кий запас, (тыс. т) - Пермская государственная

На правах рукописи
Дмитрук Вадим Николаевич
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ РАСТЕНИЙ РОДА SPHAGNUM
И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Самара – 2008
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский
университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию»
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук БЕЛОУСОВ Михаил Валерьевич
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук, профессор ПЕТРИЧЕНКО Василий Михайлович
доктор фармацевтических наук, профессор ТУРЕЦКОВА Вера Феопеновна
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится «25» ноября 2008 г. в 13 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.068.01 при Пермской государственной
фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию РФ по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина, д. 48
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Пермской
государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь,
ул. Крупской, 46
Автореферат разослан «___» _______________ 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.068.01
доктор фармацевтических наук, профессор
2
Т.В. Ярыгина
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Исторически всеобщее признание сфагновый
мох получил как высокоэффективный перевязочный материал. Применение
мха основывалось на высокой гигроскопичности его дерновины, значительно
превосходящей аналогичные свойства ваты, а так же наличии у него свойств,
способствующих ранозаживлению. Но, несмотря на многовековую историю
применения в народной медицине представителей рода Sphagnum, ни один из
видов до сих пор не является официнальным. Информация о химическом
составе
растений
рода
сфагнум
носит
фрагментарный
несистематизированный характер, а по представителям флоры Западной
Сибири практически отсутствует. В то же время, литературные данные о
биологической активности извлечений из растений рода сфагнум указывают
на их многостороннее, комплексное действие на организм. Эти сведения
обосновывают перспективность использования представителей рода сфагнум
для разработки новых высокоэффективных и малотоксичных лекарственных
средств, что является актуальной проблемой современной фармации.
Таким
образом,
недостаточная
изученность
сфагновых
мхов
определяет необходимость их комплексного фармацевтического изучения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования
является
обоснование
возможности
практического
использования
в
медицине наиболее распространенных представителей рода Sphagnum флоры
Томской области.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие
задачи:
1. Дать оценку ресурсного потенциала наиболее распространенных
видов сфагновых мхов флоры Томской области на примере исследуемого
участка, изучить особенности восстановления их популяции и определить
перспективный вид для дальнейшего изучения в медицине.
2. Определить диагностические признаки сфагновых мхов флоры
3
Томской области на основе их сравнительных анатомо-морфологических
исследований для выявления возможных подмесей к перспективному виду.
3. Провести изучение химического состава основных групп БАВ
перспективного вида сфагнового мха.
4. Провести оценку острой токсичности и биологической активности
суммарных комплексов, выделенных из перспективного вида сфагнового
мха.
5. Разработать методики стандартизации качества его сырья.
6. Разработать проект фармакопейной статьи на сырье («Дерновина
сфагнового мха»).
Научная новизна исследования. Впервые дана оценка ресурсного
потенциала 7 наиболее распространенных видов сфагнового мха на
территории
Томской
области
на
примере
исследуемого
участка
«Плотниково» и предложена рациональная схема их практического
использования.
Для
идентификации
наиболее
распространенных
и
перспективных для применения в медицинской практике видов сфагновых
мхов
Томской
области
определены
макро-
и
микроскопические
диагностические признаки.
На основании оценки ресурсного потенциала сфагновых мхов и
химико-фармакологических исследований суммарных комплексов БАВ
выявлен перспективный для внедрения в медицинскую практику вид
растений рода Sphagnum – S. fuscum (Shimp) Klinggr (сфагнум бурый).
Впервые подробно изучен состав его фенольного комплекса и мономерного
состава ПСК. Экспериментально доказано, что суммарный комплекс,
выделенный из дерновины S. fuscum обладает противовоспалительной и
анальгезирующей
активностью,
ранозаживляющими
свойствами
и
противомикробным действием. Для предложенного биологически активного
комплекса S. fuscum экспериментально доказана его безвредность и
обоснованы показатели норм качества сырья.
Практическая значимость работы. Разработаны и предложены
4
методики
стандартизации
сырья
сфагнума
бурого.
Результаты
диссертационного исследования используются в научных изысканиях ГОУ
ВПО СибГМУ Росздрава и внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО СамГМУ
Росздрава и ГОУ ВПО «Самарский государственный университет» в виде
учебного пособия для студентов фармацевтических и биологических
факультетов «Характеристика сфагновых мхов флоры Томской области»,
утвержденного и рекомендованного к печати ЦКМС ГОУ ВПО СамГМУ
Росздрава (протокол № 2 от 21 ноября 2007 г.), (акты внедрения от 5.12.07 г и
8.12.07 г.). Разработана технологическая Инструкция по сбору и сушке
дерновины мха сфагнума бурого. Для внедрения предложен разработанный
проект фармакопейной статьи на сырье «Дерновина Сфагнума бурого».
На защиту выносятся следующие положения:
а) экспертная оценка ресурсного потенциала 7 видов сфагнового мха
(S. fuscum (Shimp) Klinggr., S. balticum (Russ.) Russ. ex C. Jens., S. papillosum
Lindb., S. lindbergii Schimp. ex Lindb., S. fallax (Klinggr.) Klinggr., S.
magellanicum Brid., S. angustifolium (Russ. ex Russ.) C. Jens.), результаты их
сравнительного анатомо-морфологического исследования;
б) результаты изучения химического состава БАВ, содержащихся в
дерновине S.fuscum, их токсических свойств и биологической активности;
в) экспериментальное обоснование методик стандартизации качества
сырья дерновины S. fuscum.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены и
обсуждены на межкафедральных научных семинарах фармацевтических
факультетов СибГМУ г Томск и СамГМУ г. Самара в 2004–2006 г., на
заседании ученого совета СамГМУ. Основные положения диссертационной
работы доложены и обсуждены на научной конференции, посвященной 50летию Алтайского гос. ун-та, (г. Барнаул 2004 г.), на всероссийской научнопрактической конференции «Современные проблемы фармакологии и
фармации» (Новосибирск, 2005 г.), на 2-й всероссийской конференции
«Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья»
5
(Барнаул, 2005 г.), на научной школе «Болота и биосфера» (Томск, 2005 г.),
на всероссийской научно практической конференции посв. 100-летию со дня
рождения проф. Л. Н. Березнеговской (Томск, 2006 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных
работ, из них 2 в рекомендованных ВАК изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из трех
взаимосвязанных глав, изложенных на 163 страницах компьютерного набора,
иллюстрирована 47 рисунками, 37 таблицами, содержит 178 источника
литературы, в том числе 17 на иностранных языках, а также приложения в
отдельном томе.
Работа выполнена на базе кафедр химии и фармакогнозии, ботаники и
экологии
Сибирского
государственного
медицинского
университета,
кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского
государственного медицинского университета.
Отдельные разделы работы по идентификации химического состава
объектов исследования были выполнены на базе Института органической
химии СО РАН (г. Новосибирск).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования
Объектами для исследования служили 1005 дерновинок 7 видов
растений рода сфагнум, собранные в экспедиционных условиях на
территории Томской области в 2003–2006 годах. Сбор сырья производился
ручным способом в естественных местах обитания видов. При определении
видов сфагновых мхов использовали «Определитель листостебельных мхов
Томской области», «Определитель сфагновых мхов СССР» и «Флору мхов
средней части европейской России». Исследования урожайности сфагновых
мхов проводили с помощью метода проективного покрытия. Морфологоанатомические исследования сырья проводились по методикам, изложенным
6
в ГФ XI, вып.1.
Для
обнаружения,
разделения,
идентификации,
выделения
и
количественного определения БАВ в исследуемых объектах использовали
различные качественные реакции, спектральные, хроматографические и
другие общепринятые методы анализа.
Объекты для фармакологических исследований выделяли, используя
технологические приемы в соответствии с требованиями ГФ XI.
Испытание микробиологической чистоты проводилось по методике,
изложенной в ГФ XI издания, вып. 2, стр. 193 и Изменением № 3 к ГФ XI от
19.06.03 г.
Для анализа элементного состава использовали метод нейтронноактивационного анализа. Работу проводили на ядерном реакторе «Спутник»
(г. Томск).
Исследования биологической активности проведены на 400 белых
беспородных мышах-самцах массой 18–22 г и 100 белых беспородных
крысах-самцах массой 180–200 г, полученных из питомника «Рассвет» НПО
«Вирион» (г. Томск). Все манипуляции с животными были проведены в
соответствии
с
правилами
гуманного
обращения
с
животными,
регламентированными «Правилами проведения работ с использованием
экспериментальных животных», утвержденные приказом МЗ СССР № 755 от
12.08.77 г, ФЗ «О защите животных от жестокого обращения» от 1.01.1997 г,
а также положениями Европейской конвенции по защите позвоночных
животных (Страсбург, 18.03.86 г.).
Острую токсичность, противовоспалительную и анальгезирующую
активности, ранозаживляющие свойства исследуемого экстракта исследовали
согласно Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ (2000 г.).
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили
общепринятыми методами с определением средней арифметической (М) и
ошибки средней арифметической (m). Достоверность результатов оценивали
7
параметрически по t-критерию Стъюдента. Кроме того, использовали пакет
статистических программ «Statistica for Windows 7.0».
Оценка ресурсного потенциала наиболее распространенных
видов растений рода Sphagnum на территории Томской области
При заготовке сырья дикорастущих растений возникает необходимость
решения целого ряда экологических и биологических вопросов, в первую
очередь проведения научно обоснованной оценки ресурсного потенциала.
Кроме того, для правомочности рекомендаций к объемам и правилам
заготовки сырья, необходимо также оценить способность популяции к
восстановлению.
Для решения этих задач нами были проведены 4-х летние полевые
исследования на территории болот Шегарского и Бакчарского районов
Томской области.
Определение особенностей роста и возобновляемости
сфагновых мхов
В результате проведенных нами исследований процессов регенерации
сфагновых мхов через один год после изъятия дерновины на площадках
размером 25х25, 50х50 и 100х100 см было зафиксировано активное
вегетативное возобновление для всех исследуемых видов. Скорость
восстановления имеет четкую зависимость от вида мха и от размеров
нарушенного участка. Быстрее всего происходит возобновление дерновины
топяных мхов: S. balticum, S. papillosum, S. lindbergii, S. fallax на площадках
25х25 см и 50х50 см. Дерновины сфагновых мхов «рямовых» сообществ: S.
fuscum, S. magellanicum, S. angustifolium восстанавливаются дольше. При
этом заметна четкая зависимость не только от площади, но и от глубины
изъятия дерновины.
Восстановление
нарушенного
участка
протекает
«наползанием»
дерновины, путем ветвления сфагновых дерновинок по краю нарушенного
8
участка, а также за счет регенерации оставшихся нижних частей дерновины
путем формирования придаточных почек на стебле вблизи места отхождения
стеблевых листьев.
Наибольшая скорость восстановления характерна для топяных видов S.
balticum, S. papillosum, S. lindbergii, S. fallax, которая составила 3 года, а для
представителей рослого ряма S. angustifolium и S. magellanicum – 4 года.
Восстановление дерновины у S. fuscum при выборке сырья до торфа за 4летний период наблюдений составляет 60–70%, но если производить
заготовку до очеса – полное восстановление происходит всего за 2 года.
Определение ресурсов сырья сфагновых мхов в Томской
области на примере исследуемого участка «Плотниково»
Определение запасов сфагновых мхов нами проводилось для 7
наиболее распространенных на территории Томской области видов на
участке «Плотниково», методом определения урожайности по проективному
покрытию. Величины запасов сфагновых мхов представлены в таблице 2.
Таблица
2
–
Урожайность
и
биологический
запас
наиболее
распространенных видов сфагновых мхов на исследуемом участке
«Плотниково»
Урожайность
(т/га)
Биологический запас,
(тыс. т)
Эксплуатационный
запас, (тыс. т)
Объем
ежегодной
заготовки,
(тыс. т)
S. fuscum
33,7  3,2
489,4
404,5
36,8
S. balticum
6,8  0,6
28,4
23,8
6,0
S. papillosum
11,3  1,3
48,4
38,4
9.6
S. lindbergii
3,2  0,6
14,6
10,0
2,5
S. fallax
1,0  0,2
4,6
3,1
0,8
S. angustifolium
7,5  0,8
28,5
23,0
4,6
S. magellanicum
7,1  0,7
26,7
21,9
4,4
640,6
524,7
64,7
Вид рода
Sphagnum
Всего:
9
Как видно из представленных данных, наибольшую урожайность
имеют S. fuscum – 33,7 т/га и S. papillosum – 11,3 т/га.
Высокие показатели S. fuscum объясняются особенностями вида и его
местообитанием. Вид имеет очень плотную дерновину. Очес этого растения в
условиях ряма может достигать 15–50 см, так как данный вид создает сильно
кислую среду (до рH 2,5), что значительно замедляет разложение его нижней
части.
Всего по исследуемому участку «Плотниково» эксплуатационный
запас 7 наиболее распространенных видов составляет 524,7 тыс. т, а объем
ежегодных заготовок – 64,7 тыс. т.
Сравнительный
исследуемых
анализ
видов
сфагновых
анатомо-морфологических
мхов
с
признаков
аналогичными
видами,
произрастающими в европейской части России и в арктической зоне не
выявил качественно-значимых анатомо-морфологических отличий, что
позволяет установить единые требования к определению подлинности сырья
при его заготовке на всей территории РФ.
На основании оценки ресурсного потенциала сфагновых мхов на
примере исследуемого участка «Плотниково», в том числе биологического и
эксплуатационного запасов, объема ежегодных заготовок, а так же
литературных данных по использованию сфагнового мха, нами выбран
наиболее перспективный объект – S. fuscum, для дальнейшего его химикофармакологического исследования.
Качественный и количественный анализ содержания основных
групп БАВ в сфагнуме буром
Общий фитохимический анализ дерновины сфагнума бурого нами был
проведен с использованием общепринятых качественных реакций (табл. 3).
Таким образом, в исследуемом объекте доминируют две группы
соединений
–
полисахаридный
комплекс
и
фенольные
соединения,
представленные преимущественно фенолкарбоновыми кислотами.
10
Таблица 3 – Результаты качественного и количественного анализа на
основные группы БАВ в сфагнуме буром
Биологически активные вещества
Результат анализа
Содержание % от массы
абсолютно-сухого сырья
Выход экстрактивных веществ
6,06 ± 0,30
Фенольные соединения, в т.ч.:
+
0,23±0,02
– флавоноиды
+
0,04±0,01
– кумарины
+
0,02±0,01
– дубильные в–ва
+–
–
– фенолкарбоновые кислоты
+
0,16±0,01
+
2,88±0,12
Полисахариды, в т.ч.:
– водорастворимые полисахариды
0,13±0,02
– пектиновые вещества
0,61+0,04
– гемицеллюлоза А
2,14+0,10
Сапонины
–
–
Антраценпроизводные
–
+–
–
Алкалоиды
–
Примечание: «+» – реакция положительная;
«–» – реакция отрицательная;
«+–» – положительная реакция слабо выражена.
Исследование мономерного состава полисахаридов
сфагнума бурого
Исследование моно- и дисахаридного состава водорастворимого ПСК
для вида сфагнума бурого было проведено впервые. Для этого мы
предварительно
провели
кислотный
гидролиз
ВРПС
с
помощью
трифторуксусной кислоты, и полученный гидролизат триметилсилилировали
с помощью триметилсилилимидазола, как наиболее часто используемого
реагента силилирования сахаров. Полученную смесь анализировали с
помощью ГЖХ-МС, как наиболее информативного и чувствительного метода
анализа для решения данной задачи. При идентификации использовали
традиционные для метода параметры и библиотеку данных масс-спектров
соединений данного класса.
11
Полученные нами данные, представленные в таблице 4, совпадают с
данными литературы о моносахаридном составе других видов сфагновых
мхов только по наличию D-ксилозы, D-маннозы, D-галактозы, D-глюкозы и
D-глюкуроновой кислоты.
Таблица 4 – Компонентный состав триметилсилилированного
гидролизата ПСК сфагнума бурого по результатам ГЖХ-МС
Время
удерживания,
мин
Силильные производные
стандартных образцов
1
2
15.5015.60
15.6615.69
16.5316.65
–
2,3,4,5-тетракис-O(триметилсилил)-L-арабиноза
6-дезокси-2,3,4,5-тетракис-O(триметилсилил)-L-манноза
2,3,4,5-тетракис-O(триметилсилил)-D-ксилоза
–
17.66- 2,3,4,5,6-пентакис-O17.68 (триметилсилил)-D-манноза
2,3,4,5,6-пентакис-O18.23
(триметилсилил)-D-галактоза
18.50- 2,3,4,5,6-пентакис-O18.52 (триметилсилил)-D-глюкоза
18.68- 1,2,3,4,5,6-гексакис-O18.75 (триметилсилил)-D-маннитол
2,3,4,5-тетракис-O(триметилсилил)-D19.44глюкуроновой кислоты
19.56
триметилсилиловый эфир
–
–
Время
удерживания
Углевод
силилированУглевод
соответствующий
ных
соответствующий
стандартному компонентов
компоненту или его
образцу или его
ПСК
производное
производное
фагнума
бурого
3
4
5
L-арабиноза
15.57
L-арабиноза
L-рамноза
15.70
L-рамноза
D-ксилоза
16.62
D-ксилоза
–
17.19
438 [M]+(<1%),
217[C9H21O2Si2]+ (60%),
204[C8H20O2Si2]+
(100%),
191[C7H19O2Si2]+ (57%),
147[C5H7O5]+ (35%),
73[C3H9Si]+ (100%)
D-манноза
17.72
D-манноза
D-галактоза
18.26
D-галактоза
D-глюкоза
18.60
D-глюкоза
D-маннитол
18.70
D-маннитол
D-глюкуроновая
кислота
19.45
D-глюкуроновая
кислота
24.97
D-мелибиоза,
6-O-[2,3,4,6-тетракисO-(триметилсилил)- D-галактопира-нозил]1,2,3,6- тетракис-O(триметилсилил)-Dглюкопираноза
–
12
Продолжение таблицы 4
1
25.3625.49
25.6425.70
2
4-O-[2,3,4,6-тетракис-O(триметилсилил)--Dгалактопиранозил]-1,2,3,6тетракис-O-(триметилсилил-Dглюкопираноза
4-O-[2,3,4,6-тетракис-O(триметилсилил)--Dглюкопиранозил]-1,2,3,6тетракис-O-(триметилсилил-Dглюкопираноза
3
4
5
D-лактоза
25.46
D-лактоза
D-мальтоза
25.74
D-мальтоза
Кроме этого, установлено, что моносахаридный состав ПСК сфагнума
бурого также представлен L-арабинозой, L-рамнозой и D-манитолом, а
дисахаридный – D-мелибиозой, D-лактозой и D-мальтозой, наличие которых
в ПСК сфагновых мхов ранее в литературе не отмечалось.
Наличие фруктозы и дисахаридов – сахарозы и раффинозы, найденных
по данным литературы в других видах, в гидролизате ПСК сфагнума бурого
установлено не было.
Помимо идентифицированных, в гидролизате присутствует компонент
со временами удерживания 17.19 мин, структуру которого не удалось
определить.
Фракционирование экстракта сфагнума бурого на этаноле 70%
методом колоночной хроматографии
Для изучения химического состава фенольного комплекса из сфагнума
бурого был получен экстракт на этаноле 70%, который разделяли методом
колоночной хроматографии с использованием в качестве сорбента полиамида
Woelm (Германия). Фракции № 12, 13 и 14, из полученных 27, содержащие
по данным ТСХ максимальное количество компонентов, были объединены и
разделены на колонке с силикагелем Chemapol (L 40/100 мкм). В результате
деления были получены 32 фракции, из которых № 3 (D1), 4 (D2), 5 (D3), 6
(D4), 9 (D5), 10 (D6), 14 (D7) и 16 (D8) отобраны для последующего
исследования методами ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС, а фракции № 19 и 20
13
объединены и разделены на колонке с полиамидом. Из полученной 51
фракции для ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС были отобраны фракции № 2 (D10), 4
(D11), 8 (D12), 11 (D13), 16 (D14), 22 (D15), 23 (D16), 28 (D17), 33 (D18), 39
(D19), 49 (D20) и 51 (D21).
Критерием отбора фракций являлась максимальная концентрация
индивидуального компонента по данным ТСХ, наряду с минимальным
содержанием примесей.
Анализ состава фенольного комплекса методами
ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС
При идентификации индивидуальных компонентов исследуемых
фракций методами ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС на жидкостном хроматографе с
диодно-матричным УФ- и масс-селективным детекторами (Agilent 1100
Series LS/MSD) нами были использованы некоторые стандартные образцы
фенолокислот, кумаринов и флавоноидов. При выборе предполагаемой
структуры мы использовали следующие критерии: время удерживания
исследуемых веществ; УФ-спектры и масс-спектры соответствующих пиков
на ВЭЖХ; базы данных и обзорные статьи по основным спектральным и
физико-химическим характеристикам природных соединений.
УФ-спектры компонентов в исследуемых образцах можно разделить по
максимумам поглощения на четыре основных типа, характерных для:
фенолкарбоновых кислот (галловая, сиреневая, ванилиновая, протокатеховая
– 235–270 нм и 290–305 нм); гидроксикоричных кислот (кумаровая,
кофейная, феруловая – 230–240 нм и 290–320 нм); кумаринов (230–250 нм и
290–360 нм); флавоноидов (кверцетин, рутин – 250–270 нм и 350–390 нм).
Следовательно, основными компонентами исследуемой смеси могут являться
производные этих классов соединений.
Методом ВЭЖХ мы провели первичный аналитический скрининг всех
полученных фракций. Максимально информативными оказались данные при
длине сканирующей волны 274 нм.
14
На основании анализа полученных УФ-спектров, фракции с высоким
содержанием основного компонента (D1, D3, D5, D6, D10, D15, D17, D19)
нами были отобраны для дальнейшего анализа методом ВЭЖХ-МС. В
результате ВЭЖХ-МС анализа, на основании УФ-спектров и данных величин
m/z, нами был предположен ряд структур основных компонентов (табл. 5, 6,
7).
Таблица 5 – Состав фракции D1 по данным ВЭЖХ-МС (в режиме ХИ
APCI, Pos, Scan и APCI, Neg, Scan)
Время
удерживания, m\z
мин
13.01–13.22 152,1
Предполагаемая структура
13.70–14.01
192,1
3,4-дигидроксикоричный
спирт (кофейный спирт)
Скополетин
14.42–14.60
178,1
Эскулетин
15.96–16.12
138,1
3,4-дигидроксибензальдегид
16.87–17.00
180,1
218,2
248,2
Кофейная кислота
(m/z 180,1)
17.66–17.80
208,1
220,2
Ацетоксикофейный спирт
(m/z 208,1)
20.31–20.50
278,2
300,2
308,3
310,3
4-О--D-рамнопиранозилпротокатеховая кислота или
4-О--D-глюкопиранозил-4гидроксибензойная кислота
(m/z 300,2)
15
Примечание
Смесь трех веществ, основной
компонент с m/z, равной 218,2.
На УФ-спектрах смеси имеются
максимумы 240, 300 и 326 нм
(кофейная кислота)
Смесь двух веществ, основной
компонент с m/z равной 220,2.
На УФ-спектрах смеси имеются
максимумы в области 259
(наиболее интенсивный) и 350 нм
Судя по масс-спектру в режиме
APCI, Neg, Scan и УФ-спектру
основным компонентом является
соединение с m/z 300,2, и это
соединение можно отнести к
гликозиду фенолокислоты (макс.
при 255 нм). В качестве примеси в
данной смеси вероятно
присутствуют гликозидированные
производные умбеллиферона (m/z
308,2) и эскулетина (m/z 310,2) на
что указывают УФ-спектры (макс.
при 320 и 345 нм)
Таблица 6 – Состав фракции D3 по данным ВЭЖХ-МС (в режиме ХИ
APCI, Pos, Scan и APCI, Neg, Scan)
Время
удерживания, m\z
мин
138,1
4.17–4.21
176,1
Предполагаемая структура
Примечание
Тирозол (m/z 138,1)
Максимум в УФ-спектре при
279 нм характерен для
тирозола. Максимум в УФспектре при 310 нм – возможно
производное коричной
кислоты.
Максимум в УФ-спектре при
255 нм, можно отнести к
производному
фенолкарбоновой кислоты
5.08–5.10
282,3
Не идентифицированный
компонент
6.67–6.70
122,1
4-гидроксибензальдегид
8.91–8.96
136,1
4-гидроксибензальдегид
10.39–10.43
208,2
3,4-диметоксикоричная кислота
10.84–10.86
284,0
176,1
Метиловый эфир
2-(4-гидроксибензоил)-3гидрокси-бутандиовая кислота
(m/z 284,0),
11.49–11.52
182,1
Сиреневый альдегид
11.76–11.85
262,1
Не идентифицированный
компонент
Смесь двух соединений с
максимумами: при 255 нм для
первого соединения (m/z
284,0), 242 нм и 300 нм для
второго соединения (m/z 176,1)
Максимум в УФ-спектре при
296 нм – характерен для
производного коричной
кислоты.
Таблица 7 – Состав фракции D5 по данным ВЭЖХ-МС (в режиме ХИ
APCI, Pos, Scan и APCI, Neg, Scan)
Время
удерживания,
мин
1
3.10–3.14
4.14–4.72
m\z
Предполагаемая структура
Примечание
2
3
4
154,0, Протокатеховая кислота
240,3 (m/z 154,0)
138,1, Тирозол (m/z 138,1)
176,1
16
Максимум в УФ-спектре при 259
нм относится к протокатеховой
кислоте. Максимум в УФ-спектре
при 294 нм характерен для
производного коричной кислоты
Максимум в УФ-спектре при 279
нм относится к тирозолу, а
максимум при 310 нм характерен
для производного коричной
кислоты.
Продолжение таблицы 7
1
5.08–5.13
282,3
Не идентифицированный
компонент
6.03–6.12
192,1
Метиловый эфир 4метоксикоричной кислоты
(m/z 192,1)
8.68–8.73
Ацетоксикоричный спирт
(ацильное производное
коричного спирта) (m/z
176,1)
316,2, Не идентифицированные
346,2 компоненты
218,1, Дигидросинаповая кислота
226,2, (m/z 226,2)
244,1
10.38–10.42
11.79–11.84
11.76–11.85
2
3
4
176,2
262,1
Не идентифицированный
компонент
Максимум в УФ-спектре при 255
нм, можно отнести к
производному фенолкарбоновым
кислотам
Максимум в УФ-спектре при 310
нм, характерен для
гидроксикоричных кислот
и их производных
Максимум в УФ-спектре при 275
нм
Два интенсивных максимума в
УФ-спектре при 288 и 320 нм
Максимум в УФ-спектре при 296
нм характерна для производных
дигидроксикоричной кислоты.
Гидрокси- и дигидроксикоричные
кислоты имеют несколько
максимумов в интервале 298–330
нм. Наличие одного максимума
свидетельствует о том, что часть
молекулы имеет общий
структурный фрагмент
Максимум в УФ-спектре при 296
нм характерен для производного
коричной кислоты
В результате проведенных нами исследований химического состава
фракций экстракта сфагнума бурого на этаноле 70% с помощью ВЭЖХ- и
ВЭЖХ-МС анализа было подтверждено наличие для данного вида ряда ранее
известных соединений, а так же выявлены новые для него соединения.
Исходя из УФ- и масс-спектральных данных можно сделать вывод о
том, что химический состав объекта в большей степени представлен
фенолкарбоновыми (феноло- и гидроксикоричными) кислотами и спиртами.
Исследование элементного состава сырья
При исследовании элементного состава сырья сфагнума бурого
нейтронно-активационным
методом
17
было
выявлено
26
элементов,
содержание токсичных из которых не превышает значения допустимых
концентраций установленных СанПиН 2.3.2.1078-01 для пищевых продуктов.
Оценка биологической активности экстракта из сфагнума бурого
Исследуемый экстракт сфагнума бурого на этаноле 20% является
малотоксичным. Результаты экспериментов не позволили определить ЛД 50.
При введении в желудок белым беспородным мышам-самцам в дозе 10000
мг/кг симптомы острого отравления отсутствовали, не наблюдалось гибели
животных и изменения их двигательной активности и поведенческих реакций
в течение двух недель наблюдения.
Мы
провели
исследования
влияния
биологически-активного
комплекса, выделенного из сфагнума бурого, на процессы, сопутствующие
протеканию экспериментальных раневых патологий.
При
исследовании
противовоспалительной
активности
наиболее
выраженный антиэкссудативный эффект исследуемого экстракта отмечался
для доз 250 и 500 мг/кг. Угнетение отека у мышей составило 30,1% и 31,1%
соответственно.
Экстракт сфагнума бурого обладает выраженным болеутоляющим
действием. Предварительное внутрижелудочное введение данного экстракта
в диапазоне доз 250–500 мг/кг приводит к достоверному, практически не
уступающему аналогичному действию индометацина по снижению среднего
количества «корчей» – на 36,9% и 42,9% соответственно.
Исследуемый экстракт оказывает выраженное ранозаживляющее
действие. При обработке раны мазью экстракта сфагнума бурого 3%
ускорение заживления раны у крыс по отношению к контрольной группе
составило 34,4%. Обработка раны мазью данного экстракта способствовала
ликвидации
гнойно-экссудативной
воспалительной
реакции,
о
чем
свидетельствовало отсутствие скопления гноя под удаляемой корочкой на 7-е
сутки после нанесения раны. Препараты сравнения – мазь метилурациловая
10% и масло облепихи в аналогичных условиях эксперимента оказали менее
18
выраженные ранозаживляющие эффекты. Аналогичная картина наблюдается
на модели «ампутации хвоста» у крыс – аппликации мази исследуемого
экстракта 3% проявляют сравнимое с мазью метилурациловой 10%
ранозаживляющее действие, ускоряя процесс заживления ампутационной
культи (по сравнению с контрольной группой) на 22,9% и 19,8%
соответственно.
Антигрибковую активность экстракта сфагнума бурого на этаноле 20%
исследовали in vitro методом двукратных серийных разведений в жидкой
питательной среде Сабуро. При этом установлено, что в концентрации 15,7
мкг/мл
исследуемый
дерматофитий
на
экстракт
уровне
активен
препаратов
в
отношении
сравнения
возбудителей
нитрофунгина
и
сангвиритрина.
При исследовании антибактериальной активности экстракта сфагнума
бурого, в качестве объектов сравнения использовали извлечения из
фармакопейного сырья шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного,
используемых в качестве антимикробных средств. Судя по полученным
данным, экстракт сфагнума бурого на этаноле 20% проявляет выраженный
бактериостатический и бактерицидный эффекты. В разведении 1/80 он
ингибирует размножение микроорганизмов штаммов Escherichia coli Н-304,
Staphylococcus aureus Р-209 и Кlebsiella pneumoniae, слабо влияя на штамм
Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 (б/ст – 1/20). Бактерицидное действие
проявляется в более высоких концентрациях: 1/40–1/20, за исключением
влияния на Staphylococcus aureus Р-209 (б/ц – 1/80).
Стандартизация сырья сфагнума бурого
В результате выполненных анатомо-морфологических и химических
исследований были определены критерии подлинности и показатели качества
сырья сфагнума бурого, на основе которых был разработан и представлен
проект ФС «Дерновина сфагнума бурого».
Таким образом, сырье S. fuscum является перспективным объектом для
19
разработки
на
его
основе
новых
фитопрепаратов.
Сочетание
противовоспалительной и анальгезирующей активности, ранозаживляющих
свойств, антибактериального и антифунгального действий водно-этанольного
экстракта делает рациональным его использование в комплексной терапии
раневых
и
воспалительных
процессов,
ожоговых
поражений
кожи,
инфицированных ран.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1.
Расчётный эксплуатационный запас S. fuscum, S. balticum, S.
papillosum, S. lindbergii, S. fallax, S. angustifolium, S. magellanicum на
территории исследуемого участка составляет 524,7 тыс. т, а объем ежегодных
заготовок – 64,7 тыс. т, с учетом 3–4 летнего периода восстановления
популяции.
2.
Выявленные
индивидуальные
макро-
и
микроморфологические
диагностические признаки у исследуемых видов сфагновых мхов Томской
флоры
позволяют
установить
единые
требования
к
определению
подлинности сырья при его заготовке на всей территории РФ.
3.
В исследуемом объекте S. fuscum доминируют две группы БАВ –
полисахаридный комплекс (2,88%) и фенольные соединения (0,20–0,22%),
представленные преимущественно фенолкарбоновыми кислотами (0,16–
0,19%).
4.
В результате ВЭЖХ-МС и ГЖХ-МС анализа были выявлены новые
для S. fuscum соединения: метоксилированные производные фенолокислот,
протокатеховая кислота, фенилпропаноиды, метоксикатехины, флавонол,
тирозол, моносахариды – L-арабиноза, L-рамноза, и D-маннитол; дисахариды
– D-мальтоза, D-мелибиоза и D-лактоза.
5.
Сфагновая кислота (молекулярная масса 222) описанная для ряда
других видов сфагновых мхов, в составе экстракта мха S. fuscum на этаноле
70% отсутствует, что может являться хемотаксономическим признаком для S.
fuscum.
20
6.
Экстракт сфагнума бурого на этаноле 20%, обладает низкой
токсичностью,
проявляет
противовоспалительное,
в
эксперименте
анальгезирующее,
выраженное
ранозаживляющее,
антибактериальное и антифунгальное свойства на уровне используемых
препаратов сравнения.
7.
На основании комплексного фармакогностического исследования S.
fuscum определены нормативы подлинности и качества сырья, включенные в
проект ФС «Дерновина сфагнума бурого».
Список опубликованных работ
1.
Биоэлементы сфагновых мхов // Новые достижения в создании
лекарственных
средств
растительного
происхождения:
Материалы
всероссийской науч.-практич. конф., посв. 100-летию со дня рождения проф. Л.
Н. Березнеговской. – Томск, 2006. – С. 44–51 (Соавт. Л.Г. Бабешина, С.Е.
Дмитрук, Н.С. Охотина, Е.Н. Репешева).
2.
Видовой
состав
сфагнового
мха
Западной
Сибири
и
его
фармацевтическая ценность // «Информационные системы мониторинга
окружающей среды» / Информационные системы: Тр. постоянно действующей
научно-технической школы-семинара студентов, аспирантов и молодых
специалистов. – Томск, ТУСУР, 2004. – Вып. 3. – С. 58–61 (Соавт. Л.Г.
Бабешина, С.Е. Дмитрук, А.Е. Корж, Л.В. Панкова, Е.Л. Панова).
3.
Изучение адсорбционной способности сфагнового мха // Новые
достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения:
Материалы всероссийской науч.-практич. конф., посв. 100-летию со дня
рождения проф. Л. Н. Березнеговской. – Томск, 2006. – С. 165–169 (Соавт. Н.В.
Келус, Л.Г. Бабешина).
4.
Исследование рынка энтеросорбентов и перспективы их поиска среди
лекарственного растительного сырья //Современные проблемы фармакологии и
фармации: тез. докл. всероссийской науч.-практич. конф. – Новосибирск, 2005.
– С. 469–472 (Соавт. Н.В. Келус, Ю.А. Музыра, Л.Г. Бабешина).
21
5.
Обоснование перспективы комплексного применения сфагнового мха в
медицинской практике / Новые достижения в создании лекарственных средств
растительного происхождения: Материалы всероссийской науч.-практич. конф.,
посв. 100-летию со дня рождения проф. Л. Н. Березнеговской. – Томск, 2006. –
С. 89–93 (Соавт. Л.Г. Бабешина, М.В. Белоусов, Р.Р. Ахмеджанов, Н.В. Келус).
6.
Продуктивность сфагновых мхов Современные проблемы фармакологии
и фармации // Материалы всероссийской науч. практич. конф. – Новосибирск,
2005. – С. 451–453 (Соавт. Л.Г. Бабешина, Е.Н. Репешева, Н.С. Охотина).
7.
Ранозаживляющее действие экстракта сфагнового мха // ВМЖ. – 2007. –
Т. CCCXXVIII, № 12. – С. 41–42 (Соавт. Р.Р. Ахмеджанов, М.В. Белоусов, М.С.
Юсубов, С.Е. Дмитрук).
8.
Фармакологическая активность этанольного экстракта из сфагнума
бурого (Sphagnum fuscum (Shimp) Klinggr) // – Химия растительного сырья. –
2008. – № 3 – С. 129–134 (Соавт. М.В. Белоусов, Р.Р. Ахмеджанов, М.С.
Юсубов, Л.Г. Бабешина, С.Е. Дмитрук).
9.
Экологические
Автоматизированные
проектирования:
группы
сфагновых
системы
обработки
докл.
Томского
гос.
мхов
Томской
информациии,
ун-та
систем
области
//
управления
и
управления
и
радиоэлектроники. – Томск, ТУСУР, 2004. – Т. 9, № 1. – С. 61–63 (Соавт. Л.Г.
Бабешина, С.Е. Дмитрук).
10. Экология сфагновых мхов Томской области и перспективы их
использования в медицине // «Лекарственные растения в фармакологии и
фармации» / Науч. конф. посв. 50-летию Алтайского гос. медицинского
университета. – Барнаул, 2005. – С. 646–649 (Соавт. Л.Г. Бабешина, С.Е.
Дмитрук, Н.С. Охотина, А.Е. Корж).
11. Экспериментальное
обоснование
применения
сфагнового
мха
в
народной медицине // Новые достижения в химии и химической технологии
растительного сырья: Материалы 2 всероссийской конф. – Барнаул, 2005. –
Книга 2. – С. 20–21 (Соавт. Л.Г. Бабешина, С.Е. Дмитрук).
22