«Исследование иммунновоспалительных маркеров развития атеротромботического ишемического инсульта и механизмов реализации ишемического повреждения

На правах рукописи
ШУРДУМОВА МАРИНА ХАСАНОВНА
«Исследование иммунновоспалительных маркеров развития
атеротромботического ишемического инсульта и
механизмов реализации ишемического повреждения
головного мозга»
14.01.11 - Нервные болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание
ученой степени кандидата медицинских наук
Москва – 2011
1
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Российский государственный медицинский университет
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Научный руководитель
член – корр. РАМН,
доктор медицинских наук
профессор
Скворцова Вероника Игоревна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук
профессор
Спирин Николай Николаевич
доктор медицинских наук
профессор
Камчатнов Павел Рудольфович
Ведущая организация:
Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.
Владимирского Департамента здравоохранения г. Москвы
Защита состоится «28» февраля 2011 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета
Д 208.072.09 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул.
Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по
адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «20 » января 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Л.В. Губский
2
Общая характеристика работы
Актуальность темы исследования
Согласно международным эпидемиологическим исследованиям ежегодно в
мире регистрируется более 30 миллионов случаев инсульта, из них умирают 4,7 млн
человек. По данным Росстата за 2009 г. смертность от инсульта в России составила
164,1 случая на 100 000 населения.
Согласно Хельсингборгской декларации о европейских стратегиях в отношении
инсульта (2006 г.), одним из приоритетных направлений научных исследований
является разработка новых методов лечения ишемического инсульта, таких как
нейропротекция и регенераторно-репаративная терапия, что требует изучения
механизмов, реализующих формирование очага ишемии, в том числе связанных с
вовлечением иммунной системы, реакциями врожденного иммунитета, локальным
воспалительным ответом и других.
Большое количество исследований, проведенных, в том числе, на кафедре
фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РГМУ, расширили
представления об участии иммунного ответа, воспалительных реакций, генетических и
молекулярных механизмов апоптоза в патогенезе ишемического инсульта. Было
показано, что при формировании церебрального инфаркта имеется дисбаланс
цитокинового статуса с дефицитом защитных противовоспалительных цитокинов и
трофических факторов [Скворцова В.И. и соавт., 2000; Ефремова Н.М. и соавт., 2000],
выраженность которого коррелирует с тяжестью и клиническим исходом инсульта;
определена значимая роль аутоиммунных процессов в ишемическом повреждении
головного мозга [Еремин И.И. и соавт., 2006]. Изучено влияние матриксной
металлопротеиназы
9
(ММП-9)
на
развитие
осложнений
после
проведения
тромболитической терапии [Шамалов Н.А. и соавт., 2010]. Были проведены
исследования, доказавшие влияние полиморфизма различных генов, в том числе
индуктора апоптоза – гена Fas, на формирование очага церебральной ишемии
[Скворцова В.И. и соавт., 2007].
В то же время, появляются новые сведения о роли врожденного иммунитета в
формировании ответа головного мозга на ишемию. Так, продемонстрировано участие
рецепторов врожденного иммунитета – Toll-подобных рецепторов 4 (TLR4), в
развитии экспериментального церебрального инфаркта [Tang S.C. et al., 2007].
Активно исследуются значение различных медиаторов апоптоза, в том числе Fasлиганда (FasL), в патогенезе ишемического инсульта, возможное нейропротекторное
действие белков теплового шока 70 (БТШ70) [Martin-Villalba A. et al., 2001; Zheng Z. et
3
al., 2005], а также роль металлопротеиназ в развитии инфаркта головного мозга.
Требуют дальнейшего изучения причины разного течения заболевания у пациентов с
ишемическим инсультом при изначально одинаковых степени тяжести и локализации
сосудистого поражения, что обуславливает поиск новых методов диагностики и
прогнозирования течения ишемического инсульта. Все это определяет актуальность
настоящей работы, ее цель и задачи.
Цель: Исследование иммунных, воспалительных процессов и параметров
апоптоза у больных в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта в
зависимости от особенностей клинического течения заболевания.
Задачи исследования:
1. Оценка уровня экспрессии поверхностных TLR4 клеток периферической крови
(моноцитов и гранулоцитов), ее динамики и клинической значимости у больных с
ишемическим атеротромботическим инсультом и в контрольной группе
2. Определение содержания и динамики изменений внутриклеточных БТШ70
мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови у больных с ишемическим
инсультом,
определение
взаимосвязи
их
концентраций
с
клиническими
особенностями заболевания и размерами очага поражения головного мозга
3. Определение уровня и динамики сывороточного sFasL, фактора некроза опухоли α
(ФНО-α)
и
интерлейкина
10
(ИЛ10)
у
больных
в
остром
периоде
атеротромботического ишемического инсульта в зависимости от его клинических
особенностей и размеров очага поражения головного мозга
4. Изучение активности спонтанного апоптоза клеток периферической крови у
пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом в первый день
заболевания и в динамике острого периода в зависимости от клинических
особенностей течения заболевания, а также от уровня таких регуляторов, как
БТШ70, sFasL, ФНО-α
5. Определение динамики концентрации циркулирующей ММП-9 у пациентов в
остром периоде атеротромботического ишемического инсульта и оценка ее
клинической значимости, сопоставление с размерами очага ишемического
повреждения головного мозга.
Научная новизна
1. Впервые был изучен уровень экспрессии ТLR4, отражающих состояние
системы врожденного иммунитета, на моноцитах и гранулоцитах периферической
крови пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом. Показано, что
уровень экспрессии поверхностных TLR4 на моноцитах больных коррелирует со
4
степенью тяжести состояния пациентов в остром периоде заболевания (r=0,79;
p=0,03), что, возможно, свидетельствует о клинической значимости активации
экспрессии TLR4 моноцитов периферической крови в патогенезе ишемического
инсульта.
2. Впервые исследован уровень активности спонтанного апоптоза клеток
периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом,
выявлено его достоверное повышение по сравнению с контрольными значениями
(р≤0,05) и максимальное нарастание к 7-м суткам заболевания с последующим
снижением до исходного уровня к 14-м суткам.
3. Впервые исследовано содержание и динамика изменений внутриклеточных
БТШ70 мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови у пациентов с
атеротромботическим ишемическим инсультом. Определена обратная зависимость
интенсивности спонтанного апоптоза клеток периферической крови пациентов с
ишемическим инсультом и уровня внутриклеточного БТШ70, что отражает
антиапоптотическую направленность этого шаперонного белка.
4. Проведена комплексная оценка иммунных, воспалительных маркеров и
параметров апоптоза, изучено их клиническое значение у больных в остром периоде
атеротромботического ишемического инсульта. Определена временная взаимосвязь
между развитием воспалительной реакции и активацией системы апоптоза при
атеротромботическом ишемическом инсульте, нарастающая к 7-м суткам заболевания
и формирующая единый пул «отдаленных последствий ишемии».
Научно-практическая значимость работы
1.
Лейкоцитоз в 1-е сутки атеротромботического ишемического инсульта следует
рассматривать как предиктор тяжести заболевания (r=0,47; р≤0,01) при отсутствии
сопутствующей патологии, влияющей на данный показатель.
2.
Достоверное различие концентрации сывороточной ММП-9 на 1-е и 7-е сутки
заболевания у тяжелых и среднетяжелых пациентов, по сравнению с легкобольными
(p≤0,006 и p≤0,01), а также наличие статистически значимой корреляционной
зависимости между уровнем сывороточной ММП-9 и тяжестью инсульта на 1-е сутки
(r=0,44;
р≤0,03)
позволяют
рассматривать
ММП-9
как
показатель
тяжести
ишемического инсульта.
3.
Связь экспрессии TLR4 на моноцитах периферической крови и уровня
циркулирующей ММП-9 с тяжестью атеротромботического ишемического инсульта; а
также
подтверждение
в
клинических
условиях
антиапоптотических
свойств
внутриклеточного БТШ70 свидетельствуют о возможности разработки новых
5
нейропротекторов,
действие
которых
будет
направлено
на
представленные
молекулярные мишени.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Установлена клиническая значимость активации экспрессии рецептора врожденного
иммунитета – TLR4 моноцитов периферической крови в патогенезе ишемического
инсульта, что выражается повышением уровня экспрессии поверхностных TLR4 на
моноцитах больных с атеротромботическим ишемическим инсультом, по сравнению с
контрольными значениями, и его корреляцией со степенью тяжести состояния
пациентов в остром периоде заболевания (r=0,79; p≤0,03).
2. Показано, что уровень активности спонтанного апоптоза клеток периферической
крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом достоверно выше
контрольных значений (р≤0,05) в остром периоде заболевания, максимально нарастая
к 7-м суткам и снижаясь до исходного уровня к 14-м суткам. Содержание индуктора
апоптоза sFasL в сыворотке крови также достоверно нарастает к 7-м суткам (р≤0,05) у
пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом вне зависимости от
тяжести заболевания.
3. Выявлено повышение уровня внутриклеточных белков теплового шока 70 в остром
периоде
атеротромботического
ишемического
инсульта,
по
сравнению
с
контрольными значениями (p≤0,05), и отрицательные корреляции их уровня с
активностью спонтанного апоптоза периферических клеток крови (r=-0,75; р≤0,01),
что, возможно, отражает антиапоптотические свойства этого шаперонного белка.
4. Показано, что уровень сывороточной ММП-9, обладающей деградирующими
свойствами в отношении соединительнотканных структур, отражает тяжесть течения
атеротромботического ишемического инсульта: достоверно повышается на 1-е
(p≤0,01) и 3-е (p≤0,03) сутки заболевания, по сравнению с контрольными значениями,
коррелируя со степенью тяжести заболевания по NIH (r=0,44; р≤0,03).
5. Проведенное комплексное клиническое и иммуннобиохимическое исследование
маркеров
временные
развития
атеротромботического
взаимосвязи
между
ишемического
инициацией
и
инсульта
установило
развертыванием
процессов,
участвующих в формировании отдаленных последствий ишемии (реакция системы
врожденного иммунитета – TLR4, локальный воспалительный ответ – ФНО-α, апоптоз
на примере спонтанного апоптоза клеток периферической крови и исследования
индуктора апоптоза sFasL) и активацией компенсаторных защитных механизмов
(синтез внутриклеточных БТШ70, регуляторных цитокинов – ИЛ10).
6
Внедрение в практику
Основные положения диссертации внедрены в лечебную работу отделений
неврологии и нейрореанимации ГКБ № 31 Департамента здравоохранения г.Москвы,
научно-исследовательскую работу НИИ цереброваскулярной патологии и инсульта
ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Апробация диссертационной работы
Апробация диссертации состоялась на конференции кафедры фундаментальной и
клинической неврологии и нейрохирургии и НИИ инсульта ГОУ ВПО РГМУ
Росздрава (протокол №12 от 04 июня 2010 года).
Основные результаты исследования были доложены на научных конференциях
кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО
РГМУ, II Российском международном конгрессе «Цереброваскулярная патология и
инсульт» 17 сентября 2007 года, Российской научно-практической конференции
"Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение".
Пятигорск, 20 мая 2010 года.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 20
таблиц, 16 рисунков, 3 клинических случая. Работа состоит из введения, обзора
литературы, описания применяемых методов, 2 глав собственных результатов
исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список
цитируемой литературы состоит из 187 источника, включая 31 отечественных и 156
зарубежных.
Материалы и методы исследования
В период с 2007 по 2009 гг было обследовано 107 пациентов с церебральным
ишемическим инсультом, из которых по критериям TOAST в исследование были
включены 58 пациентов с атеротромботическим патогенетическим вариантом.
Контрольную группу составили 20 пациентов без острых цереброваскулярных
событий в анамнезе, сопоставимые по половозрастным признакам и сопутствующим
заболеваниям с основной группой.
В основную группу были включены пациенты с впервые возникшим
атеротромботическим ишемическим инсультом, поступившие в клинику в течение 24
часов от начала развития заболевания. Средний возраст составил 68,55 ±11,2 лет.
Мужчин было 35 (60,3%), женщин – 23 (39,7%).
7
Большая часть включенных в исследование больных в течение длительного
времени страдала артериальной гипертонией, сахарным диабетом, ожирением
различной степени. У части больных в анамнезе отмечались транзиторные
ишемические
атаки.
Частота
имевшихся
фоновых
заболеваний
и
основные
характеристики пациентов представлены в таблице 1.
Таблица 1.Фоновые заболевания обследованных больных
Основная группа (n=58) Контрольная группа (n=20)
1. ТИА
10,3%
0%
2. ИБС
8,6%
35,7%
3. Сахарный диабет
22,4%
28,6%
4.Артериальная гипертензия
94,8%
95%
5. Ожирение
39,7%
42,8%
муж
60,3%
55%
жен
39,7%
45%
68,55 ±11,2
67,9±10,5
6.Пол
7.Возраст (лет)
Для
объективизации
неврологического
дефицита
тяжести
и
состояния,
оценки
динамики
выраженности
клинических
очагового
показателей
использовали шкалу инсульта National Institutes of Health (NIH) и оригинальную шкалу
оценки неврологического статуса Е.И.Гусева, В.И.Скворцовой. Клинические исходы
заболевания оценивали по модифицированной шкале Рэнкина (МШР) на 14 сутки.
Лабораторные исследования включали в себя твердофазный иммуноферментный
анализ (ELISA) с использованием коммерческих иммуноферментных наборов и тестсистем для определения содержания ММР-9, ИЛ10, ФНО-α, sFasL в сыворотке крови
(n=37) и метод проточной цитофлоуриметрии для определения внутриклеточного
БТШ70 и поверхностных TLR4 на клетках периферической крови, а также анализа
интенсивности спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов (n=21).
Кроме того, всем пациентам выполняли рутинные лабораторные исследования:
общий
анализ
крови,
общий
анализ
мочи,
биохимический
анализ
крови,
коагулограмму (АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время, ПТИ –
протромбиновый индекс, МНО – международное нормализованное соотношение,
количество тромбоцитов).
8
Компьютерно-томографическое исследование головного мозга проводили при
поступлении пациента в стационар и на 6-7-е сутки после развития инсульта. На
томограммах определяли локализацию, характер и объем очага поражения головного
мозга.
С целью верификации патогенетического варианта ишемического инсульта
всем пациентам выполняли ультразвуковое исследование: дуплексное сканирование
магистральных артерий головы, транскраниальную допплерографию и Эхо-КГ. ЭхоКГ исследование выполняли с целью верификации наличия эмбологенной массы в
полости сердца и других кардиологических нарушений, способных вызывать
кардиоэмболический ишемический инсульт.
Статистическая обработка данных
Статистическую
обработку
данных
проводили
параметрическими
и
непараметрическими методами в зависимости от нормальности распределения
признаков. Для оценки различий количественных показателей между группами
использовали критерий суммы рангов Манна–Уитни. Для повторных измерений
применялся
математический
парный
тест
Вилкоксона.
Ассоциацию
между
непрерывными переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции
Спирмена. Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах, имеют следующие
обозначения: М - среднее, s - стандартное (среднеквадратичное) отклонение, m ошибка среднего, n - объем анализируемой подгруппы, р - достигнутый уровень
значимости. Все вычисления проводили с использованием программного обеспечения
STATISTICA for Windows 7.0. Значение вероятности <0,05 (двусторонняя проверка
значимости) демонстрировало статистическую значимость.
Результаты клинического исследования больных и их обсуждения
Оценка неврологического статуса пациентов основной группы выявила
следующие ведущие неврологические синдромы, к которым относились пирамидная
недостаточность (93,1%), речевые расстройства (37,8% по типу афазии и 53,4% по
типу дизартрии) и нарушение чувствительности (48,3%). У 10 (17,2%) пациентов
имелись расстройства уровня сознания.
Средний балл по шкале инсульта NIH на первые сутки заболевания составил
11,4±6,2, по оригинальной шкале оценки неврологического статуса – 37,7±5,8.
Инсульт с легким неврологическим дефицитом наблюдался у 17 (29,3%) пациентов, у
20 (34,5%) пациентов – средней степени тяжести и у 21 (36,2%) – тяжелый инсульт.
Средний возраст и пол пациентов статистически достоверно не различались в
9
зависимости от тяжести инсульта. Более значимая положительная динамика на 14-е
сутки наблюдения была у пациентов с инсультом средней тяжести и тяжелым.
При оценке восстановления неврологических функций по МШР на 14-е сутки
заболевания благоприятные исходы чаще наблюдались у пациентов с инсультом с
легким неврологическим дефицитом, по сравнению с пациентами, у которых
состояние при поступлении в клинику оценивалось как среднетяжелое и тяжелое
(р≤0,001).
По результатам КТ головного мозга, все инсульты были полушарными:
правополушарная локализация ишемического очага повреждения была выявлена у 27
(46,5%) пациентов, левополушарная – у 31 (53,4%) пациентов. При проведении КТ на
6-7-е сутки инсульта чаще всего ишемический очаг локализовался в теменно-височной
области (41,7%) и в подкорковых структурах головного мозга (19,2%).
Наблюдалась закономерная прямая достоверная корреляция между объемом
очага и степенью тяжести пациентов (r=0,73; p≤0,05) и статистически значимые
различия между объемом очага у легкобольных по сравнению со среднетяжелыми и
тяжелыми пациентами (р≤0,01).
Была выявлена прямая корреляция высокой степени достоверности между
уровнем лейкоцитов в периферической крови на 1-е сутки заболевания и объемом
очага ишемии
(r=0,47;
р≤0,01), что
указывает на отрицательное значение
бессимптомного лейкоцитоза на 1-е сутки ишемического инсульта и соответствует
литературным данным [Yoon S.S. et al., 2005].
Ультразвуковое исследование магистральных артерий головы у всех пациентов
основной группы выявляло гемодинамически значимые стенозы (более 50% согласно
критериям TOAST) причинных сосудов на стороне поражения. Не было выявлено
достоверных различий между степенью стеноза в зависимости от тяжести состояния
пациентов, их пола и возраста.
Результаты лабораторного исследования и их обсуждения
Полученные
ишемического
экспериментальные
инсульта
определили
данные
о
роли
необходимость
в
патогенезе
исследования
рецептора
TLR4
врожденного иммунитета TLR4 в клинических условиях [Tang S.C. et al., 2007; Xia Y.
et al., 2006].
Известно, что TLR4 имеют практически повсеместную распространенность в
организме человека, экспрессируются на клетках, осуществляющих первую линию
защиты (нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки), на эндотелиальных и
эпителиальных клетках слизистых тканей и др. [Armant M.A. et al., 2006], что делает
10
возможным исследование экспрессии TLR4 в клетках периферической крови при
ишемическом инсульте.
При исследовании экспрессии TLR4 на моноцитах и гранулоцитах у пациентов
с атеротромботическим ишемическим инсультом было выявлено, что экспрессия TLR4
на моноцитах основной группы была достоверно выше уровня экспрессии TLR4 на
моноцитах группы контроля на 1-е сутки (р≤0,05) заболевания.
Экспрессия гранулоцитарного TLR4 у пациентов с атеротромботическим
ишемическим инсультом на 1-е, 7-е и 14-е сутки достоверно не отличалась от таковой
в группе контроля (табл. 2).
Таблица 2. Значение экспрессии TLR4 на моноцитах и гранулоцитах
периферической крови
Экспрессия TLR4 на
Контроль
1 сутки
7 сутки
14 сутки
M±m
M±m
M±m
M±m
60,33±6,59
94,25±13,46*
92,09±19,47
96,98±35,38
44,67±5,31
50,81±4,56
45,44±8,14
62,79±38,09
моноцитах (ед.)
Экспрессия TLR4 на
гранулоцитах (ед.)
*- р≤0,05 по сравнению с группой контроля
Было получено 2 типа экспрессии TLR4 на моноцитах в образцах крови, взятых
у одних и тех же пациентов: достоверно высокая за весь наблюдаемый период
(р≤0,000) и достоверно низкая (р≤0,001) по сравнению с контрольными значениями.
Возможно, данное различие экспрессии TLR4 на моноцитах у пациентов с
атеротромботическим ишемическим инсультом объясняется наличием цикличности
процесса экспрессии рецептора, при котором у части моноцитов уже запущены
генетически-молекулярные программы, направленные на максимальную экспрессию
рецептора, в то время как другая часть моноцитов еще не активирована. Кроме того,
это может быть связано с естественным циклом синтеза/распада рецептора на
поверхности моноцитов.
Корреляционный анализ выявил статистически значимую достоверную прямую
взаимосвязь между экспрессией TLR4 на моноцитах на 14-е сутки и степенью тяжести
состояния пациентов по NIHSS на 1-е (r=0,74; р≤0,03), 7-е (r=0,75; p≤0,05) и 14-е
(r=0,79, р≤0,03) сутки заболевания, что может указывать на клиническую значимость
TLR4 в патогенезе атеротромботического ишемического инсульта.
Вследствие
церебральной
ишемии
возникает
каскад
сигнальных
взаимодействий, вызывающих программированную клеточную гибель не только в
11
ткани головного мозга, но и в циркулирующих клетках иммунной системы [Nakajima
H. et al., 2003], что объясняет интерес к изучению уровня спонтанного апоптоза клеток
периферической крови при ишемическом инсульте.
Исследование уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов
периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом
выявило достоверное повышение его уровня, по сравнению с контрольными
значениями, на 1-е (р≤0,003), 7-е (р≤0,003) и 14-е (р≤0,01) сутки заболевания для
моноцитов и на 1-е (р≤0,01) и 7-е сутки (р≤0,002) для гранулоцитов. К 7-м суткам
уровень спонтанного апоптоза у пациентов с ишемическим инсультом достоверно
повышался (р≤0,01), достигая максимальные значения за весь период наблюдения. К
14-му дню регистрируемый уровень спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов
пациентов основной группы достоверно снижался (р≤0,05) (табл. 3).
Таблица 3. Уровень спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов
периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом и
группы контроля.
Спонтанный апоптоз
гранулоцитов, M±m
основная
контроль
1 сутки
7 сутки
14
15,13±1,96
Спонтанный апоптоз
моноцитов, M±m
р
контроль
группа
23,67±2,4
0,01
35,11±2,72*
0,002
19±2,83
0,36
5,59±0,68
основная
р
группа
15,83±2,95
0,003
30,89±2,94*
0,003
12,57±3,89
0,01
сутки
*- р≤0,05 по сравнению с 1-ми и 14-ми сутками
Исследование sFasL у пациентов с ишемическим инсультом выявило
достоверное увеличение его уровня на 7-е (р≤0,000) сутки по сравнению с группой
контроля. На 1-е и 3-и сутки уровень sFasL достоверно не отличался от контрольного,
что
подтверждает
отсроченное
действие
факторов
апоптоза
в
патогенезе
ишемического инсульта.
На 1-е сутки заболевания у тяжелых пациентов отмечалось незначимое
повышение концентрации сывороточного sFasL, по сравнению с пациентами средней
тяжести и легкобольными (р>0,05). В динамике у всех пациентов основной группы
происходило увеличение концентрации sFasL к 7-м (р≤0,05) суткам заболевания, без
значимых различий в зависимости от тяжести состояния, что отражает равную степень
12
реализации FasL –индуцированного апоптоза у пациентов с ишемическим инсультом
независимо от степени тяжести (рис. 1).
#- р≤0,05 по сравнению с 1-ми и 3-ми сутками своей группы
Рисунок 1. Динамика концентрации FasL в зависимости от тяжести пациентов с
ишемическим инсультом
Сравнительный анализ спонтанного апоптоза клеток периферической крови и
изучение уровня sFasL, как апоптозмодифицирующего фактора, показал, что
концентрация sFasL в сыворотке крови у пациентов с ишемическим инсультом, также
как и уровень спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, нарастает к 7-му дню
заболевания, по сравнению с 1-ми сутками.
Оценивая результаты проведенного исследования, можно сделать вывод, что,
несмотря на различные сигнальные пути индукции апоптоза в том или ином случае,
апоптотические системы реализуют свое действие практически одновременно.
Учитывая,
что
«доформирование»
очага
ишемического
повреждения
достигается путем апоптоза и апо-некроза, возникает необходимость поиска новых
нейропротекторных веществ, обладающих, в том числе, антиапоптотической
активностью. В последние годы резко возросло число исследований, нацеленных на
оценку терапевтических приложений протективных свойств БТШ70, которые
составляют молекулярные системы, необходимые всем живым клеткам для
нормального функционирования и обладают шаперонной активностью. Согласно
литературным данным, антиишемический эффект БТШ70 связан с вовлечением его в
антиапоптозный, антинекротический и антиагрегационный механизмы [Giffard R.G. et
al., 2004].
Для изучения возможных цитопротекторных свойств БТШ70
проведено
исследование их уровня в моноцитах и гранулоцитах периферической крови, в
сравнении со степенью активности спонтанного апоптоза тех же клеток, у пациентов с
атеротромботическим инсультом.
Содержание внутриклеточного БТШ70 в гранулоцитах на 1-е, 7-е и 14-е сутки
ишемического инсульта было достоверно выше содержания БТШ70 в гранулоцитах
13
контрольной группы (p≤0,05, р≤0,05 и р≤0,005 соответственно). Уровень БТШ70 в
моноцитах на 1-е и 14-е сутки заболевания был также достоверно выше контрольных
значений (р≤0,001 и р≤0,01 соответственно).
В динамике уровень внутриклеточного БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах
достоверно снижался к 7-м суткам заболевания (р≤0,05) и достоверно повышался к 14м суткам (р≤0,05), что может быть связано с истощением его содержания в клетке
вследствие реализации им определенных функций при развитии ишемического
повреждения, а также с выбросом БТШ70 во внеклеточное пространство и
последующим его ресинтезом (рис 2).
* - р≤0,05 по сравнению с группой контроля
# - р≤0,05 по сравнению с 1 и 14 сутками
Рисунок 2.Динамика БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах периферической
крови у пациентов с ишемическим инсультом
Исследование взаимосвязи экспрессии БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах
пациентов
с
ишемическим
инсультом
и
уровня
спонтанного
апоптоза
в
соответствующих клетках выявило, что статистически значимое снижение уровня
БТШ70 (р≤0,05) сопровождалось достоверным повышением процентного содержания
апоптозных клеток в анализируемых образцах крови в динамике к 7-м суткам (р≤0,01).
Достоверное повышение уровня БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах, происходящее
на 14-е сутки заболевания (р≤0,01), сопровождалось достоверным снижением
спонтанного апоптоза соответствующих клеток периферической крови (р≤0,05).
Корреляционный
анализ
выявил
наличие
статистически
значимых
отрицательных корреляций между уровнем спонтанного апоптоза моноцитов и
уровнем моноцитарного внутриклеточного БТШ70 на 14-е сутки заболевания (r=-0,81;
р≤0,026); а также отрицательных корреляций высокой степени достоверности между
14
уровнем спонтанного апоптоза гранулоцитов и уровнем внутриклеточного БТШ70 на
1-е (r=-0,75; р≤0,012) и 7-е (r=-0,73;р≤0,023) сутки заболевания.
В результате проведенного нами исследования, была выявлена обратная
зависимость интенсивности спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов
периферической крови у пациентов с ишемическим инсультом от уровня экспрессии
этими клетками внутриклеточного БТШ70, что подтверждает антиапоптотические
свойства БТШ70.
Несмотря на наличие множества исследований, посвященных изучению роли
цитокинов в формировании ишемического повреждения головного мозга, остается
неразрешенным
ряд
вопросов
о
направленности
действия
цитокинов,
их
взаимодействии друг с другом и с медиаторами апоптоза, возможных механизмах
реализации вызываемых ими эффектов, что делает интересным и актуальным их
дальнейшее изучение.
Исследование уровня ФНО-α у пациентов с ишемическим инсультом по
сравнению с группой контроля, выявило достоверное повышение уровня ФНО-α в
течение всего периода наблюдения (р≤0,05). При этом в динамике отмечалось
достоверное нарастание уровня ФНО-α на 7-е сутки заболевания (р≤0,05), по
сравнению с 1-ми и 3-ми сутками.
На 3-и сутки заболевания отмечалось достоверное повышение уровня ФНО-α
у тяжелых пациентов, по сравнению со среднетяжелыми (р≤0,01). В динамике
отмечалось достоверное увеличение уровня ФНО-α у тяжелых пациентов к 7-м суткам
заболевания (р≤0,05) (табл. 4).
Таблица 4. Уровень ФНО-α в зависимости от тяжести состояния пациентов с
ишемическим инсультом.
Легкие
Сутки
ФНО-α
M±m
Тяжелые
Средние
р
ФНО-α
р
M±m пг/мл
пг/мл
ФНО-α
M±m
пг/мл
1 сутки
10,3±4,42
ns
9,8±4,11
ns
8,5±2,62
3 сутки
11,5±3,85
ns
4,6±1,53
0,05
15,2±3,86
7 сутки
14±3,32
ns
14,2±4,5
ns
22,7±7,0*
*- p≤0,05 по сравнению с уровнем ФНО-α на 1-е и 3-е сутки у тяжелобольных
15
В результате проведенного исследования не было выявлено достоверных
корреляций уровня сывороточного ФНО-α у пациентов с атеротромботическим
ишемическим инсультом со степенью тяжести состояния больных, объемом очага
поражения и степенью восстановления неврологических функций по шкале МШР на
14-е сутки заболевания. Однако значимое повышение уровня сывороточного ФНО-α у
пациентов основной группы, по сравнению с группой контроля, с 1-х суток
заболевания и достоверное нарастание его к 7-м суткам в группе пациентов в тяжелом
состоянии, свидетельствуют в пользу провоспалительного характера данного
цитокина.
При проведении сравнительного анализа динамики уровня сывороточного
ФНО-α, sFasL и степени спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов
периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом,
было выявлено, что максимальное нарастание уровня ФНО-α по времени совпадает с
максимальной концентрацией sFasL в сыворотке крови и степенью спонтанного
апоптоза клеток периферической крови. При этом повышение уровня ФНО-α
опережает повышение сывороточного уровня sFasL. Это подтверждает литературные
данные о том, что ФНО-α способен выступать в качестве апоптозиндуцирующего
фактора при атеротромботическом ишемическом инсульте.
Исследование уровня ИЛ10 у пациентов с ишемическим инсультом на 1-е, 3-и
и 7-е сутки заболевания, по сравнению с группой контроля, выявило достоверное
повышение уровня ИЛ10 у пациентов с ишемическим инсультом на 3-и (р≤0,002) и 7-е
(р≤0,05) сутки заболевания. В динамике уровень ИЛ10 достоверно повышался с 1-х по
3-и сутки (р≤0,001) (что соответствует данным исследований, ранее проведенных на
нашей кафедре), и не зависел от степени тяжести пациентов.
При этом было выявлено 2 типа реакции ИЛ10 на возникновение
ишемического
повреждения
головного
мозга:
в
первом
случае
значение
сывороточного ИЛ10 было на уровне контрольных цифр и достоверно от них не
отличалось, во втором отмечалось достоверное повышение уровня сывороточного
ИЛ10 по сравнению с контрольными значениями на 1-е (р≤0,000), 3-и (р≤0,000) и 7-е
(р≤0,000) сутки (табл. 5). Высокие значения сывороточного ИЛ10 отмечались только у
пациентов с состоянием средней тяжести и тяжелым и не были определены ни в одном
случае у легкобольных, тогда как низкие значения ИЛ10 встречались у пациентов
независимо от степени тяжести состояния. Кроме того, у пациентов с высоким
уровнем ИЛ10 отмечалась более выраженная положительная динамика по шкале NIH
(р≤0,06) к 14-м суткам заболевания.
16
Таблица 5. Уровень ИЛ10 у пациентов с атеротромботическим ишемическим
инсультом при высоких и низких его значениях по сравнению с контролем
Сутки
Высокий
Контроль
уровень
M±m
р
Низкий
Контроль
M±m
уровень
M±m
пг/мл
M±m
пг/мл
пг/мл
1 сутки
16,78±1,29
3 сутки
20,55±1,19
7 сутки
26,82±2,11
р
пг/мл
1,23±0,28
0,000
0,75±0,11
0,000
1,8±0,21
0,000
1,2±0,22
ns
1,23±0,28
ns
ns
При проведении сравнительного анализа сывороточных уровней ИЛ10 с ФНОα и FasL было выявлено однонаправленное изменение их концентрации – постепенное
нарастание их сывороточного уровня от 1-х к 7-м суткам. Кроме того, были
установлены прямые статистически значимые корреляции между уровнем ИЛ10 на 1-е
(r=0,45; р≤0,028), 3-и (r=0,43; р≤0,041) и 7-е (r=0,043; р≤0,046) сутки и уровнем
сывороточного sFasL на 1-е сутки заболевания у пациентов с атеротромботическим
ишемическим инсультом.
В отличие от ФНО-α, концентрация ИЛ10 достоверно нарастала к 3-м суткам
заболевания и статистически значимо не отличалась у пациентов с состоянием разной
степени тяжести; у пациентов с высокими значениями ИЛ10 в сыворотке крови имела
место более выраженная положительная динамика в неврологическом статусе к 14-м
суткам заболевания.
Таким
образом,
результаты
исследования
взаимодействия
про-
и
противовоспалительных цитокинов, а также индукторов апоптоза на примере ФНО-α,
ИЛ10 и sFasL показали однонаправленную динамику изучаемых маркеров. При этом
повышение уровня ФНО-α с 1-х суток заболевания, опережающее нарастание уровня
sFasL, а также достоверный рост концентрации ФНО-α у тяжелобольных пациентов к
7-м суткам указывает на провоспалительную и проапоптотическую роль данного
цитокина в патогенезе атеротромботического ишемического инсульта. Динамика
уровня ИЛ10 и соотношение его концентраций со степенью восстановления
неврологического дефицита может отражать модуляторные функции ИЛ10 при
ишемическом процессе в головном мозге.
Наряду с комплексным изучением про- и противовоспалительных факторов,
индукторов апоптоза и антиапоптозных систем, элементов врожденного иммунитета,
17
был исследован уровень сывороточной ММП-9, обладающей деградирующей
способностью в отношении почти всех компонентов внеклеточного матрикса,
встречающихся в соединительных тканях, а также биологически активных пептидов.
Исследование концентрации сывороточной ММП-9 в остром периоде
атеротромботического ишемического инсульта выявило достоверное повышение ее
значений на 1-е (p<0,01) и на 3-е (p<0,03) сутки заболевания по сравнению с группой
контроля. На 1-е сутки заболевания было выявлено максимальное значение ММП-9 у
пациентов основной группы, затем происходило достоверное снижение уровня к 7-м
(р≤0,01) суткам.
Было выявлено, что на 1-е (p≤0,006) и 7-е (p≤0,01) сутки заболевания
концентрация ММП-9 была достоверно выше у пациентов с состоянием средней
тяжести и тяжелым по сравнению с пациентами с минимальным неврологическим
дефицитом (рис. 3).
*-р≤0,05 по сравнению с легкобольными на 1 сутки
#- р≤0,005 по сравнению с легкобольными на 7 сутки
Рисунок 3. Динамика концентрации ММП-9 в зависимости от тяжести
пациентов с ишемическим инсультом
Корреляционный анализ выявил статистически значимую прямую зависимость
между уровнем ММП-9 и тяжестью состояния пациентов по шкале инсульта NIH
(r=0,436; р≤0,03) на 1-е сутки заболевания, что согласуется с литературными данными
[Kelli P.G. et al., 2008].
Результаты исследования выявили однонаправленную динамику концентраций
ИЛ10, ФНО-α и sFasL и обратную им динамику уровня ММП-9. Уровень ММП-9
достигал своего максимума на 1-е сутки заболевания, а затем последовательно
снижался, в то время как происходило последовательное нарастание уровня ИЛ10,
ФНО-α и sFasL. Наблюдаемое нами нарастание уровня ММП-9 к концу 1-х суток
18
ишемического
атеротромботического
инсульта
закономерно
и
отражает
многофакторность участия ММП-9 в этиопатогенезе заболевания: ремоделирование и
повреждение покрышки атеросклеротической бляшки в инсульт-зависимой артерии,
разрушение ГЭБ, разрушение и перестройка нейроваскулярного матрикса в очаге
ишемии [Gladov S. et al., 1998; Fujimura M. et al., 1999].
Итак,
настоящее
атеротромботического
врожденного
исследование
ишемического
иммунитета,
показало,
инсульта
воспалительного
что
в
результате
происходит
ответа,
развития
активация
запускаются
систем
программы,
отвечающие за реализацию апоптоза и компенсаторный синтез антиапоптозных
веществ в клетках периферической крови.
Было
впервые
показано,
что
активное
участие
в
патогенезе
атеротромботического ишемического инсульта принимает моноцитарная экспрессия
TLR4 периферической крови, которая достоверно повышается по сравнению с
контрольными значениями и коррелирует с тяжестью состояния пациентов. Были
исследованы динамика внутриклеточных БТШ70 и степень активности спонтанного
апоптоза клеток периферической крови у пациентов с атеротромботическим
ишемическим инсультом. Выявлена антиапоптотическая роль внутриклеточных
БТШ70, что может иметь большое значение для разработки новых стратегий
цитопротекции.
Изучена
роль
ФНО-α
в
патогенезе
атеротромботического
ишемического инсульта, показано наличие провоспалительных и проапоптотических
свойств у данного цитокина. Коллагеназа ММП-9 определена как один из индикаторов
тяжести течения заболевания, концентрация которой нарастает уже в острейшем
периоде заболевания, в зависимости от тяжести инсульта.
Полученные результаты, позволяющие наметить новые диагностические
маркеры,
а
также
цитопротекции,
молекулярные
делают
терапевтические
обоснованными
дальнейшие
мишени
для
исследования
проведения
в
данном
направлении с перспективой последующего клинического применения.
ВЫВОДЫ:
1. Уровень экспрессии маркеров врожденного иммунитета – поверхностных TLR4 на
моноцитах периферической крови достоверно повышается у больных с ишемическим
атеротромботическим инсультом, начиная с 1-х суток
заболевания (р≤0,05), по
сравнению с контролем, и к 14-м суткам коррелирует с тяжестью состояния больных
(r=0,8; р≤0,03).
2. Уровень спонтанного апоптоза клеток периферической крови (моноцитов и
гранулоцитов)
статистически
значимо
19
повышается
у
пациентов
с
атеротромботическим ишемическим инсультом, начиная с 1-х суток (р≤0,01), по
сравнению с контролем,
достигая своего максимума к 7-м суткам заболевания
(р≤0,002).
3. Содержание одного из индукторов апоптоза sFasL в сыворотке крови достоверно
нарастает к 7-м суткам ишемического инсульта (р≤0,05), при этом концентрация sFasL
значимо не отличается у пациентов в зависимости от тяжести состояния, что,
вероятно, отражает равную степень реализации FasL-индуцированного апоптоза при
ишемическом инсульте разной степени тяжести.
4. Содержание внутриклеточных белков теплового шока 70 в клетках периферической
крови в конце 1-х суток ишемического инсульта достоверно превышает контрольные
значения (p≤0,05). Уровень белков теплового шока 70 на 1-е, 7-е и 14-е сутки инсульта
обратно коррелирует с уровнем спонтанного апоптоза периферических клеток крови
(r=-0,75; р≤0,01), что подтверждает антиапоптотические свойства внутриклеточного
БТШ70.
5. Уровень ФНО-α у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом
достоверно выше, чем в контроле, в течение всего острого периода заболевания. К 7-м
суткам заболевания происходит достоверное нарастание концентрации сывороточного
ФНО-α (р≤0,05) по сравнению с 1-ми сутками только в группе тяжелых инсультов, что
отражает роль локального воспаления в патогенезе церебральной ишемии.
6. Сывороточный ИЛ10 у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом
нарастает на 3-и сутки заболевания (р≤0,02), по сравнению с контрольными
значениями, и проявляет модуляторные функции при ишемическом процессе в
головном мозге: с одной стороны, положительно коррелируя с концентрацией
индуктора апоптоза – sFasL (r=0,04; р≤0,05), а с другой – повышаясь у пациентов с
более выраженной положительной динамикой восстановления неврологического
статуса.
7. Уровень сывороточной ММП-9 у пациентов с атеротромботическим ишемическим
инсультом достоверно повышается на 1-е (p≤0,01) и 3-е (p≤0,03) сутки заболевания, по
сравнению с контрольными значениями, и отражает тяжесть течения инсульта,
значимо преобладая у пациентов с тяжелым и среднетяжелым состоянием, по
сравнению с легкобольными (p≤0,006 и p≤0,01), и коррелируя со степенью тяжести
заболевания по NIH (r=0,44; р≤0,03).
8. Уровень лейкоцитов на 1-е сутки заболевания статистически значимо коррелирует с
объемом очага ишемии на 6-7-е сутки (r=0,47; р≤0,01) и тяжестью состояния в остром
периоде заболевания (r=0,41; p≤0,01), что позволяет расценивать лейкоцитоз в
периферической крови в 1-е сутки ишемического инсульта как предиктор тяжести
20
заболевания при отсутствии сопутствующей патологии, влияющей на данный
показатель.
9. Проведенное комплексное клиническое и иммуннобиохимическое исследование
маркеров
развития
временные
атеротромботического
взаимосвязи
между
ишемического
инициацией
и
инсульта
установило
развертыванием
процессов,
участвующих в формировании отдаленных последствий ишемии (реакция системы
врожденного
иммунитета,
компенсаторных
воспалительный
защитных
механизмов
ответ,
(синтез
апоптоз)
и
активацией
внутриклеточных
БТШ70,
регуляторных цитокинов).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. С целью прогнозирования течения атеротромботического ишемического инсульта
целесообразно
исследование
в
1-е
сутки
заболевания
уровня
лейкоцитов
периферической крови и концентрации сывороточной ММП-9, повышение которых
предшествует утяжелению инсульта.
2.
Учитывая полученные данные о клиническом значении экспрессии TLR4 на
моноцитах периферической крови у пациентов с ишемическим инсультом, по
сравнению с гранулоцитами, целесообразно дальнейшее изучение экспрессии
рецептора на моноцитарных клетках.
3. Рекомендовано продолжить исследование уровня спонтанного апоптоза клеток
периферической
крови
на
большей
выборке
пациентов
с
различными
патогенетическими вариантами ишемического инсульта для выявления возможной
взаимосвязи активности апоптоза периферических клеток с апоптозом в очаге
ишемического повреждения головного мозга, что может быть использовано в качестве
диагностического маркера.
4. Учитывая результаты исследования, указывающие на антиапоптотические свойства
внутриклеточного БТШ70, рекомендовано его дальнейшее клиническое изучение на
большей
выборке
ишемического
пациентов
инсульта
для
с
различными
возможной
нейропротекции.
21
патогенетическими
разработки
новых
вариантами
подходов
к
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Скворцова В.И., Кольцова Е.А., Константинова Е.В., Шурдумова М.Х.
Атеротромбоз
каротидных
и
коронарных
сосудов:
особенности
механизмов
реализации ишемического повреждения // Журнал неврологии и психиатрии им.
С.С.Корсакова 2007;20:3-10.
2. Скворцова В.И., Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Еремин И.И.,
Ефремова Н.М. Провоспалительные цитокины у больных с острым ишемическим
инсультом и инфарктом миокарда // Неврологический вестник (Журнал им.
В.М.Бехтерева) 2007; 1;22-25.
3. Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Еремин И.И., Шостак Н.А., Скворцова
В.И. Влияние перендоприла на уровень фактора некроза опухоли –α и матриксной
металлопротеиназы
-
9
периферической
крови
в
остром
периоде
атеротромботического ишемического инсульта и инфаркта миокарда // Журнал
неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2008; 23:15-21.
4. Скворцова В.И., Шурдумова М.Х., Константинова Е.В. Значение Tollподобных рецепторов в развитии ишемического повреждения // Журнал неврологии
и психиатрии им. С.С.Корсакова 2010;4:12-17.
5. Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Еремин И.И., Ефремова Н.М.
Скворцова В.И. Сравнительное изучение провоспалительных цитокинов при остром
ишемическом инсульте и инфаркте миокарда // Журнал неврологии и психиатрии
им. С.С.Корсакова. Спецвыпуск 2007: 233
6. Скворцова В.И., Константинова Е.В., Кольцова Е.А., Шурдумова М.Х.
Различия и общность механизмов формирования атеротромбоза и ишемического
повреждения при атеротромботическом инсульте и инфаркте миокарда // Качество
жизни 2007; 3(20): 8-13.
7. Скворцова В.И., Константинова Е.В., Шурдумова М.Х.,
Кольцова Е.А.
Особенности атеросклеротического поражения в различных сосудистых бассейнах //
Клиницист 2008; 4:7-10
8. Шурдумова М.Х., Константинова Е.В., Скворцова В.И., Еремин И.И., Шостак
Н.А. Сравнительное изучение динамики уровня матриксной металлопротеиназы-9 и
фактора
некроза
опухоли-альфа
периферической
крови
в
остром
периоде
атеротромботического ишемического инсульта и инфаркта миокарда // Труды I
Национального
Конгресса
«Кардионеврология»,
А.В.Фонякина. Москва 2008: 325
22
под.
ред
М.А.Пирадова,
9. Константинова Е.В., Шурдумова М.Х., Еремин И.И., Шостак Н.А., Скворцова
В.И. Исследование динамики уровня сывороточной матриксной металлопротеиназы-9
в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта и инфаркта миокарда
// Научно-практическая конференция. Медико-биологические науки для теоретической
и клинической медицины. РГМУ. МБФ. Москва 2008: 58.
10. Шурдумова М.Х., Константинова Е.В., Еремин И.И., Скворцова В.И.
Сравнительное
изучение
динамики
уровня
интерлейкина-10
и
ФНО-А
периферической крови в остром периоде атеротромботического ишемического
инсульта // Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и
Лекарство» 2010: 308-309.
11. Шурдумова М.Х., Константинова Е.В., Еремин И.И., Скворцова В.И.
Исследование Fas-лиганда у больных с атеротромботическим ишемическим инсультом
// Материалы Российской научно-практической конференции "Нарушения мозгового
кровообращения: диагностика, профилактика, лечение". Пятигорск 2010:77-78.
23