УДК 631.468:631.86.:631.445.2.:631.452
advertisement
УДК 631.468:631.86.:631.445.2.:631.452 КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ИЗ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ © 2007 г. Б.А. Бызов*1, Т.Ю. Нечитайло2,3, Б.К. Бумажкин4, А.В. Кураков5, П.Н. Голышин 2,3, Д.Г. Звягинцев1 Факультет почвоведения, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова 2 Department of Environmental Microbiology, HZI –Helmholtz Centre for Infection Research, 38124 Braunschweig, Germany 3 Institute of Microbiology, Biozentrum, Technical University of Braunschweig, 38106 Braunschweig, Germany 4 Центр «Биоинженерия» РАН 5 Международный Биотехнологический Центр, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова Поступила в редакцию 2007 г. 1 Исследовали состав культивируемых аэробных копиотрофных бактерий и грибов, населяющих очищенные от пищи пищеварительные тракты дождевых червей Aporrectodea caliginosa, Lumbricus terrestris и Eisenia fetida, а также почву (компост) и свежие экскременты червей. Микроорганизмы выделяли на питательных средах и идентифицировали, секвенируя фрагменты бактериальных 16S рДНК и грибных 28S рДНК (D1/D2 домен) генов с последующим филогенетическим анализом. Из пищеварительных трактов червей Comamonadaceae, Pseudomonadaceae, выделены бактерии Enterobacteriaceae, из семейств Aeromonadaceae, Flavobacteriaceae, Sphingobacteriaceae (Bacteroidetes), Moraxellaceae, а также из Actinobacteria. Пять штаммов: Ochrobactrum sp. 341-2 (-Proteobacteria), Massilia sp. 557-1 (Proteobacteria), Sphingobacterium sp. 611-2 (Bacteroidetes), Leifsonia sp. 555-1 и бактерия из семейства Microbacteriaceae, изолят 521-1 (Actinobacteria) имеют идентичность генов 16S рРНК известным генам 93-97%, что позволяет предположить их принадлежность к новым видам и родам. Группировки бактерий, выделяемых из пищеварительных 1 трактов, существенно различаются от группировок из почвы и экскрементов. Ряд таксонов бактерий оказались общими для различных отделов кишечника A. caliginosa и для кишечников червей различных видов, хотя в целом, состав бактериальных сообществ этих объектов различен. Предполагается, что существуют группировки бактерий, симбиотически ассоциированных с кишечниками. Среди грибов из очищенных пищеварительных трактов выделялись Bjerkandera adusta и Syspastospora parasitica, представленные стерильным светлоокрашенным мицелием, а также Geotrichum candidum, Acremonium murorum (A. murorum var. felina), Alternaria alternata, Aspergillus candidus, A. versicolor, Cladosporium cladosporioides, Rhizomucor racemosus, Mucor hiemalis, Fusarium (F. oxysporum, Fusarium sp.), Penicillium spp. Они длительно выживают в пищеварительной среде червей. Для доказательства принадлежности микроорганизмов, ассоциированных с пищеварительным трактом червей к симбионтам, необходимо изучение их функциональных особенностей и роли в организме-хозяине. Ключевые слова: культивируемые бактерии, грибы, дождевые черви, пищеварительный тракт, симбионты. * Автор для корреспонденции: (e-mail: boris.byzov@ps.msu.ru) Исследование симбиотических взаимодействий микроорганизмов и беспозвоночных животных – одно из главных направлений почвенной микробной экологии. Симбиоз предполагает, что два или более видов организмов сосуществуют, причем один более высоко организованный партнер вмещает в себя другого. Это может быть внутри клеток или специальных органов, а также в пищеварительном тракте. Огромное разнообразие почвенных микроорганизмов и животных предполагает самые разнообразные ассоциации между ними, включая симбиозы, в том числе кишечные. В частности, известны симбионты пищеварительного тракта термитов, а так же их вероятные функции [1]. Микроорганизмы, населяющие кишечные тракты других наземных беспозвоночных (диплопод, мокриц, 2 личинок и имаго насекомых, дождевых червей), также являлись предметом микробиологических исследований. Электронная микроскопия [2-6], выделение на селективные среды [7-12] и молекулярно-генетические исследования [13] прямо или косвенно свидетельствуют о наличии группировок микроорганизмов, состав которых отличается от тех, которые обитают в почве и в сопряженных субстратах. Cимбиотическую природу этих микробных сообществ нельзя считать доказанной пока не установлены их функциональные связи с организмом-хозяином. Таким образом, исследования состава и структуры микробных популяций пищеварительного тракта беспозвоночных и их функций в организме-хозяине представляются важным аспектом почвенной экологии. Всего несколько работ посвящены оценке функциональной роли микроорганизмов, населяющих пищеварительный тракт дождевых червей. Показано, что бактерии участвуют в образовании закиси азота (N2O) и окислении метана, известных как парниковые газы [14-19]. Таким образом, особенности таксономического состава и функций микробного населения пищеварительного тракта дождевых червей остаются относительно слабо изучены, при том, что черви – ведущие представители мезофауны, осуществляющие в почве важнейшие функции «инженеров экосистем» [20]. Несмотря на все возрастающие темпы внедрения в микробную экологию молекулярно-генетических методов, позволяющих количественно учитывать и идентифицировать микроорганизмы в их среде обитания, выделение микроорганизмов на питательные среды остается столь же актуальным для изучения биохимической активности бактерий и грибов как продуцентов витаминов, антибиотиков, ферментов, эффективных фиксаторов атмосферного азота, деструкторов биополимеров. Цель работы: таксономическая характеристика культивируемых аэробных бактерий и грибов, населяющих пищеварительный тракт дождевых червей Aporrectodea caliginosa, Lumbricus terrestris и Eisenia fetida, в сравнении с населяющими почву и ассоциированные субстраты. 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Дождевые черви. В работе исследовали дождевых червей разных эколого-трофических групп: почвенного - Aporrectodea caliginosa (Sav.), и так называемого норного - Lumbricus terrestris (L.), обитающих в окультуренной дерново-подзолистой почве под бобово-злаковой растительностью с многолетнего опыта кафедры агрохимии МГУ им. М.В. Ломоносова (Московская область, Почвенно-экологический центр МГУ “Чашниково”). Содержание в почве общего углерода – 1.72 %, азота – 0.13 %, pH водной вытяжки 5.7. Навозных червей Eisenia fetida (Sav., 1826) отбирали из вермикомпостирующегося полуперепревшего навоза крупного рогатого скота. Для очистки пищеварительного тракта червей от пищи (почвы или компоста) червей содержали на влажной фильтровальной бумаге или на влажном стерильном песке в течение 5-7 сут при 5-7°С. Чистоту пищеварительного тракта оценивали визуально по наличию внутри него темных частиц. Как правило, за это время пребывания во влажной среде черви очищали кишечник от пищи. Кишечники только таких червей использовали для исследования ассоциированных бактерий. Выделение кишечников. Для выделения кишечников, очищенных от пищи, червей замораживали на морозильном столике (элемент Пелтье) до -16°C и вскрывали сразу после разморозки, при этом не допускали повторного замораживания-оттаивания. Выделение микроорганизмов. Сравнивали бактериальные и грибные группировки в кишечниках червей A. caliginosa, L. terrestris, E. fetida, а также в пище, кишечнике и в свежих экскрементах червей A. caliginosa. Всего произведено 5 выделений микроорганизмов. Для выделения использовали смешанные образцы, включающие около 50 мг почвы (компоста), кишечников или их отделов (полученных от пяти червей) и свежих экскрементов (получали, помещая червей на стерильную увлажненную 4 фильтровальную бумагу, содержали несколько часов в холодильнике). Бактерии десорбировали на гомогенизаторе DIAX 900 (Heidolph, Германия) при 8000 об/мин в течение 30 сек или на вортексе ELMI Sky Line при 3200 об/мин в течение 2 мин после возникновения водоворота. При выделении бактерий рост грибов подавляли нистатином (500 мг/л). Каждый образец рассевали из нескольких разведений, каждое разведение на 5 чашек Петри с R2A агаром: дрожжевой экстракт - 0.5 г; пептон - 0.5 г; казаминовые кислоты - 0.5 г; глюкоза - 0.5 г; крахмал – 0.5 г; пируват натрия - 0.3 г; двузамещенный фосфорнокислый натрий - 0.3 г; сернокислый магний - 0.05 г; дистиллированная вода – 1 л. Чашки Петри инкубировали при 18-20°С в течение 10-14 сут. Грибы выделяли высевом разведений образца на подкисленную до pH 4.5 агаризованную среду Чапека. Отсевали по несколько морфологически схожих колоний. Изоляты микроорганизмов хранили в пробирках Eppendorf на соответствующих средах с 25% глицерина, пробирки содержали при -18°С или -80°С. Выделено более 1000 штаммов бактерий и около 150 штаммов грибов. Подготовка культур для ПЦР-амплификации. Изоляты бактерий и грибов выращивали в 50 мкл жидкой среды Чапека в 96-ти луночных планшетах (NUNCTM, Denmark) при 30°C в течение 4 дней. Затем культуру из каждой лунки отбирали и выращенную биомассу промывали 100 мкл раствора PBS (phosphate-buffered saline) (137 мМ NaCl; 2.7 мМ KCl; 10 мМ Na2HPO4; 2 мМ KH2PO4). Биомассу грибов подвергали процедуре лизиса: 1) инкубация в течение 2 часов с лизирующим ферментом в буфере Y1 (сорбитол 1М; ЭДТА 0,1М; литиказа 100U/мл) (RNA/DNA Mini Kit; Qiagen, Germany; 2) аликвота буфера Y1 инкубируется с 100 мкл ПЦР-лизирующего раствора А (67 мМ tris-Cl, pH 8.8; 16 мМ NH4SO4; 5 мкМ β-меркаптоэтанол; 6.7 мМ MgCl2; 6.7 мкМ ЭДТА, pH 8.0; 1.7 мкл додецил сульфата Na; 50 мкг/мл протеиназа K) [21] в течение 4-8 часов при 55°С. Дезактивацию протеиназы К осуществляли прогревом лизата при 80°С в течение 10 минут. 5 Бактерии лизировали в ПЦР-лизирующем растворе А сразу после отмывки в PBS. Aмплификация бактериальных 16S и грибных 28S рРНК (D1/D2 домен) генов. Реакционную смесь для полимеразной цепной реакции (ПЦР) составляли в объеме 20-21 мкл в соответствии с рекомендациями производителя (QIAGEN GmbH, Germany): деионизированная вода - 9 мкл; Q-solution - 4 мкл; 20 мМ раствор dNTPs (pH 8.0) - 4 мкл; ПЦР Буфер (10 x; содержит 15mM MgCl2) - 2.0 мкл; 1.0 U Taq ДНК полимеразы; 0.12 нмоль каждого праймера (NL-1 (upstream) [5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA3’] и NL-4 (downstream) [5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’]) и 2 мкл лизата грибов или 0.12 нмоль каждого AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’] праймера и R1492 F27 (upstream) (downstream) [5’[5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’] и 1 мкл лизата бактерий. Условия амплификации: первоначальная денатурация при 95°С в течение 2 мин; затем 30 циклов, состоящих из 1 мин денатурации при 95°С, 1 мин отжига при 50°С и 1.5 мин амплификации при 72°С; завершающий отжиг при 72°С в течение 10 мин. Pеакцию ставили в термоциклере Eppendorf 5341 (Germany). ПЦР-продукты размером около 680 нк (грибы) и 1400 нк (бактерии) получены электрофорезом в 2% агарозном геле в 96 луночном формате (Invitrogen, Germany). Секвенирование ампликонов. Перед сиквенированием ПЦР-продукты были очищены с использованием MinElute 96 UF PCR purification kit (Qiagen, Germany). Однонаправленный сиквенс был поставлен с использованием праймера NL-4 и R1492 в Eppendorf 5341 (Germany) в соответствии с протоколом BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Готовая реакционная смесь состояла из Ready Reaction Premix (2.5x) 4 мкл; BigDye Sequencing Buffer (5.0x) - 2 мкл; праймер - 10 пкмоль; ПЦРпродукт - 60 нг; деионизированная вода - 12 мкл. Условия реакции: 25 циклов, состоящих из 20 сек при 96°C, 20 сек при 50° C и 4 мин при 60°C. В случае низкой идентичности фрагментов рибосомальных генов бактерий 6 известным последовательностям проводилось дополнительное сиквенирование ампликонов с праймерами F27 и R1087. В некоторых случаях идентификация по фрагментам 16 рРНК генов недостаточна для четкой видовой дифференциации и требуется сиквенирование всего гена, а также биохимическая и морфологическая характеристика изолятов. Дополнительно идентификацию микроскопических грибов осуществляли по соответствующим для конкретной систематической группы определителям. Филогенетический анализ 16S и 18S рРНК генов. Идентификация полученных фрагментов использованием рибосомальных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) генов осуществлена BLAST [22]. с software Филогенетический анализ бактериальных изолятов проводили с использованием программы MEGA версия 4.1 [23], Neighbor-Joining кластерного метода и Kimura two-parameters алгоритма. Изоляты, имеющие 100%-ную идентичность фрагментов рибосомальных генов друг с другом, включены в анализ и представлены на филогенетическом дереве одним штаммом. РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Анализ бактериальных сообществ почвы, пищеварительного тракта и экскрементов червей. 1.1. Бактерии, выделенные из переднего и заднего отделов кишечника червей Aporrectodea caliginosa. Общее число выделенных изолятов – 16. Из переднего и заднего отделов кишечника A. caliginosa выделены бактерии, отнесенные к 11 и 10 таксонам соответственно, изоляты имели высокий процент сходства (99-100%) с описанными видами и штаммами (Рис. 1) следующих таксонов: Proteobacteria (классы ), Bacteroidetes, Firmicutes (класс Bacilli) и Actinobacteria. Пять видов бактерий оказались общими для обоих отделов кишечника: Ochrobactrum grignonense (Proteobacteria; Brucellaceae), Delftia acidovorans (-Proteobacteria), Aeromonas 7 sp., Pseudomonas sp. (-Proteobacteria) и Sphingobacterium sp. (Bacteroidetes) (Рис. 2, 3). 1.2. Бактерии, общие для почвы, кишечника и свежиx экскрементов Aporrectodea caliginosa. Состав бактерий, выделенных из почвы, кишечника и экскрементов, сильно различался. При этом, однако, было выявлено 9 общих изолятов среди 43, выделенных из кишечников, и 25, выделенных из свежих экскрементов червей. Среди бактерий, выделенных из почвы (40 таксонов) и кишечников, общими оказались 13, причем 9 - грамположительных, из них 6 - спорообразующих (класс Bacilli), что составляет около 30% от общего числа выделенных таксонов. Сравнение бактерий из почвы и экскрементов показало сходство только между 6 изолятами (3 грамотрицательных и 3 грамположительных). Бактерии Brevundimonas diminuta (-Proteobacteria), D. acidovorans (-Proteobacteria) и K. palustris (Actinobacteria) выделялись из всех исследованных субстратов (Рис. 2, 3). 1.3. Сравнение состава бактерий, выделенных из пищеварительных трактов червей Aporrectodea caliginosa, Lumbricus terrestris и Eisenia fetida. В этом эксперименте сравнивали бактериальные группировки всего пищеварительного тракта разных червей. Максимальное количество бактериальных таксонов было выделено из пищеварительного тракта червей A. caliginosa - 43, L. terrestris – 22 таксона, E. fetida – 21. Представители порядков Proteobacteria (классы Bacteroidetes (классы Flavobacteria и Sphingobacteria), Actinobacteria и Firmicutes (класс Bacilli) выделялись из червей всех видов (Рис. 3). Среди них идентифицированы B. diminuta (-Proteobacteria), D. acidovorans (-Proteobacteria), Aeromonas spp., Acinetobacter sp. (-Proteobacteria) и Kocuria palustris (Actinobacteria), хотя количество таксонов бактерий, общих для сравниваемых червей, гораздо выше (Рис. 2, 3). Из общего количества выделенных бактерий 5 изолятов имеют относительно низкую идентичность прочитанных фрагментов генов 16S 8 рРНК (около 1490 нуклеотидов) к генам уже описанных таксонов (93-97%): Ochrobactrum sp. 341-2 (-Proteobacteria), Massilia sp. 557-1 (Proteobacteria), Sphingobacterium sp. 611-2 (Bacteroidetes), Leifsonia sp. 5551 и бактерия из семейства Microbacteriaceae изолят 521-1 (Actinobacteria). 2. Анализ сообществ микромицетов пищеварительного тракта и экскрементов червей. В пищеварительных трактах червей, содержащихся без пищи, обнаружены микромицеты. Содержание червей при разных температурах не повлияло на количество КОЕ грибов, выделяющихся из их кишечников (табл. 1). Разнообразие микромицетов снижалось со временем содержания. Среди грибов, выделенных идентифицированы из червей Bjerkandera на adusta 20 и сутки голодания, Syspastospora были parasitica, представленные стерильными светлоокрашенными мицелиями, а также Geotrichum candidum, Acremonium murorum (A. murorum var. felina), Alternaria alternata, Aspergillus candidus, A. versicolor, Cladosporium cladosporioides, Rhizomucor racemosus, Mucor hiemalis, Fusarium (F. oxysporum, Fusarium sp.), Penicillium spp. (табл. 2). Плотность популяций грибов в кишечнике составляет 103 -104 КОЕ на один воздушно-сухой кишечник и близка к плотности популяций грибов в минеральных горизонтах почв. Эти грибы можно считать наиболее устойчивыми к условиям пищеварительного тракта. Доказательство их принадлежности E. fetida – 21 к симбионтам червей требует дополнительных исследований. ОБСУЖДЕНИЕ В настоящей работе проведен таксономический анализ компонентов аэробных бактериальных и грибных группировок, населяющих пищеварительные тракты дождевых червей, посредством высева на стандартные питательные среды. Микроорганизмы выделяли из пищеварительных трактов червей, очищенных от остатков пищи и основной массы привнесенных из среды обитания микроорганизмов, что достигалось 9 путем длительного содержания червей без пищи при пониженной (5-7°С) температуре. Мы полагаем, что выделяемые таким образом микроорганизмы являются ассоциированными с червями, а не транзитными (заметим, что получить полностью очищенный от почвенных микроорганизмов пищеварительный тракт можно только путем выведения червей из стерилизованных коконов). Выделенные микроорганизмы относятся к аэробным копиотрофам, так как они культивировались на богатых питательных средах (R2A агар для бактерий и среда Чапека для грибов) в аэробных условиях. Идентификацию бактерий и грибов производили современными молекулярно-генетическими методами, что определенную строгость при интерпретации результатов. вносит Результаты экспериментов подтвердили ранее высказанное нами предположение, что пищеварительный тракт червей может быть населен специфическими микроорганизмами, не выделяющимися в качестве доминирующих из среды обитания червей [9]. Микробное население пищеварительного тракта червей представлено бактериями из Aeromonadaceae, разных таксонов. Comamonadaceae, Выделены бактерии Enterobacteriaceae, из семейств Flavobacteriaceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Sphingobacteriaceae (Bacteroidetes), а также Actinobacteria. Несколько штаммов имеют низкую идентичность генов 16S рРНК генам уже описанных таксонов (93-97%), что позволяет предположить их принадлежность к новым видам и родам. Вероятно, при более тщательном анализе состава культивируемых бактерий с использованием различных сред и условий культивирования, в том числе и для анаэробных бактерий, можно выявить много представителей новых таксонов. На примере изолятов из червей вида A. caliginosa показано, что ряд бактериальных таксонов сходны с выделенными из почвы, но количество их меньше в кишечнике и свежих экскрементах червей. Таксономический состав бактерий, выделенных из разных отделов кишечника и экскрементов 10 A. caliginosa различается, однако ряд бактерий заселяют оба отдела кишечника. Всего 2 таксона бактерий оказались общими для пищеварительных трактов всех исследованных видов червей: Acinetobacter sp. (близкий к Acinetobacter sp. ANT9054, A. lwoffii), Aeromonas sp. (близкий к A. jandaei, A. media, A. hydrophila) (-Proteobacteria). Среди выделенных изолятов обнаружены бактерии, относящиеся к новым таксонам, однако основная масса представлена уже описанными видами, которые отнесены к, так называемой, факультативно-ассоциированной микробиоте кишечника дождевых червей. Эти бактерии встречаются также в почве, но, по-видимому, попадая в кишечник, способны там активно размножаться. Однако мы допускаем, что предварительные процедуры по очистке кишечника могли изменить состав микробных сообществ, и для дальнейшего доказательства принадлежности названных бактерий к группе кишечной микробиоте необходимо установить определенные особенности их физиологии. Такими особенностями могут быть устойчивость к пищеварительным ферментам и киллерным веществам червей [24, 25], способность к росту в анаэробных и факультативно анаэробных условиях [26], специческая ферментативная активность, устойчивость к абразивному действию почвенных частиц, возникающему в пищеварительном тракте червей и другие. В целом, разделение факультативно- и облигатносимбиотических микроорганизмов на данном этапе исследования не представляется возможным. Вероятно, для этого надо анализировать особи червей, выведенных из коконов в контролируемых условиях (гнотобиотические животные, наличие стерильной пищи и среды обитания) для доказательства необходимости для выживания червей ассоциированных с кишечником микроорганизмов (симбионтов). Сведения о микробном населении пищеварительного тракта дождевых червей отрывочны и часто противоречивы. Объяснить это можно, вопервых, тем, что исследовались черви разных видов, населяющие субстраты 11 с различающимися нестандартностью микробными процедур сообществами, подготовки червей во-вторых, для выделения микроорганизмов и различными условиями выделения. Большинство работ свидетельствует, тем не менее, в пользу наличия специфических бактериальных группировок доминирующих бактерий в кишечниках выделяют червей. представителей В качестве Vibrio [27], Streptococcus [11], Actinobacteria [4, 28 - 31]. Третьякова с соавт. [9] обнаружили у червей E. fetida в качестве доминирующих культивируемых бактерий представителей Enterobacteriaceae, Vibrionaceae и Actinobacteria, которые не доминировали в посевах из среды обитания (компоста) этого червя. Бактерии, выделенные из червей E. fetida, были представлены на 90% быстрорастущими грамотрицательными, оксидазо-положительными, бродящими бактериями, идентифицированными как Aeromonas hydrophila [32]. Показано, что в центре пищеварительного тракта дождевых червей создаются анаэробные условия [17, 26]; доля бактерий, способных к росту в анаэробных условиях выше в кишечнике, чем в почве [26]. Сведений о встречаемости микромицетов как постоянных обитателей пищеварительных трактов червей нами не обнаружено. Грибы, которые мы выделили из пищеварительных трактов червей, нельзя отнести к симбиотическим только на этом основании - они выделяются и из среды обитания червей. Однако длительное выживание их в кишечниках при сохранении плотности популяции, близкой к их обилию в почве, позволяет предположить их связь с червями. Ранее мы показали, что устойчивость к перевариванию позволяет некоторым из этих грибов выживать, а их спорам активнее прорастать под действием кишечной жидкости червей [24, 25]. В заключение отметим, что пищеварительный тракт дождевых червей представляется микроорганизмов. как „фильтр“ Часть и одновременно микроорганизмов, ферментер попадающих из для среды, элиминируется, а устойчивые микроорганизмы размножаются в нем. Действующими агентами являются механическая [33] и биохимическая 12 (киллерная, стимулирующая) активность пищеварительной среды червей [24, 25], возможны и межмикробные антагонистические взаимодействия [34]. Подчеркнем, специфическим что пищеварительный местообитанием для тракт червей микроорганизмов. является Существует специфическая кишечная группировка микроорганизмов, изменчивая в отношении таксономического состава, но, вероятно, устойчивая в отношении биохимической активности и выполняющая определенные функции. Это не удивительно, поскольку все до сих пор исследованные животные имеют микробных кишечных ассоциантов. Еще раз отметим, что доказательство наличия симбионтов у дождевых червей требует установления специфических функций в организме-хозяине. Работа выполнена при поддержке РФФИ, проекты № 05-04-48676а, № 06-04-48557а и № 08-04-00786а, гранта Президента РФ поддержки ведущих научных школ НШ-2227.2008.4., а также European Union Project “Biotic and Abiotic Mechanisms of TSE Infectivity Retention and Dissemination in Soil” (QLRT-2001-02493). 13 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. König H., Varma A. (Eds.) Intestinal microorganisms of termites and other invertebrates // Soil Biology, 2006, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, V. 6. 483 p. 2. Бызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве // Автореф. дисс…. докт. биол. наук. М: Изд-во “Макс Пресс”, 2003, 52 с. 3. Bignell D.E., Oskarsson H., Anderson J.M. Colonization of the epithelial phase of the peritrophic membrane and the ectoperitrophic space by actinomycetes in a soil-feeding termite // Journal of Invertebrate Pathology. 1980. V. 36. № 3. P. 426–428. 4. Griffiths B.S., Wood S. Microorganisms associated with the hindgut of Oniscus asellus (Crustacea, Isopoda) // Pedobiologia. 1985. V. 28. P. 377–381. 5. Jolly J.M., Lappin Scott H.M., Anderson J.M., Clegg C.D. Scanning electron microscopy of the gut microflora of two earthworms: Lumbricus terrestris and Octolasion cyaneum // Microbial Ecology. 1993. V. 26. P. 235–245. 6. Mendez, R., Borges, S., Betancourt, C. A microscopical view of the intestine of Onychochaeta borincana (Oligochaeta: Glossoscolecidae) // Pedobiologia. 2003. V. 47. № 5-6. P. 900-903. 7. Густелева Л.А., Исаев А.С. Микрофлора насекомых–ксилофагов // Новосибирск: Изд-во Наука, Сибирское отделение, 1982. 116 с. 8. Шивокене Я.С., Малукас Э.З. Симбиотическая микрофлора пищеварительного тракта насекомых и ее роль в их патогенезе // Труды АН Лит. ССР. 1984. № 4. С. 98–110. 9. Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными // Микробиология. 1996. Т. 65. № 1. С. 102–110. 10. Ineson P., Anderson J.M. Aerobically isolated bacteria associated with the gut and faeces of the litter feeding macroarthropods Oniscus assellus and Glomeris marginata // Soil Biology and Biochemistry. 1985. V. 17. P. 843– 849. 14 11. Szabó I.M., Chu T.L., Contreras E., Heydrich M., Jáger K., Marialigeti K., Pobozsny M., Ravasz K., Zicsi A. On the problems of intestinal bacteriology of forest–litter consuming invertebrates // Striganova B.R. (ed.) Soil fauna and soil fertility. Proceedings 9th International Colloquium on Soil Zoology. Moscow, Nauka. 1987. P. 58–63. 12. Byzov B.A., Chernjakovskaya T.F., Zenova G.M., Dobrovolskaya T.G. Bacterial communities associated with soil diplopods // Pedobiologia. 1996. V. 40. P. 67–79. 13. Sampedro L., Whalen J.K. Changes in the fatty acid profiles through the digestive tract of the earthworm Lumbricus terrestris L. // Applied Soil Ecology. 2007. V. 35. № 1. P. 226–236. 14. Karsten G.R., Drake H.L. Denitrifying bacteria in the earthworm gastrointestinal tract and in vivo emission of nitrous oxide (N 2O) by earthworms // Applied and Environmental Microbiology. 1997. V. 63. P. 1878-1882. 15. Matthies C., Griesshammer A., Schmittroth M., Drake, H.L. Evidence for involvement of gut-associated denitrifying bacteria in emission of nitrous oxide (N2O) by earthworms obtained from garden and forest soils // Applied and Environmental Microbiology. 1999. V. 65. P. 3599-3604. 16. Ihssen J., Horn M.A., Matthies C., Gößner A., Schramm A., Drake H.L. N2Oproducing microorganisms in the gut of the earthworm Aporrectodea caliginosa are indicative of ingested soil bacteria // Applied and Environmental Microbiology. 2003. V. 69. P. 1655–1661. 17. Horn M.A., Schramm A., Drake H.L. The earthworm gut: an ideal habitat for ingested N2O-producing microorganisms // Applied and Environmental Microbiology. 2003. V. 69. P. 1662–1669. 18. Horn M.A., Mertel R., Gehre M., Kastner M., Drake H.L. In vivo emission of dinitrogen by earthworms via denitrifying bacteria in the gut. Applied and Environmental Microbiology. 2006. V. 72(2). P. 1013-1018. 15 19. Héry M., Singer A.C., Kumaresan D., Bodrossy L., Stalis-Pavese N., Prosser J., Thompson I.P., Murrel J.C. Effect of earthworms on the community structure of active methanotrophic bacteria in a landfill soil // ISME Journal. 2008. V. 2. P. 92-104. 20. Jones C.G. Lawton J.H., Shachak M. Positive and negative effects of organisms as physical ecosystem engineers // Ecology. 1997. V. 78. P. 1946– 1957. 21. Sambrook J., Russel D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. New York, USA: Gold Spring Harbor Laboratory Press. 3rd ed. 2001. 6.22. 22. Altschul S.F., Madden T.L., Schäffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Research. 1997. V. 5. P. 33893402. 22. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. 2007. P. 1596-1599. 24. Хомяков Н.В, Харин С.А., Нечитайло Т.Ю., Голышин П.Н., Кураков А.В., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Реакция микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей // Микробиология. 2007. № 76. № 1. с. 45-54. 25. Byzov B.A., Khomyakov N.V., Kharin S. A., Kurakov A.V. Fate of soil bacteria and fungi in the gut of earthworms // European Journal of Soil Biology. 2007. V. 43. P. 149-156. 26. Karsten G.R., Drake H.L. Comparative assessment of the aerobic and anaerobic microfloras of earthworms’ guts and forest soils // Applied and Environmental Microbiology. 1995. V. 61, № 3. P. 1039–1044. 27. Marialigeti K. On the community structure of the gut–microbiota of Eisenia lucens (Annelida, Oligochaeta) // Pedobiologia. 1979. V. 19. P. 213–220. 28. Contreras E. Studies on the intestinal actinomycete flora of Eisenia lucens (Annelida, Oligochaeta) // Pedobiologia. 1980. V. 20. P. 411–416. 16 29. Ravasz K., Zicsi A., Contreras E., Szell V., Szabo I.M. The intestinal actinomycete flora of some earthworm species // Opuscula Zoologica. 1986. V. 22. P. 85–102. 30. Shaw C., Pawluk S. Faecal microbiology of Octalasion tyrtaeum, Apporrectodea turgida and Lumbricus terrestris and its relation to the carbon budgets of three artificial soils // Pedobiologia. 1986. V. 29, № 6. P. 377–389. 31. Dkhar M.S., Mishra R.R. Microflora in the gut contents of the earthworm (Amynthas diffringens Baird.) // Journal of Phytology Research. 1991. V. 4. P. 155–159. 32. Toyoto K., Kimura M. Microbial community indigenous to the earthworm Eisenia foetida // Biology and Fertility of Soils. 2000. V. 31. № ¾. P. 187– 190. 33. Moody S.A., Piearce, T.G., Dighton J. Fate of some fungal spores associated with wheat straw decomposition on passage through the guts of Lumbricus terrestris and Aporrectodea longa // Soil Biol. Biochem. 1996. V. 28. P. 533537. 34. Нгуен Дык Т.Л., Антагонистические Бызов свойства Б.А., Зенова Г.М., актиномицетов, Звягинцев Д.Г. ассоциированных с пищеварительным трактом почвенных беспозвоночных // Вест. Моск. Ун-та, сер. 17 почвовед. 1996. № 3. С. 70-77. 17 Таблица 1. Численность КОЕ грибов в пищеварительных трактах червей Aporrectodea caliginosa, Lumbricus terrestris и Eisenia fetida при их содержании без пищи в течение 20 суток при различной температуре Вид червя Aporrectodea caliginosa Lumbricus terrestris Eisenia fetida КОЕ/кишечник x 103 4oС 1.0 ± 0.4* 0.5 ± 0.3 0.7 ± 0.2 15oС 0.9 ± 0.4 1.1 ± 0.3 1.0 ± 0.5 *-n=3 18 Таблица 2. Микромицеты, выделенные из пищеварительных трактов червей Aporrectodea caliginosa, содержащихся без почвы при 4°С Вид/Род Acremonium murorum (A. murorum var. felina)* Acremonium sp. Alternaria sp. Aspergillus candidus A. fumigatus A. ustus A. versicolor Cladosporium sphaerospermum Chrysosporium sp. Doratomyces stemonitis Eupenicillium crutaceum* Fusarium (F. oxysporum, Fusarium sp.) Gliocladium penicilloides Humicola grisea Mucor hiemalis* Ophiobolus herpotrichus/Setamelonomma* Paecylomyces varioti Penicillium (P. chrysogenum, P. griseoroseum*, P. crustosum*, Penicillium spp.) Rhizomucor racemosus* Trichoderma viride (Hypocrea rufa)* Verticillium (V. lateritium, V. epiphytum*) Geotrichum candidum, Syspastospora parasitica, Bjerkandera adusta, светлоокрашенный стерильный мицелий* Время содержания червей без почвы, сут. 5 20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + микромицет выделен; - микромицет не выделен * - идентифицированы по 28S рДНК (D1/D2 домен) 19 ПОДПИСИ К РИСУНКАМ Рис. 1. Филогенетическое дерево бактериальных изолятов, выделенных из пищеварительного тракта червя Aporrectodea caliginosa и некоторые родственные виды бактерий (помечены жирным шрифтом). Бактерии, выделенные из переднего отдела помечены знаком (▲); выделенные из заднего отдела кишечника помечены (▼); штаммы, встречающиеся в обоих отделах помечены (●). Алайнированные фрагменты генов 16S рРНК имеют размер около 570 нуклеотидов. Уровень бутстрапов показан на развилках филогенетического дерева. Рис. 2. Филогенетическое дерево грамотрицательных бактерий, выделенных из почвы, пищеварительных трактов червей и экскрементов червей, а также некоторые родственные виды бактерий (помечены жирным шрифтом). Источник выделения указан в скобках: почва, черви Aporrectodea caliginosa (A.c.), Lumbricus terrestris (L.t.), Eisenia fetida (E.f.), содержимое кишечника (сод. киш.), стенки кишечника (ст. киш.), экскременты (экскр.). Бактерии, выделенные из всех субстратов, помечены знаком (●); выделенные из всех видов червей, помечены знаком (▲). Алайнированные фрагменты генов 16S рРНК имеют размер около 470 нуклеотидов. Уровень бутстрапов указан на развилках филогенетического дерева; бутстрапы ниже 50% не показаны. Рис. 3. Филогенетическое дерево грамположительных бактерий, выделенных из почвы, пищеварительных трактов и экскрементов червей, а также некоторые родственные виды бактерий (помечены жирным шрифтом). Бактерии, выделенные из всех субстратов, помечены знаком (●). Алайнированные фрагменты генов 16S рРНК имеют размер около 520 нуклеотидов. Уровень бутстрапов указан на развилках филогенетического дерева; бутстрапы ниже 50% не показаны. 20
