введение - Nirvana.FM
advertisement
ВВЕДЕНИЕ Растительные организмы построены из большого числа различных клеток, тканей и органов, и поэтому им необходима система, которая обеспечивала бы координацию функционирования его отдельных частей, а также регулирование на уровне целого растения. Клетка должна не только поддерживать собственную целостность, но функционировать согласованно с другими клетками организма растения, этому между клетками происходит обмен информацией. Одна группа клеток при этом становится «отправителями» сигнала, а другая воспринимает его. Сигнал химической природы, молекулу с сигнальной функцией называют первичным мессенджером. Растительная клетка воспринимает разнообразные химические стимулы, реагирует на них. Физиологический ответ вызывает изменение концентрата сахаров во флоэмном токе, олигомерные сахара и фрагменты хитина, индолилуксусная кислота, брассиностероиды и др. Среди обширного списка первичных мессенджеров можно выделить гормоны растений. Вещество можно отнести к гормонам, если оно обладает следующими свойствами: • вызывает специфический физиологический ответ; особенность растительных гормонов в том, что они запускают крупные программы развития не только на уровне клеток, но и на уровне тканей, органов, целого растения; • синтезируется в растении одной группой клеток, а отвечает на него другая группа (разобщено место синтеза и место действия, т.е. сигнальное вещество транспортируется). К синтезу гормонов потенциально способна любая клетка растений; как правило, фитогормоны являются низкомолекулярными соединениями. • практически не играет роли в основном метаболизме клетки, а используется лишь для сигнальных целей. Иногда эти свойства расширяют: • вещество действует в низкой концентрации — не более 10~5 моль/л. Перечисленные свойства позволяют ограничить круг веществ, традиционно считающихся растительными гормонами (в научной литературе их принято называть фитогормонами): ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизовую кислоту, этилен, брассиностероиды, жасмоновую и салициловую кислоты, а также полипептид системин. 1 ПОНЯТИЕ ФИТОГОРМОНА Фитогормоны –это органические, сравнительно низкомолекулярные эндогенные вещества, с помощью которых осуществляется взаимодействие различных клеток, органов и тканей, которые необходимы для запуска, регуляции и выключения морфогенетических и физиологических программ. Было установлено, что с помощью фитогормонов осуществляется координация взаимодействия клеток, тканей и органов в растении, регуляция функций и обеспечение целостности организма, запуск морфогенетических и физиологических программ. Фитогормонам принадлежит важная роль в ответных реакциях растения на разные внешние воздействия. Необходимо подчеркнуть, что очень редко фитогормоны функционируют в одиночку. Тем более эмпирически очень трудно вычленить эффекты, оказываемые при их экзогенном применении. Даже если ткани обрабатываются одним фитогормоном, наблюдаемый эффект будет определяться не только им, но и другими эндогенными гормонами. Взаимодействие отдельных фитогормонов в организме растения может осуществляться как в процессе их синтеза, транспорта и катаболизма, так и на уровне механизма действия. Тем более, что некоторые элементы рецепции и передачи сигнала для ряда фитогормонов могут быть общими. Фитогормоны принимают участие в процессах формирования пола ,старения и перехода к стадии покоя, в транспорте веществ, в передаче сигналов об изменении внешней среды и адаптации к стрессовым воздействиям, в регуляции процессов синтеза органических соединений и их распада. РЕЦЕПТОРЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГОРМОНОВ Для того чтобы гормон мог вызвать ответную реакцию клетки, нужен соответствующий рецептор. Открытие рецепторов стало возможным благодаря многолетним исследованиям физиологов, молекулярных биологов и генетиков. Уже более 10 лет назад был детально охарактеризован рецептор ауксина. Но прямых доказательств его рецепторной функции до сих пор не получено. До последнего времени вопрос о том, что представляют собой рецепторы фитогормонов оставался открытым. более того, было не ясно, локализованы рецепторы гормонов растений не плазмалемме как пептидные гормоны животных, или они находятся в цитоплазме как их стероидные гормоны. 2 В самые последние годы открыты рецепторы этилена и цитокининов, которые по своей структуре оказались очень близкими. Открытие этих рецепторов стало возможным благодаря получению мутантных растений арабидопсиса ,не реагирующих на эти гормоны, а так же благодаря полному секвенированию генома этого растения. Секвенирование- это определение первичной последовательности нуклеотидов в цепи ДНК. Рецепторы этилена и цитокининов представляют собой специальные ферменты, аналогичные гистидиновым протеинкиназам прокариот. Гистидинкиназы ( фосфотрансферазы)- это ферменты, способные переносить остатки фосфорной кислоты на гистидин белка. Гистидинкиназа, являющаяся рецептором цитокининов, представляет собой высокомолекулярный трансмембранный белок. Внешняя ее часть взаимодействует с цитокинином, а внутренняя – отвечает на это взаимодействие фосфорилированием гистидина. Далее остаток фосфата с гистидина переносится на остаток аспарата, располагающегося в С концевой области этого белка. Затем активный фосфат способен переходить через посредники ( мессенджеры) на другие белки-регуляторы ответа (RR- белки), ответственные за активность соответствующих генов. Рецептор ответа активизируется и активирует ( или репрессирует) соответствующие группы генов, что стимулирует ( или ингибирует ) синтез определенных ферментов. Начало или окончание синтеза определенного белка и является ответной реакцией на действие гормона. Рецептор этилена тоже является гистидиновой протеинкиназой, он представляет собой белковую молекулу, полипептидная цепь которой содержит 3 гидрофобных участка, следовательно, она трижды пересекает плазмалемму. N конец этой цепи находится в периплазматическом пространстве клетки (внеклеточная часть) и к нему присоединяется этилен. Связыванию этилена с рецептором способствуют ионы меди. С конец этой цепи находится в цитозоле и является трансмиттером, который представляет собой белок, аналогичный гистидиновым протеинкиназам бактерий. Механизм передачи сигнала с этого рецептора похож на механизм передачи с рецептора цитокининов. Рецептор связывается с этиленом в периплазматическом пространстве клетки, при этом меняется форма его молекулы. Эти конформационные изменения передаются на трансмиттер, находящийся в цитоплазме. Результатом является фосфорилирование остатка гистидина трансмиттера. Затем фосфатный остаток переносится на остаток аспарагиновой кислоты, находящийся в регуляторе ответа. Итак, связывание гормона с поверхностным рецептором – это начало передачи ( трансдукции сигнала). Молекула гормона должна образовать комплекс с рецепторной частью сенсорного белка, 3 поэтому для каждого гормона нужен свой рецептор. Поступивший сигнал (присутствие гормона) с помощью вторичных мессенджеров многократно усиливается и передается на системы клеточного ответа. Ответной реакцией является активация определенного гена и синтез кодируемого им белка, что вызывает начало роста, его прекращение или дифференцировку клетки. Вообще путь передачи сигнала у высших растений сложен и пока мало изучен. Предполагают, что в нем участвуют фосфолипаза D, протеинфосфатаза и, возможно, кальций/кальмодулин. Нельзя исключить также наличие рецепторов гормонов, локализованных в нуклеоплазме или цитоплазме растительных клеток. РЕЦЕПЦИЯ И УСИЛЕНИЕ СИГНАЛА Первичные мессенджеры, воспринимаемые клеткой как сигналы, специфически взаимодействуют со многими белковыми молекулами. Так, ауксин с высокой эффективностью связывается с рецепторами, транспортными белками, ИУК -оксидазой, ИУК -гликозидазой, но не каждое взаимодействие приводит к физиологическому ответу. Чтобы клетка ответила на стимул, нужно включить внутриклеточную систему вторичных мессенджеров. Одна из функций вторых мессенджеров — усиление сигнала (один С-белок активирует более 10 молекул фосфолипазы С; одна молекула ауксина приводит в движение до 10 4 атомов). Для поиска рецепторов применяют следующие правила: 1)рецептор взаимодействует с гормоном и его аналогами; чем больше физиологический ответ, вызываемый аналогом, тем выше эффективность; 2) при взаимодействии рецептор не должен менять химическую структуру ( исключают белки, метаболизирующие гормоны); 3) взаимодействие гормона с рецептором приводит к включению системы вторичных мессенджеров. Большинство систем вторичных мессенджеров, изученных у животных, в настоящее время обнаружены и у растений. Каскад усиления сигнала называют характерным мессенджером. Наиболее известны фосфатидилинозитольная, енилатциклазная и гуанилатциклазная системы, МАР-киназный каскад и др. Рецепторы обычно локализованы на плазмалемме, но не исключена их локализация в других компартментах клетки. Рецептор при этом связан с разными вторичными мессенджерами. Так, при его локализации в цитоплазме первостепенную роль играют белокбелковые взаимодействия, активирующие процессы фосфорилирования/дефосфорилирования, что приводит к 4 изменению метаболизма и работы цитоскелета. При внутриядерной локализации рецептор взаимодействует с белками ядра так, чтобы включить одни и выключить другие промоторы, обеспечивая специфический ответ на уровне генома. Фосфатидилинозитольная система вторичных мессенджеров Принципы работы вторичных мессенджеров в данном подразделе показаны на примере фосфатидилинозитольной системы. Фосфатидилинозитол — один из липидов плазмалеммы, поэтому фосфатидилинозитольная система работает с рецепторами, расположенными на внешней мембране. При связывании с гормоном белок-рецептор меняет конформацию и не дает сигнал на О-белок. О-белки названы так за способность связывать и гликолизировать ГТФ. Конформация белкового комплекса рецептора влияет на способность С-белка связывать и удерживать ГТФ. Пока молекула ГТФ остается связанной с О-белком, он успевает активизировать до 10 молекул фосфолипазы С, входящей в состав мембранных потоков. После этого происходит гидролиз ГТФ, ГДФ и фосфат освобождают О-белок, который переходит в неактивное состояние, пока не захватит новую молекулу ГТФ. Работа С-белка регистрируется в первые 1 — 5 с после обработки гормоном. Активизация фосфолипазы С приводит к гидролизу фосфатидилинозитол фосфата. При этом в мембране остается гидрофобный остаток диацилглицерина, а в цитоплазму поступает инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3). Именно это событие и дало название всему каскаду вторичных мессенджеров. Уменьшение доли фосфатидилинозитолтрифосфата и поступление фосфатинозитолтрифосфата в цитоплазму наблюдается уже через 10— 15 с после получения сигнала, достигая максимума к 60 с. Инозитолтрифосфат может взаимодействовать с Са -каналами на мембране. Через 2 мин после обработки гормоном в цитоплазму начинает поступая кальций. Этот процесс имеет характер осцилляции (так называемые «кальциевые волны»). Концентрация кальция в клетке изменяется приблизительно с I до 100 моль/л. Дальнейшее повышение концентрации кальция может вызвать автолиз клетки: активизируются Са-зависимые фосфолипазы (например, фосфолипаза А), что приведет к разрушению мембраны. Чтобы избежать автолиза, клетка модулирует уровень кальция через концентрацию инозитолтрифосфата. Так, при превышении уровня ИФ3 может происходить дополнительное фосфорилирование, а инозитолтетрафосфат (ИФ4) уже не взаимодействует с Са каналами. При этом инозитолтетрафосфат используется км депо, из 5 которого можно «изъять» новую порцию активного инозитолтрифосфата. После достижения максимума инозитолтрифосфат поэтапно гидролизуется до инозитола. Далее инозитол включается в состав фосфатидилинозитола и только в составе мембраны фосфорилируется до фосфатидилинозитолдифосфата и используется еще раз. Фосфатидилинозитолдифосфат является важным модулятором при взаимодействии мембран с цитоскелетом. Так, повышение его доли в составе мембран провоцирует сборку активных филаментов.: дефосфорилирование приводит к разборке цитоскелета. Инозитол в растительных клетках может полностью фосфорилироваться, превращаясь в инозитолгексафосфат (фитин). Обычно это соединение рассматривают как депо фосфора в семенах и запасных тканях. У дрожжей инозитолгексафосфат необходим для транспорта РНК из ядра в цитоплазму. Возможно, похожие явления будут обнаружены и у растений. Кроме фосфатидилинозитольной системы у растений обнаружены еще несколько сигнальных систем. Например, аденилатциклазная система похожа по действию на аналогичную систему животной клетки. В липоксигеназной системе в регуляцию сигнального каскада вовлечена также фосфолипаза А, активируемая кальцием. После ее активизации в мембране появляются свободные жирные кислоты. Кроме того, кальций активизирует липоксигеназу, которая включает кислород в состав полиненасыщенных жирных кислот с образованием пятичленных углеродных колец. Одним из результатов работы липоксигеназы является синтез жасминовой кислоты, блокирующей Са-каналы, что предотвращает избыточное поступление кальция. Есть сведения о работе в растительной клетке системы фосфатидной кислоты, НАДН-окси-ВазноЙ системы, пароксидазной системы, МАРкиназного каскада. Следующими по времени активируются функциональные системы клетки, происходит активация/инактивация генов, изменяется мембранный потенциал. Так, активация фосфатидилинозитольной системы ауксином вызывает выброс протонов из цитоплазмы за счет активизации И-помпы. Через 5 — 7 мин после воздействия гормона наблюдается закисление матрикса клеточной стенки. Ответ этого компартмента на закисление зависит от состава клеточной стенки, в частности от присутствия кислых гидролаз, инвертазы, доли пектиновых веществ и т.д. Увеличение размеров клетки начинается через 10— 12 мин после обработки ауксином. При закислении клеточной стенки из пектина освобождается кальций, связанный с кислотными группировками. Таким образом, растительная клетка использует клеточную стенку как депо Са +. Уровень Са в цитоплазме зависит от концентрации инозитолтрифосфата и жасминовой кислоты, состояния матрикса 6 клеточной стенки, работы Са -каналов и Са ' –АТФ. Эти факторы действуют не одновременно, причем приток кальция в клетку провоцирует процессы, приводящие к снижению его концентрации и наоборот. В результате поток кальция оказывается неравномерным во времени, возникают волны поступления/удаления кальция. Динамика волн кальция существенно различается для разных внешних сигналов. До 70 % поступившего в клетку кальция связывается с цитоскелетом, активизируя его работу. Важным вторичным мессенджером в передаче сигнала являются небольшие белки — кальмодулины. Кальмодулин имеет 4 центра, связывающихся с Са , и его конформация различается в зависимости от числа занятых кальцием центров. От активности кальмодулинов, в частности, зависит работа Са -АТФаз: полностью заполненный кальцием кальмодулин усиливает выкачивание кальция из клетки. Гидрофобный диацилглицерин также является вторичным мессенджером. Он взаимодействует с протеинкиназой С, повышая ее фосфорилирующую активность. Далее запускается каскад фосфорилирования белков. Вторичными мессенджерами в приведенном примере выступают С-белки, фосфолипазы С и А, инозитолтрифосфат, жасминовая кислота, кальций, цилглицерин, протеинкиназа С. При добавлении в клетку какого-либо из мессенджеров даже без первичного сигнала можно наблюдать физиологический ответ (обычно такой ответ бывает неполным). ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИГНАЛОВ Несмотря на большое многообразие первичных сигналов, при ответе клетка часто активизирует одни и те же механизмы, которые можно назвать неспецифическим ответом. Так, при действии ауксинов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты, красного света и даже при оказании механического давления на клетку, уже через I мин можно зарегистрировать гидролиз фосфатидилинозитолдифосфата со всей цепочкой последующих событий. Активизируются и другие системы вторичных мессенджеров. Один и тот же компонент может входить в несколько каскадов усиления сигнала. Так. многие системы вторичных мессенджеров включает Са +. Часто происходит изменение резус статуса клетки и увеличивается концентрация активных форм кислорода. Протеинкиназы и факторы транскрипции изменяют активность в ответ на несколько воздействий. Оказывается, что участники одного каскада вторичных мессенджеров вовлечены и в другие реакции ответа. Тогда говорят о «переговорах» путей передачи сигнала. При повреждении ( точек 15 перекрестной регуляции нарушается физиологический ритм на несколько стимулов одновременно. Так, 7 определенный мутант не чувствителен ни к свету, ни к силе тяжести. Очевидно, белковый продув гена участвует в «переговорах» между каскадами мессенджеров фотогравитропизма. Если бы на каждом этапе передачи сигнала происходило только усиление, ответ слишком быстро охватил бы все молекулы в клетке. Этого не происходит благодаря «переговорам»: если один сигнал «противоречит» другим, в результате «переговоров» число его мессенджеров уменьшается. Востребованный сигнал в результате «переговоров» усиливается. Таким образом, одна из функций «переговоров» между сигнальными модулями — модуляция сигнала. Специфический ответ клетки предполагает, что : 1) разные клетки в одном организме отвечают на стимул не одинаково; 2) одна и та же клетка отвечает на разные стимулы по-разному. Это достигается за счет того, что в ядре экспрессируется разный набор мРНК, в клетке вырабатываются новые белки, что позволяет развить адекватную реакцию на стимул. Восприятие сигнала завися от состояния, в котором находилась клетка перед его получением, — от набора рецепторов, экспрессированных в данный момент, наличия вторичных мессенджеров, результатов «переговоров» между сигналами и т.д. В организме растения существует позиционная информация, т.е. клетки «умеют оценивать» свое положение. Это позволяет им интегрироваться в единый организм и давать адекватный ответ на внешние и внутренние стимулы. Программированная гибель клеток — это ответ растения как единого целого, идущий вопреки «интересам» отдельных клеток. Запрограммированная гибель характерна для элементов ксилемы, пробковой ткани, при реакции сверхчувствительности (ответ на внедрение патогена). ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГОРМОНОВ ПО ГРУППАМ АУКСИНЫ : В 1935 году Ф. Кегль идентифицировал это вещество – индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Так как оно стимулировало рост растяжением, Кегль назвал его – ауксином (от греч. Auxeinувеличиваться, расти). ИУК присутствует практически во всех тканях растительного организма. Очень много в молодых почках и листьях, цветках и камбии, проводящей системе, семенах. ИУК один из основных гормонов высших растений и вызывает такие физиологические эффекты: активирует деление и растяжение клеток 8 необходим для формирования сосудов и боковых корней, обладает аттрагирующим эффектом -способность притягивать питательные вещества ауксин играет главную роль в ростовых движениях – тропизмах и настиях. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ: Несмотря на множественность эффектов ИУК, первичные реакции, которые этот гормон вызывает при взаимодействии с клеткамимишенями, практически во всех случаях одинаковы и начинаются со связывания ауксина с рецептором. Последующий ответ зависит от двух факторов: от специализации клетки, определяемой набором генов, которые экспрессируются в момент воздействия гормона, и, вовторых , от концентрации других сигнальных молекул. Одни клетки в ответ на ауксин начнут расти растяжением, другие станут дифференцироваться и формировать сосуды, третья делиться и образовывать примордии боковых корней. Рецептором ИУК является полипептид с молекулярной массой 22 кДа, локализованный на эндоплазматическом ретикулуме и формирующий димер. Часто, особенно в англоязычной литературе, этот рецептор называют- ауксиносвязывающим белком 1 или АВР-1. Дальнейшая передача и усиление сигнала, рецептируемого АВР-1, осуществляется с помощью таких вторичных посредников, как ионы Са, МАР-киназный каскад, G-белки, система инозитолтрифосфаной сигнализации. Конечным пунктом ауксинового сигнала является геном. Установлено, что ИУК может оказывать влияние на экспрессию ряда генов уже через 2-3 мин. Такая высокая скорость активации генов возможна только в том случае, когда имеются соответствующие транскрипционные факторы. Гены, экспрессия которых стимулируется предсуществующими факторами транскрипции, называют -генами первичного ответа, или ранними генами. Такое определение подразумевает, что весь набор белков, необходимый для ИУК-индуцируемой экспрессии генов, присутствует в клетке в момент воздействия гормона. Гены первичного ответа на гормоны выполняют как минимум три функции: они кодируют белки, регулирующие транскрипцию генов вторичного ответа, необходимых для формирования длительных ответных реакций на гормон. ранние гены вовлекаются в процессы межклеточных взаимодействий (сигнализации). Обнаружена группа генов первичного ответа, которая связана с процессами адаптации к стрессовым воздействиям. 9 В промоторной зоне генов первичного ответа найдены специфические участки, называемые –ауксиноотвечающими элементами, которые обеспечивают ответную реакцию на ИУК. Специфичность к гормону зависит от консервативной последовательности нуклеотидов, которая определяет индуцибильность гена ауксином. В промоторной зоне гена GH3 например, идентифицирован консервативный ауксиноиндуцируемый элемент, состоящий из шести нуклеотидов (TGTCTC), который отвечает за чувствительность (специфичность) промотора к ауксину. ГИББЕРЕЛИНЫ: Образно гиббереллины можно назвать «гормонами благополучия зеленого листа». Гиббереллины вырабатываются в основном в фотосинтезирующих листьях, но могут синтезироваться и в корнях. Действуют гиббереллины прежде всего на интеркалярные меристемы, расположенные в непосредственной близости от узлов, к которым прикреплены листья. Это можно наблюдать при обработке гиббереллинами злаков: растения сильно вытягиваются, механическая прочность соломины понижается, стебель полегает.В настоящее время известно около 110 гиббереллинов, многие из которых не обладают физиологической активностью в растениях. В связи с их большим количеством, гиббереллины стали обозначать символом – ГА. Гиббереллины представляют собой тетрациклические дитерпеновые кислоты и по количеству углеродных атомов в молекуле разделяются на две группы: 1. С20 – гиббереллины, содержат 20 углеродных атомов; 2. С19 –вторая половина гиббереллинов, утрачивает один атом. Наиболее характерный эффект, который гиббереллины вызывают в растениях, -это удлинение их стебля; а также : Увеличивают количество междоузлий Индуцируют цветение и образование бессемянных ягод Регулируют пол растений, активизируют завязывание и развитие плодов Стимулируют прорастание семян. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ: Основным объектом в физиологических и молекулярно-генетических исследованиях механизма действия 10 гиббереллинов служит изолированный алейроновый слой клеток эндосперма злаков. Главной моделью, которую используют для выяснения молекулярного действия гиббереллинов, является процесс синтеза и секреции алейроновым слоем L-амилазы фермента, расщепляющего крахмал. ГК стимулирует синтез и секрецию только L-амилазы. Другие гидролазы синтезируются в алейроновом слое независимо от гиббереллина. Гиббереллины контролируют только процесс их секреции клетками алейронового слоя в крахмалистый эндосперм. Получены убедительные доказательства того, что именно ГК обеспечивает регуляцию экспрессии гена L-амилазы. В промоторной зоне гена L-амилазы ряда злаков выделена высококонсервативная последовательность из 200-300 пар нуклеотидов, которая необходима для регулирования экспрессии гена ГК и которая обеспечивает специфичность именно к этому фитогормону. Этот участок называют GARC –гибберелинрегулируемым комплексом. В этот комплекс входят три специфические нуклеотидные последовательности (бокса), необходимые для гиббереллинового ответа –пиримидиновый бокс, ТААСААА- и ТАТССАС –последовательности. За чувствительность гена L-амилазы и ГК отвечает ТААСААА –бокс, который получил название GARE –гиббереллиноотвечающий элемент. Он самостоятельно может обеспечивать чувствительность гена L – амилазы к ГК. Два других бокса –пиримидиновый и ТАТССАС -также необходимы для полноценного ответа на гиббереллин. Эти три бокса, объединенные в GARC (гиббереллинорегулируемый комплекс), и является мишенью соответствующих факторов транскрипции, образующихся в ответ на гиббереллин. Рис. №1 Строение промоторной зоны гена L-амилазы : Установлено, что одним из ранних генов, активируемых гиббереллинами, является ген –MYB, продуктами которого являются ДНК –связывающие белки, относящиеся к семейству MYB –белков, они являются транскрипционными факторами, регулирующие процессы роста и развития. 11 Наиболее эффективным способом выявления возможных рецепторов ГК и механизма передачи гиббереллинового сигнала является изучение мутантов, у которых повреждена система ответных реакций на обработку этим гормоном. Получен ряд карликовых мутантов например на кукурузе (d8), на арабидопсисе (GAI), которые нечувствительны к обработке ГК. Когда ген GAI был клонирован, оказалось, что его продуктом является фактор транскрипции, который в отсутствие гормона функционирует как репрессор на пути трансдукции гиббереллинового сигнала. ГК снимает эту репрессию. Еще одним важным элементом проведения гиббереллинового сигнала являются ионы Са 2+. Через 1-4 ч. после обработки ГК концентрация ионов Са в цитоплазме клеток алейронового слоя возрастает. Полагают, что ионы Са и кальций связывающий белок кальмодулин участвуют в гиббереллиноиндуцируемой секреции L –амилазы и других гидролаз. ЦИТОКИНИНЫ: Получили свое название из-за своей способности стимулировать цитокинез (клеточное деление). Первый природный цитокинин – заетин – был выделен в 1963 году Д.Летамом и его сотрудниками из незрелых зерновок кукурузы. Цитокинины в присутствии ауксинов индуцируют деление клеток активируют рост растяжением у семядолей двудольных растений при повышенной концентрации вызывают образование побегов в культуре каллусной ткани. Обработка цитокининами предотвращает распад хлорофилла и клеточных органелл у изолированных листьев, задерживает процессы старения, способствует образованию и функционированию апикальных меристем и развитию цветков, снимает эффект апикального доминирования. Цитокинины обладают аттрагирующим (притягивающим эффектом), регулируют выход семян некоторых растений из состояния физиологического покоя и их прорастание. Несмотря на то, что цитокинины способны влиять на многие процессы в растении, наиболее существенным для роста и развития является тот факт, что эта группа фитогормонов вместе с ауксинами контролирует процессы деления клеток. Установлено, что цитокинины стимулируют репликацию ДНК и активируют деление клеток, регулируя переходы : из фаз G1 в S и из G2 в фазу митоза. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ: Хорошим инструментом для анализа молекулярных процессов, контролируемых фитогормонами, являются 12 мутации в генах, продукты которых необходимы для их синтеза, метаболизма или механизма действия. Описано более 40 генов, экспрессия которых контролируется цитокининами. Часть из них относится к генам первичного ответа, другая экспрессируются позже. Различают два основных типа цитокининовых мутаций: 1. Мутанты с низким содержанием гормона и соответственно с ослабленной функцией, за которую он отвечает. Обработка цитокининами этих мутантов может восстановить нормальный фенотип растения. Такие мутации связаны с нарушениями в генетическом контроле процессов синтеза цитокининов, а также их распада и инактивации. 2. У мутантов второго типа нарушены процессы рецепции и передачи гормонального сигнала, поэтому обработка экзогенным гормоном не оказывает на них влияния. Группа японских исследователей получила мутант арабидопсиса (cre1), который не реагировал на цитокинины. Оказалось, что расположенный во второй хромосоме мутантный ген CRE 1 кодирует рецептор цитокининов – двухкомпонентную гистидиновую киназу. Этот белок –рецептор локализован в плазмалемме и имеет гистидинкиназный домен и домен связывания с гормоном. Взаимодействие цитокининов с рецептором инициирует гистидинкиназную активность CRE 1. Далее гормональный сигнал передается путем последовательного фосфорилирования продуктов генов YPD 1, а затем SSK 1 (рис №2). Рис №2 Схема рецепции цитокининового сигнала в растениях: Предполагается, что последний SSR 1 белок функционирует как репрессор, который в отсутствие цитокининов подавляет процессы, регулируемые этим гормоном. Повышение концентрации цитокининов и фосфорилирование SSK 1, снимают эту репрессию. Вскоре было выявлено еще два гена: АНК2 и АНК3, которые кодируют гистидинкиназы – рецепторы цитокининов. То есть у 13 арабидопсиса функции рецепторов цитокининов выполняют, как минимум, три белка –CRE1 (АНК4), AHK2, АНК3. АБСЦИЗОВАЯ КИСЛОТА: В 1961 г. Б. Луи и Х. Карнс из кожуры зрелых коробочек хлопчатника получили в кристаллическом виде вещество, ускоряющее опадение листьев, которое они назвалиабсцизином. Его эмпирическая формула –С15Н20О4. АБК –играет ведущую роль в регулировании покоя, так как является ингибитором прорастания семян и роста почек. Абсцизовая кислота накапливается при водном дефиците, вызывая закрывание устьиц. Растущие ткани или органы растения обычно отвечают на обработку АБК обратимым торможением роста, которое может частично сниматься другими гормонами. Торможение роста, вызываемое АБК, сопровождается подавлением синтетических процессов и ускорением старения тканей. Очень важной функцией АБК является активация синтеза специальных белков, которые способствуют повышению устойчивости зародыша к высыханию. АБК — гормон осмотического стресса Абсцизовая кислота появляется в клетке в ответ на изменение состояния воды, вызванный тремя факторами: подсушиванием, повышением концентрации веществ в клетке, охлаждением. В этих случаях вода для клетки менее доступна, т.е. наблюдается водный дефицит. Для нормальной жизнедеятельности все молекулы должны находиться в определенных условиях оводнения. Белки и нуклеиновые кислоты удерживают воду с помощью водородных связей. В клетке поддерживается также определенная ионная сила, что не менее важно для поддержания конформации биополимеров. Нехватка воды и повышение ионной силы приводят к денатурации биологически активных молекул. При повторном увлажнении вернуть им активность сложно. При стрессе клетка должна «принять меры» по сохранению конформации ДНК, РНК и белков. Этим и обусловлены эффекты АБК. В ответ на АБК в клетке повышается уровень оксипролина, сахарозы и других осмотически активных веществ. Осмотическое давление увеличивается, что препятствует потере воды. Кроме этого в клетках появляется небольшой крайне гидрофильный белок осмотин, повышающий матричный потенциал воды. В клетках можно увидеть даже появление гранул, состоящих из осмотина. АБК усиливает синтез полиаминов (спермидина, путресцина). Полиамины несут положительный заряд (азот аминогрупп протонирован). Молекулы ДНК и РНК заряжены отрицательно, они легко ассоциируются с молекулами полиаминов, а в комплексах с полиаминами ДНК и РНК более устойчивы и к изменению ионной 14 силы, и к обезвоживанию. Синтез новых ДНК и РНК под действием АБК прекращается, клетка переходит в состояние покоя. При холодовом стрессе главная задача клетки — не допустить кристаллизации воды, так как кристаллы льда нарушают структуру мембран. Опасен также эффект «вымораживания»: растворенные в воде вещества не включаются в кристаллы льда и в не замерзшем растворе их концентрация повышается, т.е. увеличивается ионная сила. При охлаждении АБК останавливает синтез белков, ДНК и РНК, накапливаются полиамины, оксипролин, сахара и осмотин. Осмотически активные вещества препятствуют кристаллизации воды: вода становится аморфной и не повреждает мембраны. От АБК зависит биосинтез антоцианов, т.е. при понижении температуры растения становятся красным (фиолетовыми), но физиологический смысл этой реакции пока не ясен. Мутанты по синтезу АБК гибнут при легкой засухе и слабых заморозках. Хотя все защитные механизмы имеются, они не включаются без абсцизовой кислоты. Если перед стрессом такие мутанты обработать АБК, их устойчивость повышается. Для предотвращения водного дефицита нужно закрыть устьица. Действительно, в ответ на АБК устичные щели закрываются за 10— 15 мин. При по венной засухе корень синтезирует АБК, передает этот сигнал листьям, и устьица закрываются. В сильную засуху растение сбрасывает часть листьев, чтоб избавиться от лишней испаряющей поверхности. АБК отвечает за листопадом только при засухе. При водном дефиците должны остановиться процессы роста (на 95 —98 % органы растений состоят из воды): АБК ингибирует транспорт ауксина и растяжение клеток. Абсцизины синтезируются при увеличении концентрации осмотически активных веществ, например сахаров, образующихся в листьях активно растущих веток. В молодых ветках яблони содержание АБК повышается, и деревья середине лета впадают в состояние физиологического покоя. Мы не наблюди видимого роста, но меристемы продолжают работать. На насыщенном АЬК.' побеге развиваются почки. Из физиологического покоя растение сложно вывести внешними факторами. Высокий уровень АБК не дает транспортироваться ауксинам из апекса побега, т.е. нет апикального доминирования и боковые почки развиваются в пазухах всех листьев. АБК действует на почки все лето, но заканчивается ее действие в разно время. У большинства деревьев умеренной зоны действие АБК прекращается зимой, а у конского каштана — осенью (в теплую осень почки, освободившиеся от АБК, открываются, каштан цветет повторно). У других растений высокое содержание АБК держится до заморозков, и даже до января — февраля. Только тогда АБК может начать разрушаться. 15 Разрушению АБК препятствует низкая температура воздуха. Это — фа вынужденного покоя, вызванного неблагоприятными факторами (низкая температура, дефицит воды). Как только стресс закончится, АБК разрушается - начинается видимый рост. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ: Вероятным рецептором АБК является белок, кодируемый геном RPK1. Этот ген начинает экспрессироваться в ответ на обработку АБК, а также под влиянием таких стрессовых воздействий как: засоление, водный дефицит, понижение температуры. Белки-рецепторы АБК еще недостаточно охарактеризованы. Белок RРК 1 - является трансмембранным, связывается с АБК и содержит протеинкиназный цитоплазматический домен. Известны некоторые компоненты системы трансдукции АБК -сигнала. Так. сразу после действия АБК в замыкающих клетках устьиц из НАД + синтезируется циклическая АДФ -рибоза, которая может активизировать Са +-каналы (рис.№ 3). Рис№ 3 Схема рецепции и передачи сигнала АБК / — взаимодействие АБК с мембранным рецептором; 2а, 26, 2в — возможные пути передачи сигнала по системе вторичных мессенджеров; 3 — активизация фосфатидилинозитольной системы (см. рис. 7.3), ИФ) — и инозитол три фосфат; 4 — открывание Са '-каналов; 5— белки -продукты генов АВ1 1 11 АВ1 2 передают сигнал в ядро; 6 — взаимодействие транскрипционных факторов с промоторами и экспрессия АБК -зависимых генов; 7а, 76, 7в — синтез веществ-протекторов, защищающих клетку от стресса; 8 — синтез запасных белков при переходящих в состояние покоя. Са+ поступает в цитоплазму из внутриклеточных депо, цитозоль подщелачивается. Высокий рН активизирует протеинфосфатазы АВ1 1 и АВ1 2. дефосфорилирующие гипотетический белок -репрессор АБКсигнала. Пока репрессор фосфорилирован, он не дает проявляться ответам на АБК. Потеря фосфата инактивирует репрессор, и клетка отвечает на АБК. Если протеинфосфатазы не активны, репрессор 16 постоянно подавляет ответ на АБК, растение теряет чувствительность . Мутации по этим фосфатазам идентифицированы как нечувствительные к АБК, а соответствующие гены названы АВ1 1 и АВ1 2. Предполагают, что в развитии ответа на АБК играют роль Саг+-волны, распространяющиеся с интервалом около 1—2 мин. В ответ на АБК у замыкающих клеток устьиц на плазмалемме открываются быстрые К+каналы и медленные анионные каналы, через которые К*, С1 и малат выходят из клетки. Осмотическое давление понижается, выходит вода и теряется тургор, устьичная щель закрывается. Закрывание устьиц — очень быстрый ответ на АБК, и геномная регуляция не успевает включиться. Для активизации/инактивации генов в ядре важен белок АВ1 3 у арабидопсис содержащий домены, характерные для активаторов транскрипции. Без АВ1 3 или \Т 1 не экспрессируются ЕМ -гены), не идет синтез антоцианов, не накапливаются запасные белки в семенах и т.д. В соответствующих промоторах найден достаточно консервативный мотив — АБК- регулируемый консенсус (АВRС). Впрочем, одного белка АВ1 3 или УР I недостаточно для активации транскрипции через АВRC -мотив. Необходим довольно сложный транскрипционный комплекс, в который могут входить ЕМВ -белки (димерные транскрипционные факторы типа «лейциновой застежки»). Повреждение белков АВ1 3 или УР 1 в результате мутации ведет к нарушению процессов формирования зрелого семени и преждевременному прорастанию. ЭТИЛЕН: В 1924 г. Ф. Денни показал, что преждевременного созревания апельсинов, бананов и других плодов можно добиться обработкой этиленом. В 1934 г. Р. Гэйн с коллегами идентифицировали этилен химически как нормальный продукт метаболизма растений и , исходя из его физиологических эффектов, впервые назвали его гормоном. Спектр физиологических процессов, контролируемых в растении этиленом, очень широк и включает: созревание плодов и старение тканей прорастание семян и рост клеток растяжением развитие цветков и эпинастию образование корневых волосков и защиту от патогена. Этилен участвует в ответных реакциях растительных организмов на различные стрессовые воздействия, а также способен включать ряд элементов в системе защиты растений от патогенов –синтез ферментов, разрушающих клеточную стенку грибов и фитоалексинов. Этилен –основной регулятор опадения листьев. 17 МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ: В настоящее время удалось расшифровать почти всю цепочку проведения этиленового сигнала в растительной клетке, а этиленовый рецептор наиболее хорошо изученный рецептор в растении. Несмотря на множественность эффектов, вызываемых в растениях этиленом, воздействие этого гормона на клетку осуществляется по одной схеме : связывание с рецептором, передача сигнала одним или несколькими сигнальными путями, ответная реакция. Рецептор этилена функционирует как димер, состоящий из двух трансмембранных белков, соединенных дисульфидными связями: сенсорного элемента –собственно гистидинкиназы, способной к автофосфорилированию по остатку гистидина, и регуляторного элемента, содержащего остаток аспарагиновой кислоты, на которую переносится фосфатная группа (рис.№ 4). Местом связывания гормона является N –терминальный участок этиленового рецептора, который содержит три пересекающих плазмалемму гидрофобных домена и ионы меди. Рис№ 4 Механизм проведения сигналов и ответных реакций растительной клетки при воздействии этиленом Рецепторами этилена у арабидопсиса являются интегральные мембранные белки, пять семейств: ETR1 и ETR2, EIN4, ERS1 и ERS2. Механизм проведения сигналов и ответных реакций растительной клетки при воздействии этиленом показан на рис 4. Под воздействием внешних стимулов, таких как затопление, инфицирование патогенами 18 или поранение, а также при созревании плодов и др. активируются ферменты синтеза этилена –АЦК –синтаза и АЦК –оксидаза. В итоге всех этих процессов, содержание этилена в тканях возрастает. Этилен связывается с рецептором, локализованным в плазмалемме, с участием ионов меди в качестве кофактора. Предполагается, что при связывании с гормоном происходит инактивация рецептора. Отсутствие позитивного регуляторного сигнала от рецептора приводит начальный элемент в сигнальной цепи – белок CTR1 в неактивное состояние. При отсутствии этилена рецептор проявляет функции гистидинкиназы, которая активирует белок CTR1, являющийся одним из ключевых белков при передаче этиленового сигнала в каскаде фосфорилирования\дефосфорилирования. CTR1 представляет собой серин/ треониновую протеиннкиназу –фермент, фермент относящийся к семейству Raf –киназ, участвующих в передаче гормональных сигналов у животных организмов. Субстратом фосфорилирования для CTR1 –киназы являются киназа MAP –киназы или МЕК –киназа, которая в свою очередь фосфорилирует МАР –киназу. Эти ферменты способны влиять на активность факторов транскрипции, обеспечивая, таким образом, связь между киназным каскадом и процессом транскрипции.( Рис.№4). На следующем этапе активируется трансмембранный белок EIN2, который может работать как мембранная пора или канал. Предполагается, что EIN2 расположен после киназного каскада. Другие элементы передачи этиленового сигнала (EIN5, EIN6 и EIN7) также следуют после CTR1. Последующим элементом сигнального пути служит ядерный белок EIN3. Он является транскрипционным фактором, который в ответ на этиленовый сигнал связывается со специфическими нуклеотидными последовательностями в промоторах генов –мишеней и активирует их экспрессию. Одним из таких этилен –чувствительных генов является ERF1, который кодирует белок, относящийся к семейству EREBPs, т.е. белков, способных связываться со специфическим (для этиленового сигнала) GСС – боксом. 19 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Итак, в растительном организме есть система гормонов, регулирующая все обменные процессы происходящие в нем. Ауксины, гиббереллины, цитокинины, АБК, этилен –компоненты этой системы. Рост многоклеточного организма невозможен без гормонов. Без них эволюция должна была бы остановиться на уровне колонии клеток, на уровне каллуса. В заключение, сравнивая гормональную систему растений и животных, нужно отметить, что у растений нет еще обособленных эндокринных желез, места действия и функции гормонов растений менее узко специализированны, чем у высокоорганизованных животных. В растительных организмах для включения и выключения морфогенетических и физиологических программ используются одни и те же фитогормоны в разных соотношениях. Однако в процессе эволюции специализация фитогормонов, очевидно возрастает. Так, ауксин является сигналом доминирующих центров побега, оказывающим влияние на корень, а цитокинин –сигналом корня, предназначенным для побега; гиббереллины используются листом для регуляции удлинения междоузлий стебля. Одновременно с этим каждый из фитогормонов выполняет и другие функции. Гормональная система –необходимое условие жизни многоклеточного организма. Нормальный рост и формирование всех органов возможны только при сбалансированном действии соединений стимулирующих и ингибирующих эти процессы. 20 21
