Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы)
advertisement
Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции–модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции. Номенклатура и классификация. Классификация рестриктаз. По механизму действия и молекулярной структуре различают три типа рестриктаз. Ферменты рестрикции типа I представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные из трех субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают рестриктазной, ДНК-метилазной и АТРазной активностями. Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия ATP, S-аденозилметионина и ионов Mg2+, они не распознают специфические последовательности нуклеотидов и в силу этого не находят широкого применения в генной инженерии. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, требуют для проявления активности наличия в реакционной смеси ATP и ионов Mg2+ и чаще всего используются при молекулярном клонировании. Ферменты типа III также активны только в присутствии ATP и ионов Mg2+ и не проявляют абсолютной зависимости от S-аденозилметионина. Номенклатура. Названия рестриктаз складываются из первых букв видовых названий бактерий, в которых они обнаружены, например Eco – E. coli. В том случае, когда различные по специфичности действия рестриктазы присутствуют в клетках разных штаммов одного вида бактерий, в название рестриктазы вводят дополнительную букву, например рестриктазы Hinc и Hind выделены из бактериальных клеток Haemophilus influenzae, штаммы с и d. Цифры, следующие за буквенными обозначениями, отражают последовательность открытия соответствующих рестриктаз в клетках бактерий одного вида, например HaeI, HaeII и HaeIII из H. aegipticus. Рестриктазы II и IIS типов – основные инструменты генной инженерии. Большинство рестриктаз типа II специфически узнают на ДНК тетра- и гексануклеотидные последовательности, а по крайней мере три из них – октануклеотиды. Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами типа II, характерно наличие в них симметрии второго порядка, т.е. узнаваемые ими последовательности представляют собой палиндромы, например у рестриктазы EcoRI – 5’-GAATTC-3’. Ферменты типа IIS (от англ. Shift) вносят разрывы в ДНК, которые смещены на несколько нуклеотидов относительно сайта рестрикции. Формы разрывов двухцепочечных ДНК, возникающих под действием рестриктаз. В "липких" концах выступающим одноцепочечным участком может быть как 5’-, так и 3’-конец (рис. II.1,а). Формальным признаком образования 5’- или 3’-выступающих "липких" концов в сайтах рестрикции является расположение точки расщепления цепей ДНК в последовательности, используемой для обозначения сайта рестрикции, слева или справа от оси симметрии соответственно. У некоторых рестриктаз точки расщепления обеих цепей ДНК расположены непосредственно друг под другом в сайте рестрикции. В этом случае после расщепления ДНК "липких" концов не образуется, а получаются так называемые "тупые" концы, в которых нет выступающих одноцепочечных участков ДНК (см. рис. II.1,а). Имеется одно принципиальное функциональное различие между 5’- и 3’-выступающими "липкими" концами – последние невозможно пометить путем их достройки ДНК-полимеразой. Сайты рестрикции для некоторых рестриктаз II типа не являются симметричными. Например, рестриктаза HgaI узнает асимметричную последовательность 5’-GACGC-3’, а одноцепочечные разрывы вносит в противоположные цепи ДНК, отступя вправо на 5 и 10 нуклеотидов соответственно:5’-GACGC(N)53’-CTGCG(N)5(N)5Последовательности нуклеотидов образующихся "липких" концов являются уникальными для каждого такого сайта рестрикции. Изошизомеры и гетерошизомеры. В клетках разных видов бактерий могут содержаться рестриктазы, узнающие одни и те же сайты рестрикции. Такие рестриктазы называют изошизомерами. Среди изошизомеров имеются ферменты, которые узнают одни и те же последовательности, но разрезают их по-разному. Такие рестриктазы иногда называют гетерошизомерами. Изменение субстратной специфичности рестриктаз в неоптимальных условиях. Рестриктазы являются высокоспецифическими ферментами. Однако для поддержания этой специфичности in vitro необходимо соблюдать в реакционной смеси оптимальные условия для действия ферментов. При нарушении таких условий у некоторых рестриктаз начинает проявляться вторичная (так называемая штриховая) активность. Замена ионов Mg2+ на Mn2+ GAATTC->AATT. ДНК-метилазы. Большинство штаммов E. coli содержит два типа ферментов, метилирующих ДНК: dam- и dcm-метилазы. Первая осуществляет перенос метильных групп в Nположение аденина в последовательности GATC. В таком случае многие рестриктазы (например BclI, MboI или ClaI), в состав сайтов рестрикции которых входит данная метилированная последовательность, перестают расщеплять ДНК по этим сайтам. Аналогичное действие на некоторые рестриктазы, например EcoRII, оказывает и dcmметилаза, осуществляющая метилирование остатков цитозина по положению С5 в последовательностях CMeCAGG и CMeCTGG. Для того чтобы избежать нежелательного влияния этих метилаз на клонируемые ДНК, в качестве хозяев используют мутантные штаммы E. coli: dam- и dcm-. ДНК-метилазы бактериальных систем рестрикции и модификации применяют для блокирования in vitro соответствующих сайтов рестрикции на исследуемых фрагментах ДНК с целью получения под действием гомологичных рестриктаз фрагментов больших размеров. ДНК-лигазы. Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. ДНК-лигазы разделяют на два семейства в зависимости от используемого ими кофактора в качестве донора AMP [84]. ATP-зависимые лигазы обнаруживают у бактериальных и эукариотических вирусов, архей, дрожжей, млекопитающих и эубактерий. NAD+-зависимые ДНК-лигазы имеются почти исключительно у эубактерий. Единственное известное исключение в этом отношении составляют энтомопоксвирусы насекомых Melanoplus sanguinipes и Amsacta moorei. Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях сегодняшнего дня находит ATP-зависимая ДНК-лигаза бактериофага Т4. Т4-ДНК-лигаза осуществляет соединение фрагментов дцДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5’-концевого фосфата и 3'концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5’фосфорилированных концов оцДНК или РНК с 3’-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот. ДНК-зависимая ДНК-полимераза I E.coli и фрагмент Кленова. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы осуществляют синтез ДНК на ДНК-матрицах в процессе репликации вирусных, бактериальных и эукариотических, митохондриальных и хлоропластных ДНК, а также во время их репарации и рекомбинации in vivo. Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент (фрагмент Клёнова). для своего функционирования требуют наличия затравки на матричной оцДНК (Mg) со свободным 3’-ОН-концом. ДНК-полимераза I E. coli состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 109 кДа и обладает тремя активностями: полимеризующей в направлении 5’3’, 5’3’-экзонуклеазной и 3’5’-экзонуклеазной. Большой фрагмент ДНК-полимеразы I E. coli (фрагмент Кленова) является частью полипептидной цепи ДНК-полимеразы I с молекулярной массой около 76 кДа, у которой отсутствует домен, соответствующий 5’3’-экзонуклеазе. Использование для введения концевой радиоактивной метки, "затупления" концов ДНК и ник-трансляции. Как ДНК-полимераза I, так и ее фрагмент применяется для введения радиоактивно меченных дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем ник-трансляции, т.е. перемещения одноцепочечного разрыва вдоль молекулы дцДНК, в котором 3’-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов [90]. При этом ДНК-полимераза I прокладывает себе путь с помощью 5’3’-экзонуклеазы, а фрагмент Кленова вытесняет цепь ДНК с 5’-конца. Кроме того, фрагмент Кленова используют для синтеза второй цепи кДНК, секвенирования ДНК по методу Сэнгера, заполнения 5’выступающих "липких" концов ДНК с образованием "тупых" концов, введения концевой радиоактивной метки, а также для удаления 3’-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3’5’-экзонуклеазой этого фермента. РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы), использование для получения кДНК. Обратные транскриптазы, иногда называемые ревертазами, способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, полимеризуя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата как это имеет место в случае ДНК-зависимых ДНКполимераз. Обратные транскриптазы, так же как и ДНК-полимеразы, функционируют только при наличии затравки. Применение полинуклеотидкиназы для введения концевой радиоактивной метки. Среди других многочисленных ферментов, используемых в генной инженерии, прежде всего следует упомянуть полинуклеотидкиназы, которые осуществляют перенос -фосфатных групп ATP на 5’-OH группы ДНК или РНК. Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 широко используется для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК с целью получения радиоактивно меченых зондов или секвенирования нуклеиновых кислот. Два типа реакций используется для введения концевой метки в ДНК с помощью полинуклеотидкиназы: прямая реакция. когда γ-фосфатная группа переносится ферментом непосредственно к дефосфорилированному 5’-концу ДНК, и реакция обмена. В последнем случае присутствие в реакционной смеси избытка ADP вынуждает полинуклеотидкиназу осуществлять перенос фосфатной группы с 5’-конца ДНК на ADP с образованием ATP, а освободившаяся OH-группа далее фосфорилируется γ-фосфатом по обычному механизму. Терминальная трансфераза. Осуществляет последовательное присоединение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов из пула дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к 3’OH-группам молекул ДНК, используется для введения радиоактивной метки в составе меченых нуклеотидов в 3’-концы ДНК, а также присоединения к 3’-концам фрагментов ДНК (особенно кДНК) протяженных гомополимерных последовательностей нуклеотидов (коннекторов) для последующего их клонирования. Щелочные фосфатазы. Применение для повышения эффективности клонирования. Катализируют удаление 5’-фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению 5’-концевой радиоактивной метки 32Р, а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Нуклеазы в генной инженерии. Экзонуклеаза III E.coli S1-нуклеаза. РНКаза A и ДНКаза I. Экзонуклеаза III E. coli катализирует последовательное отщепление 5’нуклеотидов из дцДНК в направлении 3’5’. Фермент обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, активностью РНКазы H (гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах) и 3’-фосфатазной активностью. Экзонуклеаза фага катализирует последовательное отщепление 5’мононуклеотидов в дцДНК при наличии в них 5’-концевых фосфатных групп. Ее используют для получения молекул оцДНК с целью их последующего секвенирования. Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae (35 кДа, 267 а.о.) в присутствии ионов Zn2+ специфически расщепляет молекулы оцДНК и РНК с образованием 5’фосфорилированных моно- и олигонуклеотидов. Фермент специфически распознает и расщепляет одноцепочечные участки в одноцепочечных разрывах, брешах и петлях двухцепочечных ДНК, но не в одиночных ошибочно спаренных нуклеотидах. Те же свойства присущи и нуклеазе золотистой фасоли (mung bean), а также нуклеазе P1 из Penicillium citrinum. Панкреатическая рибонуклеаза A (РНКаза A) является небольшим белком (124 а.о.), который обладает активностью эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами [92]. Продуктами гидролиза являются 3’-фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3’-монофосфаты. Во многих тканях всех млекопитающих обнаружен специфический белковый ингибитор RI (450-460 а.о.), обладающий высоким сродством к РНКазе A [93]. Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и дцДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5’-фосфатные группы. В присутствии ионов Mg2+ ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически вдоль молекулы, а в присутствии ионов Mn 2+ расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга. Понятие вектора и его емкости. Основная идея, позволяющая решать эту задачу, заключается в том, чтобы присоединить исследуемые фрагменты ДНК к молекуле-переносчику, которая могла бы автономно существовать внутри бактериальных или эукариотических клеток в виде одной или нескольких копий и передаваться вместе со встроенным в нее фрагментом ДНК от одной клетки к другой. Такие молекулы-переносчики фрагментов нуклеиновых кислот были созданы, их называют векторами. Идеальная векторная молекула должна обладать несколькими обязательными свойствами. Во-первых, любой вектор должен длительное время существовать в популяции клеток-хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток. Во-вторых, в любом векторе должны быть биохимические или генетические маркеры, которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках. В-третьих, структура векторной молекулы должна допускать встраивание в нее чужеродной последовательности нуклеотидов без нарушения ее функциональной целостности. Функциональная классификация векторов: экспрессирующие векторы, челночные (бинарные) векторы. Такие векторы, способные реплицироваться в клетках-хозяевах разных биологических видов, называют челночными, или бинарными векторами. . Необходимость использования челночных векторов в генной инженерии связана с тем, что наработку в препаративном количестве векторной ДНК для проведения генноинженерных манипуляций удобнее проводить в бактериальных клетках, тогда как получение биологически активных продуктов клонированных генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в природных условиях, т.е. в своем обычном генетическом окружении. При конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген предполагается экспрессировать. Особенности строения плазмидных векторов на примере полифункционального вектора Bluescript. Таким образом, способность к автономной репликации является важнейшим биологическим свойством любой плазмиды, обеспечивающим ее независимое (в определенных пределах) существование [95]. Автономная репликация обеспечивается наличием области начала репликации, на котором происходит сборка макромолекулярного комплекса, осуществляющего инициацию и продолжение синтеза плазмидной ДНК. Для своей репликации различные плазмиды имеют разную потребность в ферментах клетки-хозяина. Существование плазмид, независимое от хромосомы клетки-хозяина, невозможно без осуществления контроля числа копий плазмидной ДНК в клетке, осуществляемого самими плазмидами . Все плазмиды осуществляют негативный контроль синтеза ДНК с использованием специфических ингибиторов репликации. Одним из распространенных механизмов негативного контроля является синтез на матрице плазмидной ДНК антисмысловой РНК (контртранскрипта), который может быть комплементарен или мРНК белка-инициатора репликации Rep, или РНК-праймеру (в том числе, его предшественнику), необходимому для инициации синтеза плазмидной ДНК. Итероны конкурируют с областью начала репликации за связывание Rep-белка, присутствующего в клетке в небольшом количестве, и связывают его полностью при достижении числа копий плазмиды определенного уровня, что полностью блокирует инициацию репликации. Еще одним важным для генной инженерии свойством плазмид является консервативность их размера. Минимальный размер плазмиды диктуется необходимостью расположения в ее молекуле всех генов и регуляторных последовательностей, необходимых для поддержания ее внутриклеточной автономии. Другое требование, которое необходимо соблюдать при конструировании искусственных плазмид – это близкое друг к другу расположение взаимозависимых регуляторных участков молекулы. Это необходимо для обеспечения высокой вероятности их совместной передачи в дочерние клетки. Повышение размера плазмиды сверх оптимального будет отрицательно сказываться на ее стабильности. Различные близкородственные плазмиды, как правило, не могут длительное время сосуществовать друг с другом в клетках потомства исходной их содержащей бактериальной клетки. Причина несовместимости близкородственных плазмид в бактериальных клетках проста: все они обладают одним и тем же или очень похожим механизмом контроля числа их копий. Плазмиды серии Bluescript. Полилинкер. Селектируемые маркеры. Ген lacZ в качестве селектируемого маркера. Вектор Bluescript M13+ представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной около 3 т.п.о. Он включает в себя ген устойчивости к ампициллину Ampr, ген -галактозидазы lacZ, в N-концевую часть которого встроен полилинкер, содержащий уникальные сайты рестрикции для 21 рестриктазы, промоторно-операторную область lacZ, а также ген lac-репрессора lacI. В результате встраивания клонируемого фрагмента ДНК в полилинкер происходят разрыв кодирующей части гена lacZ и инактивация -галактозидазы, что, как и в случае вектора pUC18, можно обнаружить по исчезновению окраски колоний бактерий, содержащих этот вектор со вставкой клонированной ДНК. Кроме того, встроенный в полилинкер фрагмент ДНК попадает под контроль промоторно-операторной регуляторной последовательности гена lacZ и в присутствии индуктора IPTG может быть экспрессирован в клетках E. coli. В дополнение к этому полилинкер в векторной плазмиде содержит на одном конце промотор для Т7-, а на другом – для Т3-РНКполимераз, которые ориентированы навстречу друг другу, что позволяет транскрибировать любую из цепей клонированного фрагмента ДНК in vitro с помощью той или другой РНК-полимеразы и получать препаративные количества мРНК или же комплементарной ей антисмысловой РНК. Кроме того, вектор Bluescript M13+ обладает межгенной областью (IG) фага f1, родственного фагу M13. Эта область детерминирует все цис-действующие функциональные последовательности нуклеотидов фага, необходимые для репликации его хромосомы и упаковки ее в фаговые частицы. В присутствии фага-помощника M13 происходит преимущественная упаковка образовавшейся в результате репликации одноцепочечной плазмиды в фаговые частицы M13. ОцДНК Bluescript M13+ после очистки может быть использована непосредственно для секвенирования клонированной ДНК или проведения сайтспецифического мутагенеза. Векторы типа Bluescript M13+, способные существовать либо в виде плазмиды, либо в составе фаговых частиц нитевидных бактериофагов, называют фагмидами. Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Емкость клонирующих векторов была значительно повышена с появлением векторов, сконструированных на основе хромосомы бактериофага .. Во-первых, векторы на основе ДНК фага обладают значительно большей емкостью, в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 5 до 25 т.п.о. Во-вторых, фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактериальных клеток и поэтому образовывать стерильные пятна (бляшки) на газоне бактерий. Такие бляшки содержат в концентрированном виде как сами фаговые частицы с упакованными в них рекомбинантными молекулами ДНК, так и все продукты метаболизма зараженных бактериальных клеток, включая белки и ферменты, которые появляются в результате экспрессии клонированных бактериальных генов. Основой конструирования фаговых векторов служат несколько простых принципов (рис. 7). В середине молекулы -ДНК длиной ~45 т.п.о. расположен участок хромосомы (~15 т.п.о.), который не является необходимым для литического развития бактериофага. Поэтому, в принципе, его можно заменить на любой фрагмент ДНК аналогичного размера и осуществить клонирование фрагмента путем размножения рекомбинантного бактериофага. Поскольку механизм упаковки хромосомной ДНК в фаговые частицы основан на включении ДНК строго определенного размера, рекомбинантные ДНК, содержащие фрагменты клонируемой ДНК, которые не соответствуют оптимальному размеру, не упаковываются и не клонируются. Это позволяет легко освобождаться от фаговых частиц, не содержащих вставки клонируемой ДНК, и оптимизировать процесс клонирования путем снижения в упаковочных экстрактах доли нежизнеспособных фаговых частиц. Космиды и фазмиды (фагмиды). Как уже упоминалось выше, фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15–25 т.п.о. Однако этого явно недостаточно, чтобы клонировать целиком многие гены животных и растений, длина которых зачастую превышает 35–40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами. Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos-сайты ДНК фага .В ДНК нормальных фаговых частиц cosсайты расположены на концах молекул, они разделяют мономеры фаговой ДНК в конкатемерах, объединяющих несколько соединенных "голова к хвосту" мономеров, которые являются предшественниками зрелых фаговых ДНК перед упаковкой в фаговые частицы. В таких конкатемерах соседние cos-сайты располагаются на расстоянии 35–45 т.п.о. друг от друга и заключают между собой весь фаговый геном. Таким образом, наличие cos-сайтов в ДНК является, по существу, единственным необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. Это означает, что последовательность нуклеотидов -ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, которая заключает в себе весь фаговый геном (35–45 т.п.о.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине (38–52 т.п.о.) фрагмент чужеродной ДНК и эффективно упакована в фаговые частицы (такова максимальная емкость головки фага). Естественно, что такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной. Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий. Сверхъемкие векторы YAC, BAC и PAC. Мини-хромосомы дрожжей YAC представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие большинство вышеупомянутых генетических элементов, которые позволяют им стабильно существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей. Векторы семейства YAC являются челночными, т.е. обладают последовательностями нуклеотидов, необходимыми для их репликации в бактериальных клетках. Векторы YAC, содержащие клонируемые последовательности, существуют в среднем в виде одной копии на клетку, и даже в отсутствие селектирующих условий утрачиваются с очень низкой частотой (10 -3-10-5 за клеточную генерацию). При увеличении общего размера вектора до 140 т.п.о. и выше, частота потери его молекул не превышает таковую, характерную для обычных хромосом дрожжей. . В заключение следует упомянуть о семействе векторов PAC (P1-derived artificial chromosome), также часто используемых в современных исследованиях. Векторы этой серии содержат гены умеренного бактериофага Р1, обеспечивающие репликацию фаговой хромосомы в зараженных бактериальных клетках. Рекомбинантные ДНК на их основе (размер вставки 150–200 т.п.о.) также вводятся в бактериальные клетки с помощью электропорации. Однако, в отличие от бактериофага λ, который во время скрытого (лизогенного) состояния встраивает свою хромосому в хромосому бактерии-хозяина, фаг P1 поддерживает хромосому в цитоплазме бактериальных клеток в виде кольцевой ковалентно замкнутой молекулы, напоминающей плазмиду, размер которой составляет 100 т.п.о. Размер репликона, который способен обеспечивать репликацию хромосомы P1 в лизогенном состоянии, составляет всего 1,5 т.п.о. Для преодоления трудностей, возникающих при использовании искусственных хромосом дрожжей, были сконструированы альтернативные векторные системы, среди которых наиболее популярными в настоящее время являются системы, основанные на искусственных хромосомах бактерий – BAC (bacterial artificial chromosome) [106]. В векторных системах BAC используется ДНК полового фактора (F-фактора) E. coli – гигантской плазмиды мужских бактериальных клеток, которые являются донорами бактериальной ДНК при конъюгации с женскими клетками (рис. 11). Типичный F-фактор содержит гены oriS, repE, parA и parB, регулирующие его собственную репликацию и контролирующие число его копий в бактериальных клетках. В частности, гены oriS и repE обеспечивают однонаправленную репликацию F-фактора, а гены parA и parB поддерживают число его копий на уровне одной-двух на бактериальную клетку. Классический вектор BAC (pBAC108L) включает в себя все эти гены, а также ген устойчивости к хлорамфениколу, используемый в качестве селектируемого маркера. Вектор содержит также фрагмент ДНК, по которому производится клонирование. В этом фрагменте имеются типичный полилинкер, а также два уникальных сайта рестрикции HindIII и BamHI, фланкированные промоторами T7- и Sp6-РНК-полимераз. Такие промоторы могут быть использованы для получения РНК-зондов, необходимых для осуществления "прогулок по хромосомам", а также прямого секвенирования клонированной ДНК в месте стыковки с вектором. Искусственные хромосомы животных (MAC) и человека (HAC). Конструирование MAC методом «сверху вниз». Данная стратегия основана на последовательном укорачивании природных хромосом с сохранением их элементов, обеспечивающих репликацию и митотическую сегрегацию. Эта группа методов известна как фрагментация хромосом, с использованием теломерных последовательностей (telomere-associated chromosome fragmentation – TACF) или укорачивание с помощью теломер (telomere directed truncation – TDT). Метод основан на гомологичной рекомбинации между вектором (YAC) и укорачиваемой хромосомой, в результате которой происходит замена большей части последовательностей плеч хромосомы на последовательности вектора. Такой вектор исходно содержит последовательности, гомологичные таковым изменяемой хромосомы, по которым происходит кроссинговер, селектируемый маркер (обычно ген устойчивости к антибиотику neo или gpt, кодирующий гуанинфосфорибозилтрансферазу) и теломерные последовательности. Конструирование MAC методом «снизу вверх». При этом подходе искусственную минихромосому собирают из отдельных последовательностей, соответствующих теломерам, центромерам и областям начала репликации природных хромосом, с которыми объединяют требуемую рекомбинантную ДНК. Теломерные последовательности животных представляют собой тандемно повторяющиеся последовательности вида (TTAGGG)n, которые, будучи объединенными в повторы длиной ~1 т.п.о., эффективно функционируют в клетках человека. В качестве областей начала репликации могут быть использованы различные последовательности, среди которых наиболее изучены соответствующие последовательности β-глобинового гена человека. Вект Размер вставки Хозяин Структура ор (т.п.о.) E. coli Пла Кольцевая 0,1–10 змиды E. coli Хро мосома Линейная 5-25 фага λ Кос E. coli Кольцевая 35–45 миды E. coli BAC Кольцевая До 300 E. coli PAC Кольцевая 100–300 Линейная S. cerevisiae YAC 100–2000 хромосома MA Клетки Линейная или 41000 (?) C животных кольцевая Понятие библиотеки (клонотеки) нуклеотидных последовательностей. Уникальные гены, представленные в гаплоидном геноме только одной копией, затеряны среди других последовательностей генома, и для работы с индивидуальными рекомбинантными ДНК требуется их очистка от ненужного генетического материала. Такая задача в генной инженерии решается через создание репрезентативных (представительных) клонотек последовательностей нуклеотидов ДНК или, иначе говоря, клонотек генов. Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или какую-либо известную его часть. Ее репрезентативность. При этом репрезентативная клонотека должна заключать в себе с высокой долей вероятности любую последовательность нуклеотидов изучаемого генома. Экспериментальная оценка качества библиотеки последовательностей. Оценку качества клонотеки осуществляют путем определения среднего размера вставок в случайно выбранных клонах. Методы синтеза кДНК. При конструировании клонотек кДНК прежде всего проводят очистку мРНК хроматографией на олиго-dT-целлюлозе, которую используют в качестве матрицы при обратной транскрипции (рис. 16) [228,229]. Обратная транскриптаза, также как и ДНКзависимая ДНК-полимераза, для своего функционирования требует затравки в виде олигонуклеотида, как правило олиго(dT), который отжигают с 3’-концевой поли(A)последовательностью мРНК [230]. Элонгируя этот праймер, обратная транскриптаза синтезирует первую цепь кДНК. Удаление РНК-матрицы из гибрида проводят с помощью РНКазы H или путем щелочного гидролиза мРНК. Образовавшиеся молекулы оцДНК имеют тенденцию самопроизвольно формировать вторичную структуру, что приводит к образованию структуры типа «стебель-петля» на 3’-конце оцДНК. Этот конец в свою очередь используется в качестве затравки при синтезе второй цепи кДНК ДНК-полимеразой I. В итоге образуется дцДНК, обе цепи которой на одном конце соединены между собой петлей из оцДНК. Петлю удаляют инкубацией с S1-нуклеазой, специфически гидролизующей одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Альтернативно в цепи мРНК, использованной в качестве матрицы при синтезе первой цепи кДНК, с помощью РНКазы H делают одноцепочечные разрывы [231]. Образовавшиеся в итоге фрагменты мРНК далее используются ДНК-полимеразой I E. coli в качестве затравок при синтезе второй цепи кДНК. Повторная инкубация кДНК с ДНК-полимеразой приводит к окончательному «затуплению» ее концов, а концы кДНК фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы, что необходимо для проведения последующего клонирования этих макромолекул. Для клонирования к концам кДНК присоединяют с помощью ДНК-лигазы олигонуклеотидные адаптеры, содержащие сайты рестрикции, необходимые для соединения с линеаризованным вектором. После этого кДНК фракционируют по размерам, очищают от оставшихся молекул адаптера и клонируют по липким концам стандартными методами. Поскольку длина кДНК редко превышает несколько т.п.о., в качестве вектора обычно используют плазмиды или инсерционные векторы на основе фага λ. Методы отбора требуемых последовательностей из клонотек ДНК. Способы получения требуемых последовательностей нуклеотидов из клонотек генов можно разделить на три группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на присутствие в них искомых последовательностей нуклеотидов путем последовательного перебора случайных клонов. При таком подходе, получившем название скрининга, творческие усилия исследователя направлены только на облегчение самого процесса анализа клонов, например, на его автоматизацию. Во втором случае, присутствие нужных последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах бляшек продуктов экспрессии искомых генов – РНК, белков или ферментативной активности, т. е. определенного фенотипа, который отличает такие клоны от соседних, не содержащих соответствующих последовательностей. В этом случае исследователь среди большого количества суммарных клонов осуществляет выбор тех, которые резко отличаются от соседних по своему фенотипу, например цвету колоний. При таком подходе производится выбор требуемого фенотипа среди большого числа других фенотипов. Реализация третьего подхода требует создания селективных условий, при которых преимущество в размножении получают те клоны, которые отвечают требованиям отбора, например, приобрели способность к росту на селективных питательных средах в присутствии антибиотика или в отсутствие аминокислоты в случае исходно ауксотрофного штамма. Последний подход, кроме своего необыкновенного изящества в замысле, демонстрирует и самую высокую эффективность, так как позволяет «в одно касание» освободиться от всех нежелательных примесей в виде ненужных клонов. Гибридизация с зондами. Гомологичные зонды. Использование гомологичных зондов, т. е. зондов, последовательность которых полностью соответствует исследуемому гену, становится возможным в том случае, если известна (например, из литературы или базы данных) первичная структура последовательности, которую пытаются обнаружить в клонотеке. Такая задача часто возникает, когда определенный ген или кДНК хотят использовать в прикладных целях, например, в биотехнологических разработках или для генотерапии наследственных заболеваний. Та же самая задача может возникнуть и при необходимости получения последовательности целого гена, если предварительно клонирована его часть. Подход с использованием гомологичных зондов может быть применен и при исследовании популяционного полиморфизма исследуемых последовательностей. Сложнее обстоит дело в том случае, если на момент клонирования последовательность нуклеотидов исследуемого участка хромосомы совершенно неизвестна. Такие задачи иногда могут быть решены с использованием гетерологичных зондов. Гетерологичные зонды. Гетерологичные олигонуклеотидные зонды получают на основании предположения о наличии гомологии в последовательностях у генов организмов разных биологических видов, которые выполняют аналогичные функции. При гибридизации гетерологичных зондов с ДНК исследуемой клонотеки используют более низкие температуры их отжига для того, чтобы даже при наличии нескольких неправильно спаренных оснований в гибриде, он оказался достаточно стабильным для обнаружения. Понижение температуры отжига зонда значительно ниже его температуры плавления будет почти неизбежно сопровождаться получением ложноположительных результатов, то есть гибридизацией зондов с неродственными последовательностями, которые обладают определенной гомологией с искомой. Во многих случаях этот результат не опасен, поскольку после такого предварительного отбора, круг поиска нужной последовательности существенно сужается. Проведение повторной гибридизации в других условиях среди предварительно отобранных клонов может привести к положительному результату. Ситуация становится угрожающей в том случае, если число ложноположительных клонов, выявленных на первом этапе отбора, становится слишком большим. В этом случае цена повторного скрининга может оказаться слишком высокой. Использование ПЦР. Обратная трансляция. Разработать последовательность зонда или праймера для ПЦР к неизвестному гену иногда оказывается возможным путем очистки небольшого количества белка, кодируемого клонируемым геном, и определения последовательности его нескольких N-концевых или C-концевых аминокислотных остатков. На основании этих данных с учетом вырожденности генетического кода и частоты встречаемости аминокислотных остатков у исследуемого организма синтезируют олигонуклеотидные зонды, которые используют для гибридизации in situ, аналогично тому как было описано выше. Такой поход к определению последовательности нуклеотидов гена на основании последовательности аминокислот белка, кодируемого этим геном, получил название обратной трансляции. Повторный скрининг. Часто при первичном отборе клоны на чашках Петри вырастают настолько плотно, что после гибридизации с зондом бывает трудно выделить с первого раза бактерии, относящиеся к одному клону или фаговые частицы одной бляшки, которые дали положительный сигнал во время проведения первого раунда отбора. В этом случае бактериальные клетки или фаговые частицы, выделенные из зоны сигнала, рассевают до отдельных колоний или бляшек и используют во втором раунде отбора. Как правило с помощью такого простого подхода удается «расчистить» нужные клоны и выделить их в гомогенном состоянии. Субклонирование рекомбинантных ДНК. При субклонировании вставку рекомбинантной ДНК, выделенную из вектора изолированного клона, переносят в новый вектор, который дает возможность её исследования в более простых условиях и с затратой меньших усилий. Если вставка была получена в фаговом, космидном векторе или с использованием искусственной хромосомы, что предполагает ее большой исходный размер, то она может быть переклонирована по частям в плазмидном векторе, и это может значительно облегчить ее дальнейшее исследование, например с помощью секвенирования. Микроматрицы и микрочипы ДНК Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время становится использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе методов на небольшой по размеру поверхности стекла или другого твердого носителя иммобилизуют в виде правильно расположенных микропятен небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов (чаще всего синтетические олигонуклеотиды или кДНК), которые далее используют для гибридизации с анализируемыми образцами нуклеиновых кислот. При совпадении первичной структуры ДНК микропятна и анализируемого образца на поверхности стекла образуются правильные ДНК–ДНКгибриды, которые обнаруживаются по появлению в данных участках микроматрицы сигналов, например в виде микроскопической флуоресцирующей точки или по тушению флуоресценции исходно меченых последовательностей. Такие кусочки твердого носителя с нанесенными на них микроматрицами ДНК получили название микрочипов ДНК. Методы создания микроматриц ДНК Для нанесения нуклеиновых кислот на поверхность подложки в основном используют три подхода: короткие олигонуклеотиды синтезируют прямо на ее поверхности, а также прикрепляют к ней предварительно полученные фрагменты ДНК ковалентными или нековалентными связями. При альтернативном подходе микроматрицы олигонуклеотидов синтезируют на подложке с использованием технологии струйных принтеров. В этом случае головка принтера движется вдоль подложки и, в соответствии с заложенной программой, наносит на необходимые участки небольшие количества раствора с фосфорамидитными производными нуклеотидов из индивидуальных резервуаров. Этапы снятия защитных групп и промывания производятся так же, как и при обычном твердофазном синтезе олигонуклеотидов. Эффективность каждого этапа синтеза в этом случае может превышать 99%, что позволяет синтезировать олигонуклеотиды длиной до 40 оснований с суммарным выходом 67% (40 этапов с выходом 99% на этап). Еще одной разновидностью методов создания микроматриц является синтез индивидуальных олигонуклеотидов, их очистка и нанесение с помощью микроробота на поверхность подложки с адгезивным покрытием. Однако создание этим способом микроматриц, содержащих тысячи индивидуальных элементов, – очень трудоемкий процесс. Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и прикладных исследованиях Определение первичной структуры и картирование ДНК являются основными направлениями использования микроматриц олигонуклеотидов в настоящее время. Прямое секвенирование генов с помощью олигонуклеотидных микрочипов сдерживается необходимостью применения мягких условий гибридизации, при которых происходит внутреннее спаривание нуклеотидов как в зондах, так и в анализируемых частях генов, что часто является причиной неправильной интерпретации получаемых данных. Тем не менее, на основании результатов гибридизации продуктов ПЦРамплификации частей клонов геномных библиотек с микроматрицами олигонуклеотидов удается осуществлять достаточно эффективное упорядочивание клонов друг относительно друга. Продемонстрирована возможность осуществления биохимических манипуляций с ДНК, иммобилизованных на микрочипах, с использованием ДНК-полимераз и эндонуклеаз рестрикции. Такие воздействия применяют параллельно с гибридизацией для получения дополнительной информации об анализируемых ДНК. Исследование генетического полиморфизма ДНК. Более информативными оказываются результаты использования микроматриц ДНК для оценки генетического полиморфизма родственных геномов. Способность зондов гибридизоваться с ДНК микроматриц сильно изменяется при наличии даже единственного неспаренного нуклеотида в гибридах зонд–мишень. Это позволяет с высокой эффективностью осуществлять поиск полиморфизмов в сравниваемых геномах даже на уровне различий в отдельных нуклеотидах. Исследование экспрессии генов с использованием микроматриц ДНК. Технология микрочипов ДНК позволяет осуществлять одновременный мониторинг за экспрессией большого числа генов (expression profiling). С этой целью для генов с известными последовательностями нуклеотидов создается микроматрица сегментов кДНК длиной 0,5–1,0 т.п.о. Из анализируемых образцов (например опухоли и здоровой ткани) выделяют суммарную мРНК, которую с помощью обратной транскрипции превращают в кДНК, метят флуоресцентными красителями и используют для последующей конкурентной гибридизации с зондами, нанесенными на микроматрицу. Интенсивность флуоресценции отдельных элементов микроматрицы после образования гибридов позволяют качественно характеризовать различия в уровнях экспрессии конкретных генов в анализируемых образцах. Например, отсутствие конкуренции за образование гибридов со стороны кДНК нормальной ткани может говорить о транскрипции в опухоли новых генов, не экспрессирующихся в нормальных клетках. Такой подход успешно использовали для характеристики ответа клеток в культуре или in vivo по изменению уровней экспрессии генов на различные внешние стимулы, включая тепловой шок, воспалительные реакции и канцерогенные воздействия. Помимо известных генов в мониторинг иногда включают и случайные клоны кДНК, что позволяет идентифицировать новые гены, экспрессия которых ассоциирована с патологическими состояниями органов и тканей. С использованием микроматриц кДНК в современный анализ могут быть одновременно включены до 10000 экспрессирующихся генов. Микроматрицы олигонуклеотидов также применяют для определения профилей экспрессии генов. В этом случае для повышения эффективности мониторинга одновременно в разных элементах матрицы используют несколько олигонуклеотидов, комплементарных различным частям анализируемых кДНК. С помощью этого подхода недавно был определен профиль экспрессии 6800 генов в культивируемых клетках фибросаркомы в присутствии -интерферона. Футпринтинг Принцип защиты последовательности нуклеотидов рестрикционных фрагментов ДНК белками от действия агентов, расщепляющих ДНК, лежит в основе футпринтинга – метода, позволяющего определять места специфических контактов белков с ДНК. Этот метод оказался особенно полезным для точной локализации последовательностей нуклеотидов генов, взаимодействующих с регуляторными белками, активаторами и репрессорами, а также с самими РНК-полимеразами, и своему появлению целиком обязан генной инженерии. Рестрикционные фрагменты ДНК, последовательности нуклеотидов которых известны, метят по одному из концов 32P и инкубируют с исследуемыми белками. Образовавшиеся комплексы белок–ДНК подвергают действию агентов, гидролизующих ДНК, например ДНКазы I, в условиях неполного расщепления ДНК, и полученные продукты гидролиза разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей авторадиографией. В отсутствие белка на авторадиограммах наблюдают появление полного набора фрагментов ДНК в том виде, как это имеет место при обычном секвенировании ДНК. Участки ДНК, защищенные белком от действия ДНКазы, идентифицируются по исчезновению полос, соответствующих продуктам статистического расщепления ДНК, концы которых попадают в область связывания с белком. При этом на электрофоретических дорожках появляются характерные пропуски (или "следы" – footprints), что и дало название всему методу. Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды Главный механизм, лежащий в основе функционирования системы антисмысловых РНК, прост и опирается на известный феномен взаимодействия двух комплементарных друг другу молекул нуклеиновых кислот с образованием двухцепочечных РНК–РНК- или ДНК–РНК-гибридов. Оказалось, что взаимодействие с мРНК комплементарного ей полинуклеотида или олигонуклеотида (которые могут быть транскриптами незначащей цепи ДНК, т.е. противоположной той, с которой произошла транскрипция этой мРНК) может блокировать ее трансляцию рибосомами и нарушать экспрессию всего гена на уровне трансляции. Механизм действия антисмысловых РНК Многочисленные исследования антисмысловых РНК показали, что конечным результатом их действия, как правило, является высокоспецифическое ослабление экспрессии генов, мРНК которых является мишенью действия антисмысловых РНК. При использовании олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным частям мРНК подавление трансляции мРНК достигалось главным образом за счет ее расщепления РНКазой H в месте образования РНК–ДНК-гибрида. Взаимодействие антисмысловых РНК с 5’-концевыми нетранслируемыми последовательностями мРНК может изменять пространственную структуру мРНК таким образом, что инициирующий AUG-кодон становится недоступным рибосомам. Не исключено, что в ряде случаев антисмысловые РНК могут блокировать экспорт мРНК из ядра в цитоплазму, особенно когда они присутствуют в молярном избытке. Это также может быть одной из причин подавления синтеза соответствующих белков. Наилучшие результаты по блокированию экспрессии генов были получены в том случае, когда гены антисмысловых РНК находились в клетках в виде множественных экспрессируемых копий, встроенных в геном, или под контролем сильных промоторов. Дуплексы антисмысловых РНК и мРНК, образующиеся в клетках, которые экспрессируют антисмысловые РНК, являются субстратом для расплетающего фермента (unwindase), который присутствует в клетках всех типов тканей животных. Расплетающий фермент производит дезаминирование 25–40% остатков аденина в обеих цепях дуплекса с образованием инозина. Остатки инозина образуют комплементарные пары с остатками гуанина, поэтому в процессе такой модификации происходит изменение кодирующих свойств мРНК и ее трансляция может приводить к образованию нефункциональных белков. Таким образом, и в данном случае антисмысловые РНК опосредуют инактивацию комплементарных им мРНК, что является еще одним механизмом их ингибирующего действия на экспрессию генов. Рибозимы Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК характеризуется высокой специфичностью. Это обусловлено большой точностью процесса РНК-РНКгибридизации, основанной на комплементарном взаимодействии друг с другом протяженных последовательностей нуклеотидов. Однако сами по себе антисмысловые РНК не инактивируют необратимо мРНК-мишени, и для подавления экспрессии соответствующих генов требуются высокие (по крайней мере, эквимолярные по отношению к мРНК) внутриклеточные концентрации антисмысловых РНК. Эффективность действия антисмысловых РНК резко повысилась после того, как в их состав были введены молекулы рибозимов – коротких последовательностей РНК, обладающих эндонуклеазной активностью. Рибозимами в широком смысле называют молекулы РНК, обладающие любой ферментативной активностью. Нестабильность РНК является одним из основных ограничений, препятствующих эффективному их использованию in vivo в качестве лекарственных средств. Поскольку рибозимы представляют собой короткие молекулы, которые можно получать в результате химического синтеза, химические модификации этих олигонуклеотидов рассматриваются как одна из перспективных возможностей повышения их устойчивости к нуклеазам. Репарация мутантных РНК с помощью рибозимов Аутосплайсинг транскриптов, содержащих интроны группы I, начинается с расщепления фосфодиэфирной связи между 5’-концевым экзоном и прилегающим к нему интроном, сопровождаемого полным удалением интрона и лигированием фланкирующих его экзонов, приводящим к восстановлению непрерывной структуры РНК. Идея, лежащая в основе использования рибозимов для репарации РНК, проста. Достаточно лишь с помощью генно-инженерных методов к 3’-концу рибозима присоединить вместо 3’-концевого экзона любую другую последовательность, чтобы она соединялась с последовательностью 5’-концевого экзона в строго определенной точке с образованием гибридной молекулы РНК. Поскольку сайт взаимодействия рибозима с РНК во время транс-сплайсинга и положение точки разрыва РНК целиком определяются внутренней направляющей последовательностью рибозима (internal guide sequence – IGS), присоединение новой 3’-концевой последовательности можно осуществлять практически в любом месте РНК-мишени (рис. II.28). Таким образом, для репарации мутационного повреждения в экзоне 2 на уровне РНК IGS делают комплементарной участку РНК-мишени, локализованному выше точки повреждения (в рассматриваемом примере – А) на стыке экзонов 1 и 2. Экзон 2 дикого типа соединяют с рибозимом, который после взаимодействия с РНК-мишенью вырезает из нее мутантную последовательность экзона 2 и заменяет на эквивалентную последовательность дикого типа. В результате комплекс рибозима и репарированной РНК распадается и обновленная РНК вовлекается в трансляцию. Дезоксирибозимы Несмотря на прогноз о большой каталитической инертности ДНК, в течение последних пяти лет ферментативная активность была обнаружена и у ее молекул, правда пока только в искусственных условиях. Молекулы ДНК, обладающие ферментативной активностью, получили название дезоксирибозимов. К настоящему времени описана способность дезоксирибозимов расщеплять, лигировать и фосфорилировать молекулы ДНК, метилировать порфирины или осуществлять гидролиз РНК. Получены дезоксирибозимы с активностями РНКазы, которые используют в качестве кофакторов аминокислоты, ионы металлов, а также не требуют кофакторов вообще. При этом Mg2+-зависимые дезоксирибозимы расщепляют РНК со скоростью, сопоставимой с таковой природных рибозимов (kкат= 10 мин-1). Аптамеры Аптамерами называют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры с требуемыми свойствами выделяют из библиотек случайных последовательностей методами селекции in vitro, используя их способность специфически взаимодействовать с соответствующими иммобилизованными лигандами. Такие соединения находят применение в фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов взаимодействия нуклеиновых кислот с лигандами, и их начинают использовать для обнаружения повреждений в ДНК, для воздействия на экспрессию генов, а также в качестве модулей при конструировании рибозимов, обладающих аллостерическими свойствами. В настоящее время получены аптамеры как рибо-, так и дезоксирибонуклеотидной природы, которые образуют специфические комплексы с разнообразными химическими соединениями, включая большинство аминокислот, нуклеотиды и их производные, антибиотики, биологически активные пептиды, органические красители, дофамин, теофиллин, и многие другие органические соединения, имеющие биологическое значение. Недавно была реализована идея использования аптамеров для введения флуоресцентной метки в молекулы РНК, синтезируемые in vivo, для наблюдения за экспрессией соответствующих генов. Исключительно важные результаты могут быть получены при скрининге in vitro аптамеров среди пула фрагментов природных РНК. В этом случае библиотеки природных последовательностей могут быть использованы для поиска доменов нуклеиновых кислот, специфически взаимодействующих с известными молекулами биогенного происхождения, например белками ретровирусов, для которых неизвестны РНК-мишени клетки-хозяина. Не исключено, что в ходе такого рода исследований у РНК или их фрагментов будут обнаружены новые внутриклеточные функции, связанные с метаболизмом важных биологических кофакторов, включая ATP, GTP, FAD и NAD+. Ферментативная активность РНК Молекулы РНК могут распознавать аминокислоты. По крайней мере, у двух природных РНК (как и у обсуждавшихся выше искусственных аптамеров) обнаружены структурные элементы, способные связывать аминокислоты. Кроме того, известно, что редактирующая функция аминоацил-тРНК-синтетаз (разрушение связи между ошибочно соединенными аминокислотой и тРНК) включает опосредованное РНК распознавание аминокислот. Предполагается, что в процессе редактирования имеют место непосредственные контакты РНК с аминокислотами. Спонтанное аминоацилирование РНК. Процесс аминоацилирования тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами in vivo происходит в два этапа: вначале фермент активирует соответствующую аминокислоту с образованием 5’-аминоациладенилата, который затем атакуется 2’(3’)-концом тРНК, что сопровождается возникновением соответствующей ковалентной связи между аминокислотой и тРНК. Нагруженные таким образом молекулы тРНК далее используются рибосомами в качестве субстратов при образовании пептидных связей. Перенос ацильных групп, катализируемый РНК. Повсеместное использование аминоациладенилатов и аминоацилированных тРНК при трансляции в природных условиях указывает на возможную роль РНК в ранних системах трансляции. Действительно, способность рибозимов к спонтанному аминоацилированию позволяет предполагать и возможность их участия в следующем этапе биосинтеза белка – переносе аминоацильной группы с донорной молекулы на свою собственную акцепторную, т.е. в осуществлении аминоацилтрансферазных реакций. Анализ первичной структуры таких рибозимов обнаружил вблизи 3’-концов наличие высококонсервативной внутренней матрицы, которая обладала способностью связывать и приводить в контакт друг с другом 2’(3’)-конец донорной молекулы и акцепторный 5’-конец своей собственной полинуклеотидной цепи. Рибозимы оказались не просто матрицей. Они действительно катализировали перенос ацильных групп, ускоряя этот процесс в 103 раз (kкат = 9,4·10-2 мин-1) по сравнению с системами, в которых была задействована только матрица. Интересно, что два неправильно спаренных основания G–U в месте стыковки дуплексов донор–матрица и акцептор– матрица оказались необходимыми для функционирования рибозимов, стимулируя реакцию переноса ацильной группы в 10 раз. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов. Принципиальная схема ПЦР Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Проведение ПЦР С помощью ПЦР амплифицируются короткие (до 10 kb [1]) участки ДНК с известными концами. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента. Термостабильная ДНК-полимераза. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T). Буферный раствор. ПЦР проводят в термоциклёре — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно, с точностью не менее 0,1°С. Праймеры Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 букв. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг [2]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже). Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (T m) комплекса праймер-матрица. Она определяется, как температура, при которой половина сайтов связывания праймера занята. Tm можно приблизительно определить по формуле , где nX — количество нуклеотидов Х в праймере. Если праймер короткий и Tm мала, то праймер может оказаться частично комплементарен другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Сверху температура плавления ограничена оптимумом действия полимеразы, активность которой падает при температуре выше 80 °C. При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев: GC-состав ~ 40—60 %; близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C); отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек[3] и димеров[4]; желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (рис. 2). 1. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. 2. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. 3. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°С. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10—15 мин. Рис. 2: Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96°C. (2) Отжиг при 68°C (например). (3) Элонгация при 72°C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается. Разновидности ПЦР «Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) — применяется для уменьшения доли побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить фланкирующие последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим лигированием. В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) — используется для амплификация, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят транскрипцию молекулы РНК с помощью обратной транскриптазы и получют кДНК. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены. Ассиметричная ПЦР (англ. Assymetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе. Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления. Touchdown ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК. ПЦР на колониях (англ. Colony PCR) — бактериальные клоны проверяют на наличие продуктов лигирование. Колонии отбирают с чашки с агарозным гелем, добавляют праймеры и выдерживают при 95°С продолжительное время, чтобы разрушить клеточные стенки бактерий. ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR) ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 kb и больше). Используют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой. RAPD PCR (надо написать) Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые буквы. Например, последовательность праймера может быть таким: ...ATH..., где Н - А, Т или С. Клонирование генов Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов из одного организма и вставки их в другой. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужерожный ген в другой организм. В качестве векоторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или белка. Это называется экспрессией гена. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельком хозяйстве, медицине и др.
