Начало формы О.В. ЕСЫРЕВ КЛЕТОЧНЫЕ ПУТИ ПРОВЕДЕНИЯ
advertisement
О.В. ЕСЫРЕВ КЛЕТОЧНЫЕ ПУТИ ПРОВЕДЕНИЯ СИГНАЛОВ ЦИТОКИНОВ. УСПЕХИ И ПЕРСПЕКТИВЫ МЕДИЦИНСКОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ЦИТОКИНОВ (Алматинский Университет Технологии и Бизнеса, г. Алматы, Республика Казахстан) Цитокины представлены группой молекул, которые проводят внутриклеточные сигналы используя многие сигнальные пути. Обсуждается Jak - STAT путь, как главный сигнальный путь, наряду с этим обсуждаются и другие пути. Jak-STAT путь является самым коротким цитозоль-в-ядро сигнализирующим путем. Цитокины наряду с влиянием на процессы пролиферации и дифференцировки участвуют в регуляции естественной гибели (апоптоза) клеток иммунной системы. Обсуждаются медицинские аспекты использования цитокинов для лечения разнообразных заболеваний Введение. В настоящее время укрепляется понимание того, что основные клеточные функции - рост, старение, трансформации - обеспечиваются сложной сетью биохимических сигнальных путей, проводящих внешние сигналы внутрь клетки и, благодаря каскаду реакций осуществляемых сигнальными белками, проводящих их к специфическим мишеням в цитоплазме или ядре /1, 2, 3, 4/. Связываясь с рецепторами сигнальные молекулы, список которых обширен (к примеру, цитокины, факторы роста, пептидные и стероидные гормоны, нейромедиаторы и антигены) открывают расходящиеся сигнальные пути. Передача сигналов от рецепторов на геном - одна из наиболее актуальных и интенсивно развивающихся областей клеточной и молекулярной биологии. Особое внимание уделяется сведениям о веществах, которые обеспечивают или блокируют частично или полностью передачу сигнала. Цель настоящего обзора состоит в освещении некоторых последних данных в сигнализации и, в частности, в сигнализации цитокинов и обсуждении их практического применения. Прогресс в изучении биохимии клетки, молекулярной биологии и иммунологии послужил основой современных революционных преобразований в области терапии. Именно здесь для борьбы с разнообразными патологическими случаями все в большей степени используются биологические вещества. Биотехнология, традиционная микробиологическая и фармацевтическая промышленность составляют производственную базу для получения таких веществ, в том числе новых вакцин, лекарственных препаратов и биологических материалов. Ras-Raf-MAP киназный путь. В так называемых Ras-зависимых сигнальных путях ключевую роль играет продукт протоонкогена c-ras-белок Ras. Этот белок активируется и от него расходятся многие сигнальные пути. Суперсемейство Ras включает большое число молекул вовлекающихся в клеточную пролиферацию, дифференциацию, реорганизацию цитоскелета, апоптоз, транспортирования белков и везикул в ядро /1, 2, 5, 6/. В состав семейства Ras входят H-Ras, K-Ras, N-Ras и другие гомологичные белки, также такие как R-Ras, TC 21, Rap и Ral. Не вдаваясь в детали функционирования Ras-зависимых сигнальных путей в упрощенном виде схему данных путей можно представить следующим образом. Благодаря собственной GTPазной активности и действию факторов обмена гуаниннуклеотидов (включает белки Sos-h, Cdc25 и Sos2) и активатора GTPазы (GAP) (включает p120GAP и нейрофибромин NF1GAP) белок Ras циклически переходит из GTPсвязанной активной формы в GDP-связанную неактивную и обратно. Активированный RasGTP связывается с серин/треонин протеин киназой Raf-1, и захватывает эту киназу в плазматическую мембрану, что способствует ее активации. Далее запускается каскад реакций Raf-1, активированный взаимодействием с Ras, фосфорилирует треонин/тирозин киназу МЕК (МАРКК-киназа митогенактивируемой протеин киназы), субстратом которой является конечное звено киназного каскада митогенактивируемая протеин киназа - МАР-киназа. МАР-киназа - полифункциональный фермент, способный проникать в ядро и фосфорилировать по серину и треонину продукты протоонкогенов c-mic, c-jun, c-fos, белки ATF-2, NF-IL6, p62TcF, превращает их в факторы транскрипции. Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что такая каскадная последовательность реакций во многих случаях действует как включатель, определяющий регуляцию генной экспрессии, требующуюся для решения клетки делиться или дифференцироваться. Известно, что в наиболее распространенных опухолях и лейкозах усилена мощность Rasзависимых сигнальных путей и, как следствие этого, наблюдается гиперпродукция протоонкогенов mic, jun, fos-конечных звеньев этих сигнальных путей. Не случайно продукт протоонкогена c-ras белок p21 Ras привлекает внимание исследователей как возможная мишень для противоопухолевых препаратов. SH2- и SH3-домены. В последние годы получены доказательства, что отдельные сигнальные белки узнают собственных партнеров с помощью так называемых SH2- и SH3-доменов /2/. Они являются некаталитическими доменами в молекулах цитоплазматических протеинтирозин киназ семейства Src, в липидкиназах, протеинфосфатазах, адапторных белках и факторах транскрипции и способны избирательно и с высоким сродством связываться с фосфотирозиновыми участками мембранных рецепторов и других сигнальных белков. В результате функционирования SH2-доменов происходит физическое связывание звеньев сигнального пути в единую цепь и взаимодействие между различными сигнальными путями. Поскольку многие компоненты сигнальных путей обладают протеин киназной активностью, то при их объединении происходит резкое усиление сигнала и включение биохимических механизмов усиления ответной реакции клетки. SH3-домены обеспечивают взаимодействие между белками, локализованными на мембранах или в цитоскелете, подведение сигнальных белков к их субстратам и регуляцию активности ферментов. Это можно иллюстрировать тем, что адапторный белок Grb2 своим SH2-доменом связывается с рецепторами факторов роста, а SH3- домен соединяется с активатором G белков Sos-h, притягивая его к плазматической мембране и G белки и запуская тем самым целую сеть Ras-зависимых сигнальных путей. С открытием SH2-доменов сигнальных белков появились новые возможности для воздействия на систему Ras с целью блокады передачи митогенных сигналов от рецепторов факторов роста или цитокинов к Ras белкам. Возможна блокада короткими олигопептидами, комплементарными SH2-доменам адапторных белков Grb2, Grk, Nck, Shc или фосфотирозиновым мотивам их рецепторных лигандов передачи сигнала от рецепторов к Ras белкам. Подобного рода олигопептиды могут выступить в качестве новых противоопухолевых лекарств. Согласно литературным данным сдвоенные SH2-домены Т-протеинтирозин киназы Zap70 могут рассматриваться в качестве мишени специфичных для Т-клеток иммунодепрессантов, не оказывающих побочного цитотоксического действия на клетку другого происхождения. Такими депрессантами могут быть олигопептиды, комплементарные иммунотирозин активирующим мотивам Т-клеточного рецептора антигенов или SH2-доменам Zap70 киназы. Есть основания утверждать, что углубления знаний о структуре и функциональных свойствах SH2- и SH3-доменов будет способствовать поиску новых эффективных нетоксических противоопухолевых и иммуномодулирующих лекарственных средств /2/. Кроме того, было отмечено блокирование передачи сигнала при направленной мутации SH2доменов или фосфотирозиновых участков их лигандов. Эти наблюдения позволяют предположить возможность коррекции работы сигнальных путей, поврежденных при некоторых генетических заболеваниях человека. STAT белки. В 1990 году открыт однокаскадный путь, когда сигнал от рецептора непосредственно активирует транскрипционные факторы в ядре. Это STAT белки (signal transducers and activators of transcription). Они локализованы в цитоплазме. К настоящему моменту охарактеризовано семь STAT белков: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b и STAT6 /2, 6/. Следует напомнить, что эти белки соединяются с фосфорилированными цепями рецепторов цитокинов с помощью своих SH2 доменов. Поскольку имеет место различие в STAT белках, то отмечается и различие в аминокислотных последовательностях их SH2-доменов. После соединения с рецепторами STAT белки сами становятся мишенями для фосфорилирования цитоплазматическими Jak киназами по их функционально важному Стерминальному тирозину. Затем они диссоцируют от рецептора и объединяются в форму гомо- или гетеродимеров, связываясь с собственными SH2-доменами или других STAT белков. В результате возникает большой набор STAT димеров, каждый из которых проникает в ядро, где прямо связывается с ДНК в регуляторных районах генов-мишеней и становится фактором транскрипции, модулируя экспрессию генов. Этим достигается специфичность сигнализации, осуществляемой через разные рецепторы цитокинов. Важно понимать, что открытие STAT белков является, по сути, только началом в изучении этого сигнального пути и его механизмов регуляции и коррекции нарушений при заболеваниях. Представлены первые данные, указывающие на роль STAT белков в опухолевой трансформации клеток и на возможность для STAT3 действовать как онкоген. Цитокины. Цитокины представляют группу разнообразных молекул, которые проводят внутриклеточные сигналы /6,7/. Согласно последним экспериментальным данным большую часть цитокинов можно разделить на две группы: тип I и тип II цитокины. Цитокины типа I включают многие интерлейкины и колонии-стимулирующие факторы, такие как IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF и гранулоцит-колонии стимулирующий фактор. Кроме того, сюда входят нейтрофильный фактор, фактор ингибирования лейкемии, кардиотрофин-1, онкостатин М, гормон роста, пролактин, эритропоэтин, тромбопоэтин, лептин, фактор стволовых клеток и Т-хелпер 1 и Т-хелпер 2 цитокины. Цитокины типа II включают INF (INF-a/b и INF-g) и IL-10 /6/. Их функция состоит в регуляции деления и дифференцировки кроветворных клеток, межклеточных взаимодействий, иммунных ответов. Цитокины обычно синтезируются в очагах воспаления. Цитокины осуществляют свои регуляторные функции, стимулируя через протеинтирозин киназы Src-семейства как Ras-зависимые, так и Ras-независимые сигнальные пути. В целом цитокины используют сложные сигнальные пути, однако, особое внимание, как главный сигнальный путь для цитокинов вызывает Jak-STAT система. Тирозивные мотивы рецепторов многих цитокинов после фосфорилирования становятся специфическими местами связывания SH2-доменов Jak киназ /8/. Получено доказательство, что в дополнение к Ras-Raf-MAP-киназному и Jak-STAT пути цитокин IL-2 активирует другие сигнальные пути, включая пути сопряженные с фосфатидилинозитол 3-киназой (PI3K). Активация PI3K интерлейкином-2 важна для активации р70S6 киназы и Akt. К возможным эффекторам Akt относят р70S6 киназу, которая обладает выраженным антиапоптическим действием /3/. Jak-STAT путь является очень быстрым цитозоль-в-ядро сигнальным путем быстро проводящим экстраклеточные сигналы в ядро /2/. Этот краткий экскурс в проблематику цитокинов позволяет заключить, что сигнализирование этими агентами складывается из активации различных сигнальных путей. Однако недостаточно ясно в настоящее время как достигается специфичность действия индивидуальных цитокинов и как различные сигнальные пути интегрируют друг с другом. Цитокины являются регуляторами различных процессов в иммунной системе и апоптоза (генетически программируемая клеточная смерть), в частности. Иммунные ответы подчиняются тем же закономерностям, что и процессы идущие с участием классических гормонов и рецепторов. В связи с этим важно изучение механизмов иммуномодуляции и расширение круга препаратов, тестируемых на иммуномодулирующую активность. Апоптоз - распространенная форма клеточной гибели эукариот, встречающаяся среди различных систем организма и, в том числе, среди клеток иммунной системы. Апоптоз - это реакция также каскадная и сигнальная, поскольку контрабаллансом апоптозу являются процессы клеточной пролиферации, то неудивительно, что отклонения от нормы в апоптических процессах могут иметь патологические последствия. Клинические проявления апоптической недостаточности обнаруживаются при злокачественных перерождениях, болезни Альцгеймера, СПИДе и ревматоидных артритах. Появились данные о том, что IL-2 подавлял процесс клеточной гибели тимоцитов, причем этот эффект, по всей видимости, обусловлен протеин киназой С, поскольку ингибитор киназы GF109203Х отменял супрессию апоптоза. IL-2 также угнетал также специфический апоптоз, индуцированный g-облучением зрелых Т-клеток памяти. Это свойство IL-2 может найти терапевтическое применение у больных, получающих химио- или радиотерапию, и у больных СПИДом, иммунодефицит которых связан с потерей антигенспецифических клеток памяти. IL2 препятствовал так же апоптозу в лейкемических клетках человека. Дефекты IL-2 и его рецептора были найдены при множественном склерозе, ревматоидном артрите. Терапевтическое применение IL-2 состоит в использовании активированных клеток против опухолевого роста. Лишение интерлейкина-3 клеток и IL-3-зависимых линий приводило к развитию апоптоза. При удалении IL-6 некоторые миелоидные линии погибали по типу апоптоза, добавление же экзогенного IL-6 предотвращало клеточную гибель. IL-12 предотвращал апоптоз Th-1лимфоцитов больных СПИДом. IL-4, как и IL-2 также предотвращали вызванный глюкокортикоидами апоптоз тимоцитов. Кроме того, терапевтический потенциал IL-4 связан с его возможностью, восстанавливать клеточный и гуморальный иммунитет. Таким образом, отсутствие интерлейкинов в культуре или недостаток их in vivo приводит к программированной гибели клеток разных типов. Другой представитель цитокинов g-интерферон оказался эффективным в лечении ряда заболеваний, таких как опухоли, септический шок. Показано также участие интерферонов в процессе апоптоза. Недавно синтезировано оригинальное семейство гистаминсодержащих соединений, имитирующих действие цитокинов и значительно повышающих специфичность клеточного ответа /9/. Пептидомиметик L-Glu-Hist из данного семейства оказался потенциальным иммунотерапевтическим агентом. Как выяснилось, данный агент играет специфическую роль физиологического агониста, вызывая различные виды клеточных ответов, в том числе пролиферацию лимфоцитов. Хорошо известна серия антагонистов, которые антогонизируют эффект цитокинов на рецепторном уровне и ингибируют вызванную определенным цитокином сигнальную трансдукцию и могут поэтому быть кандидатами для иммунофармакологического воздействия на течение заболеваний, например астмы /10/. В этом отношении также вызывает интерес антагонист рецептора IL-2 и растворимые рецепторы IL-2 и IL-4. Для иммунофармакологического вмешательства важны также антитела. Человеческие анти-IL-5 и анти-TNF антитела уже предложены в клинику. Кроме того, ряд цитокинов имеют антиаллергические, антивоспалительные активности: в качестве примера - g-IFN является IL-4-антагонистом; IL-12 индуцирует дифференциацию Тн1-тип Тлимфоцитов; g-IFN, IL-10, TGF-b, IL-6,IL-1, IL-2 и фактор некроза опухоли-a выявляют активный антивоспалительный эффект. Растворимый рецептор IL-1, являющийся антагонистом рецептора IL-1 и растворимый рецептор IL-4 были идентифицированы как потенциальные иммунорегуляторные агенты для лечения астмы /10/. В терапевтических целях IL-1 используется не только благодаря его возможности стимулировать продукцию антител, но и как ранозаживляющее вещество, стимулятор гемопоэза и адъювант при вакцинации. В настоящее время становится ясным, что терапия цитокинами и родственными факторами представляет собой один из подходов к лечению заболеваний, особенно в онкологии. Безусловно, иммунотерапия не может быть лечебным средством онкологических заболеваний, но вместе с удобным антиканцерным лечением она будет важным инструментом в наборе онколога. При терапевтическом применении цитокинов следует учитывать чувствительность клеток к возникновению апоптоза и возможность возникновения влияния на этот процесс. Понимание молекулярных процессов регулирования апоптоза будет существенно помогать развитию терапевтических мер лечения апоптоз-связанных заболеваний /11/. В качестве принципиального положения из выше сказанного о цитокинах следует то, что для достижения положительных результатов в терапии онкозаболеваний лучшим инструментом послужит комбинация традиционных терапий с цитокинами, ингибиторами проведения сигнала, клеточными адъювантами и эффекторами. Заключение. По современным представлениям медико-биологический подход к лечению болезней человека и перевод улучшения здоровья на биотехнологический путь являются неотвратимыми тенденциями. Большинство из имеющихся в арсенале веществ модулирующих проведение сигнала в клетках получено микробным синтезом. Работы, которые могут представлять интерес с позиций создания биотехнологических препаратов должны быть связаны с всесторонним исследованием структуры, свойств и механизмов действия сигнальных молекул и, в первую очередь, сигнальных белков. Что касается цитокинов, то углубленное изучение цитокинов, их рецепторов и механизмов их действия позволит разработать подходы к лечению самых различных болезней, в том числе рака, аутоиммунных заболеваний, хронических инфекций, СПИДа, а также предотвращению отторжения трансплантанта при пересадке органов. ЛИТЕРАТУРА 1. J. Gomez e. a., Dual role of Ras and Rho proteins: At the cutting edge of life and death. Immunology and Cell Biology, 1998, V. 76, №2, P.125-134. 2. A.K.Белоусова, Молекулярные основы специфического взаимодействия сигнальных белков. Успехи современной биологии, 1999, том 119, №4, с. 345-358. 3. M.A. Красильников, Сигнальные пути, регулируемые фосфатидилинозит-3-киназной и их значение для роста, выживаемости и злокачественной трансформации клеток. Биохимия, 2000, том 65, вып. 1, с. 68-78. 4. M. Rincon e. a., Do T cells care about the mitogen-activated protein kinase signalling pathways?. Immunology and Cell Biology, 2000, V. 78, №2, P.166-175. 5. D.A. Lauffenburger, Cell signaling pathways as control modules: Complexity for simplicity?. PNAS, 2000, V. 97, №10, P.5031-5033. 6. W. J. Leonard, J-X Lin, Cytokine receptor signaling pathways. J Allergy Clin Immunol, 2000,V.105, №5, P.877-888. 7. M. R. Wilson, Apoptotic signal transduction: emerging pathways. Biochem. Cell Biol., 1998, V.76, №3, P.573-582. 8. M.B. Робинсон, B.A. Труфакин, Апоптоз и цитокины. Успехи современной биологии, 1999, том 119, №4, с. 359-367. 9. M.A. Бабижаев и др., Передача клеточного сигнала и модуляция свободнорадикального окисления новым пептидомиметиком L-глутамилгистамином. Биохимия, 1999, том 64, вып. 5, с. 612-627. 10. L.J. Rosenwasser, New immunopharmacologic approaches to asthma: Role of cytokine antagonism. J Allergy Clin Immunol, 2000,V.105, №2, P.586-592. 11. I. D. Davis, An overview of cancer immunotherapy. Immunology and Cell Biology, 2000, V. 78, №3, P.179-195. SUMMARY Cytokines represent a group of molecules that transmit intercellular signals. Cytokines use multiple signaling pathways. The major signaling pathway Jak-STAT is discussed, although other pathways are reviewed. The Jak-STAT pathway is a very rapid cytosol-to-nuclear signaling pathway. Cytokines are shown to participate in regulating the natural (programmed) death (apoptosis) of immune system` cells along with their influence on proliferation and differentiation. Medical aspects related to cytokine treatment of diverse diseases are discussed.
