правило, отсутствующие у животных наземного
контроля. У одной улитки обнаружились два глаза в регенерировавшем щупальце. У планарий,
перед полетом подвергнутых продольному рассечению тела, прирастала недостающая половина.
Вместе с тем их тело было явно искривлено по сравнению с контрольными объектами (рис. 1-3).
Рис. 1. Регенерация глазных щупалец в 163-суточном КЭ. а – интактное глазное щупальце, б –
регенерировавшее глазное щупальце без глазного яблока, в-м – регенерировавшие глазные щупальца
с глазными яблоками, з – правое интактное, левое регенерировавшее глазное щупальце, н – улитка с
глазными щупальцами спустя 776 суток после отсечения верхней части левого глазного щупальца.
Стрелки – граница отсечения глазных щупалец и отрастания регенератов.
3
Рис. 2. Планария G. tigrina в
интактном состоянии, ее головной,
туловищный и хвостовой участки
непосредственно
после
оперативного вмешательства за 12 ч
перед стартом ПКК «Союз» и их
регенерация
орбитальном
в
10-суточном
полете
(последовательность
на
МКС
фотографий
слева направо).
1
2
3
4
Рис. 5
Рис. 3. Регенерация планарии после продольного рассечения тела. 1 – планария в интактном
состоянии, 2 и 3 – рассеченные половины планарии за 14 ч перед стартом ПКК «Союз», 4 –
регенерировавшая планария из правой половины. Снимок спустя 8 ч после завершения 11суточного орбитального полета.
Возникновение аномалий в регенерировавших образованиях в орбитальном полете диктует
необходимость постановки нового КЭ («РЕГЕНЕРАЦИЯ-1»)
для углубленного изучения и
выяснения возможных причин этого феномена (невесомость, повышенная весомость, радиация,
вибрации).
Методы исследования. Выполнение КЭ «Регенерация-1» предусматривает проведение
комплексных исследований: морфологических, с использованием световой и электронной
микроскопии – для выявления морфологических особенностей регенерировавших структур и
электрофизиологических – для оценки их функционального состояния.
Предполетная
подготовка
КЭ.
Предварительно
отобранные
улитки,
прошедшие
карантинный срок, разделяются на полетную и две контрольные группы – синхронную и
4
виварийную. За 7-10 суток перед началом КЭ прекращается кормление животных полетной и
синхронной контрольной групп. За 4-5 суток перед стартом животные полетной группы
доставлятся на техническую позицию г. Байконур. За 12-14 ч перед стартом улиток взвешиваются
на электронных весах «Accula3 V-1 mg», измеряется диаметр раковины штангенциркулем и
полученные значения заносятся в протокольную тетрадь. Глазными ножницами ампутирутся
дистальные кончики глазных щупалец вместе с глазными пузырьками с одной стороны, в ряде
случаев одно или оба щупальца у основания. У планарий туловище рассекается на две
продольные половины. После указанных процедур улитки укладываются в инкубационный
контейнер «Улитка», фрагменты планарий (от 8 до 15) – в инкубационные капсулы, заполненные
на 1/3 дистиллированной водой и на 2/3 артезианской водой «Малютка». Контейнеры
закрываются крышкой и помещаются в транспортировочные чехлы (рис. 1, 2). За 12-14 ч перед
стартом контейнеры с биообъектами после обработки 3-процентным раствором перекиси
водорода размещаются в гермоотсек ТГК «Прогресс М», либо на борт ТПК «Союз ТМА».
Прооперированные улитки и фрагменты планарий синхронных контрольных групп находятся в
аналогичных «полетным» контейнерах и при температуре, близкой к бортовой. Кроме того, они
подвергаются ударным воздействиям и динамическим нагрузкам, имитирующим факторы
выведения космических аппаратов на орбиту и возвращения на Землю. Улитки виварийной
контрольной группы содержатся при комнатной температуре (20-22ºС) и имеют свободный
доступ к корму и воде.
В интактном состоянии и после соответствующего оперативного вмешательства
производится фото- и видеосъемка планарий и глазных щупалец улиток. Их изображения перед
полетом, а также полученного материала после полета создаются с помощью специальной
установки, состоящей из микроскопа МБС-9, оборудованного видеокамерой CCD Color Camera
CV-7017H (Sony, Japan), устройства для видеозахвата AverTV Cardbus Plus (AverMedia, Taivan) и
ноутбука
Aspire
1662WLMi
Acer
(Taivan).
После
заверения
КЭ
для
регистрации
электроретинограммы (ЭРГ) и импульсной электрической активности зрительного нерва улиток
используется полуинтактный препарат: улитки извлекаются из раковины, туловище разрезается
по средней линии, глазные щупальца вскрываются и обнажается зрительный нерв. Для отведения
ЭРГ к поверхности обнаженных глаз прикладываются стеклянные микроэлектроды диаметром
кончика 70-80 мкм. Электроды заполняются агар-агаром, приготовленном на 1-молярном
растворе NaCI. Для отведения импульсной электрической активности зрительного нерва
используются металлические электроды толщиной 80 мкм. Индифферентный электрод в виде
серебряной пластинки располагается на туловище улитки. Для предотвращения высыхания глаза
постоянно орошаются физиологическим раствором со скоростью 10 мл/ч. Перед каждым глазом
на расстоянии 1 см располагаются светодиоды белого свечения HB5-439AWD (диаметр
светодиода 5 мм, угол свечения 22 град., сила света 7 Кд), соединенные с электрическим
5
стимулятором MSE-3R (Nihon Kohden). Применяются одиночные и парные световые стимулы
различной яркости и продолжительности. Запись ЭРГ через усилитель постоянного тока (ЭРГ) и
переменного тока (импульсной электрической активности зрительного нерва) производится на 4канальный чернильный самописец. Для проведения морфологических исследований регенераты
фиксируются в жидкости Карнуа и в глутаральдегиде и после соответствующих процедур
заключаются соответственно в парафин и смолу для световой и электронной микроскопии.
Вышеуказанные процедуры проводятся на улитках в день их возвращения на Землю.
Аналогичные полетным исследования проводили на животных контрольных групп, а
также на центрифуге и в клиностате. Состояние повышенной силы тяжести величиной до 5 ед и
продолжительностью до 1 мес создается на центрифуге БМЦ-ЭМИБ (СССР). Контейнеры с
биообъектами размещаются в металлических стаканах центрифуги внутренним диаметром 65
мм и высотой 90 мм и в стакане, расположенном на оси центрифуги. Контейнеры с биообъектами
закрепляются на горизонтальную ось клиностата и подвергаются непрерывному вращению
продолжительностью до 1 мес со скоростью один оборот в течение 15-20 минут.
Необходимые средства для проведения КЭ:
1. РС МКС, позволяющий в полной мере решить научные задачи КЭ «РЕГЕНЕРАЦИЯ-1».
2. Наземный
лабораторный
комплекс
(инкубационные
контейнеры,
электрофизиологическая установка, оптический микроскоп, трансмиссионный и сканирующий
электронные микроскопы, центрифуга, клиностат, радиация, вибростенд).
2. Необходимость проведения КЭ в условиях космического пространства в составе РС
МКС
В соответствии с целью и задачами КЭ может быть выполнен только в условиях
космического пространства в составе РС МКС, при активном участии экипажа в его реализации.
Участие экипажа в КЭ необходимо для выбора оптимального места размещения контейнеров с
биообъектами РС МКС, для регулярного отслеживания температуры в зоне расположения
контейнеров с биообъектами и передачи информации на Землю.
3. Описание КЭ
3.1 Порядок проведения КЭ
Российский экипаж переносит аппаратуру «Статокония» и «Регенерация» на РС МКС,
размещает её в служебном модуле на панели № 406, фотографирует и докладывает на Землю о
выполнении работ. В течение всего полета происходит регистрация значений температуры
температурным датчиком и радиационного фона дозиметрическим датчиком, расположенными в
близости
от
аппаратуры.
После
окончания
эксперимента
аппаратура
«Статокония» и
6
«Регенерация» демонтируется с места экспонирования и переносится в спускаемый аппарат для
возвращения на Землю.
3.2 Принципиальные требования к условиям выполнения КЭ.
Точное выполнение циклограммы. Отслеживание температуры в указанные в циклограмме
сроки и передача информации на Землю.
3.3 Технические особенности НА.
Техническими особенностями НА являются: контейнер «Улитка» с сепараторнофильтрационным устройством и контейнер «Планария» с тройным уровнем защиты.
4.
Новизна,
оценка
качественного
уровня
по
сравнению
аналогичными
отечественными и зарубежными исследованиями
Новизна КЭ состоит в установлении возможных причин возникновения аномальных форм
регенератов в орбитальном полете на РС МКС с использованием адекватных задачам методов
исследований. Аналогичные отечественные и зарубежные исследования отсутствуют.
5. Ожидаемые результаты и их предполагаемое использование
5.1 Основные результаты КЭ.
5.1.1 Сведения о регенерации поврежденных частей тела у животных организмов в
условиях орбитального полета.
5.1.2 Результаты КЭ позволят определить возможные причины появления аномалий
восстановительного морфогенеза в процессе регенерации поврежденных частей тела у животных
организмов в условиях орбитального полета.
5.2 Предполагаемые результаты.
Экспериментальные данные, полученные при решении поставленных в КЭ задач, могут
быть учтены при разработке стратегии медицинского обеспечения длительных космических
полетов.
6. Обоснование
технической
возможности
создания
НА
с
заданными
характеристиками
Будут использованы уже имеющиеся разработки, эксплуатируемые на РС МКС при
проведении КЭ «РЕГЕНЕРАЦИЯ» (инкубационные контейнеры «Улитка» и «Планария»).
7. Характеристики рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ
Риск и дискомфорт при проведении КЭ отсутствуют.
7
Список цитируемой литературы
1.
Бесова Н.В., Савельев С.В., Черников В.П. // Бюл. экспер. биол. 1993. Т. 116, № 7. С.90-92.
2.
Григорян Э.Н., Антон Г. Дж., Миташов В.И. В сб. Материалы XII конференции по
космической биологии и авиакосмической медицине. 10-14 июня 2002. М. 2002. С. 123-124.
3.
Григорян Э.Н., Ойгенблик Э.А., Тучкова С.Я, Мальчевская И.Е., Миташов В.И. В кн.:
Результаты исследований на биоспутниках. М., Наука. 1992. С. 345-350.
4.
Горгиладзе Г.И. Доклады академии наук. 2008, Т. 421 № 1, С. 131–134.
5.
Горгиладзе Г.И., Короткова Е.В., Тихонравова Н.М., Новоженова Ю.В. Материалы XIII
конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина». К 45-летию первого
полета человека в космос. 13-16 июня 2006 г., Москва, Россия. Москва, 2006. С. 81-82.
6.
Горгиладзе Г.И., Короткова Е.В., Тихонравова Н.М. Материалы 5-го Международного
аэрокосмического конгресса. 27-31 августа 2006 г., Россия. Москва, 2006. С. 75-76.
7.
Горгиладзе Г.И., Короткова Е.В., Кузнецова Е.Е., Мухамедиева Л.Н., Бегров В.В., Пепеляев
Ю.В.. Авиакосмическая и экологическая медицина. 2010. Т. 44. № 3. С. 61-64.
8.
Дурнова Г.Н., Бурковская Т.Е., Воротникова Е.В. // Космическая биол. 1991. Т. 25, №5. С.
29-33.
9.
Тартаковская О.С. Влияние экологических факторов (плотность популяции, световой режим)
и возраста на регенерацию периферического отдела зрительного аппарата брюхоногого
моллюска Achatina fulica. Автореф. дисс. уч. ст. канд. биол. наук. Калининград, 2003.
10.
Тучкова С.Я, Брушлинская Н.В., Григорян Э.Н., Миташов В.И. // Изв. РАН. Сер. биол. 1994.
№6. С. 859-867.
11.
Agata K. // Current Opinion in Genetics and Development. 2003. V. 13. № 5. P. 492-496.
12.
Berg E., von, Schneider G.// Naturwissenschaften. 1967. 54 Jahrgang. H. 22. S. 591-592.
13.
Brøndsted H.V. Planarian Regeneranion. Pergamon Press, New York, 1969, 276 p.
14.
Eakin R.M. Ferlatte M. // J. Exp. Zool. 1973. V. 184. № 1. P.81-95.
15.
Flores D.V., Pellegrino de Iraldi A. // Z. Zellforsch. 1973. V . 142. № 1. P. 63-68.
16.
Flores D.V., Salas P.J.I., Saavedra J.P. // J. Neurobiology. 1983. V. 14. № 3. P. 167-176.
17.
Gillary H.L. // Vision Res. 1970. V. 10. P. 977-991.
18.
Sánchez Alvarado A. // Cell. 2006. V. 124. № 2. P. 241-245.
19.
Sánchez Alvarado A. // Comptes Rendus Biologies. 2007. V. 330. № 6/7. P. 498-503.
20.
Sánchez Alvarado A., H. Kang. // Exp. Cell Res. 2005. V. 306. № 2. P. 299-308.
Научный руководитель и ответственный исполнитель
Вед. научн. сотр. д.б.н. проф.
Г.И. Горгиладзе