А.О. Сагитов, М.М. Исин, Б.К. Копжасаров, Б. А. Дуйсембеков BACILLUS БЕЛОЙ БАБОЧКИ
advertisement
А.О. Сагитов, М.М. Исин, Б.К. Копжасаров, Б. А. Дуйсембеков ТОО «Казахский НИИ защита и карантина растений» E – mail: bakyt-kk@mail.ru УДК 632.782/.937 БИОПРЕПАРАТ «АҚ-ҚӨБЕЛЕК» НА ОСНОВЕ BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP. KURSTAKI ПРОТИВ АМЕРИКАНСКОЙ БЕЛОЙ БАБОЧКИ Резюме В статье изложены материалы результатов выделения из больных гусениц американской белой бабочки бактерий Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, ее идентификации и создание в Казахстане на их основе биопрепарата «Ақ - көбелек». Ключевые слова: биопрепарат «Ақ - көбелек», бактерии Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, американская белая бабочка. Summary The article presents information on the release of the dead white moth caterpillars bacteria Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, and its identity and institutions in Kazakhstan on the basis of bacterial biological product "Ak kөbelek." Keywords: biological product "Ak - kөbelek" bacteria Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, American white butterfly. В 2003 году на территории Казахстана, в частности в ряде районов Алматинской области, впервые обнаружена американская белая бабочка (Hyphantria cunea Drury), которая является опасным карантинным вредителем и новым инвазивным чужеродным видом для республики [1]. Вредоносность территорию с карантинных других насекомых, континентов, в попавших на значительной новую степени обуславливается отсутствием в пределах нового ареала биологических регуляторов их численности. Попав в новый регион с благоприятными климатическими условиями и обильными кормовыми ресурсами, небольшая популяция быстро увеличивается в численности, ареал ее расширяется, вредоносность вида возрастает [2]. При обследовании древесных насаждений в Алматинской области в селе Ынтымак Илийского района нами в 2004-2005 годах в лесополосах на клене ясенелистном (Acer negundo L.) были обнаружены гнезда АББ со 100%-ной гибелью гусениц. Почерневшие гусеницы были второго возраста, причем в 2004 и в 2005 годах это происходило при развитии второго поколения. В гнездах находилось до 200 погибших гусениц. Погибшие гусеницы сохраняли тургор, имели черный с блеском цвет. Содержимое трупов представляло собой темно-серую вязкую жидкость с фрагментами кишечника. Необходимо отметить, что каких-либо обработок в районе обследования не проводилось. Интересно, располагалось высоко на вершине старого клена. что гнездо На основании вышеуказанных фактов, нами сделано предположение, что причиной гибели гусениц могла стать болезнь, вызванная каким-нибудь патогеном. Для установления точной причины гибели гусениц АББ были проведены тщательные микробиологические исследования в лаборатории биотехнологии НИИ Защиты растений и в лаборатории патологии насекомых Института систематики и экологии животных СО РАН (Россия, г. Новосибирск). Под руководством сотрудников ИС и ЭЖ СО РАН из погибших гусениц АББ были выделены и идентифицированы штаммы кристаллообразующих бактерий Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Особую благодарность за помощь в проведении микробиологических исследований и идентификации патогена выражаем доктору биологических наук, профессору В.В. Глупову, кандидатам биологических наук В.П. Ходыреву и В.Ю. Крюкову. Как правило, чтобы быть уверенными в том, что выделенные бактерии действительно были причиной заболевания и гибели насекомых, проводят экспериментальное заражение личинок насекомых и в случае их гибели, заново выделяют бактерии. Если исходная и вновь выделенная бактерия будут идентичны, можно считать ее энтомопатогенной. Идентификацию возбудителя бактериоза американской белой бабочки проводили по определителю Берги [3] с помощью микробиологических, микроскопических исследований. Внутривидовую идентификацию проводили путем биохимических, серологических и физико-химических методов исследования согласно схеме де Баржак и Бонфуа [4]. Микробиологический анализ трупного материала АББ сбора 20042005 гг показал наличие кристаллообразующих бактерий B. thuringiensis. Эти бактерии выделялись практически в чистой культуре, численность их была низкой и составляла 5х106-8х106 зародышей (колоний) на один экземпляр весом 1 мг. Можно предположить, что на фоне высокой температуры и достаточной влажности сложились благоприятные условия для развития инфекции, вызванной B.thuringiensis. Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki – возбудитель бактериоза AББ имеет следующие характеристики: Культурально-морфологические свойства кристаллообразующих изолятов. При росте на МПА и среде ЛАГ бактерии представляли R-форму. Культуры в рассевах образовывали два варианта колоний: белые и серые. Белые колонии на МПА (R-вариант) имели зернистую или шероховатую поверхность. На среде ЛАГ это крупные колонии с морщинистой поверхностью. Серые колонии (S-вариант) были с гладкой поверхностью и полупрозрачные в проходящем свете. Соотношение белых и серых колоний на питательных средах примерно 97:3. Кроме того, отмечены сегментированные колонии с обоими вариантами, которые достигали 5% на ЛАГ. Для белых вариантов колоний характерно высокое формирование спор и кристаллов. В серых колониях доминировали вегетативные клетки, а также полиморфные кристаллы. Таким образом, из патологического материала 2004 года отобраны культуры с высокой продуктивностью спорокристаллического комплекса, которые сохраняли структуру колоний в R-форме при пересевах. Это белые колонии с зернистой поверхностью. При культивировании штамма 2127 из указанной колонии на среде ЛАГ получена культура штамма 2127-3к практически с полным образованием клетками спор и эндотоксина. При этом штамм 2127-3к не образовывал колоний S-вариантов. Микроскопический анализ. Штамм 2127-3к образует эллиптические споры и кристаллы бипирамидальной формы размером (0,4-0,6)х1,4 мкм, кроме того, продуцируются округлые, ромбовидные и квадратные кристаллы меньших размеров (в среднем 0,3 мкм), что характерно для подвида kurstaki Биохимические свойства. ацетилметилкарбинол, Культура лецитоветеллиновая бактерии реакция образует положительна. Образует уреазу и кислоту с салицином, но не образует кислоты с сахарозой и маннозой. Разжижает желатин. Гидролизирует эскулин. На бульоне не образует пленки, а на желтковой среде пигмента. Серологические свойства. С иммунной сывороткой для подвида kurstaki нами поставлена реакция агглютинации с 10 изолятами 2004 г и с таким же количеством штаммов, выделенных в 2005 г, включая штамм 2127-3к. Все изолированные из насекомых культуры агглютинировали с иммунной сывороткой для подвида kurstaki (H3a3b3c). Таким образом, как показали проведенные исследования, гибель гусениц АББ в природе в 2004-2005 годах была вызвана кристаллообразующей бактерией Bacillus thuringiensis subs. kurstaki. Следовательно, карантинный полифаг, каким является американская белая бабочка, в условиях юго-востока Казахстана, может в естественных условиях развития поражаться от указанной бактерии. Патологический материал является источником для получения высоковирулентных культур. Изучена биологическая эффективность выделенного штамма 2127-3к в сравнении с эталоном штамма Z-52 (продуцента лепидоцида) на гусеницах АББ 3-4-х возрастов (таблица 1). Таблица 1 – Биологическая эффективность Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki штамма 2127-3к в сравнении с эталоном Z-52 для гусениц АББ 3-4го возраста Штамм 2127-3к Z-52 2127-3к Z-52 2127-3к Z-52 2127-3к Z-52 Кол-во Титр гус-ц, спор/мл шт. 5х107 1х107 5х106 1х106 40 40 40 40 40 40 40 40 Смертность по дням (экз.) 2 3 4 5 6 7 18 23 21 4 5 0 0 0 25 27 26 5 12 3 4 0 29 27 32 12 16 3 6 1 40 31 40 19 18 4 13 1 40 33 40 19 22 5 13 0 40 33 40 19 22 5 13 0 Смерт ность, % 100 82,5 100 47,5 55,0 12,5 32,5 5,0 Как видно из таблицы 1, от испытуемого штамма погибли все подопытные насекомые, а от контрольного – на 82,5%. Биологическая эффективность от концентрации 1х107 спор/мл для испытуемого нами штамма составляла 100%, от эталона смертность была в два раза меньше. При применении титра 5х106 спор/мл от штамма 2127-3к смертность гусениц составляла 55,0%, тогда как от эталона – 12,5%, то есть насекомых погибло в 4 раза меньше. От действия культуры штамма 2127-3к с титром 106 спор/мл смертность гусениц составляла 32%, от контрольного штамма всего 5%. Таким образом, спорокристаллический комплекс штамма 2127-3к оказался более активным по сравнению с эталоном для гусениц АББ средних возрастов. На основе штамма 2127-3к кристаллообразующих бактерий Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki в в лаборатории биотехнологии Казахского НИИ защиты и карантина растений создан первый отечественный биопрепарат «Ақ – көбелек», который может быть использован против гусениц американской белой бабочки и других листогрызущих вредителей. Проведенные испытания биопрепарата «Ақ – көбелек» против американской белой бабочки на территории пос. «Карасу» Кордайского района Жамбылской области на клене остролистном, показали высокую биологическую эффективность (таблица 2). Таблица 2. Биологическая эффективность биопрепарата «Ақ – көбелек» против американской белой бабочки (Hyphantria cunea Drury)на клене остролистном (2010-2011гг.) Вариант опыта Норма расхода, (л/га, кг/га) «Ақ – көбелек», с.п. Каратэ 050 к.э. (эталон) Кинмикс 10% в.с. Контроль 2,5 Численность гусениц на одной скелетной ветви после обработки на день учета, особей 3 7 14 12 8 8 Снижение численности гусениц на день учета, % 3 7 14 94,2 96,1 96,1 0,3 6 5 5 97,1 97,6 97,6 0,2 4 3 2 98,1 98,6 99,1 - 205 205 203 - - 2 Данные приведенные в таблице убедительно свидетельствует о высокой эффективности биопрепарата «Ақ – көбелек» против гусениц АББ. Уже на третий день после обработки, биологическая эффективность, составила 94,2% и была практически на уровне инсектицидов каратэ и кинмикс. Следовательно, можно заключить, что новый отечественный биопрепарат «Ақ – көбелек» является высокоэффективным биологическим средством, с достаточно высокой агрессивностью штамма бактерии Bacillus thuringiensis, против американской белой бабочки и других чешуекрылых вредителей. По результатам проведенных испытаний биопрепарат «Ақ – көбелек» включен в Справочник пестицидов, разрешенных к применению на территории Республики Казахстан[5]. ВЫВОДЫ Из больных гусениц АББ выделен и идентифицирован штамм бактерий B. thuringiensis ssp. kurstaki, обозначенный как 2127-3к, биологическая эффективность которого против АББ в 3 раза выше по сравнению с эталоном штамм Z-52 (продуцента лепидоцида). Проведенные испытания показали, что созданный впервые в Казахском НИИ защиты и карантина растений биопрепарат «Ақ-көбелек» на основе бактерии Bacillus thuringiensis, обладает высокой вирулентностью против гусениц американской белой бабочки. ЛИТЕРАТУРА 1 Исин М.М., Копжасаров Б.К. Американская белая бабочка - опасный вредитель древесных пород // Матер. международ. научно-практ. конф. «Леса и лесное хозяйство в условиях рынка: проблемы и перспективы устойчивого развития». – Алматы, 2003. – Книга 2 – С. 98. 2 Ижевский С.С. Перспективный метод защиты от карантинных вредителей // Защита растений. – 1979. – №5. – С. 48. 3 Хоулт Д. Краткий определитель бактерий Берги. – Москва: Мир, 1980 – 495 с. 4 De Barjac H., Frachon E. Cllassification of Bacillus thuriensis strains // Entomophaga. – 1990. – Vol. 35. – P. 233-240. 5 Хасенов С., Алимкулов Д., Юсупова Г. Справочник пестицидов (ядохимикатов), разрешенных к применению на территории Республики Казахстан. – Астана: Asia MIX, 2003 – 103 с.
